CN113125731A - 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用 - Google Patents

一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113125731A
CN113125731A CN201911411897.6A CN201911411897A CN113125731A CN 113125731 A CN113125731 A CN 113125731A CN 201911411897 A CN201911411897 A CN 201911411897A CN 113125731 A CN113125731 A CN 113125731A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
receptor
kit
composition
analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911411897.6A
Other languages
English (en)
Inventor
强中华
范树芹
徐静心
李临
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kemei Boyang Diagnostic Technology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Chemclin Diagnostics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemclin Diagnostics Corp filed Critical Chemclin Diagnostics Corp
Priority to CN201911411897.6A priority Critical patent/CN113125731A/zh
Publication of CN113125731A publication Critical patent/CN113125731A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种竞争性均相化学发光测定试剂盒，其包括：第一组合物，其包含第一受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体；第二组合物，其包含第二受体以及与之结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体，所述受体能够与单线态氧作用产生化学发光；所述第三组合物，其包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原，所述第一抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力高于所述第二抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力；同时，所述第一抗体或其结合片段与第一受体的质量比低于所述第二抗体或其结合片段与第二受体的质量比。

Description

一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于均相化学发光技术领域，具体涉及一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用。
背景技术
竞争性免疫分析是一种用于小分子半抗原定量分析的检测方法。放射免疫分析(RIA)是最早建立的竞争性免疫分析方法，并荣获1974年度诺贝尔生理医学奖。在放射性免疫分析中，含有放射性核素标记的竞争抗原(标记抗原)和限量的特异性抗体，标本中待检抗原和作为试剂的标记抗原，分别竞争性与特异性抗体结合。分离结合标记物(B)和游离标记物(F)，并测定结合标记物的放射活性(或强度，单位每分钟计数，CPM)，放射活性与待检抗原呈反比例函数关系。采用系列已知浓度校准品，获得校准品的数学函数关系(校准函数，可简单理解为校准曲线)。未知标本按照校准品的同样条件操作，测定放射活性，再通过标准函数获得待测标本的浓度值。
在竞争性免疫分析中，竞争抗原的用量直接关乎竞争性免疫分析的功能灵敏度。此外，在竞争性免疫分析中，选择合适特异性抗体和使用浓度同样至关重要。化学发光分析具有很好分析性能，分析特异性、分析灵敏度、自动化操作等较好满足临床要求。但是，针对某些特殊指标如甾体类激素，对功能灵敏度和检测范围均有很高的要求，而现有化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、光激化学发光免疫分析等尚存在缺陷，不能有效兼顾功能灵敏度和分析范围的特殊要求。因此，亟需一种化学发光检测技术，其能兼顾功能灵敏度和分析范围的要求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种竞争性均相化学发光测定试剂盒，利用该试剂盒进行检测时，同时具有优异的功能灵敏度和检测范围。
为此，本发明第一方面提供了一种竞争性均相化学发光测定试剂盒，其包括第一组合物、第二组合物和第三组合物，所述第一组合物包含第一受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体；所述第二组合物包含第二受体以及与之结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体，所述受体能够与单线态氧作用产生化学发光；所述第三组合物包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原；
所述第一抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力高于所述第二抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力；同时，
所述第一抗体或其结合片段与第一受体的质量比低于所述第二抗体或其结合片段与第二受体的质量比。
在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体或其结合片段与所述第一受体的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。
在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～10):1。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物单独分散在同一种缓冲液中。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述第一受体和第二受体均为含有高分子聚合物载体的受体微球，且第一受体微球的平均粒径与第二受体微球的平均粒径相同。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。
在本发明的一些实施方式中，所述被分析物为小分子抗原或半抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述竞争抗原为被分析物或被分析物类似物；优选为被分析物类似物；更优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员结合。
本发明第二方面提供了一种如发明第一方面所述试剂盒在化学发光分析仪中的应用。
本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒通过选用不同亲合力的抗体分别以不同质量比偶联受体微球，再以适当比例混合两种受体微球，实现两种不同亲合力抗体视待检抗原浓度差异选择性发挥作用，在保障功能灵敏度的同时，拓宽检测范围，且所述试剂盒隶属均相免疫分析，全程没有分离洗涤过程，不仅节省检测时间，而且回避洗涤所致误差，具备较高的精密度和准确度。此外，为了进一步提高功能灵敏度，选择与被分析物结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，确保被分析物能够优先结合特异性抗体。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明所述方法的检测原理图；其中，附图标记的含义如下：1第一受体微球以及与之结合的第一抗体，第一受体微球表面包被少量高亲和力的第一抗体，但第一受体微球浓度较高，确保检测低浓度E2样本时，第一受体微球优先发挥作用；2第二受体微球以及与之结合的第二抗体，第二受体微球表面包被较多低亲和力的第二抗体，但第二受体微球浓度较低，确保检测高浓度E2样本时，第二受体微球优先发挥作用；3与生物素结合的E2；4待测的E2(雌二醇)。
图2为实施例5中E2样本测值与对比试剂盒测值相关性图，其中n＝133。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“供体微球”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体微球反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体微球可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体微球为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。
本发明所述用语“受体微球”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体微球被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体微球俘获，从而传递能量以激活所述受体微球。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体微球包含发光组合物和基质，所述发光组合物填充于基质中和/或包被于基质表面。本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。
本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。
本发明所述用语“表位”是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。针对蛋白质而言，抗原表位是一段特定氨基酸序列(线性表位)，也可以是几段特定氨基酸序列构成的空间构象(构象表位)。抗原表位不仅是抗体结合最小结构和功能单位，同时也是淋巴细胞(B细胞)抗原受体识别的基本单位。
本发明所述用语“单克隆抗体”是指采用杂交瘤融合技术制备的、针对单一抗原表位、具备单一特异性、结构和功能完全均一的抗体。首先，单克隆抗体具备单一特异性，杜绝交叉反应，提高标记免疫分析特异性。其次，单克隆抗体确保持续供应，且较小批间差异，有效降低免疫诊断试剂盒的批间差异。再次，不同单克隆抗体识别抗原位点不同，显示不同亲合力特征。
本发明所述用语“差异性受体微球”特指用不同亲合力单克隆抗体偶联的受体微球(FG)。
本发明所述用语“功能灵敏度”指最低检测线，即将已知浓度标本倍比稀释后，分析方法所能检测到的最低含量，且批内精密度不能大于20％。分析灵敏灵敏度是真实测定获得，也称为“功能灵敏灵敏度”。
本发明所述用语“检测范围”，是指剂量函数的有效范围，如将高浓度标本倍比稀释，所用稀释标本测定结果做线性回归分析，相关系数(R)大于0.990。
Ⅱ.具体实施方案
下面将详细说明本发明。
关于竞争性免疫分析，欲获得优质竞争性校准函数(可简单理解为校准曲线)，其需满足两个基本条件：其一，竞争抗原和待检抗原同源，与特异性抗体具有相同或类似的亲合力；其二，确保抗体限量原则，特异性抗体用量需要小于两种抗原所需抗体的累计用量，但必须大于竞争抗原或待检抗原所需抗体累计用量。本发明基于光激化学发光技术，获得光激化学方法定量检测被分析物含量的竞争性均相化学发光测定试剂盒，该试剂盒的分析性能指标能够满足行业标准或临床实验室的基本要求。主要表现在：选用针对分析物的两个亲和力不同的抗体分别偶联受体微球，可以提高高端样本以及低端样本的测值符合性。此外，通过选择与被分析物结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，确保待测的被分析物能够优先结合特异性抗体，进一步提高功能灵敏度。
因此，本发明第一方面所涉及的竞争性均相化学发光测定试剂盒，其包括第一组合物、第二组合物和第三组合物，所述第一组合物包含第一受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体；所述第二组合物包含第二受体以及与之结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体，所述受体能够与单线态氧作用产生化学发光；所述第三组合物包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原；
所述第一抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力高于所述第二抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力；同时，
所述第一抗体或其结合片段与第一受体的质量比低于所述第二抗体或其结合片段与第二受体的质量比。也即所述第一抗体或其结合片段在所述第一受体上的偶联量低于所述第二抗体或其结合片段在所述第二受体上的偶联量。
本发明中，所述受体能够经由第一抗体或其结合片段和/或所述第二抗体或其结合片段结合所述被分析物。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗体和第二抗体均为与被分析物特异性结合的单克隆抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体或其结合片段与所述第一受体的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。在本发明的一些具体实施方式中，所述第一抗体或其结合片段与所述第一受体的质量比为1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900或1:1000等。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。本发明中，所述浓度既可以是质量浓度也可以是摩尔浓度。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～10):1。在本发明的一些具体实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为2:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1或50:1等。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。
在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物单独分散在同一种缓冲液中。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂(即试剂1)。
在本发明的一些实施方式中，所述第一受体和第二受体均为含有高分子聚合物载体的受体微球，且第一受体微球的平均粒径与第二受体微球的平均粒径相同。值得注意的是：本发明所述“受体”不止包含高分子聚合物微球，也可以包含如磁颗粒等的微球。
在本发明的另一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。
在本发明的一些实施方式中，所述被分析物为小分子抗原或半抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述竞争抗原为被分析物或被分析物类似物；优选为被分析物类似物；更优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员(例如生物素)结合。本发明中，所述被分析物类似物与检测抗体的特异性结合能力低于被分析物与检测抗体的特异性结合能力，也即优选地，竞争抗原与检测抗体的特异性结合能力低于待测抗原与检测抗体的特异性结合能力，这样可以进行一步提高功能灵敏度。本发明中，包含第三组合物的试剂又称为试剂2。
在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒中还包括已知被分析物浓度的列校准品溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括第四组合物，其包括供体微球，所述供体微球与特异性配对成员中的另一员(例如亲和素)结合。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括释放剂；优选地，所述释放剂选自二氢睾酮、美睾酮、达那唑和己烯雌酚中的一种或多种。
针对两种极端样本，第一抗体偶联的第一受体微球和第二抗体偶联的第二受体微球发挥作用方式不同：针对低浓度待测样本，待检抗原结合微球表面的抗体依赖于受体微球的浓度，即第一抗体偶联的第一受体微球的浓度高，此种微球占优势；针对高浓度待测样本，待检抗原结合微球表面的抗体不再依赖于微球的浓度，而是依赖于微球表面抗体的分子数量，虽然第二抗体偶联的受体微球浓度低，但是微球表面抗体分子数量多，高浓度待检抗原需要更多抗体分子，此时第二抗体偶联的第二受体微球起决定作用。
基于上述分析，本发明采用不同亲和力抗体，分别以不同方式(偶联质量比和/或偶联方式)制备差异性受体微球。将差异性受体微球按一定比例混合作为单一溶液(试剂1)，此种溶液中的两种性质不同的受体微球，利用微球液相扩散原理和单克隆抗体亲和力差异，可以实现根据样本中待检抗原的浓度差异选择性发挥作用，满足临床对功能灵敏度和检测范围的特殊要求。
此外，通过选择与被分析物结构相似的类似物作为竞争抗原标记生物素，竞争抗原与受体微球上的检测抗体的结合能力低于被分析物与受体微球上的检测抗体的结合能力，因此可以确保待测的被分析物能够优先结合检测抗体，进一步提高功能灵敏度。
在本发明的一些实施方式中，利用所述试剂盒对被分析物进行检测的方法包括：
步骤N1，将待测样本、试剂1、试剂2混合后，获得第一混合物；
步骤N2，将与亲和素结合的供体微球溶液与第一混合物混合后，获得第二混合物；
步骤N3，利用能量或者活性化合物激发第二混合物中的供体微球生成活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成化学发光信号；
步骤N4，检测步骤N3中所述化学发光信号的强度，分析待测样本中是否存在被分析物和/或被分析物的浓度。
本发明所述方法中，所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是10-50min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃；温育的时间可以选自10min、20min、30min、35min、40min、45min或50min。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括，利用已知被分析物浓度的系列校准品溶液制作化学发光信号-被分析物浓度的标准曲线的步骤；所述标准曲线用于确定待测样本中被分析物的含量。
在本发明的另一些实施方式中，步骤N3中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发第二混合物中的供微球产生活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成520-620nm的发射光。
将待测的血清样本、试剂1、试剂2混合温育，血清样本中的待测抗原和Bio-竞争抗原，竞争性与受体微球上的检测抗体(FG-Ab)结合，分别形成复合物(FG-Ab-竞争抗原-Bio，FG-Ab-待测抗原)，随后SA-GG(与亲和素结合的供体微球)与生物素(Bio)结合，受体微球和供体微球相互靠近，激发后诱导光信号产生。游离的受体微粒不能获得能量，无光信号的产生。由于本发明采用竞争性分析模式，光信号强度与待测血清样本中待测抗原含量呈反比例函数关系，通过已知浓度被分析物校准品所形成的数学函数，便可计算未知血清标本待测抗原浓度水平。
本发明第二方面提供了一种如发明第一方面所述试剂盒在化学发光分析仪中的应用。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：针对被分析物为雌二醇(E2)的本发明所述试剂盒的制备
(1)单克隆抗体偶联受体微球溶液(试剂1)的制备过程
受体微球：微球表面含有醛基(-CHO)，通过醛基与抗体分子连接。内含有发光化合物(二甲基噻吩的衍生物)及镧系元素(Eu)化合物的螯合物。
生物原料：与E2特异性结合的亲和力高的单克隆抗体(即，HA-McAb)和与E2特异性结合的亲和力低的单克隆抗体(即，LA-McAb)。
制备过程：制备过程：
1)与E2特异性结合的亲和力高的单克隆抗体(即，HA-McAb)用碳酸盐缓冲液透析过夜，与受体微球(FG)混合，抗体和微球混合的质量比为1:400，包被2小时，加入封闭液，封闭1小时，制成含FG-HA-McAb-n的浓溶液备用；
2)与E2特异性结合的亲和力低的单克隆抗体(即，LA-McAb)用碳酸盐缓冲液透析过夜，与受体微球(FG)混合，抗体和微球混合的质量比为1:80，包被2小时，加入封闭液，封闭1小时，制成含FG-HA-McAb-N的浓溶液备用；
3)用试剂1稀释液将FG-HA-McAb-n按照1:200稀释，编号为R1-1；用试剂1稀释液将FG-LA-McAb-N按照1:500稀释，编号为R1-2；
4)将R1-1和R1-2两种溶液等体积混合，即获得试剂1。
(2)与生物素结合的竞争抗原(试剂2)的制备过程
用试剂2稀释液将1ug/ml的Bio-E2按照1:10000稀释，配制成R2工作液即作为试剂2。
也可用试剂2稀释液浆1ug/ml的Bio-E3按照1:8000稀释，配制成R2工作液即作为试剂2。
(3)释放剂的制备
取美睾酮纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成100ng/L。
(4)已知浓度E2系列校准品的制备过程
取E2纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0～4800ng/L的系列校准品溶液各0.5ml。
实施例2：
利用实施例1中的方法，分别改变抗体类型、偶联的质量比、竞争抗原类型等条件，利用LiCA500自动光激化学发光分析系统检测同一批样本，自动完成并输出均相化学发光信号，分析检测结果的检出范围和检出限。
使用实施例1制备的试剂盒进行检测的过程由LiCA500自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果，具体步骤为：
a.在反应孔中分别加入10μl样本、校准品或质控品；
b.在反应孔中依次加入25μl释放剂、25μl试剂1和25μl试剂2；
c.37℃温育15分钟；
d.加入LiCA通用液(与亲和素结合的供体微球溶液)175μl；
e.37℃温育15分钟；
e.激光照射微孔并计算每孔发光光子量；
f.根据校准曲线，计算样品浓度。结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002350192950000111
从表1可知，两种亲和力抗体偶联受体微球的结果都是抗体与受体微球的质量比越低的检测结果越好。当仅使用高亲和力抗体(HA-McAb)偶联的受体微球检测时，线性范围低值和检出限优于仅使用低亲和力抗体(LA-McAb)偶联的受体微球，可以达到10～20ng/L；但是低亲和力抗体(LA-McAb)偶联的受体微球的线性范围上限优于高亲和力抗体(HA-McAb)偶联的受体微球，可以达到5000ng/L以上。当将合适偶联质量比的高亲和力抗体受体微球和低亲和力抗体受体微球按照1:200和1:500等体积混合后，可以使线性范围上、下限和检出限都达到最优的结果。另外，采用Bio-E3抗原作为竞争抗原，由于其竞争能力弱于Bio-E2抗原，更有利于样本中的E2与检测抗体结合，所以采用Bio-E3抗原作为竞争抗原进行检测的功能灵敏度(检出限)都略好于用Bio-E2抗原作为竞争抗原的结果。
实施例3：
检验实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E2作为竞争抗原)的精密度。
精密度意义：精密度是衡量试剂盒批内和批间变异的重要指标，是评价拟上市产品有效性的重要依据，通常包括批内精密度和批间精密度。
批内精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本对1个批次的产品进行独立分析，对每个批次重复测定10次，计算10次测量结果的平均值
Figure BDA0002350192950000121
和标准差(SD)，根据公式
Figure BDA0002350192950000122
计算变异系数(CV)，结果如表1所示。
批间精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本，对3个批次的产品进行独立分析，对每个批次重复测定20次，计算测量结果的平均值
Figure BDA0002350192950000123
和标准差(SD)，根据公式
Figure BDA0002350192950000124
计算变异系数(CV)，结果如表2所示。
表2：测试结果
Figure BDA0002350192950000125
Figure BDA0002350192950000131
从表2可知，三批试剂批内和批间精密度均<10％，说明所述试剂盒的测值重复性好，随机误差小。
实施例4：
检验实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E2作为竞争抗原)的准确度的检测
准确度意义：实测值与真实值的相符程度，反应系统误差的大小。
准确度评估方法：将含不同E2水平的2个样本，用校准品基质液进行多点稀释，利用实施例2所述的方法对稀释后样本进行浓度测定，然后再根据稀释比例分别计算2个样本的回收率，结果分别如表3和4所示。
表3
Figure BDA0002350192950000132
表4
Figure BDA0002350192950000133
从表3和表4可知，用不同水平的2例E2样本进行多点稀释后，回收率均在90％～110％范围内，说明实测值与真实值接近，所述试剂盒的检测误差小。
实施例5：
利用实施例2中的试验编号7中所使用的试剂盒(其中采用Bio-E3作为竞争抗原)对E2样本进行检测，检测结果与同类进口试剂盒检测结果进行比较，结果分别如图2所示。
从图2可知，本发明所述试剂盒对E2样本测值与同类进口试剂盒测值相关性r＝0.9888，相关性良好。说明采用本发明所述试剂盒能准确检测出样本中雌二醇激素的含量。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (12)

1.一种竞争性均相化学发光测定试剂盒，其包括第一组合物、第二组合物和第三组合物，所述第一组合物包含第一受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体；所述第二组合物包含第二受体以及与之结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段是特异性结合被分析物的检测抗体，所述受体能够与单线态氧作用产生化学发光；所述第三组合物包含与雌二醇竞争结合所述检测抗体的竞争抗原；其特征在于，
所述第一抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力高于所述第二抗体或其结合片段与被分析物特异性结合的亲和力；同时，
所述第一抗体或其结合片段与第一受体的质量比低于所述第二抗体或其结合片段与第二受体的质量比。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体或其结合片段与所述第一受体的质量比选自1:(100～1000)，优选选自1:(200～800)，更优选选自1:(300～600)。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的浓度高于所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为(2～50):1，优选为(2～25):1，更优选为(2～10):1。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物与所述第二组合物单独分散在同一种缓冲液中。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组合物与所述第二组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体和第二受体均为含有高分子聚合物载体的受体微球，且第一受体微球的平均粒径与第二受体微球的平均粒径相同。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述被分析物为小分子抗原或半抗原。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述竞争抗原为被分析物或被分析物类似物；优选为被分析物类似物；更优选地，所述竞争抗原与特异性结合配对成员中的一员结合。
12.一种如权利要求1-11中任意一项所述试剂盒在化学发光分析仪中的应用。
CN201911411897.6A 2019-12-31 2019-12-31 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用 Pending CN113125731A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911411897.6A CN113125731A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911411897.6A CN113125731A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113125731A true CN113125731A (zh) 2021-07-16

Family

ID=76770185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911411897.6A Pending CN113125731A (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113125731A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113125696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 科美诊断技术股份有限公司 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用
CN114778833A (zh) * 2022-06-22 2022-07-22 北京芯迈微生物技术有限公司 基于竞争性免疫分析的定量检测试剂盒及方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113125696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 科美诊断技术股份有限公司 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用
CN113125696B (zh) * 2019-12-31 2024-03-26 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用
CN114778833A (zh) * 2022-06-22 2022-07-22 北京芯迈微生物技术有限公司 基于竞争性免疫分析的定量检测试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108051585B (zh) 一种均相免疫检测试剂盒、检测方法及其应用
RU2559581C2 (ru) Иммунологические исследования с использованием недисперсного хемилюминесцентного реактива
CN101201354B (zh) 甲状腺素化学发光免疫分析定量测定试剂盒及制备方法
CN109709317B (zh) 一种无基质效应的均相免疫检测试剂盒及其分析方法和应用
CN113125696B (zh) 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用
CN108169497A (zh) 人泌乳素检测试剂盒及其制备方法与应用
WO2009026168A1 (en) Anti-antibody reagent
CN108445239B (zh) 检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装及其制备方法和应用
CN108445216B (zh) 一种人抗缪勒氏管激素测定试剂盒及其制备方法与应用
CN113125731A (zh) 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用
CN113125697B (zh) 一种睾酮均相化学发光检测试剂盒及其应用
US8900882B2 (en) Method of assaying complex and kit to be used therefor
CN113125704A (zh) 一种均相化学发光测定试剂盒及其应用
CN113125706A (zh) 一种竞争性均相化学发光测定试剂盒及其应用
CN110618280A (zh) 一种促甲状腺素测定试剂盒及其制备方法
CN111665235A (zh) 一种化学发光微阵列芯片及其应用
CN111665237A (zh) 一种均相化学发光检测方法及其应用
CN113125415A (zh) 一种竞争性均相化学发光检测方法及其应用
CN108918888A (zh) 一种检测内皮抑素的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用
CN114354919A (zh) 检测14-3-3 eta蛋白的均相免疫检测试剂盒及其应用
CN113125418A (zh) 一种均相化学发光检测方法及其应用
CN113125416A (zh) 一种竞争性均相化学发光检测方法及其应用
JP4556605B2 (ja) 標的物質の測定方法および測定試薬
CN111665236A (zh) 一种发光微阵列芯片的制备方法及其应用
CN113125699B (zh) 一种β-hCG均相化学发光检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20231110

Address after: 201203, 3rd and 5th floors of Building 1, No. 88 Cailun Road, Pudong New Area Free Trade Pilot Zone, Shanghai

Applicant after: Kemei Boyang diagnostic technology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 100094 1st and 6th floors of incubation building, Beike modern manufacturing park, No.7 Fengxian Middle Road, Yongfeng base, Haidian District, Beijing

Applicant before: Kemei Diagnostic Technology Co.,Ltd.