CN102798725A - 血清总IgE测定诊断试剂盒及制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种血清总IgE测定诊断试剂盒及制备和使用方法。所述试剂盒包括IgE标准品、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液和链霉亲和素标记的供体微球溶液。本发明的试剂盒解决了现有非均相免疫试剂盒繁琐洗涤步骤；同时克服了放射免疫分析环境污染，货架期短的缺陷，克服酶免疫分析重复性差，易发生“钩状效应”缺陷，检测精度远高于免疫比浊分析。

Description

血清总IgE测定诊断试剂盒及制备和使用方法

技术领域

本发明属于免疫分析医学领域，具体是涉及一种血清总免疫球蛋白E(总IgE)测定诊断试剂盒及制备和使用方法。

背景技术

过敏性疾病是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时发生的一种以机体生理功能紊乱或组织损伤为主的病理性免疫应答。临床过敏性疾病主要指I型过敏反应，发生机制为过敏原(allergen)进入机体后可刺激B淋巴细胞产生特异性IgE(sIgE)抗体，IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合使机体处于致敏状态。当相同过敏原再次进入已致敏状态机体时，就可与特异性IgE抗体结合而触发细胞活化，产生过敏反应。近年来，随着社会经济的发展，生活环境的改善和生活方式的变化，过敏性疾病正在迅速增加，同时引起公众和医学领域的广泛重视。

体内存在多种B淋巴细胞克隆，每种克隆之间携带不同抗原受体，用来识别不同抗原分子(抗原表位)。机体针对过敏原的免疫应答同样遵循上述规律，不同过敏原可诱导产生特异性各异IgE分子，一般称之为特异性IgE(sIgE)。尽管不同sIgE可变区的一级结构(氨基酸种类和顺序)不同，但人类IgE的恒定区具有相同的一级结构，具有相同的抗原特异性，能够被鼠(或兔)抗人IgE抗体识别。人体内各种特异性IgE总和，我们称之为总IgE(简写IgE)。研究发现，正常人血清总IgE水平很低，但在发生过敏反应时会显著升高。临床上，总IgE测定常作为过敏反应性疾病的初筛试验。测定总IgE虽不能说明对何种物质过敏，但在鉴别过敏与非过敏的问题上有一定价值。资料显示，在变态反应性疾病中，78％的患者总IgE高于110kU/L，而非变态反应性疾病中84％低于25kU/L。另约有20％～30％的变态反应性疾病患者特异性IgE高而总IgE正常。

目前检测总IgE水平的实验方法比较成熟并有商品化试剂盒出售，一般采用双抗体夹心法。具体方法有放射免疫分析、酶免疫分析和发光免疫分析，其中以酶免疫标记较为普及。酶免疫分析采用双抗体夹心测定模式，测定原理如下：两种不同的抗体，分别包被微孔板和标记辣根过氧化物酶(或碱性磷酸酶)。先加入待测血清，血清中IgE与固相表面抗-IgE结合。洗涤去除未参加反应的物质，再加入酶标记抗人-IgE抗体，形成固相抗体-待测IgE-酶标抗体复合物并吸附于固相材料表面。未结合的物质通过洗涤去除。加入显色底物显色，通过测量颜色的变化来判断标本中IgE的浓度。

放射免疫分析采用放射性核素(¹²⁵I)作为标记物，采用双抗体夹心分析模式。放射免疫分析的主要缺点是放射性核素带来的环境污染；同时，放射性标记物半衰期短，试剂盒货架期短，不便于储存。国内酶免疫分析采用辣根过氧化物酶(HRP)作为标记物，采用双抗体夹心两步法检测模式。酶联免疫分析主要缺点是酶活性受多种因素影响，重复性差，每次操作均需制作标准曲线，会增加单份标本的检测成本；同时，酶免疫分析采用微孔反应板作为固相材料，微孔板表面积有限不能包被足够抗体，容易产生“钩状效应”，导致错误检测结果。此外，近年来免疫浊度分析也用于血清总IgE的测定。乳球增强比浊以纳米乳胶微球作为固相载体，包被兔抗人IgE抗体形成致敏微球；血清中待测IgE与受体微球表面抗人IgE结合，导致微球相互聚集，从而使体系的浊度发生变化。免疫浊度分析具有操作简单的优点，但血脂、溶血标本均会影响检测结果；同时，免疫比浊分析受抗原、抗体比例影响较大，检测范围较窄，而临床标本IgE范围较宽，超出检测范围的标本需要稀释才能获得准确结果。

此外，不论发射免疫分析，还是酶免疫分析，由于标记抗体为过量，检测前均需要去除未参加反应的标记抗体。此时，通过检测与待测抗原结合的标记抗体，才能与待测抗原呈正比例关系。在标记免疫分析技术中，固相吸附分离是分离游离标记抗体的重要方法，即需要固相材料吸附捕获抗体-待检抗原-标记抗体。

固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面：

1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被于固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。

2.“洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种血清总IgE均相发光免疫测定诊断试剂盒及制备和使用方法，以解决现有非均相免疫试剂盒繁琐洗涤步骤；同时，克服放射免疫分析环境污染，货架期短的缺陷，克服酶免疫分析重复性差，易发生“钩状效应”缺陷。本发明采用发光免疫分析，具有较高的敏感度和精密度，检测精度远高于免疫比浊分析。

本发明的检测原理如图3所示：利用均相发光免疫测定方法，在受体微球(发光微球)表面包被兔抗人IgE多克隆抗体，得到抗体包被的受体微球；将鼠抗人IgE单克隆抗体标记生物素，制备生物素标记抗体；同时，在供体微球(感光微球)表面已预先包被链霉亲和素。

当检测到体系中存在待测IgE，IgE同时与生物素标记抗体和受体微球表面的兔抗人IgE多克隆抗体发生特异性结合，并于受体微球表面形成双抗体夹心复合物；此时，如加入供体微球，生物素与链霉亲和素结合而使得两个微球相互靠近，在激发光源的激发下，供体微球释放单线态氧，在溶液中碰到受体微球后产生化学发光，从而更进一步激发同一个微球上的荧光基团产生级联放大反应产生荧光。此时，待测IgE越多，荧光强度越强，根据发光的强弱定量检测血清中总IgE的含量。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种血清总IgE均相发光免疫测定诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)IgE标准品(校准品)：6个浓度，分别是1000IU/ml，500IU/ml，200IU/ml，100IU/ml，50IU/ml，0IU/ml；

(2)生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液：浓度为0.335-0.67微克/毫升，优选0.447微克/毫升；

(3)包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液：浓度为5～20微克/毫升，优选10微克/毫升；

(4)链霉亲和素标记的供体微球溶液，浓度为20～80微克/毫升，优选50微克/毫升。

所述的鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体为商品化试剂，可市售得到。举例如，鼠抗人IgE单克隆抗体可选自abcam公司的Anti-IgE antibody(Mouse monoclonal[4C3]to IgE)，货号：ab106494；兔抗人IgE多克隆抗体可选自abcam公司的Anti-IgEantibody(Rabbit polyclonal to IgE,)，货号：ab75673。

鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体应满足如下主要指标：

特异性：免疫原采用人IgE的重链，与人IgE有良好特异性，但与人IgG、IgA、IgM交叉反应率低于0.01％。

亲和力：在检测范围内(0～1000IU/ml)表现良好结合，能够获得良好剂量-反应曲线。

效价：酶联免疫吸附试验(ELISA)大于1/15000。

纯度：蛋白A亲和层析纯，纯度大于99％。

所述受体微球、供体微球均为商品化试剂。

受体微球用于包被兔抗人IgE多克隆抗体。受体微球为醛基修饰的发光微粒，通过醛基与抗体分子连接，形成抗体包被的受体微球。发光微粒内含有发光化合物及镧系元素化合物的螯合物，发光化合物为二甲基噻吩的衍生物，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phne。受体微球可购自铂金埃尔默有限公司，货号6762001。

供体微球内含有感光化合物酞箐染料(鲁米诺类化学发光物质)，同时供体微球内含有活泼醛基，并预先包被有链霉亲和。供体微球可购自铂金埃尔默有限公司，货号6760002S。

进一步的，所述试剂盒中还包括不透明微孔板，例如均相发光96孔反应板。

本发明还提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括如下步骤：

(1)配制缓冲液

分别配制0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液；0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲溶液；0.1M，pH 8.0磷酸盐缓冲溶液；0.1M，pH 8.0Tris-HCl缓冲液；

(2)总IgE标准品配制

取IgE纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列标准品溶液各1毫升；

(3)制备包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球；

(4)配制受体微球工作液

用pH 8.0，0.1M Tris-HCl缓冲液将包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球稀释到相应浓度，如10微克/毫升；

(5)制备生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液；

(6)将IgE标准品、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液、链霉亲和素标记的供体微球溶液组装成试剂盒成品。

优选的，包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球由如下步骤制备得到：

(1)预处理抗体和含量测定

将欲标记的兔抗人IgE多克隆抗体装入透析袋中，置于0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，透析后用紫外分光光度计测定抗体含量，调整浓度至1-2毫克/毫升。

(2)洗涤微球

取50微升，浓度为20毫克/毫升的受体微球置于1.5毫升塑料离心管中，加入0.1MpH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液，离心洗涤1-2次，每次16000rpm 15分钟，弃上清液，待用(目的是将微球沉淀，与溶液分离达到洗涤目的)；

(3)标记

上述离心管内加入0.1毫克兔抗人IgE多克隆抗体，并用0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上(含48小时)；

(4)封闭

用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，取10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内反应1小时；

(5)洗球

将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000rpm离心15分钟，弃上清液，再加入200微升0.1M，pH 8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，再次悬浮至50微升，得所述包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球。

优选的，所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液由如下步骤制备得到：

将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与鼠抗人IgE单克隆抗体的摩尔比为20∶1的比例将二者混合反应，将反应后的液体用0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液进行透析，得所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液。用紫外吸收测定蛋白浓度，经优化确定最佳生物素标记抗体稀释倍数，组装试剂盒时，优选稀释至浓度为0.447微克/毫升装瓶即可。

本发明还提供了一种用上述试剂盒检测血清总IgE的方法，包括如下步骤：

(1)取不透明微孔板，向微孔内依次加入IgE标准品或待检血清、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液和包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液，混匀后置37℃温育30分钟，以使抗原抗体充分结合；

(2)再避光加入链霉亲和素标记的供体微球，混匀后置37℃温育15分钟，使亲和素与生物素结合，从而使两微球相互靠近；

(3)测定微孔内的反应产物在激发光激发下产生的荧光强度；

(4)以加入的已知不同浓度的IgE标准品的荧光强度检测值，用四参数拟合方式绘制IgE浓度-荧光强度标准曲线；

(5)测量待检血清的荧光强度，通过标准曲线计算得到待检血清中总IgE的浓度。

优选的，激发波长为670～690nm，更优选激发波长680nm；所述发光强度的检测波长为520～620nm，优选检测波长为615nm。

本发明具有的优点和积极效果是：

1、本发明采用均相的方法，混合后即可测定，无需洗板等繁琐步骤，因此可缩短检测时间，同时因没有洗涤过程可减少因洗涤而造成的偏差，使批间及批内差异小，重复性好，克服放射免疫分析环境污染，货架期短的缺陷及酶免疫分析重复性差，易发生“钩状效应”的缺陷；

2、与酶免疫分析相比，本发明检测荧光强度时所采用的发光检测仪具有很强的抗干扰能力，使背景信号很低，检测的灵敏度远高于免疫比浊分析；

3、本发明的试剂盒检测试剂成本低，能够快速测定过敏患者血清中总IgE浓度，从而辅助临床更好地进行脱敏治疗，临床推广好。

附图说明

图1是本发明包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球制备流程图。

图2是本发明试剂盒操作流程示意图。

图3是本发明的检测原理图。

图4是本发明的IgE浓度-荧光强度标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1

一种血清总IgE均相发光免疫测定诊断试剂盒，包括：

(1)IgE标准品(校准品)：6个浓度，分别是1000IU/ml，500IU/ml，200IU/ml，100IU/ml，50IU/ml和0IU/ml；

(2)生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液：浓度为0.447微克/毫升；鼠抗人IgE单克隆抗体购自abcam公司的Anti-IgE antibody(Mouse monoclonal[4C3]to IgE)，货号：ab106494；

(3)包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液：浓度为10微克/毫升；受体微球购自铂金埃尔默有限公司，货号6762001；兔抗人IgE多克隆抗体购自abcam公司的Anti-IgEantibody(Rabbit polyclonal to IgE，)，货号：ab75673。

(4)链霉亲和素标记的供体微球溶液，浓度为50微克/毫升，购自铂金埃尔默有限公司，货号6760002S。

[5]均相发光96孔反应板

通过如下步骤制备上述的试剂盒：

(1)配制缓冲液

按下述方法分别配制0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液；0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲溶液；0.1M，pH 8.0磷酸盐缓冲溶液；1M，pH 8.0Tris-HCl缓冲液；

(1)磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)0.1M pH 7.4

ddH₂O(双蒸水)     800毫升

NaH₂PO₄·2H₂O     2.96克

Na₂HPO₄·12H₂O    29克

NaCl              8.5克充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至

7.4，加ddH₂O定容至1升

(2)磷酸盐缓冲溶液(PB)0.1M pH 7.4

ddH₂O(双蒸水)                3.6升

NaH₂PO₄·2H₂O(磷酸二氢钠)    11.84克

Na₂HPO₄·12H₂O(磷酸氢二钠)   116克

充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至7.4，加ddH₂O定容至4升

(3)磷酸盐缓冲溶液(PB)0.1M pH 8.0

ddH₂O(双蒸水)                3.6升

NaH₂PO₄·2H₂O(磷酸二氢钠)    11.84克

Na₂HPO₄·12H₂O(磷酸氢二钠)   116克

充分溶解后，用HCl或NaOH调节pH至8.0，加ddH₂O定容至4升

(4)Tris-HCl 0.1M pH 8.0

Tris(三羟甲基氨基甲烷)       12.12克

ddH₂O(双蒸水)                70毫升

充分溶解后，用HCl调节pH至8.0，加ddH₂O定容至100毫升

(2)总IgE标准品配制

取IgE纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列标准品溶液各1毫升，并用质控血清(国际lyphochek质控血清，货号371-373)校准。

(3)制备包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球，流程图如图1所示。

[1]预处理抗体和含量测定

将欲标记的兔抗人IgE多克隆抗体装入透析袋中，置于0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，透析后用紫外分光光度计测定抗体含量，调整浓度至1-2毫克/毫升。

[2]洗涤微球

取50微升，浓度为20毫克/毫升的受体微球置于1.5毫升塑料离心管中，加入0.1MpH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液，离心洗涤1-2次，每次16000rpm分钟，弃上清液，待用；

[3]标记

上述离心管内加入0.1毫克兔抗人IgE多克隆抗体(即抗IgE抗体)，并用0.1M pH8.0磷酸盐缓冲盐水溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上；

[4]封闭

用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内反应1小时；

[5]洗球

将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000×G离心15分钟，弃上清液，再加入200微升100mM，pH 8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，再次悬浮至50微升备用；

(4)配制受体微球溶液

用pH 8.0，0.1M Tris-HCl缓冲液将包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球稀释至10微克/毫升；

(5)制备生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液；

将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与鼠抗人IgE单克隆抗体的摩尔比为20∶1的比例将二者混合反应，将反应后的液体用0.1M PBS进行透析，得所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液；此溶液为储备液，浓度为2.68毫克/毫升，组装试剂盒时，用0.1M pH 8.0的Tris-HCl溶液稀释1∶6000倍至浓度为0.447微克/毫升装瓶即可。

(6)试剂盒组装

将IgE标准品、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液、链霉亲和素标记的供体微球溶液和均相发光96孔反应板组装成试剂盒成品。

实施例2

如图2所示，一种实施例1制备的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)将IgE标准品、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液、链霉亲和素标记的供体微球溶液取出，至室温平衡20分钟；在均相发光96孔反应板上做好标记；

(2)取反应板，向微孔内依次加入10微升待检血清或IgE标准品、50微升生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液及50微升被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液，混匀后于37℃下温育15分钟，以使抗原抗体充分结合；

(3)再避光向微孔中加入100微升链霉亲和素标记的供体微球，混匀后置37℃温育15分钟，使亲和素与生物素结合，从而使两微球相互靠近；

(4)应用发光检测仪(美国PerkinELmer公司(珀金埃尔默有限公司)，型号：Enspire)测定微孔内的反应产物在激发光激发下产生的荧光强度；

(5)以实施例1中配制的一系列已知浓度的IgE标准品的荧光强度检测值，数值如表2所示，用四参数拟合方式绘制的IgE浓度-荧光强度标准曲线如图4所示。

表2

标准品	STD-1	STD-2	STD-3	STD-4	STD-5	STD-6
							浓度(IU/ml)	0	50	100	200	500	1000
荧光强度(CPS)	47	492	964	1933	4028	5654

(6)测量待检血清的荧光强度，通过标准曲线计算得到待检血清中总IgE的浓度。

所述激发光的波长为680nm，所述发光强度的检测波长为615nm。

实施例3

本发明所制备的试剂盒的性能检测。

精密度测试试验

测试方法：用正常人血清配制成低、中、高值待测样本，在同一次实验中测定IgE含量，每个样本平行作10次，计算批内变异系数(CV)；在不同实验日测定IgE含量，每个样本平行作10次，计算批间变异系数。

表3本发明的精密度测定结果

表4酶免疫分析精密度测定结果

本发明采用的是均相化学发光免疫测定，由于没有洗涤过程，可减少因洗涤造成误差；同时，克服酶免疫分析不稳定缺陷。从表3和表4可以看出，本发明制备的试剂盒精密度有大幅度提高，批间及批内差异小(精密度)，重复性好，灵敏度高。

以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种血清总IgE均相发光免疫测定诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

(1)6个浓度的IgE标准品：分别是1000IU/ml，500IU/ml，200IU/ml，100IU/ml，50IU/ml和0IU/ml；

(2)生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液：浓度为0.335-0.67微克/毫升；

(3)包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液：浓度为5～20微克/毫升；

(4)链霉亲和素标记的供体微球溶液：浓度为20～80微克/毫升。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液：浓度为0.447微克/毫升；

所述包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液：浓度为10微克/毫升；

所述链霉亲和素标记的供体微球溶液：浓度为50微克/毫升。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括不透明微孔板。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)配制缓冲液

分别配制0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液；0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲溶液；0.1M，pH 8.0磷酸盐缓冲溶液；0.1M，pH 8.0Tris-HCl缓冲液；

(2)总IgE标准品配制

取IgE纯品，用含20％灭活小牛血清的0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列标准品溶液各1毫升；

(3)制备包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球；

(4)配制受体微球工作液

用pH 8.0，0.1M Tris-HCl缓冲液将包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球稀释到相应浓度；

(5)制备生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液；

(6)将IgE标准品、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液、链霉亲和素标记的供体微球溶液组装成试剂盒成品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球由如下步骤制备得到：

(1)预处理抗体和含量测定

将欲标记的兔抗人IgE多克隆抗体装入透析袋中，置于0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，透析后用紫外分光光度计测定抗体含量，调整浓度至1-2毫克/毫升；

(2)洗涤微球

取50微升，浓度为20毫克/毫升的受体微球置于1.5毫升离心管中，加入0.1M pH8.0磷酸盐缓冲盐水溶液，离心洗涤1-2次，每次16000rpm 15分钟，弃上清液，待用；

(3)标记

上述离心管内加入0.1毫克兔抗人IgE多克隆抗体，并用0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液定容至200微升，再依次加入1.25微升10％吐温20溶液、10微升新鲜配制的400mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀置37℃温箱内反应48小时以上；

(4)封闭

用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液；取10微升羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，置37℃温箱内反应1小时；

(5)洗球

将经步骤(4)处理后的离心管置于离心机内，16000rpm离心15分钟，弃上清液，再加入200微升0.1M，pH 8.0的Tris-HCl溶液，重新悬浮微球；重复离心，再次悬浮至50微升，得所述包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液由如下步骤制备得到：

将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与鼠抗人IgE单克隆抗体的摩尔比为20∶1的比例将二者混合反应，将反应后的液体用0.1M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液进行透析，得所述生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液。

7.一种权利要求1-2任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取不透明微孔板，向微孔内依次加入IgE标准品或待检血清、生物素标记的鼠抗人IgE单克隆抗体溶液和包被兔抗人IgE多克隆抗体的受体微球溶液，混匀后置37℃温育30分钟，以使抗原抗体充分结合；

(2)再避光加入链霉亲和素标记的供体微球，混匀后置37℃温育15分钟，使亲和素与生物素结合，从而使两微球相互靠近；

(3)测定微孔内的反应产物在激发光激发下产生的荧光强度；

(4)以加入的已知不同浓度的IgE标准品的荧光强度检测值，用四参数拟合方式绘制IgE浓度-荧光强度标准曲线；

(5)测量待检血清的荧光强度，通过标准曲线计算得到待检血清中总IgE的浓度。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于：激发光的激发波长为670～690nm，荧光强度的检测波长为520～620nm。

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