JP6749337B2 - 前立腺抗原標準およびその使用 - Google Patents

Description

総前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血中濃度の上昇は、前立腺がん等の前立腺関連の障害と関連付けられる。ヒトカリクレイン２（ｈＫ２）の測定と共に、ＰＳＡのアイソフォームのレベルを別々に測定することは、対象者中の前立腺がんの存在に関連する予測の改善につながるという重大な証拠がある。一般に、ＰＳＡアイソフォームおよびｈＫ２等の前立腺抗原のレベルの上昇を測定するためのアッセイは、抗原標準曲線を利用して前立腺抗原レベルを定量化する。

本開示の態様は、前立腺アッセイに現在使用されている標準が、対費用効果が高くない大量の前立腺抗原の使用を必要とするという認識に関連する。更に、現在使用されているアッセイでの標準に包含される濃度の広範囲さにより、抗原濃度の定量化が不正確になる可能性がある。なぜならば、この標準の範囲は、典型的な臨床試料中に存在する抗原の量と適切に整合されていないからである。従って、対費用効果が高く、かつ抗原レベルの定量化の正確度を高める新規の標準の必要性が認識されている。

前立腺抗原レベルを定量化するための多くのアッセイは、検出された抗原シグナルと標準抗原濃度のセットから得られた値のセットとの比較に依存する。しかしながら、現在使用されているアッセイは大量の前立腺抗原標準を必要とすることから対費用効果が高くはない。例えば、いくつかの前立腺抗原試験は、１回のアッセイ当たり最大３５０ｎｇ／ｍＬのｉＰＳＡまたは最大２２ｎｇ／ｍＬのｈＫ２の最高濃度を有する標準に依存する。更に、現在使用されている抗原標準に包含される大きな前立腺抗原範囲により、試料中の前立腺抗原レベルの定量化が不正確になる可能性があり、かつ誤診のリスクが増加する可能性がある。本開示は、前立腺抗原レベルの定量化の改善のための対費用効果が高い組成物および方法を提供することにより、これらの問題を解決する。

従って、一態様では、本開示は前立腺抗原のレベルを定量化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、免疫測定法を実施して試料中の前立腺抗原の存在を検出するステップと、同じ免疫測定法を使用して検出した有益な前立腺抗原標準の最小セットに照らして、試料中で検出した前立腺抗原のレベルを定量化するステップとを含む。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは、所定量の前立腺抗原を含む少なくとも２種の力価を含み、このセットの最大力価はｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の７５倍超との間である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価の量は免疫測定法の定量化限界未満である。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の年齢中央値は６０〜７０歳の範囲である。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の下位四分位の年齢は５５〜６５歳の範囲である。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の上位四分位の年齢は６５〜７５歳の範囲である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｉＰＳＡまたはｈＫ２である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．０２５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は１５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｈＫ２である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．００２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは前立腺抗原標準の７種の力価からなる。いくつかの実施形態では、前立腺抗原標準の各中間の力価は、対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離である。いくつかの実施形態では、免疫測定法は、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、サンドイッチ法、ウエスタンブロット法および免疫沈降法（ＩＰＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫測定法はＤＥＬＦＩＡ（登録商標）である。いくつかの実施形態では、免疫測定法はＥＬＩＳＡである。いくつかの実施形態では、試料をヒト対象者から得る。いくつかの実施形態では、試料は前立腺組織生検である。いくつかの実施形態では、試料は血液試料または血漿試料である。

いくつかの態様では、本開示は、前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原検出キットであって、免疫測定法を使用して試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための有益な前立腺抗原標準の最小セットを含み、各前立腺抗原標準は溶液として容器中に存在する、キットを提供する。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは、所定量の前立腺抗原を含む少なくとも２種の力価を含み、このセットの最大力価はｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の７５倍超との間である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価の量は免疫測定法の定量化限界未満である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｉＰＳＡまたはｈＫ２である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．０２５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は１５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｈＫ２である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．００２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは前立腺抗原標準の７種の力価からなる。いくつかの実施形態では、前立腺抗原標準の各中間の力価は、対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離である。

いくつかの態様では、本開示は、試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原標準を調製する方法であって、（ｉ）前立腺がんと関連付けられた抗原を得るステップと、（ｉｉ）適切な緩衝液中の抗原のストック溶液を調製するステップであり、このストック溶液は、ｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の７５倍超との間の力価である、調製するステップと、（ｉｉｉ）前立腺抗原標準の各中間の力価が対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離であるように、ストック溶液の連続希釈により前立腺抗原標準の最小セットを調製するステップとを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の年齢中央値は６０〜７０歳の範囲である。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の下位四分位の年齢は５５〜６５歳の範囲である。いくつかの実施形態では、対象者の標的集団は複数の男性からなり、これらの男性の上位四分位の年齢は６５〜７５歳の範囲である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｉＰＳＡまたはｈＫ２である。いくつかの実施形態では、前立腺抗原は無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．０２５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は１５ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、前立腺抗原はｈＫ２である。いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価は０．００２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は８ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ。いくつかの実施形態では、有益な前立腺抗原標準の最小セットは前立腺抗原標準の７種の力価からなる。いくつかの実施形態では、前立腺抗原標準の各中間の力価は、対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離である。

対象者の集団（Ｎ＝１０１２）のｈＫ２レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す非限定的な箱ひげ図である。 対象者の集団（Ｎ＝１０１２）のｉＰＳＡレベル（ｎｇ／ｍＬ）を示す非限定的な箱ひげ図である。

本開示の態様は、試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための標準を提供する。本開示で説明されている標準は、現在使用されている標準を上回る改善を示す。なぜならば、本開示で説明されている標準は対費用効果が高く（例えば、必要な前立腺抗原の量がより低い）、かつ前立腺抗原の臨床的に意義のある範囲とより密接に整合されている値のセットを提供するからである。本開示はその一部が、力価範囲を有益な前立腺抗原標準の最小セットに検定することにより費用が著しく削減され、同時に前立腺レベルの定量化の正確度が高められるという認識に関連する。そのため、いくつかの態様では、本開示は、前立腺抗原のレベルを定量化する改善された方法を提供する。この方法は概して、免疫測定法を実施して試料中の前立腺抗原の存在を検出するステップと、同じ免疫測定法を使用して検出した有益な前立腺抗原標準の最小セットに照らして、試料中で検出した前立腺抗原のレベルを定量化するステップとを含む。

本明細書で使用する場合、「有益な前立腺抗原標準の最小セット」とは、所定量の前立腺抗原を含む少なくとも２種の力価を含む特定の免疫測定法用の前立腺抗原標準のセットのことであり、このセットの最小力価の量は免疫測定法の定量化限界未満であり、このセットの最大力価の量はｉ）対象者の標的集団（例えば、前立腺がんを有する疑いがあるまたは生検を必要とする複数の男性）の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の１００倍超との間である。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は、ｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の７５倍超との間である。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は、ｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の５０倍超との間である。いくつかの実施形態では、このセットの最大力価は、ｉ）対象者の標的集団の上位四分位の血中前立腺抗原濃度とｉｉ）その血中前立腺抗原濃度の２５倍超との間である。

いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価の量は免疫測定法の定量化限界未満である。本明細書で使用する場合、用語「定量化限界」は、免疫測定法を使用することにより検出可能なおよび定量化可能な物質の最少量を意味する。いくつかの実施形態では、定量化限界とは、免疫測定法を使用することにより２５％未満、１５％未満、５％未満または１％未満の変動係数で検出可能なおよび定量化可能な物質の最少量のことである。

いくつかの実施形態では、このセットの最小の非ゼロ力価の量は免疫測定法の検出限界未満である。本明細書で使用する場合、用語「検出限界」は、免疫測定法を使用することにより検出可能ではあるが必ずしも定量化可能ではない物質の最少量を意味する。

前立腺抗原標準
いくつかの態様では、本開示は、試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原標準を提供する。本明細書で使用する場合、「前立腺抗原標準」とは、未知の量の前立腺抗原を測定することができる基準を確立するのに適した前立腺抗原の実質的に均質な調製物のことである。いくつかの実施形態では、前立腺抗原標準は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％純粋である前立腺抗原の調製物を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、この標準は、試験する試料（例えば、血液試料、血清試料、尿試料または血漿試料）の培地と類似の培地（例えば溶液）中の前立腺抗原の均質な調製物を含む。例えば、前立腺抗原標準を、本来ならば前立腺抗原を含まない血液試料、血清試料、尿試料または血漿試料に添加することができる。このようにして、前立腺抗原標準のバックグラウンドと未知の試料とは類似しているか同じであり、検出および定量化の正確度を向上させることができる。

いくつかの実施形態では、濃度曲線を使用して試料中の特定の抗原の濃度を決定する。例えば、抗原の複数の既知の濃度（例えば抗原濃度のセット）に対して相対蛍光単位（ＲＦＵ）をプロットすることにより、濃度曲線を作ることができる。次いで、未知の抗原濃度を有する試料から得られたＲＦＵ値を濃度曲線と比較して、試料の抗原濃度を決定することができる。

いくつかの実施形態では、標準物質は抗原力価のセットを含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原のセット」は複数の別々の抗体力価を意味する。いくつかの実施形態では、セットの各抗原力価は別々の容器に収容されている。いくつかの実施形態では、抗原標準のセットの最大抗原濃度と比べて高い抗原力価を有するマスターストックから、このセットを作る。いくつかの実施形態では、マスターストックを連続的に希釈することにより、このストックから抗原標準のセットを作る。いくつかの実施形態では、抗原のセットの最大抗原濃度で抗原濃度を有するマスターストックから、このセットを作る。いくつかの実施形態では、抗原のセットは１〜２０種の抗原力価、５〜１５種の抗原力価または８〜１２種の抗原力価である。いくつかの実施形態では、抗原のセットは１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種または２０種の抗原力価である。

いくつかの態様では、本開示は、前立腺抗原標準の最小セットを確立することにより費用が著しく削減され、同時に前立腺抗原レベルの定量化の正確度が高められるという発見に関する。本明細書で使用する場合、用語「有益な」は、未知の抗原量または抗原濃度を有する試料中の抗原の臨床的に意義のある定量化を提供するための抗原または抗原のセットの特徴を意味する。例えば、広範囲の抗原濃度を有する標準から、値の有効範囲から外れる臨床的に意義のある抗原濃度を有する値のセット（例えば濃度曲線）が作られる場合がある。このことは、提供される値の予測力を低下させる可能性があり、そのためあまり有益ではない傾向がある。一方、抗原濃度の範囲が標的集団での抗原量または抗原濃度とおそらく一致している標準の使用は有益である。なぜならば、結果として得られる値（例えば濃度曲線）は、この値（曲線）の有効範囲に含まれる臨床的に意義のある抗原濃度の数がより多いからである。

いくつかの態様では、本開示は、有益な前立腺抗原濃度のセットでの前立腺抗原濃度の分布に関する。いくつかの実施形態では、セットの各有益な前立腺抗原濃度は、この前立腺抗原濃度の上および／または下の有益な前立腺抗原濃度から等距離である。本明細書で使用する場合、用語「等距離」は前立腺抗原濃度間の単位数を意味する。例えば、濃度１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬおよび４ｎｇ／ｍＬはそれぞれ、線形スケール上での上および／または下の濃度から等距離（即ち１ｎｇ／ｍＬ）である。単位を、線形スケールまたは対数スケール（例えばｌｏｇ_１０、自然対数（ＬＮ）等）等の任意の適切なスケール上で測定することができる。いくつかの実施形態では、セットの各有益な前立腺抗原濃度は、対数スケール上でのこの有益な前立腺抗原濃度の上および／または下の有益な前立腺抗原濃度から等距離である。例えば、ｉＰＳＡ抗原の有益なセットは、０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬであることができる。別の例として、ｈＫ２抗原の有益なセットは、０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬであることができる。連続希釈等の任意の適切な方法により、またはある量の抗原を適切な緩衝液に溶解させて有益な抗原濃度を有する溶液を得ることにより、抗原の等距離の濃度を調製することができる。

様々なタイプの抗原が本開示により意図される。抗原の例として、ペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質および小分子（例えばハプテン）が挙げられるがこれらに限定されない。抗原の他の非限定的な例として、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド等の核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、前立腺抗原を含む標準を提供する。本明細書で使用する場合、用語「前立腺抗原」は、対象者の前立腺中で産生されるまたは発現される抗原を意味する。前立腺抗原の例として、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、標準物質はｉＰＳＡ濃度の有益なセットを含む。いくつかの実施形態では、標準物質はｈＫ２濃度の有益なセットを含む。

本明細書で使用する場合、用語「対象者」は、がんを有するもしくはがんを有する疑いがあるまたはがんの検査を受けている哺乳動物を意味する。対象者の例として、ヒト、非ヒト霊長類（例えばマーモセットおよびサル）、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウスが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象者はヒト対象者である。いくつかの実施形態では、対象者は、前立腺がんを有するまたは前立腺がんを有する疑いがあるヒトである。いくつかの実施形態では、対象者は、前立腺がんの検査を受けているヒトである。ヒト対象者は前立腺がんの徴候または症状を示してもよいし示さなくてもよく、この徴候または症状として、（特に夜間に）頻繁に排尿する必要性、排尿を始めるもしくは尿を我慢する困難さ、流れが弱いもしくは途切れる尿、痛みを伴うもしくは焼けるような排尿、勃起困難、痛みを伴う射精、および／または尿中のもしくは精液中の血液が挙げられる。

標準物質用の容器も本開示により意図される。本明細書で説明されている標準物質を任意の適切な容器に入れることができる。適切な容器の非限定的な例として、バイアル（例えばガラスバイアルまたはプラスチックバイアル）、試験管、ブリスターパック、ボトル、パウチおよびアッセイプレートが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原濃度のセット（例えば有益な前立腺抗原濃度のセット）を複数の容器に収容することができる。例えば、７種の有益な前立腺抗原標準のセットを７個の封管中で保管することができ、各封管には１種のみの有益な前立腺抗原標準が収容されている。一般に、標準物質は、容器に入っている間は液相である。しかしながら、標準物質（例えばタンパク質抗原）を粉末形態（例えば凍結乾燥の形）で収容し、適切な量の溶媒（例えば水または緩衝溶液）で有益な抗原濃度へと再構成することができることが当業者により認識される。

いくつかの実施形態では、本開示は、標準物質を含むキットに関する。キットは、標準物質と、アッセイを実施するための関連機器（例えば、アッセイプレート、適切な緩衝液、試料採集用の器具および装置等）と、この標準物質を使用してアッセイを実施するための指示書とを含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示は複数の容器を有するキットを提供し、各容器には標準物質が収容されている。いくつかの実施形態では、各容器は、有益な前立腺抗原濃度のセットのある有益な前立腺抗原濃度を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されているキットは、試料から前立腺抗原のレベルを定量化するための指示書を更に含む。

前立腺抗原標準を調製する方法も本開示により意図される。いくつかの実施形態では、本開示は、前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原標準を調製する方法であって、（ｉ）前立腺がんと関連付けられた抗原を得るステップと、（ｉｉ）適切な緩衝液中のまたは溶媒中のこの抗原のストック溶液を調製するステップと、（ｉｉｉ）このストック溶液から有益な濃度のセットを調製するステップであり、このセットの各有益な濃度は、対数スケール上でのこの濃度の上および／または下の濃度から等距離である濃度を有する、調製するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前立腺がんと関連付けられた抗原は前立腺抗原である。いくつかの実施形態では、この前立腺抗原は、ｔＰＳＡ、ｆＰＳＡ、ｉＰＳＡおよびｈＫ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この前立腺抗原はｉＰＳＡまたはｈＫ２である。適切な緩衝液および／または溶媒の非限定的な例として、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が挙げられる。例えば、複数の有益な抗原濃度に達するようにストック溶液を連続的に希釈することにより、このストック溶液から有益な抗原濃度のセットを調製することができる。

前立腺抗原レベルの定量化のためのアッセイ
いくつかの態様では、本開示は、前立腺抗原レベルを定量化する方法に関する。本開示はその一部が、本開示により説明されている前立腺抗原標準が、現在使用されている前立腺抗原標準と比べて対費用効果が高くて前立腺抗原の正確な定量化を可能にするという発見に基づいている。

従って、いくつかの態様では、本開示は、前立腺抗原のレベルを定量化する方法であって、免疫測定法を実施して試料中の前立腺抗原の存在を検出するステップと、この免疫測定法による有益な前立腺抗原濃度のセットの検出に由来の値に基づいて、試料中で検出した前立腺抗原のレベルを定量化するステップとを含む方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、抗原濃度の有益なセットはｉＰＳＡ濃度の有益なセットである。いくつかの実施形態では、抗原濃度の有益なセットはｈＫ２濃度の有益なセットである。

前立腺抗原の存在を検出するための更なる方法が、例えば２０１４年３月２８日に出願された米国特許出願第６１／９７２，０９９号明細書で開示されており、この明細書の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

免疫測定法
前立腺特異抗原（例えば、ｔＰＳＡ、ｉＰＳＡ、ｆＰＳＡおよびｈＫ２）のレベルは、任意の適切な方法によって評価することができる。いくつかの実施形態では、免疫測定法での使用に適した抗体または抗原結合フラグメントが提供される。そのような抗体または抗原結合フラグメントを利用する免疫測定法は、直接または間接形式での競合および非競合免疫測定法であり得る。そのような免疫測定法の非限定的な例は、解離増強型ランタニド蛍光免疫測定法（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標））、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、サンドイッチ法（イムノメトリック法）、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学、免疫顕微鏡法、側方流動免疫クロマトグラフィー法およびプロテオミクス配列である。

いくつかの実施形態では、この免疫測定法はＤＥＬＦＩＡ（登録商標）である。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（解離増強型ランタニド蛍光免疫測定法）は、ランタニドキレート標識試薬を使用して化合物または生体分子の存在を検出するように設計されている時間分解蛍光（ＴＲＦ）強度技術である。ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイは柔軟性があり、様々なプレートリーダーに対応しており、洗浄ベースの技術として、様々な試料タイプ（例えば、血液、血清、血漿、細胞等）に対応している。この技術は、ランタニドキレート（ユーロピウム、サマリウムおよびテルビウム）の蛍光に基づく。このランタニドキレート標識の蛍光減衰時間は従来のフルオロフォアと比べてはるかに長く、自家蛍光バックグラウンドの低減のための時間分解能の効率的な使用が可能になる。大きなＳｔｏｋｅｓシフト（励起波長と発光波長との間の差異）および狭い発光ピークは、信号対ノイズ比の増加に寄与する。解離増強原理（即ち、ランタニドキレートが解離されて新規の高蛍光キレートが保護ミセル溶液に形成される）により、感度が更に増加される。従来のＥＬＩＳＡとは異なり、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）は、検出可能なシグナルを生成するための酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））の使用を伴わない。

抗原もしくは抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、固相担体（例えば、キャリア、膜、柱、プロテオミクス配列など）と結合させることによって、固定化することができる。固相担体物質の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、ニトロセルローズなどの天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびにマグネタイトなどを含む。担体の性質は、溶液中で固定しているかまたは浮遊しているもの（例えば、ビーズ）であり得る。

いくつかの実施形態では、標識抗体または抗原結合フラグメントは、抗原結合抗体複合体を検出するためのトレーサーとして使用することができる。トレーサーを生成するために使用できる標識のタイプの例は、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、磁性および化学発光化合物ならびに生物発光化合物を含む。放射性標識抗体は、^１５３Ｅｕ、^３Ｈ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^５９Ｆｅまたは^１２５Ｉなどの放射性同位元素を結合することによって、公知の方法で製剤化され、次いで、ガンマカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーによって検出することができる。本明細書で論じられるように、抗体および抗原結合フラグメントは、代わりに、酵母アルコール脱水素酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび同様のものなどの酵素で標識し、次いで、成長させ、分光光度法でまたは視覚的に検出することができる。適切な蛍光標識は、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ローダミンおよび同様のものを含む。適切な化学発光標識は、ルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステル、ルシフェリンおよびその他を含む。

免疫測定法は、抗体または抗原結合フラグメントと抗原との結合複合体の形成を可能にするという条件の下で、抗原を含む試料（例えば、血漿試料）を抗体または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２）と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、血漿試料は、抗原が試料中に存在する場合は、標的抗原との抗体または抗原結合フラグメントの結合に適した条件の下で、抗体または抗原結合フラグメントと接触させる。このことは、試験管、プレートウェル、膜槽、細胞培養皿、顕微鏡スライドおよび他のチャンバなどの反応チャンバで実行することができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、固相担体上に固定化される。試料中の抗原と結合する抗体または抗原結合フラグメントは、捕捉抗体と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、タグに関与する相互作用（例えば、ストレプトアビジンが固相担体に固定化されるビオチンストレプトアビジン相互作用）によって固相担体へのその固定化を促進するタグ（例えば、ビオチン標識）を含む。いくつかの実施形態では、固相担体は、反応チャンバの表面である。いくつかの実施形態では、固相担体は、高分子膜（例えば、ニトロセルローズストリップ、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜など）のものである。他の実施形態では、固相担体は、生物学的構造（例えば、細菌細胞表面）である。他の例示的な固相担体は、本明細書で開示され、当業者に明らかである。

いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、抗原と接触させる前に固相担体上に固定化される。他の実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントの固定化は、結合複合体の形成後に実行される。さらなる他の実施形態では、抗原は、結合複合体の形成前に固相担体上に固定化される。いくつかの実施形態では、固定化された結合複合体を検出するために、トレーサーを反応チャンバに添加することができる。いくつかの実施形態では、トレーサーは、抗原に対する検出可能に標識された二次抗体を含む。いくつかの実施形態では、トレーサーは、捕捉抗体に対する検出可能に標識された二次抗体を含む。いくつかの実施形態では、一次抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体が検出可能に標識される。

一実施形態では、本明細書で開示される免疫測定法は、抗体または抗原結合フラグメントを固相担体に固定化するステップと、試料中に存在する場合は、抗体または抗原結合フラグメントとの抗原の結合を可能にするという条件の下で、試料（例えば、血漿試料）を固相担体に加えるステップと、固相担体から余分な試料を取り除くステップと、抗原結合固定化抗体または抗原結合フラグメントとのトレーサーの結合を可能にするという条件の下で、トレーサー（例えば、検出可能に標識された抗体または抗原結合フラグメント）を加えるステップと、固相担体を洗浄するステップと、存在トレーサーをアッセイするステップとを含む。

いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、反応チャンバで抗原と接触させた後に固相担体上に固定化される。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、反応チャンバで抗原と接触させる前に固相担体上に固定化される。いずれの場合も、固定化された結合複合体を検出するために、トレーサーを反応チャンバに添加することができる。いくつかの実施形態では、トレーサーは、抗原に対する検出可能に標識された二次抗体を含む。いくつかの実施形態では、トレーサーは、一次抗体または抗原結合フラグメントに対する検出可能に標識された二次抗体を含む。本明細書で開示されるように、検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア、発光性分子、酵素、ビオチン部分、エピトープタグまたは色素分子であり得る。適切な検出可能な標識は、本明細書で説明される。

いくつかの実施形態では、低ｐＨ緩衝液中で免疫測定法を実行することは、より感度の高い抗原検出につながることが分かっている。それに従って、いくつかの実施形態では、トレーサーが捕捉抗体抗原複合体と結合するように、トレーサー抗体は、６．５から７．７５未満の範囲のｐＨを有する緩衝液中で捕捉抗体と接触させる。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５または７．６である。

本明細書で開示されるいかなるアッセイでも、捕捉抗体はトレーサー抗体と交換できることを理解すべきである。

いくつかの実施形態では、ｆＰＳＡのレベルを測定する免疫測定法は、第１の捕捉抗体がｆＰＳＡと結合し、それにより、捕捉抗体ｆＰＳＡ複合体が生成されるという条件の下で、血漿試料中に存在するｆＰＳＡをｆＰＳＡに特異的な捕捉抗体と接触させるステップと、トレーサーを使用して捕捉抗体ｆＰＳＡ複合体を検出するステップとを伴う。捕捉抗体は、Ｈ１１７抗体であり得る。いくつかの実施形態では、トレーサーは、５Ａ１０抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）フラグメント）を含む。いくつかの実施形態では、このトレーサーは、５Ａ１０抗体との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体またはそのフラグメント（例えばＦ（ａｂ）フラグメント）を含む。いくつかの実施形態では、このトレーサーは、５Ａ１０抗体との少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体またはそのフラグメント（例えばＦ（ａｂ）フラグメント）を含む。

フラグメントに組み込むことができる５Ａ１０抗体の重鎖および軽鎖配列を以下に示す。
５Ａ１０重鎖

５Ａ１０軽鎖

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＡのレベルを測定する免疫測定法は、第２の捕捉抗体が少なくともｉＰＳＡと結合し、それにより、捕捉抗体ｉＰＳＡ複合体が生成されるという条件の下で、血漿試料中に存在するｉＰＳＡを遊離ＰＳＡ（ｉＰＳＡおよび切断ＰＳＡを含む）に特異的な捕捉抗体と接触させるステップと、第２のトレーサーを使用して捕捉抗体ｉＰＳＡ複合体を検出するステップとを伴う。いくつかの実施形態では、トレーサーは、４Ｄ４抗体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、５Ａ１０抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）フラグメント）である。

いくつかの実施形態では、ｔＰＳＡのレベルを測定する免疫測定法は、第３の捕捉抗体がｔＰＳＡと結合し、それにより、捕捉抗体ｔＰＳＡ複合体が生成されるという条件の下で、血漿試料中に存在するｔＰＳＡをｔＰＳＡに特異的な捕捉抗体と接触させるステップと、第３のトレーサーを使用して捕捉抗体ｔＰＳＡ複合体を検出するステップとを伴う。いくつかの実施形態では、トレーサーは、Ｈ５０抗体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、Ｈ１１７抗体である。

いくつかの実施形態では、ｈＫ２のレベルを測定する免疫測定法は、血漿試料中に存在するＰＳＡをＰＳＡに特異的な遮断抗体と接触させるステップと、第４の捕捉抗体がｈＫ２と結合し、それにより、捕捉抗体ｈＫ２複合体が生成されるという条件の下で、血漿試料中に存在するｈＫ２をｈＫ２に特異的な第４の捕捉抗体と接触させるステップと、第４のトレーサーを使用して捕捉抗体ｈＫ２複合体を検出するステップとを伴う。いくつかの実施形態では、トレーサーは、７Ｇ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、６Ｈ１０Ｆ（ａｂ）_２である。いくつかの実施形態では、遮断抗体は、５Ｈ７抗体、５Ｈ６抗体および２Ｅ９抗体を含む。

以下の表１は、本明細書で開示される方法で使用できる抗体および抗原結合フラグメントならびにそれらに対応するエピトープをリストする。

いくつかの態様では、本開示は、試料中の抗原のレベルを定量化するための免疫測定法の使用に関する。本明細書で使用する場合、用語「定量化」は、抗原の有益な濃度のセットを有する前立腺抗原標準に基づく試料中の抗原の量または濃度の決定を意味する。例えば、有益なｉＰＳＡ濃度のセットと検出可能な抗体とを接触させるステップと、各抗体に結合した有益なｉＰＳＡの濃度の検出可能な出力に基づいて値のセット（例えば濃度曲線）を作るステップと、未知のｉＰＳＡ濃度を有する試料と検出可能な抗体とを接触させるステップと、試料の抗体に結合したｉＰＳＡの検出可能な出力を測定するステップと、有益な濃度の検出により作られた値のセットとの比較に基づいて試料のｉＰＳＡレベルを定量化するステップとにより、ｉＰＳＡのレベルを定量化することができる。

いくつかの実施形態では、抗体の検出可能な出力を得ることにより値のセットを作る。いくつかの実施形態では、蛍光リーダー（例えば蛍光顕微鏡）、マイクロプレートリーダーおよび／またはＵＶ分光光度計により、検出可能な出力を得る。いくつかの実施形態では、蛍光リーダーはコンピュータに接続されている。いくつかの実施形態では、このコンピュータは、検出可能な出力からの濃度曲線の算出用のソフトウェア（例えば、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ（商標）またはＧｅｎ５ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む。

本開示の態様はコンピュータを使用して実行され得る。例えば、試料中の前立腺抗原の免疫測定法による測定結果を得るステップと、コンピュータを使用して、この測定結果と前立腺抗原標準の最小セット中の前立腺抗原の量とを比較するステップとにより、前立腺抗原標準に照らして試料中の前立腺抗原の量を決定することができる。例えば、本開示によって説明されているコンピュータシステムを使用して、抗体−抗原結合の出力を検出することができる、または有益な抗原濃度のセットから得られる出力値を使用して標準曲線を作ることができる。このコンピュータシステムは、１つまたは複数のプロセッサと、１つまたは複数のコンピュータ可読の非一時的な記憶媒体（例えば、メモリおよび１つもしくは複数の不揮発性記憶媒体）とを含むことができる。このプロセッサは、任意の適切な方法で、メモリおよび不揮発性記憶装置へのデータの書き込みならびにこのメモリおよび不揮発性記憶装置からのデータの読み取りを制御することができるが、本明細書で説明されている本開示の態様はこの点において限定されない。

本明細書で説明されている機能のいずれかを実施するために、例えば有益な前立腺抗原の最小セットに基づいて前立腺レベルを算出するために、このプロセッサは、１つまたは複数のコンピュータ可読記憶媒体（例えばメモリ）中に格納されている１つまたは複数の命令（例えばプログラムモジュール）を実行することができ、このコンピュータ可読記憶媒体は、このプロセッサによる実行のための命令を格納する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体として機能することができる。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行するかまたは特定の抽象データタイプを実装するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。また、実施形態は、通信ネットワークを通じてリンクされるリモート処理デバイスによってタスクが実行される分散コンピューティング環境で実装することもできる。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、記憶装置を含むローカルおよびリモートコンピュータ記憶媒体の両方に位置し得る。データ入力およびプログラムコマンドは、コンピュータによって、入力インタフェースを通じて受信することができる。入力インタフェースは、キーボード、タッチスクリーン、ＵＳＢポート、ＣＤドライブ、ＤＶＤドライブまたは他の入力インタフェースを含み得る。

上記で説明されている特徴のうちの１つまたは複数を用いて様々な実施形態を形成することができることを理解すべきである。上記の態様および特徴を任意の適切な組合せで採用することができるが、本開示はこの点において限定されない。また、様々な実施形態に組み込まれ得る様々なコンポーネントおよび特徴を図面が示すことも理解すべきである。分かり易いように、図面のいくつかは、２つ以上の任意選択的な特徴またはコンポーネントを示すことができる。しかしながら、本開示は、図面で開示されている特定の実施形態に限定されない。本開示はいずれか１つの図面で示されているコンポーネントの一部のみを含み得る実施形態を包含することおよび／または複数の異なる図面で示されているコンポーネントを組み合わせる実施形態も包含し得ることを認識すべきである。

実施例１：ＰＳＡおよびヒトカリクレイン２の配列
ＰＳＡタンパク質（配列番号３）

ｈＫ２タンパク質（配列番号４）

実施例２：前立腺抗原を検出するための改善された標準物質
従来のＰＳＡ標準は１６６〜３５０ｎｇ／ｍＬの範囲の最大濃度を有した。本実施例は、表２に示すように、１５ｎｇ／ｍＬの最大濃度の連続希釈によるｉＰＳＡ標準の再構成を説明する。下記に示す有益なセットは、従来の標準セットを上回るいくつかの利点を提供する。第１に、最大ｉＰＳＡ濃度の低下は、必要とされる抗原がより少ないことから費用を約１１〜２３倍削減する。第２に、アッセイ範囲の縮小により、検定曲線のより多くの点（例えば値）を前立腺がんの診断用のｉＰＳＡ濃度の臨床的に意義のある範囲に含めることが可能になる。最後に、７種の連続的に希釈された濃度（例えば等距離の濃度）の使用により、セットから検出された生のシグナル値上に仕様を置くことが可能になり、標準のロット間およびアッセイの実行間の品質管理が改善される。

ヒトカリクレイン２（ｈＫ２）標準を同じような方法で再構成した。表３に示すように、従来の利用可能なｈＫ２標準は１３．１ｎｇ／ｍＬ〜２２．７ｎｇ／ｍＬの最大濃度を有する。下記に示す有益なセットは、従来の標準セットを上回るいくつかの利点を提供する。第１に、最大ｈＫ２濃度の低下は、必要とされる抗原がより少ないことから費用を約１．６〜２．８倍削減する。第２に、アッセイ範囲の縮小により、検定曲線のより多くの点（例えば値）を前立腺がんの診断用のｈＫ２濃度の臨床的に意義のある範囲に含めることが可能になる。最後に、７種の連続的に希釈された濃度（例えば等距離の濃度）の使用により、セットから検出された生のシグナル値上に仕様を置くことが可能になり、標準のロット間およびアッセイの実行間の品質管理が改善される。

実施例３：４Ｋスコアアッセイ（４Ｋｓｃｏｒｅ Ａｓｓａｙ）でのｉＰＳＡ標準およびｈＫ２標準の使用
本実施例は、４Ｋスコア検定（４Ｋｓｃｏｒｅ Ｔｅｓｔ）での上記で説明したｉＰＳＡ標準およびｈＫ２標準の使用を説明する。４Ｋスコア検定は、血液試料中の前立腺に関連付けられた４種のカリクレインタンパク質（総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）、無傷ＰＳＡ（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２））の測定ならびに下記の臨床情報：以前の陰性生検の有り（または無し）、患者の年齢および直腸指診（ＤＲＥ）状態時の小結節の観測（または無し）を含むアルゴリズムから得られる、検定された多変量の個別化リスクスコアである。このアルゴリズムは、仮に前立腺生検を実施すれば悪性度の高いがん（グリーソンスコア７）を発見するリスク確率を算出する。この検定は、前立腺生検を続けるかどうかに関する臨床判断の補助として使用されることを目的としている。

ｔＰＳＡおよびｆＰＳＡの濃度を、ＦＤＡによりヒト診断での使用が承認されている市販のアッセイ（Ｒｏｃｈｅ（商標）Ｃｏｂａｓ（登録商標）機器およびＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ）により決定する。ｉＰＳＡおよびｈＫ２の濃度を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）ＡｕｔｏＤＥＬＦＩＡ（登録商標）機器で実行するために開発された試験を使用して決定する。

静脈血試料をＫ_２ＥＤＴＡ管中に採取する。この管のサイズは、血液約７．５ｍＬ（血液５ｍＬ以上）の採取を可能にするのに十分な大きさでなければならない。ＥＤＴＡとの良好な混合を確実にするために、試料採取直後に血液の管を８回反転させなければならない。この血液量により、十分な血漿を得ることができることが保証される。４種のカリクレインマーカーの単回の測定には血漿約１ｍＬが必要である。必要な場合には、血漿２ミリリットル（２ｍＬ）でアッセイを再実行することができる。

サンドイッチ（非競合）免疫測定法によりｉＰＳＡおよびｈＫ２の存在を検出する。ｉＰＳＡアッセイは、２種の異なるマウスモノクローナル抗体産物を採用する。捕捉プローブは、ｆＰＳＡ（ｉＰＳＡがコンポーネントである）に対する特異性を有するモノクローナル抗体５Ａ１０のビオチン化組換えＨｉｓ_６−Ｃｙｓタグ付きＦａｂフラグメントである。トレーサーは、ｉＰＳＡおよび複合体化ＰＳＡ（ＰＳＡ−ＡＣＴ）に対する特異性を有するユーロピウム標識モノクローナル抗体４Ｄ４である。組み合わせると、試薬はｉＰＳＡに特異的である。ｈＫ２アッセイは、５種の異なるマウスモノクローナル抗体産物を採用する。捕捉プローブは、ｈＫ２およびｔＰＳＡに対する特異性を有する６Ｈ１０モノクローナル抗体のビオチン化Ｆ（ａｂ）２フラグメントである。トレーサーは、ｈＫ２およびｔＰＳＡに対する特異性を有するユーロピウム標識モノクローナル抗体７Ｇ１である。このアッセイはｔＰＳＡ用のブロッカー抗体の使用を必要とする。試料を３種のｔＰＳＡモノクローナル抗体（クローン２Ｅ９、５Ｆ７および５Ｈ６）のカクテルで希釈し、トレーサー配合物も５Ｈ６を含む。組み合わせると、試薬はｈＫ２に特異的である。

アッセイを下記の通りに検定する。ｉＰＳＡアッセイを、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＰｒｏＳｔａｔｕｓ（商標）ＰＳＡ Ｆｒｅｅ／Ｔｏｔａｌキットに対して検定し、次いでＷＨＯ９６／６７０（ｔＰＳＡ）および９６／６６８（ｆＰＳＡ）に対して検定する。ＰｒｏＳｔａｔｕｓアッセイは、ｉＰＳＡがサブセット分子であるｔＰＳＡおよびｆＰＳＡの定量的測定を可能にする。ｉＰＳＡ検定溶液の割り当てを、ｔＰＳＡアッセイおよびｆＰＳＡアッセイで得られた平均リカバリから導く。ｈＫ２アッセイをＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＰｒｏＳｔａｔｕｓ（商標）ＰＳＡ Ｆｒｅｅ／Ｔｏｔａｌキットに対して検定し、次いでＷＨＯ９６／６７０（ｔＰＳＡ）および９６／６６８（ｆＰＳＡ）に対して検定する。ＰｒｏＳｔａｔｕｓアッセイは、ｔＰＳＡおよびｆＰＳＡの定量的測定を可能にし、ｔＰＳＡコンポーネントはｈＫ２との等モル交差反応性を有する。ｈＫ２検定溶液の割り当てを、ｔＰＳＡアッセイで得られたリカバリから導く。

次いで、免疫測定法でのｉＰＳＡおよびｈＫ２の検出から得られたシグナルを、同じｉＰＳＡ抗体およびｈＫ２抗体を使用する標準（例えばキャリブレータ溶液）のセットの検出から得られたシグナルと比較する。ｉＰＳＡアッセイおよびｈＫ２アッセイはそれぞれ、７種の標準（例えばキャリブレータ溶液）を用いる。標準（例えばキャリブレータ溶液）の測定を使用して、アッセイの報告範囲を決定する。この報告範囲は、下端での定量限界（ＬｏＱ）と上端での最高キャリブレータとにより定義される。ｉＰＳＡアッセイおよびｈＫ２アッセイの場合、ＣＬＳＩ ＥＰ−１７Ａを使用してＬｏＱを決定した。アッセイの報告範囲を下記の表４に示す。

ｉＰＳＡおよびｈＫ２に関する期待値を、１０１２例の参加者を含む４Ｋスコア検定に関する米国臨床試験からのデータを分析することにより得た。患者の生検を始めた後、組織の病理学的検査に基づいて参加者を３群に分けた。データを下記の表５および表６に示し、かつ図１および図２で箱ひげヒストグラムとして示す。結果は、ｈｋ２値の９９．９％（１０１１例／１０１２例）およびｉＰＳＡ値の９９．６％（１００８例／１０１２例）がアッセイの報告範囲に含まれることを示す。

ＣＬＳＩ ＥＰ５−Ａ２およびＣＬＳＩ ＥＰ６−Ａを使用してｉＰＳＡおよびｈＫ２のアッセイ性能を評価した。結果を下記の表７に示す。各アッセイ（例えばｉＰＳＡまたはｈＫ２）での変動係数（ＣＶ）値が報告範囲の全域で低く（＜１５％）維持されることに留置されたい。加えて、各アッセイのＲ^２値は１である。まとめると、これらのデータはアッセイの報告範囲の全域での高い正確度および精度を示す。

４Ｋスコア検定の臨床性能を評価した。合計１０１２例の患者を、米国内の２６箇所の泌尿器科センターでの盲検の前向き臨床試験に登録した。現在の生検選択の実行を代表するコホートを得るために、年齢、ＰＳＡ、ＤＲＥまたは以前の生検にかかわらず、前立腺生検が予定されている全ての男性に登録が開かれていた。各参加者は少なくとも１０コアの経直腸超音波ガイド前立腺生検を受けており、各センターでの慣習に従って組織病理学検査を行なった。ＰＳＡレベルに影響を及ぼすことが知られている処置歴を有する患者を除外した。盲検の血液試料を生検前に採取し、４種のカリクレインマーカー（ｔＰＳＡ、ｆＰＳＡ、ｉＰＳＡおよびｈＫ２）の試験のためにテネシー州ナッシュビル（Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）のＯＰＫＯ Ｌａｂに送った。４種のカリクレインマーカー、組織病理、年齢、ＤＲＥおよび以前の生検状態のデータの結果を、独立した生物統計学者により非盲検化して分析し、表８に示す。ｉＰＳＡおよびｈＫ２の中央値および四分位間レベルはアッセイの報告範囲内であり、かつ非常に有意なｐ値を有することに再度留意されたい。

本発明のいくつかの実施形態を本明細書で説明しているおよび図示しているが、当業者は、機能を実施するためのならびに／または本明細書で説明されている結果および／または利点のうちの１つもしくは複数を得るための様々なその他の手段および／または構造を容易に想到することができ、そのような変形および／または改変はそれぞれ、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、本明細書で説明されている全てのパラメータ、寸法、材料および配置は例示であるように意図されており、実際のパラメータ、寸法、材料および／または配置は本発明の教示が使用される具体的な用途によって決まるであろうことを当業者は容易に理解することができる。当業者は、本明細書で説明されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識することができる、または日常的にすぎない実験を使用して確認することができる。従って、上述の実施形態はほんの一例として提示されていること、ならびに添付した特許請求の範囲またはその等価内で、具体的に説明されているおよび特許請求されている以外の方法で本発明を実行することができることを理解されたい。本発明は、本明細書で説明されている個々の特徴、システム、物品、材料および／または方法を対象とする。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料および／または方法が互いに矛盾しない場合には本発明の範囲に含まれる。

本明細書および特許請求の範囲で使用する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確な反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用する語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」（例えばある場合には接続的に存在して他の場合には離接的に存在する要素）を意味すると理解すべきである。明確な反対の指示がない限り、具体的に識別される要素に関連しているか否かにかかわらず、「および／または」節により具体的に識別される要素以外に他の要素が任意選択で存在することができる。そのため、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」等のオープンエンド型の言語と併せて使用する場合、例えば、一実施形態ではＢなしのＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）を意味することができ、別の実施形態ではＡなしのＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を意味することができ、更に別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択で他の要素を含む）を意味することができる。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リストの中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈するものとし、例えば、少なくとも１つを含むが、複数の要素、多くの要素または要素のリストも含み、任意選択で列挙されていない追加の項目も含むと解釈するものとする。逆に明示される用語のみが、例えば「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」または特許請求の範囲で使用する場合には「からなる」が、多くの要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素の包含を意味することができる。一般的に、本明細書で使用する用語「または」は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの厳密に１つ」等の排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（例えば「どちらか一方であるが両方ではない）を示すと解釈されるのみとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、１つまたは複数の要素のリストに関する語句「少なくとも１つ」は、この要素のリスト中のいずれか１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、この要素のリスト内で具体的に列挙されているあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、この要素のリスト中の要素の任意の組合せを除外しないと理解すべきである。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が言及する要素のリスト内で具体的に特定されている要素以外の要素が、この具体的に特定されている要素に関係しているか無関係であるかにかかわらず任意選択的に存在し得ることも許容する。そのため、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同じように「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」もしくは同じように「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、例えば、一実施形態ではＢが存在しない（およびＢ以外の要素を任意選択で含む）少なくとも１つの（任意選択で複数を含む）Ａを意味することができ、別の実施形態ではＡが存在しない（およびＡ以外の要素を任意選択で含む）少なくとも１つの（任意選択で複数を含む）Ｂを意味することができ、更に別の実施形態では少なくとも１つの（任意選択で複数を含む）Ａおよび少なくとも１つの（任意選択で複数を含む）Ｂ（および任意選択でその他の要素を含む）を意味することができる。

特許請求の範囲および上記の明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」および同類のもの等の全ての移行句はオープンエンドであり、例えば含むが限定されないことを意味すると理解すべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみがそれぞれ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３で規定されているように、クローズまたは半クローズの移行句であるものとする。

特許請求の範囲の構成要素を修飾するための特許請求の範囲での「第１」、「第２」、「第３」等の序数用語の使用はそれ自体、ある特許請求の範囲の構成要素の別のものに対するいかなる優先度、序列もしくは順序または方法の行為が実施される時間的順序を暗示しておらず、特許請求の範囲の構成要素を区別するために、ある特定の名称を有するある特許請求の範囲の構成要素を同じ名称を有する（しかし序数用語を使用する）別の構成要素から区別するための単なる標識として使用される。

明確な反対の指示がない限り、複数のステップまたは行為を含む本出願で特許請求されているあらゆる方法では、この方法のステップまたは行為の順序は、この方法のステップまたは行為が記載されている順序に必ずしも限定されないことも理解すべきである。

Claims (26)

1. 前立腺抗原のレベルを定量化する方法であって、
   免疫測定法を実施して試料中の前立腺抗原のレベルを測定するステップと、ここで、前記前立腺抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）および／またはヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される；
   同じ免疫測定法を実施して前立腺抗原標準のセットの各力価の前立腺抗原のレベルを測定するステップと、ここで、前記前立腺抗原標準のセットは、前立腺抗原の既知のレベルを含む少なくとも２種の力価を含み、前立腺抗原の各中間の力価は、対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離であり、前記セットの最小の非ゼロ力価の量は、前記免疫測定法の定量化限界未満であり、セットの最大力価の前立腺抗原のレベルは、ｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の前立腺抗原の血中レベルとｉｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の血中レベルの１００倍超である前立腺抗原のレベルとの間である；および
   前立腺抗原標準のセットの前立腺抗原の測定されたレベルに基づいて試料中の前立腺抗原のレベルを決定するステップと
   を含む方法。
2. 前記前立腺抗原標準のセットの最大力価は、ｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の前立腺抗原の血中レベルとｉｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の血中レベルの７５倍超である前立腺抗原のレベルとの間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記前立腺抗原は無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記セットの最小の非ゼロ力価は０．０２５ｎｇ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
5. 前記セットの最大力価は１５ｎｇ／ｍＬである、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記前立腺抗原標準のセットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬ、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記前立腺抗原はｈＫ２である、請求項１または２に記載の方法。
8. 前記セットの最小の非ゼロ力価は０．００２ｎｇ／ｍＬである、請求項７に記載の方法。
9. 前記セットの最大力価は８ｎｇ／ｍＬである、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記前立腺抗原標準のセットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原検出キットであって、前記キットは、免疫測定法を使用して試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原標準のセットを含み、
    各前立腺抗原標準は、溶液として容器中に存在し、前立腺抗原標準のセットは、前立腺抗原の既知のレベルを含む少なくとも２種の力価を含み、前立腺抗原の各中間の力価は、対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離であり、前記セットの最小の非ゼロ力価の量は、前記免疫測定法の定量化限界未満であり、セットの最大力価の前立腺抗原のレベルは、ｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の前立腺抗原の血中レベルとｉｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の血中レベルの１００倍超である前立腺抗原のレベルとの間である、
    キット。
12. 前記セットの最大力価は、ｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の前立腺抗原の血中レベルとｉｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の血中レベルの７５倍超である前立腺抗原のレベルとの間である、請求項１１に記載のキット。
13. 前記前立腺抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
14. 前記前立腺抗原は無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）である、請求項１３に記載のキット。
15. 前記セットの最小の非ゼロ力価は０．０２５ｎｇ／ｍＬである、請求項１４に記載のキット。
16. 前記セットの最大力価は１５ｎｇ／ｍＬである、請求項１４または１５に記載のキット。
17. 前記前立腺抗原標準のセットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０８９ｎｇ／ｍＬ、０．３２２ｎｇ／ｍＬ、１．１５７ｎｇ／ｍＬ、４．１６７ｎｇ／ｍＬおよび１５ｎｇ／ｍＬ、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のキット。
18. 前記前立腺抗原はｈＫ２である、請求項１３に記載のキット。
19. 前記セットの最小の非ゼロ力価は０．００２ｎｇ／ｍＬである、請求項１８に記載のセット。
20. 前記セットの最大力価は８ｎｇ／ｍＬである、請求項１８または１９に記載のキット。
21. 前記前立腺抗原標準のセットは下記の前立腺抗原標準の力価からなる：０ｎｇ／ｍＬ、０．００２ｎｇ／ｍＬ、０．０１１ｎｇ／ｍＬ、０．０５５ｎｇ／ｍＬ、０．２９０ｎｇ／ｍＬ、１．５２４ｎｇ／ｍＬおよび８ｎｇ／ｍＬ、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。
22. ｔＰＳＡ用のブロッカー抗体をさらに含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載のキット。
23. 前立腺抗原に対する特異性を有する検出可能な抗体をさらに含む、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のキット。
24. 検出可能な抗体は、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、磁性化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、またはこれらの組合せで標識される、請求項２３に記載のキット。
25. 前立腺抗原に対する特異性を有するビオチン化捕捉抗体をさらに含む、請求項１１〜２４のいずれか一項に記載のキット。
26. 試料中の前立腺抗原のレベルを定量化するための前立腺抗原標準を調製する方法であって、
    （ｉ）前立腺がんと関連付けられた抗原を得るステップと、ここで、前記抗原は、総前立腺特異抗原（ｔＰＳＡ）、遊離前立腺特異抗原（ｆＰＳＡ）、無傷前立腺特異抗原（ｉＰＳＡ）およびヒトカリクレイン２（ｈＫ２）からなる群から選択される；
    （ｉｉ）適切な緩衝液中の前立腺抗原のストック溶液を調製するステップと、ここで、前記ストック溶液は、ｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の前立腺抗原の血中レベルとｉｉ）男性対象者の標的集団の上位四分位の血中レベルの７５倍超である前立腺抗原のレベルとの間の力価である；および
    （ｉｉｉ）前立腺抗原標準の各中間の力価が対数スケール上でのこの中間の力価の上下の力価から等距離であるように、およびセットの最小の非ゼロ力価の量が免疫測定法の定量化限界未満であるように、前記ストック溶液の連続希釈により前立腺抗原標準の最小セットを調製するステップと
    を含む方法。

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