CN105548557B - 超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用，所述检测试剂包括试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球，所述试剂反应液中还含有与试剂反应液结合的单克隆抗体；所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有抗单克隆抗体，所述抗单克隆抗体为与所述单克隆抗体特异结合的抗体，并且所述抗单克隆抗体与所述聚苯乙烯乳胶微球交联。本发明中的比浊检测试剂抗原在同抗体的结合中增加了凝集位点(乳胶颗粒上的单抗与其对应的二抗)，这样即使抗原在浓度很低的时候也会遇到标记的颗粒时迅速凝集，更短的时间内形成更大的免疫复合物，从而达到了增加试剂灵敏度的效果。

Description

超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测试剂及其检测方法和应用，具体涉及一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用。

背景技术

蛋白质是由20种不同L型氨基酸连接而成的多聚体，其结构可以划分为四级。一级结构是组成蛋白质多肽链的一连串氨基酸序列；二级结构是依靠不同氨基酸之间的氢键形成的结构，主要类型为α螺旋和β折叠；三级结构是通过二级结构单元在空间上形成的蛋白质三维结构；四级结构是不同的亚基之间相互作用形成具有特定功能的蛋白质复合物分子。

免疫标记技术是指将已知抗原或抗体标记在易显示的物质上，通过检测标记物来计算抗原抗体反应的状况，从而间接地对被检抗体或抗原定形或者。免疫标记技术具有快速、定性或定量的特点，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。

PCT(降钙素原，procalcitonin)是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症或多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平显著升高。自身免疫、过敏或病毒感染时PCT不会升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。

肌钙蛋白(cTnI)，由T、C、I三亚基构成，当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4～6小时后，开始在血液中升高，肌钙蛋白因为具有高度心肌敏感性和特异性，所以肌钙蛋白T已成为目前最理想的心肌梗死标志物。

胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测技术。具体原理是在高分子胶乳微球的表面交 联或物理吸附抗体(单抗或者多抗)，当交联有抗体的微球(一般称为Reagent 2或者R2)在试剂反应液中(一般称为Reagent 1或者R1)与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。其优点是抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。其缺点是在一些检测项目中对体液中蛋白含量要求灵敏度较高的项目中免疫比浊法的灵敏度差一些。

在常规的方法中是把抗体标记在乳胶微球颗粒上，在反应体系中遇到抗原的时候由于抗原抗体的结合引起乳胶颗粒的凝集。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂及其检测方法和应用，能够在抗原抗体反应体系中迅速形成更大的免疫复合物，从而提高检测的灵敏度。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，包括试剂反应液(R1)和聚苯乙烯乳胶微球(R2)，所述试剂反应液中还含有与试剂反应液结合的单克隆抗体；所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有抗单克隆抗体，所述抗单克隆抗体为与所述单克隆抗体特异结合的抗体，并且所述抗单克隆抗体与所述聚苯乙烯乳胶微球交联。

在上述技术方案的基础上，本发明还可作出如下改进：

作为优选的方案，所述试剂反应液中含有浓度为40～60ng/ml的单克隆抗体，优选为50ng/ml。

采用上述优选的方案，该浓度的单克隆抗体能够起到较好地标记作用。

作为优选的方案，所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有浓度为 200～300ng/ml的抗单克隆抗体，优选为250ng/ml。

采用上述优选的方案，该浓度下的抗单克隆抗体能够较好地与聚苯乙烯乳胶微球交联。

作为优选的方案，所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有与抗单克隆抗体结合的珠子。

采用上述优选的方案，通过添加珠子能够使得检测灵敏度更高。

作为优选的方案，所述聚苯乙烯乳胶微球中含有浓度为200～300ng/ml的珠子，优选为25ng/ml。

采用上述优选的方案，在该浓度下的珠子检测效果好，灵敏度高，且不会造成浪费，成本低。

作为优选的方案，所述单克隆抗体与所述待检测样品中的抗原结合，且所述单克隆抗体与抗原结合的位点，不与单克隆抗体与抗单克隆抗体的结合位点重复。

采用上述优选的方案，单克隆抗体不但能够与抗单克隆抗体结合，而且不会阻挡与抗原结合的位点，也就是说在增加结合位点的同时，不会阻挡与抗原的结合，提高凝聚效果，增加检测灵敏度。

作为优选的方案，所述抗原为降钙素原或肌钙蛋白；优选地，当所述抗原为降钙素原时，所述比浊检测试剂的检测下限(灵敏度)为0.1～0.15ng/ml，优选为0.1ng/ml，或；

当所述抗原为肌钙蛋白时，所述比浊检测试剂的检测下限(灵敏度)为0.01～0.05ng/ml，优选为0.01ng/ml。

采用上述优选的方案，本发明的比浊检测试剂的检测下限提高，提高灵敏度，从而能够更准确地检测病人是否患病，从而能提前预防。

另一方面，本发明还提供一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂的检测方法，包括以下步骤：

1)将适量的单克隆抗体加入试剂反应液中，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，再将待检测样品加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，得到反应物混合液；

2)将适量的抗单克隆抗体加入聚苯乙烯乳胶微球中，得到交联 有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球；

3)再将所述反应物混合液和所述交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应，即得。

在上述技术方案的基础上，本发明还可作出如下改进：

作为优选的方案，在步骤2)中，将适量的抗单克隆抗体加入聚苯乙烯乳胶微球中前，还包括添加适量的珠子与所述抗单克隆抗体结合的步骤。

作为优选的方案，在步骤3)中，将所述反应物混合液和所述交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应4～6min。

作为优选的方案，将所述反应物混合液和所述交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min。

再一方面，本发明还提供一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂在制备用于检测生物样品的比浊试剂盒中的应用，优选地，生物样品为降钙素原或肌钙蛋白。

本发明的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，在传统的试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球比浊检测试剂系统中，分别增加单克隆抗体和与其特异结合的抗单克隆抗体，单克隆抗体、抗单克隆抗体分别能够与试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球结合，相当于抗原在同抗体结合中增加了凝集位点(乳胶颗粒上的单抗与其对应的二抗)，这样即使抗原在浓度很低的时候也会遇到标记的颗粒时迅速凝集，更短的时间内形成更大的免疫复合物，从而达到了增加试剂灵敏度的效果；并且本发明的检测试剂的检测下限低，即检测灵敏度高，从而能够更准确地检测病人是否患病。

附图说明

图1为现有技术中的比浊检测试剂的检测原理图，其中Y表示多抗或配对单抗；

图2为本发明的比浊检测试剂进行检测时聚苯乙烯乳胶微球中只加入抗单克隆抗体时的结构示意图，其中，Y表示多抗或配对单抗， 表示抗单克隆抗体，表示单抗；

图3为本发明的比浊检测试剂的检测方法检测时聚苯乙烯乳胶微球中只加入抗单克隆抗体时流程图，其中，R1表示试剂反应液，Ag表示抗原，mab为单克隆抗体，R2表示聚苯乙烯乳胶微球，zndAb表示抗单克隆抗体；

图4为本发明的比浊检测试剂进行检测时聚苯乙烯乳胶微球中同时加入抗单克隆抗体和珠子时的结构示意图，Y表示多抗或配对单抗， 表示与珠子结合的抗单克隆抗体，表示单抗；

图5为本发明的比浊检测试剂的检测方法检测时聚苯乙烯乳胶微球中同时加入抗单克隆抗体和珠子时流程图，其中，R1表示试剂反应液，Ag表示抗原，mab为单克隆抗体，R2表示聚苯乙烯乳胶微球，zndAb-beads表示与珠子结合的抗单克隆抗体。

具体实施方式

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从常规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中所用的降钙素原标准品：购自广州格瑞林生物科技有限公司，货号20150905

除非特别指明，以下实施例中所用的肌钙蛋白标准品：购自广州格瑞林生物科技有限公司，货号20150908。

实施例1降钙素原(PCT)的检测

1)取180μl试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为14C12的抗体)，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为50ng/ml，再取20μl人血清样品(取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明)，重复取10次，作为平行样品，同时以取等量的降钙素原标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得到反应物混合液；

2)然后，取60μl聚苯乙烯乳胶微球，再将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠IgG二抗)加入聚苯乙烯乳胶微球中，得到交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球，使单克隆抗体的终浓度为25ng/ml；

3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min，即得。

4)取步骤3)中反应后的混合物25μl加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪中，于600nm波长下检测，然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多点定标校准曲线等；再以校准品浓度对相应ΔA作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样品的ΔA从校准曲线上读出。

结果表明，上述10个人血清样品中的降钙素原的浓度的平均值为0.105ng/ml，SD值为0.006，而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.3ng/ml的人血清样品，也就是说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，并且能够大程度地提高相同样本的吸光度。

实施例2降钙素原的检测

1)取180μl试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为14C12的抗体)，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为40ng/ml，再取20μl的人血清样品(取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明)，重复取10次，作为平行样品，同时以取等量的降钙素原标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得到反应物混合液；

2)然后，取60μl聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠IgG二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球中，得到交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球，使单克隆抗体的终浓度为20ng/ml，珠子的终浓度为200ng/ml；

3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min，即得。

4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于600波长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多点定标校准曲线等；再以校准品浓度对相应ΔA作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样品的ΔA从校准曲线上读出。

结果表明，上述10个人血清样品中的降钙素原的浓度为平均值为0.145ng/ml，SD值为0.006，而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.3ng/ml的人血清样品，也就是说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本的吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。

实施例3肌钙蛋白(cTnI)的检测

1)取180μl试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为M18的抗体)，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为60ng/ml，再取25μl的人血清样品(取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明)，重复取10次，作为平行样品，同时以取等量的肌钙蛋白标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得到反应物混合液；

2)然后，取60μl聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠IgG二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球，使单克隆抗体的终浓度为25ng/ml，珠子的终浓度为250ng/ml；

3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min，即得。

4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于500波长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通 过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多点定标校准曲线等；再以校准品浓度对相应ΔA作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样品的ΔA从校准曲线上读出。

结果表明，上述人血清样品中的降钙素原的浓度的平均值为0.011ng/ml，SD值为0.0006，而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.1ng/ml的人血清样品，也就是说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本的吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。

实施例4肌钙蛋白(cTnI)的检测

1)取180μl试剂反应液，再取适量的鼠抗人单克隆抗体(具体为hytest的货号为M18的抗体)，得到单克隆抗体标记的试剂反应液，使单克隆抗体的终浓度为50ng/ml，再取25μl人血清样品(取自苏州大学第二附属医院，并且受试者签订了捐献声明)，重复取三次，作为平行样品，同时以取等量的肌钙蛋白标准品和生理盐水，分别作为阳性对照和负对照，然后将所取的样品，分别加入所述单克隆抗体标记的试剂反应液中，于37°孵育3min，得到反应物混合液；

2)然后，取60μl聚苯乙烯乳胶微球，先将适量的抗单克隆抗体(具体为羊抗鼠IgG二抗)与适量的珠子结合，然后将与抗单克隆抗体结合的珠子加入聚苯乙烯乳胶微球，使单克隆抗体的终浓度为30ng/ml，珠子的终浓度为300ng/ml；

3)再将反应物混合液和交联有抗单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶微球混合反应5min，即得。

4)将步骤3)中反应后的混合物加入比色杯中，在日立7020全自动生化仪，于500波长下检测。然后使用含有人血清的校准品，通过非线性计算模式，如Logit或Spline建立多点定标校准曲线等；再以校准品浓度对相应ΔA作校准曲线，样品中降钙素原的浓度通过样品的ΔA从校准曲线上读出。

结果表明，上述人血清样品中的降钙素原的浓度的平均值为 0.0478ng/ml，SD值为0.002，而现有技术中一般只能检测到降钙素原的浓度为0.1ng/ml的人血清样品，也就是说本发明的检测试剂进行检测能够明显提高检测下限，也就是能够很大的提高相同样本的吸光度，提高试剂盒测试的灵敏度。

对比例1

取含有PCT的标准品，将该标准品稀释为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.3ng/ml、0.4ng/ml、0.5ng/ml，然后将这些稀释后的标准样品分两组，一组通过现有技术中传统的比浊检测试剂(试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球)进行检测，另外一组通过本发明的比浊检测试剂进行检测，检测步骤和加的样品量与实施例1相同，结果如下述表1所示。

表1本发明的比浊检测试剂和传统的比浊检测试剂的对比

通过上述表1可看出，相比现有技术中传统的比浊检测试剂，本发明可以使相同样本的吸光度能够明显提升，能提高试剂盒测试的灵敏度。

对比例2

将上述对比例1中低浓度样本0.1ng/ml增敏后进行重复性(重复 10次)，结果如下述表2所示。

表2标识浓度为0.1ng/ml的样本测吸光度(Δ值)数据如下：

从上述表2可看出，检测发现检测十次后变异系数(CV)为4.43％在10％以内，表明本发明的比浊检测试剂具有良好的重复性。

综上，本发明的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，在传统的试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球比浊检测试剂系统中，分别增加单克隆抗体和与其特异结合的抗单克隆抗体，单克隆抗体、抗单克隆抗体分别能够与试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球结合，相当于抗原在同抗体结合中增加了凝集位点(乳胶颗粒上的单抗与其对应的二抗)，这样即使抗原在浓度很低的时候也会遇到标记的颗粒时迅速凝集，更短的时间内形成更大的免疫复合物，从而达到了增加试剂灵敏度的效果；并且本发明的检测试剂的检测下限低，检测灵敏度高，从而能够更准确地检测病人是否患病。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，包括试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球，所述试剂反应液中还含有与试剂反应液结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体与待检测样品中的抗原结合，且所述单克隆抗体与抗原结合的位点，不与单克隆抗体与抗单克隆抗体的结合位点重复；所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有抗单克隆抗体，所述抗单克隆抗体为与所述单克隆抗体特异结合的抗体，并且所述抗单克隆抗体与所述聚苯乙烯乳胶微球交联；在试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球比浊检测试剂系统中，分别增加单克隆抗体和与其特异结合的抗单克隆抗体，单克隆抗体、抗单克隆抗体分别能够与试剂反应液和聚苯乙烯乳胶微球结合，相当于抗原在同抗体结合中增加了凝集位点。

2.根据权利要求1所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述试剂反应液中含有浓度为40~60ng/ml的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有浓度为20~30ng/ml的抗单克隆抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有与抗单克隆抗体结合的珠子。

5.根据权利要求4所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球中含有浓度为200~300ng/ml的珠子。

6.根据权利要求1所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述抗原为降钙素原或肌钙蛋白；当所述抗原为降钙素原时，所述比浊检测试剂的检测下限为0.1ng/ml，或；

当所述抗原为肌钙蛋白时，所述比浊检测试剂的检测下限为0.01ng/ml。

7.根据权利要求1所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述试剂反应液中含有浓度50ng/ml的单克隆抗体。

8.根据权利要求2所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球中还含有浓度为25ng/ml的抗单克隆抗体。

9.根据权利要求4所述的超敏乳胶增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，所述聚苯乙烯乳胶微球中含有浓度为250ng/ml的珠子。