CN113125697B

CN113125697B - 一种睾酮均相化学发光检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113125697B
Application number: CN201911405819.5A
Authority: CN
Inventors: 范树芹; 李临
Original assignee: Kemei Boyang Diagnostic Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Kemei Boyang Diagnostic Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN113125697A

Abstract

本发明涉及一种睾酮均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：第一组合物，其包含与睾酮特异性结合的检测抗体；第二组合物，其包含第一受体微球以及与之结合的第一抗原，所述第一抗原与睾酮竞争结合所述检测抗体；第三组合物，其包含第二受体微球以及与之结合的第二抗原，所述第二抗原与睾酮竞争结合所述检测抗体；所述第一抗原与所述检测抗体特异性结合的亲和力高于所述第二抗原与所述检测抗体特异性结合的亲和力；同时，所述第一抗原与第一受体微球的质量比高于所述第二抗原与第二受体微球的质量比。利用本发明所述试剂盒对睾酮进行检测时既有较高的功能灵敏度又有较宽的检测范围。

Description

一种睾酮均相化学发光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于均相检测技术领域，具体涉及一种睾酮均相化学发光检测试剂盒及其应用。

背景技术

睾酮(testosterone,T)是体内最主要的雄性激素，血中的睾酮98％以结合形式存在，仅2％以游离形式存在。血清睾酮以3种形式存在：游离睾酮、弱结合睾酮(与清蛋白结合)以及紧密结合睾酮(与性激素结合球蛋白结合)。游离的睾酮才具有生物活性。男性睾酮几乎全部在睾丸间质细胞线粒体内合成。女性的卵巢可产生少量睾酮，其大部分来源于肾上腺皮质。检测男性体内睾酮含量可用于诊断睾酮产生不足的疾病，如性功能减退症、雌激素治疗、染色体异常(如Klinefelter综合征)等。许多严重的疾病(如肝、肾、心血管疾病)以及紧张、麻醉、某些药物都可引起睾酮水平降低。雄激素升高可引起女性男性化，检测女性体内睾酮含量有助于诊断雄激素综合征(AGS)、多囊卵巢综合症(PCOS)。血中的睾酮水平可有生理性波动和差异。

睾酮是小分子半抗原，单一抗原表位，需采用双抗原竞争性免疫分析模式，即待检睾酮和标记睾酮竞争限量抗体。目前现有的用于准确定量分析血清中睾酮的方法均属于非均相免疫分析。由于非均相免疫分析每次洗涤过程需要消耗时间，也必然由于洗涤分离带来“误差”。据文献报道，洗涤误差是非均相免疫分析误差的重要来源，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和灵敏度。此外，睾酮为小分子物质，如标记酶分子会对其免疫活性(结合抗体能力)产生影响。同时，竞争法要求两个抗原(待检抗原和标记抗原)对抗体的竞争能力相同或相似，才能形成均衡竞争方式。小分子睾酮与大分子酶结合，会造成空间位阻，影响与抗体分子的结合。

在竞争性免疫分析中，竞争抗原的用量直接关乎竞争性免疫分析的功能灵敏度。此外，在竞争性免疫分析中，选择合适特异性抗体和使用浓度同样至关重要。化学发光分析具有很好分析性能，分析特异性、分析灵敏度、自动化操作等较好满足临床要求。但是，针对睾酮的检测，对功能灵敏度和检测范围均有很高的要求，而现有化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、光激化学发光免疫分析等尚存在缺陷，不能有效兼顾功能灵敏度和分析范围的特殊要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种睾酮均相化学发光检测试剂盒，利用该试剂盒检测睾酮时，同时具有优异的功能灵敏度和检测范围。

为此，本发明第一方面提供了一种睾酮均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

第一组合物，其包含与睾酮特异性结合的检测抗体；

第二组合物，其包含第一受体微球以及与之结合的第一抗原，所述第一抗原与睾酮竞争结合所述检测抗体；

第三组合物，其包含第二受体微球以及与之结合的第二抗原，所述第二抗原与睾酮竞争结合所述检测抗体；

所述第一抗原与所述检测抗体特异性结合的亲和力高于所述第二抗原与所述检测抗体特异性结合的亲和力；同时，

所述第一抗原与第一受体微球的质量比高于所述第二抗原与第二受体微球的质量比。

在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与第二受体微球的质量比为1:(10～200)，优选为1:(50～150)，更优选为1:(80～120)。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一抗原与第一受体微球的质量比为1:(1～20)，优选为1:(5～15)，更优选为1:(8～12)。

在本发明的一些实施方式中，所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度低于所述第三组合物在所述试剂盒中的浓度。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为1:(10～100)，优选为1:(20～80)，更优选为1:(40～60)。

在本发明的一些具体实施方式中，所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml，优选为10～250ug/ml，更优选为15～200ug/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述第二组合物和所述第三组合物单独分散在同一种缓冲液中。

在本发明的另一些实施方式中，所述第二组合物和所述第三组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径不同。

在本发明的一些实施方式中，所述第一抗原和第二抗原为睾酮和/或睾酮类似物；优选地，所述第一抗原为睾酮，所述第二抗原为睾酮类似物；进一步优选地，所述睾酮类似物为二氢睾酮。

在本发明的另一些实施方式中，所述检测抗体与特异性结合配对成员中的一员结合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括释放剂，所述释放剂包括二甲氧基雌二醇。

在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒还包括已知睾酮浓度的系列校准品溶液；优选地，所述系列校准品溶液中睾酮的浓度为0-1600ng/dL。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒在睾酮检测中的应用。

本发明的有益效果为：本发明所述试剂盒通过选用与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原以不同质量比偶联受体微球，再以适当比例混合两种受体微球，实现两种与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原视待检抗原浓度差异选择性发挥作用，在保障功能灵敏度的同时，拓宽检测范围防止钩状效应的发生，且所述试剂盒隶属均相免疫分析，全程没有分离洗涤过程，不仅节省检测时间，而且回避洗涤所致误差，具备较高的精密度和准确度。此外，为了进一步提高功能灵敏度，选择与睾酮结构相似的类似物作为其中的一种竞争抗原，确保待检睾酮能够优先结合检测抗体。

附图说明

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

图1为本发明所述试剂盒的检测原理图；其中，附图标记的含义如下：1第二受体微球以及与之结合的第二抗原，第二受体微球表面包被少量与检测抗体亲和力低的第二抗原，但第二受体微球浓度较高，确保检测低浓度睾酮样本时，第二受体微球发挥优势作用；2第一受体微球以及与之结合的第一抗原，第一受体微球表面包被较多与检测抗体亲和力高的第一抗原，但第一受体微球浓度较低，确保检测高浓度睾酮样本时，第一受体微球上的第一抗原发挥优势作用；3与生物素结合的检测抗体，所述检测抗体能与睾酮特异性结合；4待测的睾酮。

图2为采用R1-1为试剂1的试剂盒的测值与贝克曼测值的相关性图。

图3为采用R1-2为试剂1的试剂盒的测值与贝克曼测值的相关性图。

图4为采用R1-3为试剂1的试剂盒的测值与贝克曼测值的相关性图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。

本发明所述用语“供体微球”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体微球反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体微球可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体微球为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。

本发明所述用语“受体微球”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的化合物。供体微球被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体微球俘获，从而传递能量以激活所述受体微球。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体微球包含发光组合物和基质，所述发光组合物填充于基质中和/或包被于基质表面。本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。

本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。

本发明所述用语“表位”是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。针对蛋白质而言，抗原表位是一段特定氨基酸序列(线性表位)，也可以是几段特定氨基酸序列构成的空间构象(构象表位)。抗原表位不仅是抗体结合最小结构和功能单位，同时也是淋巴细胞(B细胞)抗原受体识别的基本单位。

本发明所述用语“单克隆抗体”是指采用杂交瘤融合技术制备的、针对单一抗原表位、具备单一特异性、结构和功能完全均一的抗体。首先，单克隆抗体具备单一特异性，杜绝交叉反应，提高标记免疫分析特异性。其次，单克隆抗体确保持续供应，且较小批间差异，有效降低免疫诊断试剂盒的批间差异。再次，不同单克隆抗体识别抗原位点不同，显示不同亲合力特征。

本发明所述用语“差异性受体微球”特指用与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原偶联的受体微球(FG)。

本发明所述用语“功能灵敏度”指最低检测线，即将已知浓度标本倍比稀释后，分析方法所能检测到的最低含量，且批内精密度不能大于20％。分析灵敏度是真实测定获得，也称为“功能灵敏度”。

本发明所述用语“检测范围”，是指剂量函数的有效范围，如将高浓度标本倍比稀释，所用稀释标本测定结果做线性回归分析，相关系数(R)大于0.990。

Ⅱ.具体实施方案

下面将详细说明本发明。

关于竞争性免疫分析，欲获得优质竞争性校准函数(可简单理解为校准曲线)，其需满足两个基本条件：其一，竞争抗原和待检抗原同源，与检测抗体具有相同或类似的亲合力；其二，确保抗体限量原则，检测抗体用量需要小于两种抗原所需抗体的累计用量，但必须大于竞争抗原或待检抗原所需抗体累计用量。本发明基于光激化学发光技术，获得光激化学方法定量检测血清睾酮水平的均相化学发光检测试剂盒，该试剂盒的分析性能指标能够满足行业标准或临床实验室的基本要求。主要表现在：选用两个与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原分别偶联受体微球，可以提高高端样本以及低端样本的测值符合性。此外，通过选择与睾酮结构相似的类似物作为其中的一种竞争抗原标记生物素，确保在低端样本检测时待测的睾酮能够优先结合检测抗体，进一步提高功能灵敏度。

本发明第一方面所涉及的睾酮均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

第一组合物，其包含与睾酮特异性结合的检测抗体；

所述第一抗原与第一受体微球的质量比高于所述第二抗原与第二受体微球的质量比。也即所述第一抗原在所述第一受体微球上的偶联量高于所述第二抗原在所述第二受体微球上的偶联量。

在本发明的一些具体实施方式中，所述检测抗体为与睾酮特异性结合的单克隆抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述第二抗原与第二受体微球的质量比为1:(10～200)，优选为1:(50～150)，更优选为1:(80～120)。在本发明的一些具体实施方式中，第二抗原与第二微球的质量比为1:10、1:30、1:50、1:80、1:100、1:120、1:150、1:180或1:200等。

在本发明的另一些实施方式中，所述第一抗原与第一受体微球的质量比为1:(1～20)，优选为1:(5～15)，更优选为1:(8～12)。在本发明的一些具体实施方式中，第二抗原与第二微球的质量比为1:1、1:3、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18或1:20等。

在本发明的一些实施方式中，所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度低于所述第三组合物在所述试剂盒中的浓度。在本发明中，所述浓度既可以为质量浓度也可以为摩尔浓度。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为1:(10～100)，优选为1:(20～80)，更优选为1:(40～60)。在本发明的一些具体实施方式中，所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度比可以为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100等。

在本发明的另一些实施方式中，所述第二组合物和所述第三组合物合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂(即试剂1)。

在本发明的一些实施方式中，所述第一抗原和第二抗原为睾酮和/或睾酮类似物；优选地，所述第一抗原为睾酮，所述第二抗原为睾酮类似物；进一步优选地，所述睾酮类似物为二氢睾酮。本发明中，二氢睾酮与检测抗体的特异性结合的亲和力低于睾酮与检测抗体的特异性结合的亲和力。

在本发明的另一些实施方式中，所述检测抗体与特异性结合配对成员中的一员(例如生物素)结合。本发明，包括第一组合物的试剂又称为试剂2。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括释放剂，所述释放剂包括二甲氧基雌二醇。在本发明的一些具体实施方式中，所述释放剂成分为：40ng/ml的二甲氧基雌二醇，其利用50mM HEPES pH6.0稀释配制。利用释放剂可以将待检样本中与蛋白结合的睾酮释放出来。本发明，包含释放剂的试剂又称为试剂3。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括第四组合物，其包括与特异性结合配对成员中的另一员(例如亲和素)特异性结合的供体微球。

本发明所述试剂盒中两种受体微球智能发挥作用的原理如下：

针对低浓度睾酮标本(女性标本)，待检睾酮分子少，待检睾酮不容易结合检测抗体。在试剂1中，与第二抗原结合的第二受体微球数量占优势，与检测抗体(Bio-McAb)结合的机会远远高于与第一抗原结合的第一受体微球，即微球浓度高的第二受体微球占优势。第二受体微球表面的第二抗原分子数量少，与检测抗体的亲合力低于标本中待检睾酮分子。此时确保待检睾酮有更强能力结合检测抗体，从而获得较好功能灵敏度。

针对高浓度睾酮标本(男性标本)，待检睾酮分子多，待检睾酮容易结合同为液相中的检测抗体。在试剂1中，虽然与第二抗原结合的第二受体微球数占优势，与检测抗体(Bio-McAb)结合的机会远高于与第一抗原结合的第一受体微球，但由于第二受体微球表面的第二抗原分子数量较少，此时微球数量对竞争性反应的贡献并不明显。相反第一受体微球数量少，但是微球表面的第一抗原分子数量多，与抗体亲合力与标本中待检睾酮分子相同，第一抗原结合抗体强度能与高浓度待检睾酮平衡，从而获得理想的检测范围。

在本发明的一些实施方式中，利用所述试剂盒对睾酮进行检测的方法包括：

步骤N1，将待测样本、试剂1、试剂2以及任选的试剂3混合后，获得第一混合物；

步骤N2，将与亲和素结合的供体微球溶液与第一混合物混合后，获得第二混合物；

步骤N3，利用能量或者活性化合物激发第二混合物中的供体微球生成活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成化学发光信号；

步骤N4，检测步骤N3中所述化学发光信号的强度，分析待测样本中是否存在睾酮和/或睾酮的浓度。

本发明所述方法中，所述试剂混合后均可以根据需要进行温育。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是10-50min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃；温育的时间可以选自10min、20min、30min、35min、40min、45min或50min。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括，利用已知睾酮浓度的系列校准品溶液制作化学发光信号-睾酮浓度的标准曲线的步骤；所述标准曲线用于确定待测样本中睾酮的含量。

在本发明的另一些实施方式中，步骤N3中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发第二混合物中的供微球产生活性氧，然后受体微球与其接触到的活性氧反应生成520-620nm的发射光。

将待测的血清样本、试剂1、试剂2以及任选的试剂3(释放剂)混合温育，血清样本中的睾酮和与受体微球偶联的竞争抗原，竞争性与的检测抗体(Bio-McAb)结合，分别形成复合物(Bio-McAb-竞争抗原-FG、Bio-McAb-T-FG)，随后SA-GG(与亲和素结合的供体微球)与生物素(Bio)结合，受体微球和供体微球相互靠近，激发后诱导光信号产生。游离的受体微粒不能获得能量，无光信号的产生。由于本发明采用竞争性分析模式，光信号强度与待测血清样本中睾酮含量呈反比例函数关系，通过已知浓度睾酮校准品所形成的数学函数，便可计算未知血清标本睾酮浓度水平。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1：本发明所述试剂盒的制备

试剂和仪器：

与生物素结合的睾酮抗体，受体微球，BSA化的二氢睾酮(BSA-DHT)、BSA化的睾酮(BSA-T)、磷酸盐缓冲液(0.02M PBS，pH 7.2)，BSA，Tween-20，LiCA 500(北京科美生物技术有限公司)，日立高速冷冻离心机。

制备过程：

(1)竞争抗原偶联受体微球溶液(试剂1)的制备

1)两支2mL离心管中，分别取2mg受体微球，4℃离心10000rpm，15min，清洗一次。

2)超声分散均匀，向其中一个离心管中加入0.2mg BSA-T，另一支加入0.02mgBSA-DHT，充分混匀4℃包被过夜；

3)两支离心管分别加入20uL 10mg/mL的BSA封闭受体微球，室温旋转2h；

4)分别用含有0.5％Tween-20的PBS缓冲溶液将受体微球离心清洗三次，再用pH7.2、0.05M PBS溶液分别将两支离心管中的受体微球稀释至0.1mg/ml，分别标记为FG-NT(R1-1)和FG-nDHT(R1-2)并保存。

5)将R1-1与R1-2混合，使二者微球浓度混合比例为FG-NT:FG-nDHT＝1:50，标记为R1-3，作为试剂1。

(2)与生物素结合的检测抗体(试剂2)的制备

用试剂2的稀释液将与生物素结合的睾酮抗体稀释20000倍，至抗体浓度为0.05μg/ml，即作为试剂2。

(3)释放剂的制备

所述释放剂成分为：40ng/ml的二甲氧基雌二醇，其利用50mM HEPES pH6.0稀释配制。

(4)已知浓度T系列校准品的制备过程

将浓度为1mg/mL的睾酮溶液，加入马血清，配制校准品1～6，浓度分别为0ng/dl、50ng/dl、150ng/dl、400ng/dl、800ng/dl和1600ng/dl。

实施例2

分别利用实施例1制备的R1-1、R1-2、R1-3作为试剂1的试剂盒对含睾酮的样本进行检测，检测结果与贝克曼测值进行比较，结果分别如图2-4所示。

检测过程由LiCA500自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果，具体步骤为：

a.在反应孔中分别加入20μl样本、校准品或质控品；

b.在反应孔中依次加入20μl释放剂、25μl试剂1和25μl试剂2；

c.37℃温育15分钟；

d.加入LiCA通用液(与亲和素结合的供体微球溶液)175μl；

e.37℃温育15分钟；

e.激光照射微孔并计算每孔发光光子量；

f.根据校准曲线，计算样品浓度。

从图1-3可知，当竞争抗原使用FG-nDHT时，低值样本与贝克曼的相关性较好，但高值样本相关性较差；当竞争抗原使用FG-NT时，低值功能灵敏度(检出限)较差，但高值相关性较好；当竞争抗原将二者混合使用时，可以兼顾睾酮低值功能灵敏度和检测范围。从与贝克曼测值的相关性看，采用两种竞争抗原FG-nDHT和FG-NT混合使用时结果最好。

实施例3：精密度检测

批内精密度检测：使用本发明所述试剂盒、高中低样本进行精密度检测：每批试剂盒测10次，计算10次测量结果的平均值X和标准差SD，根据公式CV＝SD/X×100％得出变异系数CV。结果如表1和表3所示。

批间精密度检测：分别用三批本发明所述试剂盒检测高中低样本，各重复10次，计算30次测量结果的平均值X和标准差SD，根据公式CV＝SD/X×100％得出变异系数CV。结果如表2和表3所示。

表1：LiCA T试剂盒(光激化学发光法)批内精密度原始数据

表2：三批LiCA T试剂盒(光激化学发光法)批间精密度原始数据

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表3：本发明所述试剂盒(光激化学发光法)分析精密度

从表3可知，三批试剂盒批内和批间精密度均<2％，说明本发明所述试剂盒的测值重复性好，随机误差小。

实施例4：准确度检测

准确度意义：实测值与真实值的相符程度，反应系统误差的大小。

准确度评估方法：用浓度分别为0.40ng/mL、5.97ng/mL和8.15ng/mL的参考血清进行检测，根据公式1计算回收率，结果如表4所示。

B＝Xi/T×100％公式1

式中：B-回收率；X_i-样本的实测浓度；T-样本的靶值。

表4：本发明所述试剂盒(光激化学发光法)准确度

从表4可知，用不同浓度的样本进行检测后，回收率均在100％～110％范围内，说明实测值与真实值接近，本发明所述试剂盒的检测误差小。

实施例5：

利用实施例1中的方法，分别改变竞争抗原类型、偶联的质量比、受体微球浓度等条件，利用LiCA500自动光激化学发光分析系统检测同一批样本，自动完成并输出均相化学发光信号，分析检测结果的检出范围和检出限。结果如表5所示。

表5

从表5可知，当竞争抗原使用FG-nDHT时，对检出限比较有利，但高值样本测值偏低，线性范围较窄；当竞争抗原使用FG-NT时，低值功能灵敏度(检出限)较差，但高值相关性较好，线性范围较宽；当竞争抗原将二者混合使用时，可以兼顾睾酮低值功能灵敏度和检测范围。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种睾酮均相化学发光检测试剂盒，其包括如下组分：

第一组合物，其包含与睾酮特异性结合的检测抗体；

所述第一抗原与第一受体微球的质量比高于所述第二抗原与第二受体微球的质量比；

所述第二组合物在所述试剂盒中的浓度低于所述第三组合物在所述试剂盒中的浓度。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗原与第二受体微球的质量比为1:(10～200)。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗原与第二受体微球的质量比为1:(50～150)。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗原与第二受体微球的质量比为1:(80～120)。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原与第一受体微球的质量比为1:(1～20)。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原与第一受体微球的质量比为1:(5～15)。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原与第一受体微球的质量比为1:(8～12)。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度比为1:(20～80)。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组合物在所述试剂盒中的质量浓度与所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度比1:(40～60)。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度为5～500ug/ml。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度为10～250ug/ml。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述第三组合物在所述试剂盒中的质量浓度15～200ug/ml。

13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组合物和所述第三组合物单独分散在同一种缓冲液中。

14.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组合物和所述第三组合物混合后分散在一种缓冲液中组装成一种试剂。

15.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径相同。

16.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一受体微球的平均粒径与所述第二受体微球的平均粒径不同。

17.根据权利要求1-16中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原为睾酮和/或睾酮类似物。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原为睾酮，所述第二抗原为睾酮类似物。

19.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述睾酮类似物为二氢睾酮。

20.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体与特异性结合配对成员中的一员结合。

21.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括释放剂，所述释放剂包括二甲氧基雌二醇。

22.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括已知睾酮浓度的系列校准品溶液。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述系列校准品溶液中睾酮的浓度为0-1600ng/dL。

24.一种如权利要求1-23中任意一项所述的试剂盒在睾酮检测中的应用。