CN102507918A - 抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 - Google Patents
抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂中的组分包括：缓冲液、无机盐、表面活性剂、防腐剂、干扰清除蛋白、(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球和超纯水；所述R2试剂中的组分包括：缓冲液、无机盐、表面活性剂、防腐剂、抗Anti-CCP的第二抗体和超纯水；并且，所述R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为50～90:10～50。本发明利用胶乳增强免疫透射比浊法并且加入抗Anti-CCP的第二抗体测定Anti-CCP，对检测信号进行两级放大，提高了检测灵敏度，扩大了测定范围；并且可以应用于全自动生化分析仪缩短检测时间，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫体外诊断领域，涉及一种免疫比浊检测试剂，进一步地，本发明涉及抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂盒。
背景技术
抗环瓜氨酸肽抗体(Anti-CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体。临床研究表明，Anti-CCP对类风湿性关节炎（RA）具有良好的敏感性和特异性，并且与RA的活动性及病程进展相关，检测Anti-CCP对于RA的早期诊断和预后评估都很有意义。
目前，临床检测Anti-CCP有两种方法：1. 酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）；2. 电化学发光免疫测定法（Electrochemiluminescence immunoassay，ECLI）。这两种检测方法需要固相或电极支持，都需要特定的检测仪器，并且不能直接上全自动生化分析仪检测。
另外，酶联免疫吸附测定法对样品的单批次测定费用较高。因此，为节约经济成本，检测人员操作时，通常都需要收集到大量样品后才进行一次批量试验。
全自动生化分析仪操作方便快捷、准确度高，作为一种生物检测仪器，已经被广泛应用于生物医药行业。因此，需要研发出一种可以直接应用到全自动生化分析上的Anti-CCP测定试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，该试剂盒基于胶乳增强免疫透射比浊法（PETIA），可普遍用于各类全自动生化分析仪分析，使用时所需的测定时间短，特异性好，精密度高，准确度好。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，
所述R1试剂中的组分包括：
缓冲液0.4%~10%、
无机盐1% ~10%、
表面活性剂0.05%~2%、
防腐剂0.02%~0.2%、
干扰清除蛋白0.02%~0.2%、
(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球0.01%~0.2%、
超纯水77.4%~98.5%；
所述R2试剂中的组分包括：
缓冲液0.4%~10%、
无机盐1%~10%、
表面活性剂0.05%~2%、
防腐剂0.02%~0.2%、
抗Anti-CCP的第二抗体0.001%~0.5%、
超纯水77.3%~98.529%；
并且，所述R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为50～90:10～50。
上述技术方案中，CCP为环瓜氨酸肽的简称，本文其余部分所指相同。PS为聚苯乙烯的简称，即本发明选用聚苯乙烯制备胶乳颗粒，本文其余部分所指相同。所述无机盐是KCl、NaCl、KOH的混合物。
进一步的，所述(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球的直径为60～500nm。
进一步的，所述抗Anti-CCP的第二抗体为非人源抗体或非人源抗体Fab双体片段。具体的，所述抗Anti-CCP的第二抗体可以是兔抗人抗体，鸡抗人抗体，鸭抗人抗体，鹅抗人抗体，羊抗人抗体，鼠抗人抗体，马抗人抗体，Fab双体中的一种。
进一步的，所述缓冲液为PB缓冲液或Goods’缓冲液。
进一步的，所述表面活性剂为TWEEN 20、EMULGEN120 和TX100中的一种。
进一步的，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种。
上述技术方案的技术原理是基于改进的胶乳增强免疫透射比浊法。如果R2试剂中没有抗Anti-CCP的第二抗体，那么在Anti-CCP的含量极少或是极高时，形成的沉淀物Anti-CCP-(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球复合物（即抗体-抗原-PS颗粒复合物）很少，甚至无沉淀物形成，检测试剂将不能准确检测Anti-CCP的含量。因此，本发明技术方案在R2试剂中加入抗Anti-CCP的第二抗体，抗Anti-CCP的第二抗体结合在抗体-抗原-PS颗粒复合物中Anti-CCP的Fc端，发生抗原抗体特异性反应，形成了第二抗体-抗体-抗原-PS颗粒复合物，进一步增强了反应吸光度，放大了检测信号，可极大的提高检测Anti-CCP的灵敏度、扩大测定范围、缩短检测时间。
所以， R2试剂中加入抗Anti-CCP的第二抗体的优点在于“提高检测灵敏度，扩大测定范围，缩短检测时间”。在类风湿关节炎早期，血液中的Anti-CCP含量极少，利用普通胶乳增强免疫透射比浊法有时也难以区分正常人群与早期类风湿关节炎患者。加入第二抗体的检测试剂盒，可以准确检测出Anti-CCP的含量。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）、本发明试剂盒利用胶乳增强免疫透射比浊法测定Anti-CCP，放大检测信号，提高检测灵敏度，缩短检测时间。
（2）、在R2试剂中加入抗Anti-CCP的第二抗体，进一步增强了反应吸光度，放大了检测信号，极大的提高检测Anti-CCP的灵敏度；本发明试剂盒用于Anti-CCP的测定范围为2～200U/ml。
（3）、本发明试剂盒为均匀液相，可以应用到目前存在市场上的所有类型的全自动生化分析仪，使Anti-CCP的测定更为方便和快捷，提高了实验效率。
（4）、使用全自动生化分析仪测定抗环瓜氨酸肽抗体，不仅使操作更为简便，提高自动化程度，而且还节约了少量样品检测实验的经济成本。全自动生化分析仪在多批次对少量样品进行检测，和单批次对大量样品检测的成本几乎相同；因此，全自动生化分析仪可以适用于对少量样品的检测，并且不提高经济成本。
附图说明
附图1为实施例1、实施例2和实施例3中雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml）与吸光光度值的关系变化图。
附图2为对比例1、对比例2和对比例3中雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml）与吸光光度值的关系变化图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，
所述R1试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| PB缓冲液 | 0.4% |
| 无机盐 | 1% |
| TWEEN20 | 0.05% |
| ProClin300 | 0.02% |
| 干扰清除蛋白 （Roche ) | 0.02% |
| (修饰的)CCP至敏的纳米PS微球 | 0.1% |
| 超纯水 | 98.41% |
上述成分混合，即得试剂1；其中，所述(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球可以根据现有技术采用化学交联法制备，其直径为60nm。
所述R2试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| PB缓冲液 | 0.4% |
| 无机盐 | 1% |
| TWEEN 20 | 0.05% |
| ProClin300 | 0.02% |
| 羊抗人IgG-FC抗体 | 0.001% |
| 超纯水 | 98.529% |
上述成分混合，即得试剂2。
使用时，R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为1：1。
所述羊抗人IgG-FC抗体是抗Anti-CCP第二抗体的一种，在具体实施时，也可以用兔抗人抗体，鸡抗人抗体，鸭抗人抗体，鹅抗人抗体，鼠抗人抗体，马抗人抗体等其他非人源抗体或非人源抗体Fab双体片段来代替。
实施例2
抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，
所述R1试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| PB缓冲液 | 5% |
| 无机盐 | 5% |
| Emulgen120 | 1% |
| 叠氮钠 | 0.1% |
| 干扰清除蛋白 (scantibodies) | 0.1% |
| (修饰的)CCP至敏的纳米PS微球 | 0.06% |
| 超纯水 | 88.74% |
上述成分混合，即得试剂1；其中，所述(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球可以根据现有技术采用化学交联法制备，其直径为200nm。
所述R2试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| PB缓冲液 | 5% |
| 无机盐 | 5% |
| EMULGEN120 | 1% |
| 叠氮钠 | 0.1% |
| 羊抗人IgG-FC抗体 | 0.3% |
| 超纯水 | 88.6% |
上述成分混合，即得试剂2。
使用时，R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为5:1。
实施例3
抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，
所述R1试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| Goods’缓冲液 | 10% |
| 无机盐 | 10% |
| TX100 | 2% |
| 硫柳汞 | 0.2% |
| 干扰清除蛋白（Roche ) | 0.2% |
| (修饰的)CCP至敏的纳米PS微球 | 0.05% |
| 超纯水 | 77.55% |
上述成分混合，即得试剂1；其中，所述(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球可以根据现有技术采用化学交联法制备，其直径为500nm。
所述R2试剂中的组分成分（按重量百分数）是：
| PB缓冲液 | 10% |
| 无机盐 | 10% |
| TX100 | 2% |
| 硫柳汞 | 0.2% |
| 羊抗人IgG-FC抗体 | 0.5% |
| 超纯水 | 77.3% |
上述成分混合，即得试剂2。
使用时，R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为9：1。
本实施例检测范围为：2～200u/ml。
将由上述实施例1-实施例3所制备得到的试剂盒，用于测定一系列Anti-CCP浓度已知的混合样本的吸光度变化值（用△A表示）。混合样本的Anti-CCP浓度由雅培试剂测定得到。测定结果见下表：
| 雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml） | 实施例1（△A） | 实施例2（△A） | 实施例3（△A） |
| 0 | 0.0005 | -0.0011 | 0.0021 |
| 4.98 | 245 | 599 | 1257 |
| 25.12 | 449 | 1026 | 1729 |
| 51.07 | 801 | 1437 | 2219 |
| 99.21 | 1382 | 2103 | 2831 |
| 201.36 | 1803 | 2592 | 3314 |
如附图1所示，为根据上表绘制的雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml）与各实施例试剂测定的吸光度变化值的关系图。
对比例
按照下列配方制备不添加第二抗体的Anti-CCP测定试剂盒
| R1试剂 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| Buffer | 0.4%（PB） | 5%（PB） | 10%（Goods’ ） |
| 无机盐 | 1% | 5% | 10% |
| 表面活性剂 | 0.05%（TWEEN20 ） | 1%（EMULGEN120） | 2%（TX100） |
| 防腐剂 | 0.02%（ProClin300） | 0.1%（叠氮钠） | 0.2%（硫柳汞） |
| 干扰清除蛋白 | 0.02%（Roche ) | 0.1%（scantibodies） | 0.2%（Roche ) |
| 超纯水 | 98.51% | 88.80% | 77.60% |
| R2试剂 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| Buffer | 0.4%（PB） | 5%（PB） | 10%（Goods’ ） |
| 无机盐 | 1% | 5% | 10% |
| (修饰的)CCP至敏的纳米PS微球 | 0.1% (Φ60nm) | 0.3% (Φ200nm) | 0.5% (Φ500nm) |
| 表面活性剂 | 0.05%（TWEEN20） | 1%（EMULGEN120） | 2%（TX100） |
| 防腐剂 | 0.02%（ProClin300） | 0.1%（叠氮钠） | 0.2%（硫柳汞） |
| 超纯水 | 98.43% | 88.6% | 77.3% |
| R1：R2(配合比例按重量百分数计) | 1:1 | 5:1 | 9:1 |
将由上述对比例1-对比例3所制备得到的试剂盒，用于测定一系列Anti-CCP浓度已知的混合样本的吸光度变化值（用△A表示）。混合样本的Anti-CCP浓度由雅培试剂测定得到。测定结果见下表：
| 雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml） | 对比例1（△A） | 对比例2（△A） | 对比例3（△A） |
| 0 | -0.0007 | 0.0005 | 0.0019 |
| 4.98 | 29 | 68 | 175 |
| 25.12 | 63 | 134 | 417 |
| 51.07 | 188 | 417 | 891 |
| 99.21 | 446 | 719 | 1790 |
| 201.36 | 838 | 1423 | 3124 |
如附图2所示，为根据上表绘制的雅培试剂测定的混合样本浓度（U/ml）与各对比例制备的试剂盒测定的吸光度变化值的关系图。
如附图1和附图2所示，在Anti-CCP为0-200U/ml的范围内，添加第二抗体的实施例1-实施例3相对于没有添加第二抗体的对比例1-对比例3而言，其灵敏度更高，检测范围更广。
如上所述，便可较好地实现本发明。
Claims (6)
1.抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂，
所述R1试剂中的组分包括：
缓冲液0.4%~10%、
无机盐1% ~10%、
表面活性剂0.05%~2%、
防腐剂0.02%~0.2%、
干扰清除蛋白0.02%~0.2%、
(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球0.01%~0.2%、
超纯水77.4%~98.5%；
所述R2试剂中的组分包括：
缓冲液0.4%~10%、
无机盐1%~10%、
表面活性剂0.05%~2%、
防腐剂0.02%~0.2%、
抗Anti-CCP的第二抗体0.001%~0.5%、
超纯水77.3%~98.529%；
并且，所述R1试剂和R2试剂的配合比例按重量百分数计为50～90:10～50。
2.如权利要求1所述的抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，所述(修饰的)CCP至敏的纳米PS微球的直径为60～500nm。
3.如权利要求1或2所述的抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，所述抗Anti-CCP的第二抗体为非人源抗体或非人源抗体Fab双体片段。
4.如权利要求1或2所述的抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PB缓冲液或Goods’缓冲液。
5.如权利要求1或2所述的抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为TWEEN 20、EMULGEN120 和TX100中的一种。
6.如权利要求1或2所述的抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种。
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Date of cancellation: 20171222 Granted publication date: 20141029 Pledgee: Chengdu technology transfer (Group) Co., Ltd. Pledgor: SICHUAN XINJIAN KANGCHENG BIOLOGICAL CO., LTD. Registration number: 2016990001096 |
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