ES2867798T3 - Estándares del antígeno prostático y usos de estos - Google Patents

Abstract

Un método para cuantificar los niveles de un antígeno prostático, el método comprende: realizar un inmunoensayo para detectar la presencia de un antígeno prostático en una muestra; y cuantificar los niveles del antígeno prostático detectado en la muestra en relación con un conjunto de estándares de antígeno prostático detectados mediante el uso del mismo inmunoensayo, en donde el antígeno prostático es el antígeno prostático específico intacto (iPSA) o la calicreína 2 humana (hK2), en donde cada título del estándar del antígeno prostático es equidistante del título por encima y/o por debajo del mismo en una escala logarítmica, en donde la cantidad del título distinto de cero más pequeño del conjunto está por debajo del límite de cuantificación del inmunoensayo, en donde el límite de cuantificación es la cantidad más pequeña de material detectable y cuantificable con un coeficiente de variación menor al 25 %, y en donde el título más grande del conjunto es menor o igual a 15 ng/mL de iPSA o menor o igual a 8 ng/mL de hK2.

Description

DESCRIPCIÓN

Estándares del antígeno prostático y usos de estos

Antecedentes de la invención

Los niveles sanguíneos elevados del antígeno prostático específico total (PSA) están asociados con trastornos relacionados con la próstata, que incluye el cáncer de próstata. Existe evidencia considerable de que medir los niveles de isoformas de PSA por separado, junto con la medición de calicreína 2 humana (hK2), conduce a predicciones mejoradas relacionadas con la presencia de cáncer de próstata en un sujeto. Generalmente, los ensayos para medir niveles elevados de antígenos prostáticos, como las isoformas de PSA y hK2, usan curvas estándar de antígeno para cuantificar los niveles de antígeno prostático.

Resumen de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. Los aspectos de la descripción se relacionan con el reconocimiento de que los estándares usados actualmente para los ensayos de próstata requieren usar grandes cantidades de antígenos prostáticos, lo que no es rentable. Además, el amplio intervalo de concentraciones abarcado por los estándares en los ensayos usados actualmente puede conducir a una cuantificación imprecisa de la concentración de antígeno porque los intervalos estándares no están alineados adecuadamente con las cantidades de antígeno presentes en una muestra clínica típica. En consecuencia, se ha reconocido que existe la necesidad de nuevos estándares que sean rentables y proporcionen una precisión aumentada en la cuantificación del nivel de antígeno.

Muchos ensayos para cuantificar los niveles de antígeno prostático se basan en la comparación de la señal del antígeno detectado con un conjunto de valores obtenidos de un conjunto de concentraciones de antígeno estándar. Sin embargo, los ensayos que se usan actualmente no son rentables porque requieren grandes cantidades de estándares de antígeno prostático. Por ejemplo, algunas pruebas de antígeno prostático se basan en estándares que tienen una concentración máxima de hasta 350 ng/mL de iPSA o hasta 22 ng/mL de hK2 por ensayo. Además, el amplio intervalo de antígenos prostáticos abarcado por los estándares de antígenos usados actualmente puede conducir a una cuantificación inexacta de los niveles de antígeno prostático en una muestra y aumentar el riesgo de un diagnóstico incorrecto. La presente descripción resuelve estos problemas al proporcionar composiciones y métodos rentables para la cuantificación mejorada de los niveles de antígeno prostático.

En consecuencia, en un aspecto, la descripción proporciona un método para cuantificar los niveles de un antígeno prostático. En algunas modalidades, el método implica realizar un inmunoensayo para detectar la presencia de un antígeno prostático en una muestra; y cuantificar los niveles del antígeno prostático detectado en la muestra en relación con un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático detectados mediante el uso del mismo inmunoensayo. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático comprende al menos dos títulos que contienen cantidades predeterminadas de antígenos prostáticos, en los que el título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 75 veces mayor que la concentración de antígeno prostático en sangre. En algunas modalidades, una cantidad del título distinto de cero más pequeño del conjunto está más abajo del límite de cuantificación del inmunoensayo. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuya edad media está en un intervalo de 60 a 70 años. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuya edad del cuartil inferior está en un intervalo de 55 a 65 años. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuyo cuartil superior de edad está en un intervalo de 65 a 75 años. En algunas modalidades, se selecciona un antígeno prostático del grupo que consiste en: antígeno prostático específico total (tPSA), antígeno prostático específico libre (fPSA), antígeno prostático específico intacto (iPSA) y calicreína 2 humana (hK2). En algunas modalidades, un antígeno prostático es iPSA o hK2. En algunas modalidades, un antígeno prostático es el antígeno prostático específico intacto (iPSA). En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,025 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 15 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,025 ng/mL, 0,089 ng/mL, 0,322 ng/mL, 1,157 ng/mL, 4,167 ng/mL y 15 ng/mL. En algunas modalidades, el antígeno prostático es hK2. En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,002 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,002 ng/mL, 0,011 ng/mL, 0,055 ng/mL, 0,290 ng/mL, 1,524 ng/mL y 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en siete títulos del estándar del antígeno prostático. En algunas modalidades, cada título intermedio del estándar del antígeno prostático es equidistante del título por encima y más abajo de él en una escala logarítmica. En algunas modalidades, el inmunoensayo se selecciona del grupo que consiste en DELFIA®, inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo de sándwich, ensayo de transferencia Western y ensayo de inmunoprecipitación (IPA). En algunas modalidades, el inmunoensayo es un DELFIA®. En algunas modalidades, el inmunoensayo es un ELISA. En algunas modalidades, se obtiene una muestra de un sujeto humano. En algunas modalidades, una muestra es una biopsia de tejido prostático. En algunas modalidades, una muestra es una muestra de sangre o plasma sanguíneo.

En algunos aspectos, la descripción proporciona un kit de detección de antígeno prostático para cuantificar los niveles de un antígeno prostático, el kit que comprende un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático para cuantificar los niveles de un antígeno prostático en una muestra mediante el uso de un inmunoensayo, en donde cada estándar del antígeno prostático está presente en un contenedor como una solución. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático comprende al menos dos títulos que contienen cantidades predeterminadas de antígenos prostáticos, en los que el título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 75 veces mayor que la concentración de antígeno prostático en sangre. En algunas modalidades, la cantidad del título distinto de cero más pequeño del conjunto está más abajo del límite de cuantificación del inmunoensayo. En algunas modalidades, se selecciona un antígeno prostático del grupo que consiste en: antígeno prostático específico total (tPSA), antígeno prostático específico libre (fPSA), antígeno prostático específico intacto (iPSA) y calicreína 2 humana (hK2). En algunas modalidades, el antígeno prostático es iPSA o hK2. En algunas modalidades, un antígeno prostático es el antígeno prostático específico intacto (iPSA). En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,025 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 15 ng/mL. En algunas modalidades, el conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,025 ng/mL, 0,089 ng/mL, 0,322 ng/mL, 1,157 ng/mL, 4,167 ng/mL y 15 ng/mL. En algunas modalidades, un antígeno prostático es hK2. En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,002 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,002 ng/mL, 0,011 ng/mL, 0,055 ng/mL, 0,290 ng/mL, 1,524 ng/mL y 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en siete títulos del estándar del antígeno prostático. En algunas modalidades, cada título intermedio del estándar del antígeno prostático es equidistante del título por encima y más abajo de él en una escala logarítmica.

En algunos aspectos, la descripción se refiere a un método para preparar estándares de antígeno prostático para cuantificar los niveles de un antígeno prostático en una muestra, el método que comprende: (i) obtener un antígeno asociado con el cáncer de próstata; (ii) preparar una solución madre del antígeno en un tampón adecuado, en la que la solución madre tiene un título entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 75 veces mayor que esa concentración de antígeno prostático en sangre; y (iii) preparar un conjunto mínimo de estándares de antígeno prostático mediante dilución en serie de la solución madre, de manera que cada título intermedio del estándar del antígeno prostático sea equidistante del título por encima y más abajo en una escala logarítmica. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuya edad media está en un intervalo de 60 a 70 años. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuya edad del cuartil inferior está en un intervalo de 55 a 65 años. En algunas modalidades, una población diana de sujetos consiste en hombres, cuyo cuartil superior de edad está en un intervalo de 65 a 75 años. En algunas modalidades, el antígeno prostático se selecciona del grupo que consiste en: antígeno prostático específico total (tPSA), antígeno prostático específico libre (fPSA), antígeno prostático específico intacto (iPSA) y calicreína 2 humana (hK2). En algunas modalidades, el antígeno prostático es iPSA o hK2. En algunas modalidades, el antígeno prostático es un antígeno prostático específico intacto (iPSA). En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,025 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 15 ng/mL. En algunas modalidades, el conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,025 ng/mL, 0,089 ng/mL, 0,322 ng/mL, 1,157 ng/mL, 4,167 ng/mL y 15 ng/mL. En algunas modalidades, el antígeno prostático es hK2. En algunas modalidades, el título distinto de cero más pequeño del conjunto es 0,002 ng/mL. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto es de 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en los siguientes títulos del estándar del antígeno prostático: 0 ng/mL, 0,002 ng/mL, 0,011 ng/mL, 0,055 ng/mL, 0,290 ng/mL, 1,524 ng/mL y 8 ng/mL. En algunas modalidades, un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático consiste en siete títulos del estándar del antígeno prostático. En algunas modalidades, cada título intermedio del estándar del antígeno prostático es equidistante del título por encima y más abajo de él en una escala logarítmica Piironen y otros, Clinical Chemistry 42(7), 1034-1041 (1996) describe una curva de calibración estándar de calicreína 2 humana.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un diagrama de caja y bigotes no limitativo de los niveles de hK2 (ng/mL) de una población de sujetos (N=1012).

La figura 2 muestra un diagrama de caja y bigotes no limitativo de los niveles de iPSA (ng/mL) de una población de sujetos (N=1012).

Descripción detallada de la descripción

Los aspectos de la descripción proporcionan estándares para cuantificar el nivel de un antígeno prostático en una muestra. Los estándares que se describen en la descripción representan una mejora con respecto a los estándares usados actualmente porque son rentables (por ejemplo, requieren una cantidad menor de antígeno prostático) y proporcionan conjuntos de valores que se alinean más estrechamente con intervalos clínicamente relevantes de antígenos prostáticos. La descripción se refiere, en parte, al reconocimiento de que calibrar el intervalo de títulos con un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático reduce significativamente el costo y al mismo tiempo proporciona una precisión aumentada de la cuantificación del nivel prostático. Por tanto, en algunos aspectos, la descripción proporciona métodos mejorados para cuantificar los niveles de un antígeno prostático. Los métodos implican típicamente realizar un inmunoensayo para detectar la presencia de un antígeno prostático en una muestra y cuantificar los niveles del antígeno prostático detectado en la muestra en relación con un conjunto mínimo de estándares informativos del antígeno prostático detectados mediante el uso del mismo inmunoensayo.

Como se usa en la presente, un "conjunto mínimo de estándares informativos de antígeno prostático" es un conjunto de estándares de antígeno prostático para un inmunoensayo particular que incluye al menos dos títulos que contienen cantidades predeterminadas de antígenos prostáticos, en donde la cantidad del título más pequeño del conjunto está más abajo del límite de cuantificación del inmunoensayo y en donde la cantidad del título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos (por ejemplo, hombres sospechosos de tener cáncer de próstata o de necesitar una biopsia) y ii) 100 veces más alta que la concentración de antígeno prostático en sangre. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 75 veces mayor que la concentración de antígeno prostático en sangre. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 50 veces mayor que la concentración de antígeno prostático en sangre. En algunas modalidades, el título más grande del conjunto está entre i) la concentración de antígeno prostático en sangre del cuartil superior de una población diana de sujetos y ii) 25 veces mayor que la concentración de antígeno prostático en sangre.

La cantidad del título distinto de cero más pequeño del conjunto está más abajo del límite de cuantificación del inmunoensayo. Como se usa en la presente, el término "límite de cuantificación" se refiere a la cantidad más pequeña de material detectable y cuantificable mediante el uso del inmunoensayo. En algunas modalidades, el límite de cuantificación es la cantidad más pequeña de material detectable y cuantificable con un coeficiente de variación de menos del 25 %, menos del 15 %, menos del 5 % o menos del 1 % mediante el uso del inmunoensayo.

En algunas modalidades, la cantidad del título distinto de cero más pequeño del conjunto está más abajo del límite de detección del inmunoensayo. Como se usa en la presente, el término "limitación de detección" se refiere a la menor cantidad de material detectable pero no necesariamente cuantificable mediante el uso del inmunoensayo. Estándares de Antígeno Prostático

En algunos aspectos, la descripción proporciona estándares de antígeno prostático para cuantificar el nivel de un antígeno prostático en una muestra. Como se usa en la presente, un "estándar del antígeno prostático" es una preparación sustancialmente homogénea de un antígeno prostático adecuado para establecer una referencia contra la cual puede medirse una cantidad desconocida del antígeno prostático. En algunas modalidades, un estándar del antígeno prostático comprende una preparación de antígeno prostático que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % puro. Sin embargo, en algunas modalidades, el estándar comprende una preparación homogénea de antígeno prostático en un medio (por ejemplo, como solución) similar a la de la muestra a analizar (por ejemplo, una muestra de sangre, suero, orina o plasma). Por ejemplo, el estándar del antígeno prostático puede agregarse a una muestra de sangre, suero, orina o plasma que de cualquier otra manera está libre del antígeno prostático. De esta manera, los antecedentes del estándar del antígeno prostático y la muestra desconocida son similares o iguales, lo que puede mejorar la precisión de detección y cuantificación.

En algunas modalidades, las curvas de concentración se usan para determinar la concentración de un antígeno particular en una muestra. Por ejemplo, puede producirse una curva de concentración al trazar unidades de fluorescencia relativa (RFU) frente a una pluralidad de concentraciones conocidas de un antígeno (por ejemplo, un conjunto de concentraciones de antígeno). El valor de RFU obtenido de una muestra que tiene una concentración de antígeno desconocida puede compararse luego con la curva de concentración para determinar la concentración de antígeno de la muestra.

En algunas modalidades, el material estándar comprende un conjunto de títulos de antígeno. Como se usa en la presente, el término "conjunto de antígenos" se refiere a una pluralidad de títulos de antígenos discretos. En algunas modalidades, cada título de antígeno de un conjunto se aloja en un contenedor diferente. En algunas modalidades, se produce un conjunto de estándares de antígenos a partir de una reserva madre que tiene un título de antígeno superior a la concentración máxima de antígenos del conjunto. En algunas modalidades, se produce un conjunto de estándares de antígenos a partir de una reserva madre al diluir en serie la reserva. En algunas modalidades, se produce un conjunto de antígenos a partir de una reserva madre que tiene una concentración de antígeno a la concentración máxima de antígeno del conjunto. En algunas modalidades, un conjunto de antígenos está entre 1 y 20 títulos de antígenos, 5 y 15 títulos de antígenos u 8 y 12 títulos de antígenos. En algunas modalidades, un conjunto de antígenos es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 títulos de antígenos. En algunos aspectos, la descripción se refiere a un hallazgo de que el establecimiento de un conjunto mínimo de estándares de antígeno prostático reduce significativamente el costo y al mismo tiempo proporciona una precisión aumentada de la cuantificación del nivel de antígeno prostático. Como se usa en la presente, el término "informativo" se refiere a una característica de un antígeno o conjunto de antígenos para proporcionar una cuantificación clínicamente relevante de un antígeno en una muestra que tiene una cantidad o concentración de antígeno desconocida. Por ejemplo, un estándar que tiene un amplio intervalo de concentraciones de antígeno puede producir un conjunto de valores (por ejemplo, una curva de concentración) con concentraciones de antígeno clínicamente relevantes que caen fuera del intervalo útil de los valores. Esto puede reducir el poder predictivo de los valores proporcionados y, por lo tanto, tiende a ser menos informativo. Por otro lado, usar estándares que tengan un intervalo de concentraciones de antígeno consistente con las cantidades o concentraciones probables de antígeno en una población diana es informativo porque los valores resultantes (por ejemplo la curva de concentración) tienen un mayor número de concentraciones de antígeno clínicamente relevantes que se encuentran dentro del intervalo útil de los valores (curva).

En algunos aspectos, la descripción se refiere a la distribución de concentraciones de antígeno prostático en un conjunto de concentraciones informativas de antígeno prostático. En algunas modalidades, cada concentración de antígeno prostático informativa de un conjunto es equidistante de la concentración de antígeno prostático informativa por encima y/o más abajo de ella. Como se usa en la presente, el término "equidistante" se refiere al número de unidades entre las concentraciones de antígeno prostático. Por ejemplo, las concentraciones de 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL y 4 ng/mL son equidistantes de (es decir, 1 ng/mL) la concentración por encima y/o más abajo en una escala lineal. Las unidades pueden medirse en cualquier escala apropiada, como una escala lineal o una escala logarítmica. (por ejemplo log 10, logaritmo natural (LN), etc.). En algunas modalidades, cada concentración de antígeno prostático informativa de un conjunto es equidistante de la concentración de antígeno prostático informativa por encima y/o más abajo de ella en una escala logarítmica. Por ejemplo, un conjunto informativo de antígenos de iPSA puede ser 0 ng/mL, 0,025 ng/mL, 0,089 ng/mL, 0,322 ng/mL, 1,157 ng/mL, 4,167 ng/mL y 15 ng/mL. Como otro ejemplo, un conjunto informativo de antígenos de hK2 puede ser 0 ng/mL, 0,002 ng/mL, 0,011 ng/mL, 0,055 ng/mL, 0,290 ng/mL, 1,524 ng/mL y 8 ng/mL. Pueden prepararse concentraciones equidistantes de un antígeno mediante cualquier método adecuado, como dilución en serie, o al disolver una cantidad de antígeno en un tampón apropiado para obtener una solución que tenga una concentración de antígeno informativa.

La descripción contempla varios tipos de antígenos. Los ejemplos de antígenos incluyen pero no se limitan a péptidos, proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas y moléculas pequeñas. (por ejemplo, haptenos). Otros ejemplos no limitativos de antígenos incluyen ácidos nucleicos, tales como ADN, ARN y oligonucleótidos. En algunas modalidades, la descripción proporciona estándares que comprenden antígenos prostáticos. Como se usa en la presente, el término "antígeno prostático" se refiere a un antígeno que se produce o se expresa en la próstata de un sujeto. Los ejemplos de antígenos prostáticos incluyen, pero no se limitan a, antígeno prostático específico total (tPSA), antígeno prostático específico libre (fPSA), antígeno prostático específico intacto (iPSA) y calicreína 2 humana (hK2). En algunas modalidades, el material estándar comprende un conjunto informativo de concentraciones de iPSA. En algunas modalidades, el material estándar comprende un conjunto informativo de concentraciones de hK2.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un mamífero que tiene o se sospecha que tiene cáncer, o que se está analizando el cáncer. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, primates no humanos (por ejemplo, titíes y monos), cerdos, caballos, gatos, perros, ratas y ratones. En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto humano. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano que tiene o se sospecha que tiene cáncer de próstata. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano sometido a prueba de cáncer de próstata. Los seres humanos pueden mostrar o no signos o síntomas de cáncer de próstata, que incluye la necesidad de orinar con frecuencia, especialmente por la noche, dificultad para comenzar a orinar o retener la orina, flujo de orina débil o interrumpido, micción dolorosa o ardiente, dificultad para tener una erección, eyaculación dolorosa y/o sangre en la orina o el semen.

Los contenedores para materiales estándares también se contemplan en la descripción. Los materiales estándares como se describen en la presente descripción pueden estar contenidos en cualquier contenedor adecuado. Los ejemplos no limitativos de recipientes adecuados incluyen viales (por ejemplo, viales de vidrio o viales de plástico), tubos de ensayo, empaque tipo burbuja, botellas, bolsas y placas de ensayo. En algunas modalidades, un conjunto de concentraciones de antígeno (por ejemplo, un conjunto de concentraciones de antígeno prostático informativas) pueden alojarse en una pluralidad de contenedores. Por ejemplo, un conjunto de siete estándares informativos del antígeno prostático puede almacenarse en siete tubos sellados, cada tubo aloja un único estándar informativo de antígeno prostático. Generalmente, los materiales estándares están en fase líquida mientras están contenidos en un contenedor. Sin embargo, el experto en la materia reconoce que un material estándar, por ejemplo un antígeno proteico, puede estar contenido en forma de polvo (por ejemplo, en un formato liofilizado) y reconstituido en una concentración informativa de antígeno con una cantidad apropiada de solvente (por ejemplo, agua o una solución tampón).

En algunas modalidades, la descripción se refiere a kits que comprenden materiales estándares. Los kits pueden incluir un material estándar, el equipo relacionado para realizar un ensayo (por ejemplo las placas de ensayo, los tampones apropiados, los instrumentos y aparatos de recogida de muestras, etc.) e instrucciones para realizar un ensayo mediante el uso del material estándar. En algunas modalidades, la descripción proporciona un kit que tiene una pluralidad de contenedores, cada contenedor aloja un material estándar. En algunas modalidades, cada contenedor comprende una concentración de antígeno prostático informativa de un conjunto de concentraciones de antígeno prostático informativas. En algunas modalidades, los kits que se describen en la presente descripción comprenden además instrucciones para cuantificar los niveles de antígeno prostático de una muestra.

La descripción también contempla los métodos para preparar estándares de antígeno prostático. En algunas modalidades, la descripción proporciona un método para preparar un estándar del antígeno prostático para cuantificar los niveles de un antígeno prostático, el método que comprende (i) obtener un antígeno asociado con el cáncer de próstata; (ii) preparar una solución madre del antígeno en un tampón o solvente adecuado; y, (iii) preparar un conjunto de concentraciones informativas a partir de la solución madre, en donde cada concentración informativa del conjunto tiene una concentración que es equidistante de la concentración superior y/o más abajo en una escala logarítmica. En algunas modalidades, el antígeno asociado con el cáncer de próstata es un antígeno prostático. En algunas modalidades, el antígeno prostático se selecciona del grupo que consiste en tPSA, fPSA, iPSA y hK2. En algunas modalidades, el antígeno prostático es iPSA o hK2. Los ejemplos no limitativos de tampones y/o solventes adecuados incluyen agua, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y solución salina tamponada con tris (TBS). Puede prepararse un conjunto de concentraciones de antígeno informativas a partir de una solución madre, por ejemplo, al diluir en serie la solución madre para llegar a una pluralidad de concentraciones de antígeno informativas.

Ensayos para la Cuantificación de los Niveles de Antígeno Prostático

En algunos aspectos, la descripción se refiere a los métodos para cuantificar los niveles de antígeno prostático. La descripción se basa, en parte, en el descubrimiento de que los estándares de antígeno prostático que se describen por esta descripción permiten una cuantificación más rentable y precisa de los antígenos prostáticos que los estándares de antígeno prostático usados actualmente.

En consecuencia, en algunos aspectos, la descripción proporciona un método para cuantificar los niveles de un antígeno prostático, el método que comprende realizar un inmunoensayo para detectar la presencia de un antígeno prostático en una muestra y cuantificar los niveles del antígeno prostático detectado en la muestra en base a los valores derivados de la detección de un conjunto de concentraciones de antígeno prostático informativas mediante el inmunoensayo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el conjunto informativo de concentraciones de antígeno es un conjunto informativo de concentraciones de iPSA. En algunas modalidades, el conjunto informativo de concentraciones de antígeno es un conjunto informativo de concentraciones de hK2.

Se describen los métodos adicionales para detectar la presencia de antígenos prostáticos, por ejemplo, en USSN 61/972,099.

Inmunoensayos

Los niveles de antígenos específicos de próstata (por ejemplo, tPSA, iPSA, fPSA y hK2) pueden evaluarse mediante cualquier método apropiado. En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno que son adecuados para usar en inmunoensayos. Los inmunoensayos que usan tal anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno pueden ser inmunoensayos competitivos y no competitivos, en un formato directo o indirecto. Ejemplos no limitativos de tales inmunoensayos son el inmunoensayo de fluorescencia de lantánido potenciado por disociación (DELFIA®), el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo sándwich (ensayo inmunométrico), la citometría de flujo, el ensayo de transferencia Western, los ensayos de inmunoprecipitación, la inmunohistoquímica, la inmunomicroscopía, los ensayos inmunocromatográficos de flujo lateral y las series proteómicas.

En algunas modalidades, el inmunoensayo es DELFIA®. El DELFIA® (inmunoensayo de fluorescencia de lantánido potenciado por disociación) es una tecnología de intensidad de fluorescencia de resolución temporal (TRF) diseñada para detectar la presencia de un compuesto o biomolécula mediante el uso de reactivos marcados con quelato de lantánidos. Los ensayos DELFIA® son flexibles, compatibles con una variedad de lectores de placas y, como tecnología basada en el lavado, son compatibles con varios tipos de muestras. (por ejemplo, sangre, suero, plasma, células, etc.). La tecnología se basa en la fluorescencia de quelatos de lantánidos (europio, samario y terbio). El tiempo de degradación de la fluorescencia de estos marcadores de quelato de lantánidos es mucho más largo que el de los fluoróforos tradicionales, lo que permite un uso eficiente de la resolución temporal para la reducción del fondo autofluorescente. El gran desplazamiento de Stokes (diferencia entre las longitudes de onda de excitación y emisión) y los picos de emisión estrechos contribuyen a aumentar la relación señal-ruido. La sensibilidad aumenta aún más debido al principio de mejora de la disociación: el quelato de lantánido se disocia y se forma un nuevo quelato altamente fluorescente en una solución micelar protectora. A diferencia del ELISA tradicional, el DELFIA® no implica usar una enzima (por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante, HRP) para generar una señal detectable.

Pueden inmovilizarse antígenos o anticuerpos o fragmentos de unión al antígenos, por ejemplo, al unirse a soportes sólidos (por ejemplo, portadores, membrana, columnas, serie proteómica, etc.). Los ejemplos de materiales de soporte sólidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, difluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, tales como nitrocelulosa, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser fija o suspendida en una solución (por ejemplo, perlas).

En algunas modalidades, los anticuerpos marcados o los fragmentos de unión al antígenos pueden usarse como trazas para detectar complejos de anticuerpos unidos a antígenos. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse para generar las trazas incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos magnéticos, quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. Los anticuerpos radiomarcados se preparan de formas conocidas mediante el acoplamiento de un isótopo radiactivo tales como EU, H P, S, Fe, o I, que después puede detectarse mediante un contador gamma, un contador de centelleo o mediante autorradiografía. Como se describe en la presente descripción, los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígenos pueden marcarse alternativamente con enzimas tales como alcohol deshidrogenasa de levadura, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares, y después pueden desarrollarse y detectarse espectrofotométrica o visualmente. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen isotiocianato de fluoresceína, fluorescamina, rodamina y similares. Los marcadores quimioluminiscentes adecuados incluyen luminol, imidazol, éster de oxalato, luciferina y otros.

Un inmunoensayo puede comprender poner en contacto la muestra, por ejemplo, una muestra de plasma que contiene un antígeno con un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, F(ab), F(ab)2), en condiciones que permitan la formación de complejos de unión entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y el antígeno. En algunas modalidades, una muestra de plasma se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a un antígeno diana, si el antígeno está presente en la muestra. Esto puede realizarse en una cámara de reacción adecuada, como un tubo, un pozo de placa, un baño de membrana, una placa de cultivo celular, un portaobjetos de microscopio y otra cámara. En algunas modalidades, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno se inmoviliza sobre un soporte sólido. Un anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno que se une a un antígeno en una muestra puede denominarse anticuerpo de captura. En algunas modalidades, el anticuerpo de captura comprende una marca (por ejemplo, una marca de biotina) que facilita su inmovilización a un soporte sólido mediante una interacción que involucra la marca (por ejemplo, una interacción biotina-estreptavidina en la que la estreptavidina está inmovilizada a un soporte sólido). En algunas modalidades, el soporte sólido es la superficie de una cámara de reacción. En algunas modalidades, el soporte sólido es de una membrana polimérica. (por ejemplo, la tira de nitrocelulosa, membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.). En otras modalidades, el soporte sólido es una estructura biológica (por ejemplo, la superficie de la célula bacteriana). Otros soportes sólidos ilustrativos se describen en la presente descripción y serán evidentes para un experto en la técnica.

En algunas modalidades, el anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno se inmovilizan sobre el soporte sólido antes de entrar en contacto con el antígeno. En otras modalidades, la inmovilización del anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno se realiza después de la formación de complejos de unión. En aún otras modalidades, el antígeno está inmovilizado sobre un soporte sólido antes de la formación de complejos de unión. En algunas modalidades, puede añadirse una traza a la cámara de reacción para detectar los complejos de unión inmovilizados. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable dirigido contra el antígeno. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable dirigido contra el anticuerpo de captura. En algunas modalidades, el anticuerpo primario o el fragmento de unión al antígeno está marcado en sí mismo de forma detectable.

En una modalidad, los métodos de inmunoensayo que se describen en la presente descripción comprenden inmovilizar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno en un soporte sólido; aplicar una muestra (por ejemplo, una muestra de plasma) al soporte sólido en condiciones que permitan la unión del antígeno a los anticuerpos o al fragmento de unión al antígeno, si está presente en la muestra; retirar el exceso de muestra del soporte sólido; aplicar una traza (por ejemplo, anticuerpos marcados de forma detectable o fragmentos de unión al antígeno) en condiciones que permitan la unión de la traza a los anticuerpos inmovilizados unidos al antígeno o a los fragmentos de unión al antígeno; lavar el soporte sólido y ensayar la presencia de la traza.

En algunas modalidades, el anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno están inmovilizados sobre el soporte sólido después de entrar en contacto con el antígeno en una cámara de reacción. En algunas modalidades, el anticuerpo y el fragmento de unión al antígeno están inmovilizados sobre el soporte sólido antes de entrar en contacto con el antígeno en una cámara de reacción. En cualquier caso, puede añadirse una traza a la cámara de reacción para detectar los complejos de unión inmovilizados. En algunas modalidades, una traza comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable dirigido contra el antígeno. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo secundario marcado de forma detectable dirigido contra el anticuerpo primario o el fragmento de unión al antígeno. Como se describe en la presente descripción, el marcador detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo, una molécula luminiscente, una enzima, un resto de biotina, un marcador de epítopo o una molécula de colorante. Los marcadores detectables adecuados se describen en la presente descripción.

En algunas modalidades, se ha encontrado que la realización de ciertos inmunoensayos en tampón de pH bajo conduce a una detección de antígeno más sensible. En consecuencia, en algunas modalidades, un anticuerpo traza se pone en contacto con un anticuerpo de captura en un tampón que tiene un pH en un intervalo de 6,5 a menos de 7,75 de manera que la traza se une al complejo de captura-anticuerpo-antígeno. En algunas modalidades, el pH del tampón es de aproximadamente 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6.

Se apreciará que en cualquiera de los ensayos que se describen en la presente descripción, los anticuerpos de captura pueden intercambiarse con anticuerpos traza.

En algunas modalidades, un inmunoensayo que mide el nivel de fPSA implica poner en contacto el fPSA presente en la muestra de sangre plasmática con un anticuerpo de captura específico para fPSA en condiciones en las que el primer anticuerpo de captura se une a fPSA, lo que produce de esta manera un complejo de captura-anticuerpofPSA; y detecta el complejo captura-anticuerpo-fPSA mediante el uso de una traza. El anticuerpo de captura puede ser un anticuerpo H117. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo 5A10 o un fragmento de este(por ejemplo, un fragmento F(ab)). En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo o fragmento de este (por ejemplo, un fragmento F(ab)) que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un anticuerpo 5A10. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo o fragmento de este (por ejemplo, un fragmento F(ab)) que tiene al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 % al menos el 93 % al menos el 94 % al menos el 95 %, al menos el 96 % al menos el 97 % al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un anticuerpo 5A10. Las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo 5A10, que pueden incorporarse en fragmentos, se muestran más abajo:

5A10 Cadena pesada EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDEDKRYNPSLKSRLTISEDSSR NQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS (SEQ ID NO: 1)

5A10 Cadena ligera DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITN VQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN (SEQ ID NO: 2)

En algunas modalidades, un inmunoensayo que mide el nivel de iPSA implica poner en contacto el iPSA presente en la muestra de sangre plasmática con un anticuerpo de captura específico para el PSA libre, que incluye el iPSA y PSA mellado, en condiciones en las que el segundo anticuerpo de captura se une al menos a iPSA, lo que produce de esta manera un complejo de captura-anticuerpo-iPSA y detecta el complejo de captura-anticuerpo-iPSA mediante el uso de una segunda traza. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo 4D4. En algunas modalidades, el anticuerpo de captura es un anticuerpo 5A10 o un fragmento de este (por ejemplo, un fragmento F(ab)).

En algunas modalidades, un inmunoensayo que mide el nivel de tPSA implica poner en contacto el tPSA presente en la muestra de sangre plasmática con un anticuerpo de captura específico para tPSA en condiciones en las que el tercer anticuerpo de captura se une a tPSA, lo que produce de esta manera un complejo de captura-anticuerpotPSA; y detecta el complejo captura-anticuerpo-tPSA mediante el uso de una tercera traza. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo H50. En algunas modalidades, el anticuerpo de captura es un anticuerpo H117. En algunas modalidades, un inmunoensayo que mide el nivel de hK2 implica poner en contacto el PSA en la muestra de sangre de plasma con anticuerpos bloqueantes específicos para el PSA; poner en contacto la hK2 presente en la muestra de sangre de plasma con un cuarto anticuerpo de captura específico para hK2 en condiciones en las que el cuarto anticuerpo de captura se une a hK2, lo que produce de esta manera un complejo de captura-anticuerpo-hK2; y detectar el complejo captura-anticuerpo-hK2 mediante el uso de una cuarta traza. En algunas modalidades, la traza comprende un anticuerpo 7G1. En algunas modalidades, el anticuerpo de captura es un 6H10 F(ab)2. En algunas modalidades, los anticuerpos bloqueantes comprenden un anticuerpo 5H7, un anticuerpo 5H6 y un anticuerpo 2E9.

La Tabla 1 más abajo enumera los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que pueden usarse en los métodos que se describen en la presente descripción y sus epítopos correspondientes.

Tabla 1: Anticuerpos y Epítopos/Fuentes de anticuerpos

En algunos aspectos, la descripción se refiere a usar inmunoensayos para cuantificar el nivel de un antígeno en una muestra. Como se usa en la presente, el término "cuantificación" se refiere a la determinación de la cantidad o concentración de antígeno en una muestra en base a un estándar del antígeno prostático que tiene un conjunto de concentraciones informativas del antígeno. Por ejemplo, el nivel de iPSA puede cuantificarse al poner en contacto un conjunto de concentraciones de iPSA informativas con un anticuerpo detectable; y producir un conjunto de valores (por ejemplo, una curva de concentración) en base a la salida detectable de cada concentración de iPSA informativa unida al anticuerpo; contactar una muestra con concentración de iPSA desconocida con el anticuerpo detectable; medir la salida detectable del iPSA unido al anticuerpo de la muestra; y cuantificar el nivel de iPSA de la muestra en base a una comparación con el conjunto de valores producidos por la detección de las concentraciones informativas.

En algunas modalidades, se produce un conjunto de valores al obtener la salida detectable de los anticuerpos. En algunas modalidades, las salidas detectables se obtienen mediante lectores de fluorescencia, por ejemplo microscopios fluorescentes, lectores de microplacas y/o espectrofotómetros UV. En algunas modalidades, los lectores de fluorescencia están conectados a una computadora. En algunas modalidades, el programa de la computadora comprende (por ejemplo, el SoftMax Pro™ o Gen5 Data Analysis) para el cálculo de las curvas de concentración a partir de las salidas detectables.

Los aspectos de la descripción pueden implementarse mediante el uso de una computadora. Por ejemplo, la cantidad de un antígeno prostático en una muestra puede determinarse en relación con un estándar del antígeno prostático al obtener mediciones de inmunoensayo del antígeno prostático en la muestra y comparándolas, a partir de usar una computadora, con las cantidades de antígeno prostático en conjunto mínimo de estándares de antígeno prostático. Por ejemplo, los sistemas informáticos que se describen por la descripción pueden usarse para detectar la salida de la unión anticuerpo-antígeno o para crear una curva estándar mediante el uso de los valores de salida obtenidos de un conjunto de concentraciones de antígeno informativas. El sistema informático puede incluir uno o más procesadores y uno o más medios de almacenamiento no transitorio legibles por computadora (por ejemplo, memoria y uno o más medios de almacenamiento no volátiles). El procesador o los procesadores pueden controlar la escritura de datos y la lectura de datos de la memoria y el dispositivo de almacenamiento no volátil en cualquier manera adecuada, ya que los aspectos de la presente descripción que se describen en la presente descripción no están limitados a este respecto.

Para realizar cualquiera de las funciones que se describen en la presente descripción, por ejemplo, para calcular los niveles prostáticos en base a un conjunto mínimo de antígenos prostáticos informativos, el(los) procesador(es) puede(n) ejecutar una o más instrucciones, tales como módulos de programa, almacenadas en uno o más medios de almacenamiento legibles por computadora (por ejemplo, la memoria), que puede servir como medio de almacenamiento no transitorio legible por computadora que almacena instrucciones para su ejecución por parte del procesador. Generalmente, los módulos de programa incluyen rutinas, programas, objetos, componentes, estructuras de datos, etc. que realizan tareas particulares o implementan tipos de datos abstractos particulares. Las modalidades también pueden implementarse en entornos informáticos distribuidos donde las tareas se realizan mediante dispositivos de procesamiento remoto que están conectados a través de una red de comunicaciones. En un entorno informático distribuido, los módulos de programa pueden ubicarse en medios de almacenamiento informáticos tanto locales como remotos, que incluyen los dispositivos de almacenamiento de memoria. La computadora puede recibir entradas de datos y comandos de programa a través de una interfaz de entrada. La interfaz de entrada puede comprender un teclado, pantalla táctil, puerto USB, unidad de CD, unidad de DVD u otra interfaz de entrada.

Se apreciará que pueden formarse varias modalidades con una o más de las características que se describen anteriormente. Los aspectos y características anteriores pueden emplearse en cualquier combinación adecuada ya que la presente descripción no está limitada a este respecto. También se apreciará que los dibujos ilustran varios componentes y características que pueden incorporarse en diversas modalidades. Para simplificar, algunos de los dibujos pueden ilustrar más de una característica o componente opcional. Sin embargo, la descripción no se limita a las modalidades específicas que se describen en los dibujos acompañantes, los cuales ilustran una o más modalidades ilustrativas. Se reconocerá que la descripción abarca modalidades que pueden incluir solo una porción de los componentes ilustrados en cualquier figura de dibujo, y/o también puede abarcar modalidades que combinan componentes ilustrados en múltiples figuras de dibujos diferentes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Secuencias de PSA y calicreína 2 humana Proteína PSA (SEQ ID NO: 3) IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPL YDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLH VISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWI KDTIVANP

proteína hK2 (SEQ ID NO: 4) IVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPH PLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSL HLLSNDMCARAYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRK WIKDTIAANP

Ejemplo 2: Materiales estándares mejorados para detectar antígenos prostáticos

Los estándares de iPSA anteriores tenían una concentración máxima que variaba de 166 a 350 ng/mL. Este ejemplo describe la reformulación de los estándares iPSA mediante una dilución en serie de la concentración máxima de 15 ng/mL, como se muestra en la Tabla 2. El conjunto informativo que se muestra más abajo proporciona varios beneficios sobre los conjuntos de estándares anteriores. Primero, la reducción de la concentración máxima de iPSA reduce el costo aproximadamente de 11 a 23 veces porque se requiere menos antígeno. En segundo lugar, el intervalo reducido del ensayo permite más puntos (por ejemplo, valores) de la curva de calibración para caer dentro del intervalo clínicamente relevante de concentraciones de iPSA para el diagnóstico de cáncer de próstata. Finalmente, usar siete concentraciones diluidas en serie (por ejemplo, concentraciones equidistantes) permiten que se coloquen especificaciones sobre los valores de la señal sin procesar detectados del conjunto, lo que mejora el control de calidad de un lote a otro de los estándares y de una serie a otra del ensayo.

Tabla 2: Comparación de Conjuntos Estándares de iPSA (ng/mL)

Los estándares de calicreína 2 humana (hK2) se reformularon de manera similar. Los estándares de hK2 disponibles anteriormente tienen una concentración máxima de 13,1 ng/mL a 22,7 ng/mL, como se muestra en la Tabla 3. El conjunto informativo que se muestra más abajo ofrece varios beneficios sobre los conjuntos de estándares anteriores. En primer lugar, la reducción de la concentración máxima de hK2 reduce el costo aproximadamente entre 1,6 y 2,8 veces porque se requiere menos antígeno. En segundo lugar, el intervalo reducido del ensayo permite más puntos (por ejemplo, valores) de la curva de calibración para caer dentro del intervalo clínicamente relevante de concentraciones de hK2 para el diagnóstico de cáncer de próstata. Finalmente, usar siete concentraciones diluidas en serie (por ejemplo, concentraciones equidistantes) permiten que se coloquen especificaciones sobre los valores de la señal sin procesar detectados del conjunto, lo que mejora el control de calidad de un lote a otro de los estándares y de una serie a otra del ensayo.

Tabla 3: Comparación de Conjuntos Estándares de hK2 (ng/mL)

Ejemplo 3: Uso de los estándares iPSA y hK2 en el ensayo 4Kscore

Este ejemplo describe el uso de los estándares iPSA y hK2 que se describen anteriormente en la prueba de 4Kscore. La Prueba 4Kscore es una puntuación de riesgo individualizada multivariada calibrada derivada de un algoritmo que incluye la medición de cuatro proteínas de calicreína asociadas con la próstata en una muestra de sangre: el antígeno prostático específico total (tPSA), el PSA libre (fPSA), el PSA intacto (iPSA) y la cajicreína 2 (hK2) humana- más la siguiente información clínica: la existencia (o no) de una biopsia negativa previa, la edad del paciente y la observación (o no) de nódulos en el estado del tacto rectal (DRE). El algoritmo calcula la probabilidad de riesgo de encontrar un cáncer de alto grado (Puntuación de Gleason 7) si se realizara una biopsia de próstata. La prueba está destinada a usarse como ayuda en la decisión clínica sobre si proceder con la biopsia de próstata. Las concentraciones de tPSA y fPSA se determinan con ensayos comerciales aprobados para usar en diagnósticos humanos por la FDA (instrumento Roche™ Cobas® y ensayos Elecsys®). Las concentraciones de iPSA y hK2 se determinan mediante el uso de una prueba desarrollada para ejecutarse en el instrumento PerkinElmer® AutoDELFIA®.

La muestra de sangre venosa se recoge en un tubo K2EDTA. El tamaño del tubo debe ser lo suficientemente grande para permitir la recolección de aproximadamente 7,5 ml de sangre (al menos 5 ml de sangre). Para asegurar una buena mezcla con el EDTA, el tubo de sangre debe invertirse ocho veces poco después de la recolección de la muestra. Estas cantidades de sangre aseguran que pueda obtenerse suficiente plasma. La única determinación de los cuatro marcadores de calicreína requiere aproximadamente 1 ml de plasma. Dos mililitros (2 ml) de plasma permiten volver a ejecutar el ensayo, si es necesario.

La presencia de iPSA y hK2 se detecta mediante un inmunoensayo tipo sándwich (no competitivo). El ensayo iPSA emplea dos productos de anticuerpos monoclonales de ratón distintos. La sonda de captura es un fragmento Fab recombinante biotinilado marcado con His6-Cys del anticuerpo monoclonal 5A10 con especificidad para fPSA (del cual iPSA es un componente). La traza es un anticuerpo monoclonal 4D4 marcado con europio, con especificidad para iPSA y PSA en complejo (PSA-ACT). En combinación, los reactivos son específicos para iPSA. El ensayo de hK2 emplea cinco productos de anticuerpos monoclonales de ratón distintos. La sonda de captura es un fragmento F(ab)2 biotinilado de anticuerpo monoclonal 6H10 con especificidad para hK2 y tPSA. La traza es un anticuerpo monoclonal 7G1 marcado con europio, con especificidad para hK2 y tPSA. El ensayo requiere usar anticuerpos bloqueadores para tPSA. La muestra se diluye con un cóctel de tres anticuerpos monoclonales tPSA (clones 2E9, 5F7 y 5H6) y la formulación de la traza también contiene 5H6. En combinación, los reactivos son específicos para hK2.

Los ensayos se calibran como sigue. El ensayo iPSA está calibrado para el kit DELFIA® ProStatus™ PSA Free/Total, que a su vez está calibrado según la WhO 96/670 (tPSA) y 96/668 (fPSA). El ensayo ProStatus permite la determinación cuantitativa de tPSA y fPSA, de los cuales iPSA es un subconjunto de moléculas. La asignación de soluciones de calibración de iPSA se deriva de la recuperación promedio obtenida para los ensayos de tPSA y fPSA. El ensayo hK2 se calibra con el kit DELFIA® ProStatus™ PSA Free/Total, que a su vez se calibra con el WHO 96/670 (tPSA) y 96/668 (fPSA). El ensayo ProStatus permite la determinación cuantitativa de tPSA y fPSA, y el componente tPSA tiene una reactividad cruzada equimolar con hK2. La asignación de soluciones de calibración de hK2 se deriva de la recuperación obtenida para el ensayo tPSA.

Las señales obtenidas de la detección de iPSA y hK2 en los inmunoensayos se comparan luego con las señales obtenidas de la detección de un conjunto de estándares (por ejemplo las soluciones calibradoras) mediante el uso de los mismos anticuerpos iPSA y hK2. Los ensayos iPSA y hK2 usan cada uno 7 estándares (por ejemplo, las soluciones calibradoras). Medición de estándares (por ejemplo, las soluciones de calibrador) se usa para determinar el intervalo de informe del ensayo. El intervalo de informe se define por el límite de cuantificación (LoQ) en el extremo inferior y el calibrador más alto en el extremo superior. Para los ensayos de iPSA y hK2, el LoQ se determinó mediante el uso de CLSI EP-17A. El intervalo de informe del ensayo se muestra en la Tabla 4 más abajo.

Tabla 4: Intervalo de Informes de 4Kscore para iPSA y hK2

Los valores esperados para iPSA y hK2 se obtuvieron mediante el análisis de los datos del ensayo clínico de EE. UU. para la prueba 4Kscore, que incluyó a 1012 participantes. Los participantes se dividieron en tres grupos según el examen patológico de los tejidos después de que el paciente procediera a la biopsia. Los datos se muestran más abajo en las Tablas 5 y 6, y como histogramas de caja y bigotes en la FIG. l y la FIG. 2. Los resultados indican que el 99,9 % de los valores de hK2 (1011/1012) y el 99,6 % de los valores de iPSA (1008/1012) caen dentro del intervalo de notificación de los ensayos.

Tabla 5: Valores de iPSA y hK2

Tabla 6: Datos percentiles de iPSA y hk2 (todos los sujetos, N = 1012)

El rendimiento del ensayo para iPSA y hK2 se evaluó mediante el uso de CLSI EP5-A2 y CLSI EP6-A. Los resultados se muestran más abajo en la Tabla 7. Tenga en cuenta que dentro de cada ensayo (por ejemplo, de iPSA o hK2) los valores del coeficiente de varianza (CV) permanecen bajos (<15 %) en todo el intervalo de informes.

Adicionalmente, el valor de R para cada ensayo es 1. Juntos, estos datos indican una alta exactitud y precisión en todo el intervalo de informes del ensayo.

Tabla 7: Rendimiento del ensayo

Se evaluó el rendimiento clínico de la prueba 4Kscore. Se inscribió un total de 1,012 pacientes en un estudio clínico prospectivo y ciego en 26 centros de urología en los Estados Unidos. Para obtener una cohorte representativa de la práctica actual de selección de biopsias, la inscripción estuvo abierta a todos los hombres programados para una biopsia de próstata, independientemente de su edad, PSA, DRE o biopsia previa. Cada participante se sometió a una biopsia de próstata guiada por ecografía transrectal de al menos 10 núcleos, y el examen histopatológico se realizó de acuerdo con la práctica establecida en cada centro. Se excluyeron los pacientes con antecedentes de tratamiento conocidos por influir en los niveles de PSA. Se recogió una muestra de sangre ciega antes de la biopsia y se envió al laboratorio OPKO en Nashville, TN, para la prueba de los cuatro marcadores de cajicreína (tPSA, fPSA, iPSA y hK2). Los resultados de los cuatro marcadores de cajicreína, la histopatología, edad, DRE y los datos de estado de biopsia previa no fueron cegados y se analizaron por bioestadísticos independientes, y se muestran en la Tabla 8. Nótese nuevamente que los niveles medianos e intercuartílicos de iPSA y hK2 estaban dentro del intervalo de reporte del ensayo y tienen un valor p altamente significativo.

Tabla 8: Tabla de Datos del Paciente

(Continuación)

Si bien se han descrito e ilustrado en las modalidades de la presente invención, los expertos en la técnica visualizarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar las funciones y/o obtener los resultados y/o uno o más de las ventajas que se describen en la presente descripción y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que están dentro del alcance de la presente invención. Más generalmente, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones que se describen en la presente descripción deben ser ilustrativos y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para lo cual se usan las enseñanzas de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar con mediante el uso de no más que la experimentación habitual, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que se describen en la presente descripción. Por lo tanto, debe entenderse que las modalidades anteriores se presentan a manera de ejemplo únicamente y que, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y equivalentes a estas, la invención puede ponerse en práctica de cualquier otra manera que la descrita y reivindicada específicamente.

Los artículos indefinidos “un” y “una” como se usan en la presente en la descripción y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, debe entenderse que significan "al menos uno."

La frase "y/o," como se usa en la presente, en la descripción y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "cualquiera o ambos" de los elementos igualmente conjuntados, por ejemplo, los elementos que están conjuntivamente en algunos casos y disyuntivamente presentes en otros casos. Otros elementos pueden opcionalmente estar presentes aparte de los elementos específicamente identificados por la cláusula "y/o", ya sea relacionado o no relacionado a esos elementos identificados específicamente, a menos que claramente se indique lo contrario. Por lo tanto, como un ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje de extremo abierto tal como "que comprenden" puede referir, en una modalidad, solamente a A (opcionalmente incluye elementos distintos de B); en otra modalidad, solamente a B (opcionalmente incluye elementos distintos de A); aún en otra modalidad, tanto a A como a B (opcionalmente incluye otros elementos); etcétera.

Como se usa en la presente en la descripción y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que tiene el mismo significado que "y/o" como se definió anteriormente. Por ejemplo, cuando se separan los ítems en una lista, "o" o "y/o" se interpretarán como inclusivos, por ejemplo, la inclusión de al menos uno, pero además incluyen más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente, ítems adicionales no enumerados. Solo los términos que indican claramente lo contrario, tal como "solo uno de" o "exactamente uno de" o, cuando se usa en las reivindicaciones, "que consiste de", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término "o" como se usa en la presente solo se interpretará como una indicación de alternativas exclusivas (por ejemplo "uno u otro pero no ambos") cuando está precedido por términos de exclusividad, tal como "cualquiera", "uno de" "solo uno de," o "exactamente uno de." “Que consiste esencialmente en”, cuando se usa en las reivindicaciones, tendrá su significado corriente como se usa en el campo del derecho de patentes.

Como se usa en la presente en la descripción y en las reivindicaciones, la frase "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse que significa al menos un elemento seleccionado de uno o más de los elementos en la lista de elementos, pero no necesariamente incluye al menos uno de cada uno y todos los elementos específicamente enumerados dentro de la lista de elementos y no excluye ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que los elementos puedan presentarse, opcionalmente, distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase "al menos uno", ya sea relacionado o no relacionado con aquellos elementos específicamente identificados. Por lo tanto, como un ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, de manera equivalente, "al menos uno de A o B," o, de manera equivalente "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una modalidad, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, A, sin B presente (y opcionalmente que incluye elementos distintos de B); en otra modalidad, a al menos uno, que incluye opcionalmente más de uno, B, sin A presente (y opcionalmente que incluye elementos distintos de A); aún en otra modalidad, a al menos uno, que incluye

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un método para cuantificar los niveles de un antígeno prostético, el método comprende: realizar un inmunoensayo para detectar la presencia de un antígeno prostético en una muestra; y

cuantificar los niveles del antígeno prostético detectado en la muestra en relación con un conjunto de estándares de antígeno prostético detectados mediante el uso del mismo inmunoensayo, en donde el antígeno prostético es el antígeno prostético específico intacto (iPSA) o la calicreína 2 humana (hK2), en donde cada título del esténdar del antígeno prostético es equidistante del título por encima y/o por debajo del mismo en una escala logarítmica, en donde la cantidad del título distinto de cero més pequeño del conjunto esté por debajo del límite de cuantificación del inmunoensayo, en donde el límite de cuantificación es la cantidad més pequeña de material detectable y cuantificable con un coeficiente de variación menor al 25 %, y en donde el título més grande del conjunto es menor o igual a 15 ng/mL de iPSA o menor o igual a 8 ng/mL de hK2.

2. El método de la reivindicación 1, en donde una población diana de sujetos consiste de:

a) hombres, cuya mediana de edad esté en un intervalo de 60 a 70 años; u

b) hombres, cuya edad del cuartil inferior esté en un intervalo de 55 a 65 años; u

c) hombres, cuya edad del cuartil superior esté en un intervalo de 65 a 75 años.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

a) el título distinto de cero més pequeño del conjunto es 0,025 ng/mL de iPSA; o

b) el título distinto de cero més pequeño del conjunto es 0,002 ng/mL de hK2; o

c) el coeficiente de variación es inferior al 15 %.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:

a) el conjunto de esténdares de antígeno prostético consiste de los siguientes títulos de iPSA: 0 ng/mL, 0,025 ng/mL, 0,089 ng/mL, 0,322 ng/mL, 1,157 ng/mL, 4,167 ng/mL y 15 ng/mL; o

b) el conjunto de esténdares de antígeno prostético consiste de los siguientes títulos de hK2: 0 ng/mL, 0,002 ng/mL, 0,011 ng/mL, 0,055 ng/mL, 0,290 ng/mL, 1,524 ng/mL y 8 ng/mL; y/o

c) el conjunto de esténdares de antígeno prostético consiste de siete títulos de esténdar del antígeno prostético.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el inmunoensayo:

a) se selecciona del grupo que consiste en el inmunoensayo de fluorescencia de lanténidos potenciada por disociación, el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo de séndwich, el ensayo de transferencia Western y el ensayo de inmunoprecipitación (IPA); o

b) es un inmunoensayo de fluorescencia de lanténidos potenciada por disociación; o

c) es un ELISA.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra:

a) se obtiene de un sujeto humano; y/o

b) una biopsia de tejido prostético; y/o

c) una muestra de sangre o plasma sanguíneo.