CN113125696A

CN113125696A - 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113125696A
Application number: CN201911405812.3A
Authority: CN
Inventors: 强中华; 李临
Original assignee: Chemclin Diagnostics Corp
Current assignee: Kemei Boyang Diagnostic Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN113125696B

Abstract

本发明涉及一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒，其包括：第一组合物，其包含第一受体微球以及与之结合的第一抗体，所述第一抗体是特异性结合雌二醇检测抗体；第二组合物，其包含第二受体微球以及与之结合的第二抗体，所述第二抗体是特异性结合雌二醇检测抗体；第三组合物，其包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原；所述第一抗体与雌二醇特异性结合的亲和力高于所述第二抗体与雌二醇特异性结合的亲和力；同时，所述第一抗体与第一受体微球的质量比低于所述第二抗体与第二受体微球的质量比。例用该试剂盒检测雌二醇时，同时具有优异的功能灵敏度和检测范围。

Description

一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于均相化学发光检测技术领域，具体涉及一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用。

背景技术

雌二醇(Estradiol-17β，E2)是生物活性最强的雌性激素，主要由卵巢产生的17β-雌二醇，是以睾酮为前体合成。卵泡期由颗粒细胞和内膜细胞分泌，黄体期由黄体细胞分泌，肾上腺皮质和睾丸也能少量分泌。妇女怀孕期主要由胎盘分泌。雌二醇的主要功能是促进女性生殖上皮、乳腺、子宫、长骨的生长及第二性征的发育，参与脂质代谢，调节血管平滑肌细胞和内皮细胞的许多功能，在排卵的控制机制中起着核心作用。此外，雌二醇同时具有防止骨质疏松、减少心血管疾病风险，调剂下丘脑等作用。另外，雌激素在女性妊娠过程中也发挥着重要的作用。在这一时期，雌激素的产生是正常排卵妇女平均每日雌激素合成的l000倍，孕期母体内E2占主导地位，其水平也达到非孕妇女的1000倍。雌二醇检测是检查下丘脑-垂体-性腺轴功能的指标之一，E2的水平可用于原发性或继发性性早熟、下丘脑、垂体和性腺相关疾病的鉴别与辅助诊断，以及闭经或月经异常时对卵巢功能的评价等。

准确定量分析血清雌二醇(E2)的方法起源于免疫放射分析技术，因放射性污染因素，临床实验室已不再使用。如今，血清E2定量分析的主流方法是发光免疫分析，包括酶促化学发光(贝克曼公司产品)、吖啶酯化学发光(西门子公司产品)和电化学发光(罗氏公司产品)。因E2是小分子半抗原，单一抗原表位，需采用双抗原竞争分析模式，即待检雌二醇和标记雌二醇竞争限量抗体。以上三种主流发光免疫分析方法，虽然所用标记物不同，但是具备共同特点即均属于非均相免疫分析(Heterogeneous immunoassay)。非均相免疫分析是指在抗体-抗原反应后、检测信号前，需要分离去除未参加反应的、游离状态的标记抗体或标记抗原；此时，检测结合状态的结合标记物的信号强度，可通过数学函数可获得待测抗原或抗体的含量。分离结合标记物和游离标记物常用的方法是固相吸附分离技术。

虽然，固相吸附分离方法具有简单、快速等众多优点，但是，由于每次洗涤过程需要消耗时间，也必然由于洗涤分离所带来“误差”。据文献报道，洗涤误差是非均相免疫分析误差的重要来源，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和灵敏度。此外，雌二醇为小分子物质，如标记酶分子会对其免疫活性(结合抗体能力)产生影响。同时，竞争法要求两个抗原(待检抗原和标记抗原)对抗体的竞争能力相同或相似，才能形成均衡竞争方式。小分子雌二醇与大分子酶结合，会造成空间位阻，影响与抗体分子的结合。

针对人体雌二醇(E2)检测项目，临床要求较宽的检测区间，一般商品化试剂盒校准品范围低于0-4800pg/ml，换言之，临床实验室血清E2项目对功能灵敏度和检测范围要求较高。现有的分析方法不能满足要求，高值样本和低值样本难于兼顾。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒，利用该试剂盒检测雌二醇时，同时具有优异的功能灵敏度和检测范围。

为此，本发明第一方面提供了一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

第一组合物，其包含第一受体微球以及与之结合的第一抗体，所述第一抗体是特异性结合雌二醇检测抗体；

第二组合物，其包含第二受体微球以及与之结合的第二抗体，所述第二抗体是特异性结合雌二醇检测抗体；

第三组合物，其包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原；

所述第一抗体与雌二醇特异性结合的亲和力高于所述第二抗体与雌二醇特异性结合的亲和力；同时，

所述第一抗体与第一受体微球的质量比低于所述第二抗体与第二受体微球的质量比。

在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体与所述第一受体微球的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～20):1。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物单独分散在同一种缓冲液中。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径不同。

在本发明的一些实施方式中，所述竞争抗原为雌二醇和/或雌二醇类似物；优选地，所述竞争抗原为雌二醇类似物；进一步优选地，所述雌二醇类似物为雌三醇；更进一步优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员结合。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括第四组合物，其包括释放剂；优选地，所述释放剂选自二氢睾酮、美睾酮、达那唑和己烯雌酚中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括已知雌二醇浓度的系列校准品溶液；优选地，所述系列校准品溶液中雌二醇的浓度为0-4800ng/L。

本发明第二发明提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒在雌二醇检测中的应用。

本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒通过选用不同亲合力的抗体分别以不同质量比偶联受体微球，再以适当比例混合两种受体微球，实现两种不同亲合力抗体视待检抗原浓度差异选择性发挥作用，在保障功能灵敏度的同时，拓宽检测范围防止钩状效应的发生，且所述试剂盒隶属均相免疫分析，全程没有分离洗涤过程，不仅节省检测时间，而且回避洗涤所致误差，具备较高的精密度和准确度。此外，为了进一步提高功能灵敏度，选择与雌二醇结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，确保雌二醇能够优先结合特异性抗体。

附图说明

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

图1为本发明所述试剂盒的检测原理图；其中，附图标记的含义如下：1第一受体微球以及与之结合的第一抗体，第一受体微球表面包被少量高亲和力的第一抗体，但第一受体微球浓度较高，确保检测低浓度E2样本时，第一受体微球优先发挥作用；2第二受体微球以及与之结合的第二抗体，第二受体微球表面包被较多低亲和力的第二抗体，但第二受体微球浓度较低，确保检测高浓度E2样本时，第二受体微球优先发挥作用；3与生物素结合的E2；4待测的E2(雌二醇)。

图2为实施例5中E2样本测值与对比试剂盒测值相关性图，其中n＝133。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。

本发明所述用语“供体微球”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体微球反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体微球可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体微球为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。

本发明所述用语“受体微球”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体微球被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体微球俘获，从而传递能量以激活所述受体微球。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体微球包含发光组合物和基质，所述发光组合物填充于基质中和/或包被于基质表面。本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。

本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。

本发明所述用语“表位”是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。针对蛋白质而言，抗原表位是一段特定氨基酸序列(线性表位)，也可以是几段特定氨基酸序列构成的空间构象(构象表位)。抗原表位不仅是抗体结合最小结构和功能单位，同时也是淋巴细胞(B细胞)抗原受体识别的基本单位。

本发明所述用语“单克隆抗体”是指采用杂交瘤融合技术制备的、针对单一抗原表位、具备单一特异性、结构和功能完全均一的抗体。首先，单克隆抗体具备单一特异性，杜绝交叉反应，提高标记免疫分析特异性。其次，单克隆抗体确保持续供应，且较小批间差异，有效降低免疫诊断试剂盒的批间差异。再次，不同单克隆抗体识别抗原位点不同，显示不同亲合力特征。

本发明所述用语“差异性受体微球”特指用不同亲合力单克隆抗体偶联的受体微球(FG)。

本发明所述用语“功能灵敏度”指最低检测限，即将已知浓度标本倍比稀释后，分析方法所能检测到的最低含量，且批内精密度不能大于20％。分析灵敏度是真实测定获得，也称为“功能灵敏度”。

本发明所述用语“检测范围”，是指剂量函数的有效范围，如将高浓度标本倍比稀释，所用稀释标本测定结果做线性回归分析，相关系数(R)大于0.990。

Ⅱ.具体实施方案

下面将详细说明本发明。

关于竞争性免疫分析，欲获得优质竞争性校准函数(可简单理解为校准曲线)，其需满足两个基本条件：其一，竞争抗原和待检抗原同源，与特异性抗体具有相同或类似的亲合力；其二，确保抗体限量原则，特异性抗体用量需要小于两种抗原所需抗体的累计用量，但必须大于竞争抗原或待检抗原所需抗体累计用量。本发明基于光激化学发光技术，获得光激化学方法定量检测血清E2水平的均相化学发光检测试剂盒，该试剂盒的分析性能指标能够满足行业标准或临床实验室的基本要求。主要表现在：选用两个亲和力不同的针对E2的抗体分别偶联受体微球，可以提高高端样本以及低端样本的测值符合性。此外，通过选择与雌二醇结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，确保待测的雌二醇能够优先结合特异性抗体，进一步提高功能灵敏度。

因此，本发明第一方面所涉及的雌二醇均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

所述第一抗体与第一受体微球的质量比低于所述第二抗体与第二受体微球的质量比。也即所述第一抗体在所述第一受体微球上的偶联量低于所述第二抗体在所述第二受体微球上的偶联量。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗体和第二抗体均为与雌二醇特异性结合的单克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体与所述第一受体微球的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗体与所述第一受体微球的质量比为1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900或1:1000等。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。本发明中，所述浓度既可以为质量浓度也可以为摩尔浓度。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～20):1。在本发明的一些具体实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为2:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1或50:1等。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂(即试剂1)。

在本发明的一些实施方式中，所述竞争抗原为雌二醇和/或雌二醇类似物；优选地，所述竞争抗原为雌二醇类似物；进一步优选地，所述雌二醇类似物为雌三醇；更进一步优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员(例如生物素)结合。本发明中，所述雌二醇类似物与检测抗体的特异性结合能力低于雌二醇与检测抗体的特异性结合能力，也即优选地，竞争抗原与检测抗体的特异性结合能力低于待测抗原与检测抗体的特异性结合能力，这样可以进行一步提高功能灵敏度。本发明中，包含第三组合物的试剂又称为试剂2。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括第四组合物，其包括释放剂；优选地，所述释放剂选自二氢睾酮、美睾酮、达那唑和己烯雌酚中的一种或多种。本发明中，包含第三组合物的试剂又称为试剂3。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括第五组合物，其包括供体微球，所述供体微球与特异性配对成员中的另一员(例如亲和素)结合。

针对两种极端样本，第一抗体偶联的第一受体微球和第二抗体偶联的第二受体微球发挥作用方式不同：针对低浓度待测样本，待检抗原结合微球表面的抗体依赖于受体微球的浓度，即第一抗体偶联的第一受体微球的浓度高，此种微球占优势；针对高浓度待测样本，待检抗原结合微球表面的抗体不再依赖于微球的浓度，而是依赖于微球表面抗体的分子数量，虽然第二抗体偶联的受体微球浓度低，但是微球表面抗体分子数量多，高浓度待检抗原需要更多抗体分子，此时第二抗体偶联的第二受体微球起决定作用。

基于上述分析，本发明采用不同亲和力抗体，分别以不同方式(偶联质量比和/或偶联方式)制备差异性受体微球。将差异性受体微球按一定比例混合作为单一溶液(试剂1)，此种溶液中的两种性质不同的受体微球，利用微球液相扩散原理和单克隆抗体亲和力差异，可以实现根据样本中待检抗原的浓度差异选择性发挥作用，满足临床E2对功能灵敏度和检测范围的特殊要求。

此外，通过选择与雌二醇结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，竞争抗原与受体微球上的检测抗体的结合能力低于雌二醇与受体微球上的检测抗体的结合能力，因此可以确保待测的雌二醇能够优先结合检测抗体，进一步提高功能灵敏度。

在本发明的一些实施方式中，利用所述试剂盒对雌二醇进行检测的方法包括：

步骤N1，将待测样本、试剂1、试剂2以及任选的试剂3混合后，获得第一混合物；

步骤N2，将与亲和素结合的供体微球溶液与第一混合物混合后，获得第二混合物；

步骤N3，利用能量或者活性化合物激发第二混合物中的供体微球生成活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成化学发光信号；

步骤N4，检测步骤N3中所述化学发光信号的强度，分析待测样本中是否存在雌二醇和/或雌二醇的浓度。

本发明所述方法中，所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是10-50min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃；温育的时间可以选自10min、20min、30min、35min、40min、45min或50min。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括，利用已知雌二醇浓度的系列校准品溶液制作化学发光信号-雌二醇浓度的标准曲线的步骤；所述标准曲线用于确定待测样本中雌二醇的含量。

在本发明的另一些实施方式中，步骤N3中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发第二混合物中的供微球产生活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成520-620nm的发射光。

将待测的血清样本、试剂1、试剂2以及任选的试剂3(释放剂)混合温育，血清样本中的E2和Bio-竞争抗原，竞争性与受体微球上的检测抗体(FG-Ab)结合，分别形成复合物(FG-Ab-竞争抗原-Bio，FG-Ab-E2)，随后SA-GG(与亲和素结合的供体微球)与生物素(Bio)结合，受体微球和供体微球相互靠近，激发后诱导光信号产生。游离的受体微粒不能获得能量，无光信号的产生。由于本发明采用竞争性分析模式，光信号强度与待测血清样本中E2含量呈反比例函数关系，通过已知浓度E2校准品所形成的数学函数，便可计算未知血清标本E2浓度水平。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1：本发明所述试剂盒的制备

(1)单克隆抗体偶联受体微球溶液(试剂1)的制备

受体微球：微球表面含有醛基(-CHO)，通过醛基与抗体分子连接。内含有发光化合物(二甲基噻吩的衍生物)及镧系元素(Eu)化合物的螯合物。

生物原料：与E2特异性结合的亲和力高的单克隆抗体(即，HA-McAb)和与E2特异性结合的亲和力低的单克隆抗体(即，LA-McAb)。

制备过程：

1)与E2特异性结合的亲和力高的单克隆抗体(即，HA-McAb)用碳酸盐缓冲液透析过夜，与受体微球(FG)混合，抗体和微球混合的质量比为1:400，包被2小时，加入封闭液，封闭1小时，制成含FG-HA-McAb-n的浓溶液备用；

2)与E2特异性结合的亲和力低的单克隆抗体(即，LA-McAb)用碳酸盐缓冲液透析过夜，与受体微球(FG)混合，抗体和微球混合的质量比为1:80，包被2小时，加入封闭液，封闭1小时，制成含FG-HA-McAb-N的浓溶液备用；

3)用试剂1稀释液将FG-HA-McAb-n按照1:200稀释，编号为R1-1；用试剂1稀释液将FG-LA-McAb-N按照1:500稀释，编号为R1-2；

4)将R1-1和R1-2两种溶液等体积混合，即获得试剂1。

(2)与生物素结合的竞争抗原(试剂2)的制备过程

用试剂2稀释液将1ug/ml的Bio-E2按照1:10000稀释，配制成R2工作液即作为试剂2。

也可用试剂2稀释液浆1ug/ml的Bio-E3按照1:8000稀释，配制成R2工作液，即作为试剂2。

(3)释放剂的制备

取美睾酮纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成100ng/L。

(4)已知浓度E2系列校准品的制备过程

取E2纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0～4800ng/L的系列校准品溶液各0.5ml。

实施例2：

利用实施例1中的方法，分别改变抗体类型、偶联的质量比、竞争抗原类型等条件，利用LiCA500自动光激化学发光分析系统检测同一批样本，自动完成并输出均相化学发光信号，分析检测结果的检出范围和检出限。

使用实施例1制备的试剂盒进行检测的过程由LiCA500自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果，具体步骤为：

a.在反应孔中分别加入10μl样本、校准品或质控品；

b.在反应孔中依次加入25μl释放剂、25μl试剂1和25μl试剂2；

c.37℃温育15分钟；

d.加入LiCA通用液(与亲和素结合的供体微球溶液)175μl；

e.37℃温育15分钟；

e.激光照射微孔并计算每孔发光光子量；

f.根据校准曲线，计算样品浓度。结果如表1所示。

表1

从表1可知，两种亲和力抗体偶联受体微球的结果都是抗体与受体微球的质量比越低的检测结果越好。当仅使用高亲和力抗体(HA-McAb)偶联的受体微球检测时，线性范围低值和检出限优于仅使用低亲和力抗体(LA-McAb)偶联的受体微球，可以达到10～20ng/L；但是低亲和力抗体(LA-McAb)偶联的受体微球的线性范围上限优于高亲和力抗体(HA-McAb)偶联的受体微球，可以达到5000ng/L以上。当将合适偶联质量比的高亲和力抗体受体微球和低亲和力抗体受体微球按照1:200和1:500等体积混合后，可以使线性范围上、下限和检出限都达到最优的结果。另外，采用Bio-E3抗原作为竞争抗原，由于其竞争能力弱于Bio-E2抗原，更有利于样本中的E2与检测抗体结合，所以采用Bio-E3抗原作为竞争抗原进行检测的功能灵敏度(检出限)都略好于用Bio-E2抗原作为竞争抗原的结果。

实施例3：

检验实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E2作为竞争抗原)的精密度。

精密度意义：精密度是衡量试剂盒批内和批间变异的重要指标，是评价拟上市产品有效性的重要依据，通常包括批内精密度和批间精密度。

批内精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本对1个批次的产品进行独立分析，对每个批次重复测定10次，计算10次测量结果的平均值

和标准差(SD)，根据公式

计算变异系数(CV)，结果如表1所示。

批间精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本，对3个批次的产品进行独立分析，对每个批次重复测定20次，计算测量结果的平均值

和标准差(SD)，根据公式

计算变异系数(CV)，结果如表2所示。

表2：测试结果

从表2可知，三批试剂批内和批间精密度均<10％，说明所述试剂盒的测值重复性好，随机误差小。

实施例4：

检验实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E2作为竞争抗原)的准确度的检测

准确度意义：实测值与真实值的相符程度，反应系统误差的大小。

准确度评估方法：将含不同E2水平的2个样本，用校准品基质液进行多点稀释，利用实施例2所述的方法对稀释后样本进行浓度测定，然后再根据稀释比例分别计算2个样本的回收率，结果分别如表3和4所示。

表3

表4

从表3和表4可知，用不同水平的2例E2样本进行多点稀释后，回收率均在90％～110％范围内，说明实测值与真实值接近，所述试剂盒的检测误差小。

实施例5：

利用实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E2作为竞争抗原)对E2样本进行检测，检测结果与同类进口试剂盒检测结果进行比较，结果分别如图2所示。

从图2可知，本发明所述试剂盒对E2样本测值与同类进口试剂盒测值相关性r＝0.9888，相关性良好。说明采用本发明所述试剂盒能准确检测出样本中雌二醇激素的含量。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体与所述第一受体微球的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～10):1。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物与所述第二组合物单独分散在同一种缓冲液中。

7.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。

9.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径不同。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述竞争抗原为雌二醇和/或雌二醇类似物；优选地，所述竞争抗原为雌二醇类似物；进一步优选地，所述雌二醇类似物为雌三醇；更进一步优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员结合。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括第四组合物，其包括释放剂；优选地，所述释放剂选自二氢睾酮、美睾酮、达那唑和己烯雌酚中的一种或多种。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括已知雌二醇浓度的系列校准品溶液；优选地，所述系列校准品溶液中雌二醇的浓度为0-4800ng/L。

13.一种如权利要求1-12中任意一项所述的试剂盒在雌二醇检测中的应用。