CN108445239A - 检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析技术领域的一种检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装及其制备方法和应用。由本发明所提供方法获得的β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装，利用光激化学发光免疫分析平台进行分析时，信号值范围宽，达到定量测试标准；灵敏度高，可准确对血清或尿中β‑hCG水平进行体外诊断；稳定性好，精密度高；且通过优化分析体系(抗体用量和缓冲液等)，分析性能满足行业标准，为临床妊娠诊断和动态监测葡萄胎及绒毛膜上皮癌的治疗效果提供参考。

Description

检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装及其制备方法和应用。

背景技术

人β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)是胎盘中最重要的激素，其主要由胎盘合体滋养层细胞合成。β-hCG是一种异二聚体结构的糖蛋白，由α和β亚基非共价结合，其糖链末端是唾液酸。β-hCG的主要作用是在妊娠的前几周维持卵巢黄体的分泌功能，以支持早期胚胎发育的需要。确定妊娠最重要的标志是血清或尿β-hCG定量。当尿β-hCG含量超过停经后第一周的含量时，即可诊断妊娠，而血清定量实验可更早预测早期妊娠。针对葡萄胎患者，术后一个月内尿β-hCG逐渐下降。然而，对于葡萄胎清除不全、绒毛膜上皮癌等患者，尿β-hCG下降后又继续上升。因此，为评估治疗效果，需对尿β-hCG变化进行动态监测。

β-hCG定量分析的主流方法包括酶促化学发光、吖啶酯化学发光和电化学发光。以上三种发光免疫分析方法，虽然所用标记物不同，但是具备共同特点即均属于非均相免疫分析(Heterogeneous immunoassay)。非均相免疫分析在检测信号前，需要通过反复洗涤固相(微粒)，以分离去除分布于液相中的未参加反应的标记抗体。虽然，固相吸附分离方法具有简单、快速等众多优点，但是，多次洗涤必然会为免疫分析带来洗涤“误差”，影响分析方法的精密度，从而影响分析方法的准确度和分析敏感度。此外，临床要求β-hCG定量具备较宽检测区间，而现有诊断试剂的检测区间差异加大，标本需要稀释后才能获得检测结果。

因此，目前亟需开发一种精密度、准确度和灵敏度高，检测区间较宽且操作方法简便的β人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装的方法，由该方法获得的试剂套装可采用均相免疫方法检测待测样本中的β人绒毛膜促性腺激素，整个检测过程无分离洗涤过程，不仅节省检测时间，且不会产生额外废液，免除洗涤误差，具有较高的精密度、准确度和灵敏度。

本发明提供的试剂套装优选一对针对β-hCG的抗体分别标记生物素和包被受体，建立双抗体夹心血清β-hCG定量分析方法，经优化制的体外诊断试剂盒，其分析性能满足行业标准和临床实验室要求。另外，本发明制备的试剂套装具有较宽的检测范围，可满足高β-hCG标本的需求。

为此，本发明第一方面提供了一种制备检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装的方法，其包括：

制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a和第一缓冲溶液，其中所述组分a为与第一抗体或其结合片段结合的能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体；所述第一抗体或其结合片段能够与β人绒毛膜促性腺激素的第一表位特异性结合；

制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b和第二缓冲溶液，其中所述组分b为与生物素结合的第二抗体或其结合片段；所述第二抗体或其结合片段能够与β人绒毛膜促性腺激素的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠；

制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c和第三缓冲溶液，其中所述组分c为与链霉素亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体。

在本发明的一些实施方式中，所述的第一抗体和第二抗体选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。

在本发明的另一些实施方式中，所述方法还包括制备β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液。

在本发明的一些具体实施方式中，所述β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液的浓度为0～2000IU/L。

根据本发明，所述第一组合物中组分a的浓度为0.3～0.6mg/mL；优选地，所述第一组合物中组分a的浓度为0.45～0.55mg/mL；和/或，

所述第二组合物中组分b的浓度为3～6μg/mL；优选地，所述第二组合物中组分b的浓度为4.5～5.5μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述第三组合物中组分c的浓度为50～150μg/mL；优选地，所述第三组合物中组分c的浓度为80～120μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物的制备方法包括：

步骤S1，利用碳酸盐缓冲液将受体稀释至4～6mg/mL，获得受体溶液；

步骤S2，在受体溶液中加入第一抗体或其结合片段，静止后再加入用碳酸盐缓冲液稀释至8～12mg/mL的BSA溶液，获得与第一抗体或其结合片段结合的受体溶液；

步骤S3，分离与第一抗体或其结合片段结合的受体溶液中的与第一抗体或其结合片段结合的受体，并加入第一缓冲溶液，获得第一组合物。

在本发明的另一些实施方式中，所述第二组合物的制备方法包括：

步骤T1，将第二抗体或其结合片段置于透析袋内利用标记缓冲液进行透析，透析结束后加入生物素溶液，并补入透析缓冲液，静止，获得与生物素结合的第二抗体或其结合片段；

步骤T2，将与生物素结合的第二抗体或其结合片段置于透析袋内利用透析缓冲液进行透析，透析结束后加入第二缓冲液，获得第二组合物。

在本发明的一些具体实施方式中，所述标记缓冲液为0.08～0.12M的NaHCO₃溶液；所述透析缓冲液为0.08～0.12M的Tris-HCl溶液；和/或，

所述第二抗体或其结合片段与生物素的摩尔比为1:(25～35)。

在本发明的一些实施方式中，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为pH值为7.5～8.5的0.08～0.12M的Tris-HCl溶液。

根据本发明，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒；

所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述方法制备的检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装。

本发明第三方面提供了一种采用如本发明第二方面所述试剂套装检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫方法，所述方法为光激化学发光检测。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：

步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合，得到第一混合物；

步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合，得到第二混合物；

步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；

步骤R4，检测步骤R3中得到的化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在β人绒毛膜促性腺激素和/或确定β人绒毛膜促性腺激素的含量。

在本发明的另一些实施方式中，所述方法还包括：利用β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液制作化学发光信号-β人绒毛膜促性腺激素浓度的标准曲线的步骤；所述标准曲线用于确定待测样本中β人绒毛膜促性腺激素的含量。

本发明中，所有试剂组合后，均可以根据需要进行混匀和/或温育(孵育)。具体地，所述温育的温度可以是35-45℃，时间可以是5-30min；优选地，所述温育的温度可以选自36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃；温育的时间可以选自10min、12min、15min、16min、18min、20min、25min或过夜。

在本发明的一些具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

a.在反应孔中加入10～30μL的待测样本；

b.在反应孔中依次加入10～30μL所述第一组合物和10～30μL所述第二组合物，其中第一组合物中的组分a的浓度为0.2～0.8mg/mL，第二组合物中的组分b的浓度为2～8μg/mL；

c.35～45℃温育10～30分钟；

d.向反应孔中加入所述第三组合物100～250μL；其中第三组合物中的组分c的浓度为50～150μg/mL；

e.35～45℃温育5～20分钟；

f.利用波长为680nm的激光照射反应孔，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应可生成612nm的发射光；

g.检测每个反应孔内发射光的光子量，根据标准曲线计算β人绒毛膜促性腺激素的浓度。

在此，需要特别说明的是，上述方法为非疾病诊断目的的方法。

本发明第四方面提供了一种如本发明第二方面所述的试剂套装在制备用于妊娠检测、葡萄胎检测或绒毛膜上皮癌检测的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果为：由本发明所提供方法获得的β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装，利用光激化学发光免疫分析平台进行分析时，信号值范围宽，达到定量测试标准；灵敏度高，可准确对血清或尿中β-hCG水平进行体外诊断；稳定性好，精密度高；且通过优化分析体系(抗体用量和缓冲液等)，分析性能满足行业标准，为临床妊娠诊断和动态监测葡萄胎及绒毛膜上皮癌的治疗效果提供参考。

附图说明

为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。

图1为检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂盒中各组分的反应机理。

其中：1.抗β-hCG抗体结合的发光微球；2.与生物素结合的抗β-hCG抗体；3.待测β-hCG；4.与链霉亲和素结合的感光微球。

图2为实施例2的测定结果与贝克曼定值的相关性示意图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离即可进行检测。

本发明所述用语“待测样本”是指可能含有被分析物的一种混合物，被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样本包括血清和尿。待测样本可以是在使用前根据需要利用稀释液或缓冲溶液对可能含有被分析物的样本进行稀释后的溶液。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用样本稀释液将被分析物进行稀释后再在检测仪器上进行检测，此时可能含有被分析物的稀释后的溶液均统称为待测样本。

本发明所述用语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“单克隆抗体”是指由单克隆的B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。

本发明所述用语“多克隆抗体”是指由一个以上的B淋巴细胞克隆产生的免疫球蛋白集合，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。

本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。

本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。

本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。

本发明所述用语“供体”是指通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体反应的诸如单线态氧的活性中间体的敏化剂。供体可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体是光敏剂，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。在本发明另一些具体实施例中，所述供体是化学活化的其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些供体的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。

本发明所述用语“受体”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的物质。供体被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的受体俘获，从而传递能量以激活所述受体。在本发明的一些具体实施例中，所述受体是这样的物质，其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于：烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑或光泽精。在本发明的另一些具体实施例中，所述受体是能够与单线态氧反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷的烯烃类；可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类，诸如鲁米诺；和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。可以根据本公开和要求保护的发明利用的受体的具体的、非限制性实例记载于美国专利号US5340716(该专利文献在此全文引为参考)。在本发明另一些具体实施例中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其是非粒子化的并且在含水介质中可溶，这种受体的情况可参见专利PCT/US2010/025433(该专利文献在此全文引为参考)。

在本发明中，所述供体可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧，此时供体也可以称为感光微球或感光微粒，包含这种感光微球或感光微粒的溶液可以称为感光液或通用液；和/或，所述受体可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，此时可以称为发光微球或发光微粒。在本申请中，系统基于包被在基体表面的发光物质经光激发和能量传递诱导发光信号，能量传递依赖于抗原-抗体结合导致感光微球和发光微球相互靠近而实现。因此无需分离过程。纳米微球的直径更小，其悬浮性能更强，同时采用了三级放大发光系统，因而具有更高的分析灵敏度；整个检测过程无需清洗，即无需分离结合标记和结合标记物，因此反应时间更短；示踪物质(感光剂和发光剂)标记在基体上，而不是标记在生物分子上，对生物分子的活性没有影响，同时，因基体存在较大的比表面积，故其表面上能够包被更多的示踪物质及生物分子，致其在试剂的有效浓度和灵敏度及检测背景等方面的表现会更优。

本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。基体通常具有多功能性，或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到供体或受体上。有许多官能团是可用的或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、醛基(例如乙醛)、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。适用于本发明的基体的一个非限制性的例子是羧基改性的乳胶颗粒。这种基体的详细情况可参见美国专利US5709994与US5780646(这两篇专利文献在此全文引为参考)。

本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。

本发明所述用语“均相免疫检测试剂套装”是指均相免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂的组合。

Ⅱ.具体实施方案

本发明的β-hCG定量分析诊断试剂套装由与抗体结合的受体(FG-Ab)、与生物素结合的抗体(Bio-Ab)组成，分别作为试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，同时，还包括已知浓度的β-hCG校准品溶液，用于形成数学函数，获得标准曲线；以及β-hCG的低值、高值质控品，用于日常实验的质量控制。此外，该试剂套装还包括与链霉亲和素结合的供体(SA-GG)，配套均相免疫全自动分析仪器，以及相关的耗材等。

将临床标本(待测样本)或校准品与试剂Ⅰ和试剂Ⅱ混合温育，待检β-hCG分别与受体表面的特异性抗体和与生物素结合的特异性抗体结合，形成双抗体夹心复合物；此时两种抗体过量，存在未结合状态的抗体分子。加入与链霉亲和素结合的供体，链霉亲和素与生物素分子结合(包括复合物或游离生物素抗体)，但只有结合复合物(FG-Ab-hCG-Ab-Bio)中的生物素，才能将受体和供体的距离拉近，此时在激光照射情况下，存在活性氧分子转移，致使受体产生光信号。游离的与抗体结合的受体(FG)，远离供体(GG)，不能获得能量，产生光信号。因此，光信号强度与标本中β-hCG含量呈正比例函数关系。采用已知hCG浓度校准品和相应的光信号强度建立数学函数关系，便可计算未知待测β-hCG样本的浓度水平。

Ⅲ.实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1：检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装的制备

(1)与抗体结合的受体的制备：

用作本实施例的受体是含有醛基(-CHO)包被在乳胶颗粒上形成填充有二甲基噻吩的衍生物和镧系元素Eu的螯合物的微粒(发光微球)。受体通过醛基与抗体分子连接。

生物原料：β-hCG单克隆抗体

制备过程：取2mg发光微球溶液，并用0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CB)将其稀释成5mg/ml；取β-hCG单克隆抗体0.02mg转移至稀释后的发光微球溶液中，充分混匀、4℃过夜；再加入用0.05M pH 9.6的CB缓冲液稀释成10mg/ml的BSA溶液20uL，室温旋转2h；充分洗涤微球，最后用pH 8.0 0.1M的Tris-HCl溶液将微球稀释至0.5mg/ml，获得试剂R1。

(2)与生物素标记结合的抗体的制备过程

生物原料：活化生物素以及β-hCG单克隆抗体

制备过程：取β-hCG单克隆抗体0.5mg转移至14KD透析袋内，用标记缓冲液(0.1MNaHCO₃)透析，2h/次，换液1次；加入5mg/ml的生物素溶液10ul，迅速混匀，补充标记缓冲液至500μl，2-8℃混匀过夜，标记比例为1:30(抗体:生物素-摩尔比)；将标记完成的Bio-Ab转移至14KD透析袋，用透析缓冲液(0.1M Tris-HCl)透析，2h/次，换液1次；用pH 8.0 0.1MTris-HCl溶液稀释至5μg/ml，获得试剂R2。

(3)与链霉亲和素结合的供体的制备

a、感光微球(供体)混悬液处理：吸取一定量的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微球浓度至100mg/ml。

b、链霉亲和素溶液配制：称量一定量链霉亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微球(供体)混悬液、8mg/ml的链霉亲和素溶液以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1:25的体积比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2:1:10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES缓冲液)，其与反应液体积比为5:8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用感光试剂缓冲液进行悬浮，获得第三组合物。其中，第三组合物中组分c的浓度为100μg/mL，作为通用液使用，获得试剂R3。

(4)β-hCG校准品系列稀释液的制备过程

取β-hCG纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成各0.5ml的0、5、50、500、1000、2000IU/L校准品系列稀释液。

实施例2：采用本发明所述方法制备的试剂套装检测样本中的β人绒毛膜促性腺激素。

所采用的试剂套装为实施例1制备得到的β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套。检测过程由自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果，具体步骤：

1)在反应孔中分别加入10μl待测样品或校准品、质控品；

2)在反应孔中依次加入25μLR1和25μl R1；

3)37℃温育15分钟；

4)加入175μl R3；

5)37℃温育15分钟；

6)激光照射微孔并计算每孔的信号值；根据校准品的信号值绘制标准曲线，并通过标准曲线，计算出待测样品中β人绒毛膜促性腺激素的浓度。测定结果分别如表1、2和3所示，测定结果与贝克曼定值的相关性如图2所示。

表1：样本1的测定结果

表2：样本2的测定结果

表3：样本3的测定结果

从表1-3和图2可知，采用本发明所述方法测定的β人绒毛膜促性腺激素浓度与贝克曼测值的相关性r＝0.9910，相关性良好，说明采用本发明所述方法能准确地检测出样本中β人绒毛膜促性腺激素的含量。

实施例3：本发明所述方法制备的试剂套装的检测精密度

精密度是衡量体外诊断试剂批内和批间变异的重要指标，是评价拟上市产品有效性的重要依据，通常包括批内精密度和批间精密度。

批内精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本，对3个批次的产品进行独立分析，每个批次重复测定10次(采用实施例2所描述的方法进行测定)，计算10次测量结果的平均值和标准差(SD)，根据公式计算变异系数(CV)，结果如表4所示。

批间精密度评估方法：用低(L)、中(M)、高(H)值样本，对3个批次的产品进行独立分析，每个批次重复测定10次(采用实施例2描述的方法进行测定)，计算30次测量结果的平均值和标准差(SD)，根据公式计算变异系数(CV)，结果如表5所示。

表4：本发明所述方法制备的试剂套装的批内精密度

表5本发明所述方法制备的试剂套装的批间精密度

从表4和表5可知，本发明所述方法制备的试剂套装的批内精密度和批间精密度均<5％，说明采用本发明所述方法制备的试剂套装进行检测时的重复性好、随机误差小。

实施例4：本发明所述方法制备的试剂套装的检测准确度

准确度是实测值与真实值的相符程度，反应试剂套装检测误差的大小。

准确度评估方法：将含不同β-hCG水平的2个样本(样本1和样本2)，用校准品稀释液进行多点稀释，采用实施例2所描述的方法测定稀释后样本的浓度，并稀释根据稀释比例计算回收率，结果如表6和表7所示。

表7：本发明所述方法制备的试剂套装的对样本1的检测准确度

表8：本发明所述方法制备的试剂套装的对样本2的检测准确度

从表7和表8可知，用2个不同水平的β-hCG样本进行多点稀释后进行测定，回收率均在90％～110％范围内，说明实测值与真实值接近，本发明所述方法制备的试剂套装的检测误差小。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (16)

1.一种制备检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装的方法，其包括：

制备第一组合物，所述第一组合物包含组分a和第一缓冲溶液，其中所述组分a为与第一抗体或其结合片段结合的能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体；所述第一抗体或其结合片段能够与β人绒毛膜促性腺激素的第一表位特异性结合；

制备第二组合物，所述第二组合物包含组分b和第二缓冲溶液，其中所述组分b为与生物素结合的第二抗体或其结合片段；所述第二抗体或其结合片段能够与β人绒毛膜促性腺激素的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠；

制备第三组合物，所述第三组合物包含组分c和第三缓冲溶液，其中所述组分c为与链霉素亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗体和第二抗体选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液的浓度为0～2000IU/L。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一组合物中组分a的浓度为0.3～0.6mg/mL；优选地，所述第一组合物中组分a的浓度为0.45～0.55mg/mL；和/或，

所述第二组合物中组分b的浓度为3～6μg/mL；优选地，所述第二组合物中组分b的浓度为4.5～5.5μg/mL；和/或，

所述第三组合物中组分c的浓度为50～150μg/mL；优选地，所述第三组合物中组分c的浓度为80～120μg/mL。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一组合物的制备方法包括：

步骤S1，利用碳酸盐缓冲液将受体稀释至4～6mg/mL，获得受体溶液；

步骤S2，在受体溶液中加入第一抗体或其结合片段，静止后再加入用碳酸盐缓冲液稀释至8～12mg/mL的BSA溶液，获得与第一抗体或其结合片段结合的受体溶液；

步骤S3，分离与第一抗体或其结合片段结合的受体溶液中的与第一抗体或其结合片段结合的受体，并加入第一缓冲溶液，获得第一组合物。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二组合物的制备方法包括：

步骤T1，将第二抗体或其结合片段置于透析袋内利用标记缓冲液进行透析，透析结束后加入生物素溶液，并补入透析缓冲液，静止，获得与生物素结合的第二抗体或其结合片段；

步骤T2，将与生物素结合的第二抗体或其结合片段置于透析袋内利用透析缓冲液进行透析，透析结束后加入第二缓冲液，获得第二组合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标记缓冲液为0.08～0.12M的NaHCO₃溶液；所述透析缓冲液为0.08～0.12M的Tris-HCl溶液；和/或，

所述第二抗体或其结合片段与生物素的摩尔比为1:(25～35)。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为pH值为7.5～8.5的0.08～0.12M的Tris-HCl溶液。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒；

所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒。

11.一种如权利要1-10中任意一项所述方法制备的检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫检测试剂套装。

12.一种采用如权利要求11所述的试剂套装检测β人绒毛膜促性腺激素的均相免疫方法，所述方法为光激化学发光检测。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤R1，将待测样本与第一组合物和第二组合物混合，得到第一混合物；

步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合，得到第二混合物；

步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；

步骤R4，检测步骤R3中得到的化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在β人绒毛膜促性腺激素和/或确定β人绒毛膜促性腺激素的含量。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：利用β人绒毛膜促性腺激素校准品系列稀释液制作化学发光信号-β人绒毛膜促性腺激素浓度的标准曲线的步骤；所述标准曲线用于确定待测样本中β人绒毛膜促性腺激素的含量。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.在反应孔中加入10～30μL的待测样本；

b.在反应孔中依次加入10～30μL所述第一组合物和10～30μL所述第二组合物，其中第一组合物中的组分a的浓度为0.2～0.8mg/mL，第二组合物中的组分b的浓度为2～8μg/mL；

c.35～45℃温育10～30分钟；

d.向反应孔中加入所述第三组合物100～250μL；其中第三组合物中的组分c的浓度为50～150μg/mL；

e.35～45℃温育5～20分钟；

f.利用波长为680nm的激光照射反应孔，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应可生成612nm的发射光；

g.检测每个反应孔内发射光的光子量，根据标准曲线计算β人绒毛膜促性腺激素的浓度。

16.一种如权利要求11所述的试剂套装在制备用于妊娠检测、葡萄胎检测或绒毛膜上皮癌检测的试剂盒中的应用。