KR20070043868A - 암에 대한 혈소판 바이오마커 - Google Patents

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유다 엠. 포크맨
지안노울라 크레멘트
타이-텅 집
윌리암 리치
블라디미르 포더스트
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
싸이퍼젠 바이오시스템즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 면역학 및 생화학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 전신 혈관형성 활성에서 관련된 변화를 갖는 임상적 병태, 구체적으로 암, 염증 병태, 감염 및 임신과 유산과 관련된 병태의 조기 검출을 위한 방법, 장치 및 키트를 기술한다.

Description

암에 대한 혈소판 바이오마커 {PLATELET BIOMARKERS FOR CANCER}
본 발명은 면역학 및 생화학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 전신 혈관형성 활성에서 관련된 변화를 갖는 임상적 병태, 구체적으로, 염증성 병태, 감염, 및 임신과 관련된 병태의 조기 검출을 위한 방법, 장치 및 키트를 기술한다.
혈관 형성, 신규한 모세혈관의 형성은 재생, 배아 발생, 및 암 성장 및 진행을 위해 필수적인 기본 과정이다. 종양 전개의 주요 경로는 혈류를 통하는 것이다. 순환시에, 종양 세포는 혈소판과 덩어리로 응집하고, 이는 종양 세포 생존을 증대시킨다. 이후 종양 색전은 혈관 내피에 부착할 것이다[참조: Bikfalvi et al., Semin Thromb Hemost., 30(1):137-44(2004); Sargiannidou et al., Semin Thromb Hemost., 30(1):127-36(2004); Sierko et al., Semin Thrmb Hemost., 30(1):95-108(2004); Blakytny et al., J Cell Physiol., 199(1):67-76(2004); Folkman J., Semin Oncol., 29(6 Suppl 16):15-8(2002)].
암과 같은 질병 병태의 조기 검출은 통상적으로 더욱 효과적인 치료학적 치료가 가능하며 상응하는 더욱 유리한 임상적 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 임상의가 암 질병의 발달된 단계에 도달하기 전에 암 및 종양의 존재를 결정할 수 있는 검출 방법이 필요하다. 더욱이, 임상의는 암 종양이 잠복성 또는 악성인지의 여부를 효과적이고 정확하게 결정하는 방법을 필요로 한다.
발명의 개요
본 발명은 혈관형성과 관련한 병태, 특히 암을 검출하고 구별하기 위한 것이다. 본 발명은 혈관형성 현상, 특히 암 현상과 관련한 임상적 병태에 대한 바이오마커로서 혈액 혈소판에서 발견된 생체분자의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는, 혈관형성 현상은 암 대 정상(즉, 비-암(non-cancer)), 특히 침습성 암 대 잠복성 암, 또는 침습성 암 대 비-암과 같은 질병 대 비-질병간의 구별을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
실제로, 본 발명의 여러 바이오마커는 놀랍게도 양성 대 악성 종양, 침습성 대 잠복성 종양, 혈관형성 대 비-혈관형성 종양 등을 구별하는데 사용될 수 있음을 발견하였다. 혈장 중 이러한 단백질의 상응하는 증가없이 혈소판에 의한 혈관형성 조절제의 선택적 흡수는 종양이 임상학적으로 검출되기 전에 암의 진단, 특히 조기 진단에 도움을 주는 유용한 측정을 제공한다. 더욱이, 혈소판, 예를 들어 혈소판 증식에서 다수의 바이오마커의 복합 측정이 환자의 혈관형성 활성 변화의 매우 민감한 지시를 제공하고, 질병 특이적 식별을 제공한다. 이러한 혈소판 성질은 임의의 존재하는 이용가능한 진단법에 의해 검출되지 않는 미시적인 크기의 인간 암을 검출하는데 사용될 수 있다. 심지어 작은 소스의 혈관형성 단백질에서도, 잠복성 비-혈관형성 종양은 종양자체가 임상학적으로 검출되기 전에 검출가능하게 단백질 프로필을 개질할 수 있다. 특정 구체예에서, 혈소판 혈관형성 프로필은 단일 바이오마커 보다 더욱 포괄적인데, 이는 광범위한 종양 타입 및 종양 크기를 검출할 수 있기 때문이다. 혈소판 혈관형성 프로필의 상대적 변화는 종양을 발달 동안 추적하고, 동일계에서 초기 암으로부터 개시하고, 예를 들어 종양이 임상학적으로 검출되기 전부터 개시되고, 빠른 예후, 조기 치료 및 질병 진행 또는 재발(예를 들어, 혈관형성 억제제와 같은 비-독성 약물로 치료한 후)을 정확하게 모니터링할 수 있다.
혈소판은 많은 공지된 혈관형성 조절유전자 단백질, 예를 들어 VEGF-A, VEGF-C, bFGF, HGF, 앤지오포이에틴(Angiopoietin)-1, PDGF, EGF, IGF-1, IFG BP-3, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브리노겐, 헤파라나제 및 스핀고신-1 PO4,와 같은 포지티브 조절제, 및/또는 트롬보스폰딘, HGF의 NK1/NK2/NK3 단편, TFG-베타-1, 프라스미노겐(앤지오스타틴), 고분자량 키니노겐(도메인 5), 피브로넥션(45 kD단편), EGF(단편), 알파-2-안티플라스민(단편), 베타-트롬보글로불린, 앤도스타틴 및 BDNF(뇌 유래 신경영양성인자)와 같은 네가티브 조절제를 섭생하고, 소스(예를 들어, 종양)가 존재하는 동안 이들을 지속적으로 고립시킨다. 혈관형성 조절제의 고립을 위한 임의의 구체적인 생물학적 메카니즘 또는 역할로 본 발명을 제한하지 않는 한, 혈소판은 단백질의 효과적인 이송으로서 활성화된 내피 부위에 작용하고 혈소판 중 바이오마커의 프로필이 종양 존재 및 성장의 개시를 반영하는 것으로 사료된다.
이와 같이, 한 양태에서, 본 발명은 (a) 피검체로부터 생물학적 샘플 중 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하는 단계로서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택되는 단계; (b) 상기 측정을 혈관형성 현상과 대비시키는 단계를 포함하여 피검체에서 혈관형성 현상을 검정하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 하기 바이오마커로부터 선택된다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘.
한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 SELDI 프로브의 흡착제 상에 바이오마커를 포획하고 레이저 탈착-이온화 질량 분석법에 의해 포획된 바이오마커를 검출하므로써 측정된다. 특정 구체예에서, 흡착제로는 양이온교환 흡착제, 음이온교환 흡착제, 금속 킬레이트 또는 소수성 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 흡착제로는 생체특이적 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 면역학적 검정에 의해 측정된다.
다른 구체예에서, 대비는 소프트웨어 분류 알로기즘에 의해 수행된다. 특정 구체예에서, 혈관형성 현상은 암 대 정상(비-암)이다. 다른 구체예에서, 혈관형성 현상은 양성 종양 대 악성 종양이다. 또다른 구체에에서, 혈관형성 현상은 침습성 종양 대 비-침습성, 예를 들어 잠복성 종양이다. 또다른 구체예에서, 혈관형성 현상으로는 유방암, 간암, 폐암, 혈관아세포종, 방광암, 췌장암, 위암, 뇌암, 신경아세포종, 결장암, 암종, 육종, 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함하는 특정 타입의 암이 있다.
또다른 구체예에서, 본 방법은 추가로 (c) 혈관형성 현상을 기초로 하여 피검체 치료를 관리하는 단계를 포함한다. 상기 측정이 암과 대비되는 경우, 피검체 치료의 관리는 예를 들어 피검체에 화학치료제를 투여함을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 방법은 추가로 (d) 피검체 관리 후 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 피검체로부터의 샘플 중에서 하나 이상의 바이오마커를 측정함을 포함하며, 여기서 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 표 1 또는 표 2에 따른 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 SELDI 프로브의 흡착제 상에 바이오마커를 포획하고 레이저 탈착-이온화 질량분석법으로 포획된 바이오마커를 검출하므로써 측정된다. 특정 구체예에서, 흡착제로는 양이온교환 흡착제, 음이온교환 흡착제, 금속 킬레이트 또는 소수성 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 흡착제로는 생체특이적 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 면역학적 검정에 의해 측정된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 (a) 이에 부착되는 하나 이상의 포획제를 포함하며, 포획제가 표 1 및 표 2에 따른 바이오마커로부터 구성된 제 1 군으로부터 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 결합시키는 고체 지지체; 및 (b) 표 1 및 표 2에 따른 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 고체 지지체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커는 하기 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘, 및 이의 조합물.
한 구체예에서, 키트는 하기 바이오마커로부터 선택된 바이오마커를 검출하는 고체 지지체를 사용하기 위한 설명서를 제공한다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘, 및 이의 조합물.
다른 구체예에서, 포획제를 포함하는 고체 지지체 (또는 친화제로 칭함)로는 SELDI 프로브가 있다. 특정 구체예에서, 포획제는 양이온교환 흡착제, 음이온교환 흡착제, 금속 킬레이트 또는 소수성 흡착제가 있다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 포획제로는 양이온교환 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 키트는 부가적으로 (c) 4차 아민 흡착제(예를 들어, BioSepra Q Ceramic HyperD®F 흡착제 비드)와 같은 음이온 크로마토그래피 흡착제를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 부가적으로 (c) 표 1 및 표 2의 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 함유하는 용기를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 이에 부착되는 하나 이상의 포획제를 포함하며, 포획제가 표 1 및 표 2에 따른 바이오마커로 구성된 군으로부터의 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 결합시키는 고체 지지체; 및 (b) 표 1 및 표 2에 따른 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 혈소판-결합 바이오마커는 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 키트는 하기 바이오마커로부터 선택된 바이오마커를 검출하는 고체 지지체를 사용하기 위한 설명서를 제공한다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘. 다른 구체예에서, 키트는 하기 바이오마커로부터 선택된 바이오마커를 검출하는 고체 지지체를 사용하거나 대안적으로는 부가적으로 이들 바이오마커 각각을 검출하기 위한 설명서를 제공한다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘.
다른 구체예에서, 포획제를 포함하는 고체 지지체로는 SELDI 프로브가 있다. 특정 구체예에서, 포획제는 양이온교환 흡착제, 음이온교환 흡착제, 금속 킬레이트 또는 소수성 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 흡착제로는 생체특이적 흡착제가 있다. 몇몇 구체예에서, 포획제로는 양이온교환 흡착제가 있다. 다른 구체예에서, 키트는 부가적으로 (c) 음이온교환 크로마토그래피 흡착제를 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 (a) 생물학적 샘플에서 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커의 측정을 포함하는, 샘플에 기여하는 데이타를 입수하는 코드; 및 (b) 측정 함수로서 샘플의 혈관형성 질병 현상을 분류하는 분류 알고리즘을 실행하는 코드를 포함하는 소프트웨어 제품을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 바이오마커는 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 먼저 피검체로부터의 혈소판 샘플 중 VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커를 측정하고, 두번째로 피검체로부터의 혈소판 샘플 중 하나 이상의 바이오마커를 측정하고, 제 1 측정 및 제 2 측정을 비교하여 피검체의 종양 진행 또는 재발 경로를 결정함을 포함하여, 종양 진행 또는 재발의 경로를 결정하는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 분류 알고리즘은 VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로부터 구성된 군으로부터 선택된 바이오마커의 측정 함수로서 샘플의 혈관형성 현상을 분류한다. 다른 구체예에서, 분류 알고리즘은 하기 바이오마커 각각의 측정 함수로서 샘플의 혈관형성 현상을 분류한다: VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘.
다른 양태에서, 본 발명은 표 1 및 표 2에 따른 혈소판-결합 바이오마커로부터 선택된 정제된 생체분자를 제공하고, 부가적으로 질량분석법 또는 면역학적 검정에 의해 표 1 또는 표 2에 따른 바이오마커를 검출함을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점, 및 이의 바람직한 구체예는 하기의 상세한 설명, 실시예 및 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 대조군 동물(회색 선) 및 잠복성 종양(검정색 선)이 이식된 동물로부터 얻어진 혈소판 추출물의 질량분광분석 발현 지도를 나타낸 것이다. x-축의 숫자는 관찰된 입자의 전하에 대한 질량 비율(m/z)을 의미하며, 곡선의 높이는 관찰된 피크의 세기에 상응한다. 사용되는 추출물은 실시예에서 기술된 바와 같이, 개시 음이온교환 분획의 분획물 2로부터 수득된 것이다. 이러한 분획물로부터의 샘플은 WCX2 ProteinChip 어레이 상에서 분석되었다. CTAPIII 및 PF4는 종양을 지닌 마우스에서 상향-조절된 것으로 확인되었다. 도 1b는 CTAPIII 및 PF4(화살표)가 혈장이 아닌, 잠복성 및 혈관형성 종양을 지닌 마우스의 혈소판에서 상향-조절됨을 나타낸 것이다.
도 2a는 세개 군의 마우스의 혈소판 및 혈장으로부터 얻어진 추출물에서 측정된 표준화된 CTAPIII 피크 세기 플롯을 나타낸 것이다: 대조군 개개, 및 잠복성(비-혈관형성) 및 침습성(혈관형성) 인간 지방육종 개개. 도 2b는 마우스의 샘플 군의 혈소판 및 혈장에서 표준화된 PF4 피크 세기의 플롯을 나타낸 것이다. 도 2c는 19일, 32일 및 120일 성장의 종양을 지닌 마우스의 혈소판 및 혈장에서 표준화된 CTAPIII 피크 세기의 플롯을 나타낸 것이며, 이는 혈소판 CTAPIII 수준이 연구되는 시간 경과에 따라 증가하는 반면 혈장 CTAPIII 수준은 동일한 기간에 걸쳐 감소하거나 변화되지 않음을 나타내고 있다. 도 2d는 19일, 32일 및 120일 성장의 종양을 지닌 마우스의 혈소판 및 혈장에서 표준화된 PF4 피크 세기의 플롯을 나타낸 것이며, 이는 혈소판 PF4 수준이 연구되는 시간 경과에 따라 증가하는 반면 혈장 PF4 수준은 동일한 기간에 걸쳐 감소하거나 변화되지 않음을 나타내고 있다. 평균±표준 오차는 도 2에서 피크 세기의 각 그룹에 대해 나타내었다.
도 3a는 항-염기성 섬유아세포 성장인자(항-bFGF) 항체를 사용하여 혈소판 및 혈장 추출물의 항체 상호작용 발견 지도를 나타낸 것이다. 상세하게는, 도면은 bFGF 및 이의 단편이 잠복성(비-혈관형성) 종양-함유 마우스의 혈소판에서 상향조절됨을 나타내고 있다. 도 3b는 비-혈관형성 및 혈관형성 종양 함유 마우스 중 bFGF의 발현 간의 차이점 이외에 혈소판 대 혈장 추출물의 발현 수준의 변화를 비교하는 발현 지도를 나타낸 것이다. 도 3c는 혈소판에서 bFGF 고립의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 4a는 항-혈소판 유래 성장인자(항-PDGF) 항체를 사용하여 혈소판 추출물의 항체 상호작용 발견 지도를 나타낸 것이다. 도면은 PDGF 및 이의 단편이 잠복성 종양-함유 마우스를 상향 조절함을 나타낸 것이다(이식 후 30일 후). 도 4b는 혈소판 추출물 및 혈장 둘 모두의 PDGF 수준을 나타낸 발현 지도이다.
도 5는 음이온교환 컬럼 상에서 혈소판 및 혈장 추출물을 분획한 후 WCX2 ProteinChip 어레이법으로 이러한 분획물 중 하나(분획물 1)를 프로파일링하여 관찰된 바이오마커의 발현 지도를 나타낸 것이다. 도면은 VEGF 및 이의 단편이 종양을 지닌 마우스(이식 후 30일)로부터 혈소판에 상향-조절됨을 나타내고 있으며, VEGF 및 이의 단편이 잠복성 종양을 지닌 마우스와 비교하여 침습성 (혈관형성) 종양을 지닌 마우스로부터의 혈소판의 범위가 보다 크게 상향-조절됨을 나타낸 것이다.
도 6은 음이온교환 컬럼 상에서 혈소판 추출물을 분획한 후 WCX2 ProteinChip 어레이법으로 이러한 분획물 중 하나(분획물 1)를 프로파일링하여 관찰된 바이오마커의 발현 지도를 나타낸 것이다. 도면은 20400 Da 단백질을 포함하는 수개의 마커가 대조군 마우스(회색)으로부터의 혈소판 추출물과 비교하여 종양-함유 마우스(검정색)으로부터 얻어진 혈소판 추출물에서 상향 조절됨을 나타낸 것이다.
도 7은 음이온교환 컬럼 상에서 혈소판 추출물을 분획한 후 WCX2 ProteinChip 어레이법으로 이러한 분획물 중 하나(분획물 1)를 프로파일링하여 관찰된 바이오마커의 발현 지도를 나타낸 것이다. 도면은 확인된 마커가 대조군 마우스(회색)와 비교하여 잠복성 종양-함유 마우스(검정색)에서 상향 조절됨을 나타낸 것이다.
도 8은 정상, 비-혈관형성 및 혈관형성 종양-함유 마우스로부터 얻어진 혈소판 및 혈장 샘플의 bFGF, VEGF, PDGF 및 앤도스타틴 수준의 플롯을 나타낸 것이다.
도 9a는 항-VEGF, 항-bFGF 및 항-앤도스타틴 항체를 사용하여 혈소판 추출물의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 앤도스타틴은 VEGF 및 bFGF의 손실에서 혈소판의 증가를 나타낸다. 도 9b는 앤도스타틴이 혈소판 세포로의 섭생에 대해 VEGF와 경쟁적임을 나타낸다.
도 10은 50 ng의 125I-표지된 VEGF를 함유한 100 마이크로리터의 마트리겔(Matrigel)이 마우스에 주입되는 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 조직은 실질적으로 마우스로부터 분리되고 조직 1 그램 당 계수는 결정된다. 데이타는 혈소판이 인자의 혈장 수준의 상응하는 증가없이 125I-표지된 VEGF를 고립시키는 것으로 나타난다. 따라서, 혈관형성 조절 단백질은 100 마이크로리터 마트리겔 펠렛 정도로 작은 소스가 피하로 이식될 때에도 선택적이고 정량가능한 방식으로 혈소판에 의해 얻어질 수 있다.
도 11은 이식하고 133일 후에 누드 마우스 중 비-혈관형성 대 혈관형성 인간 지방육종 종양의 성장을 나타낸 것이다.
도 12a 내지 12d는 VEGF와 같은 혈관형성 조절 단백질의 혈소판 추출물의 증가된 양이 선택적 고립 과정을 나타내는 것으로, 혈소판 표면과의 간단한 결합을 나타내는 것이 아니다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구체예
I. 서론
바이오마커는 다른 표현형 상태(예를 들어 질병을 갖지 않음)와 비교하여 하나의 표현형 상태(예를 들어, 질병을 갖음)의 피검체로부터 얻어진 샘플 중에 차별되게 존재하는 유기 생체분자이다. 바이오마커는 상이한 군 중 바이오마커의 평균 또는 중간 발현 수준이 통계적으로 유의하게 되도록 계산되는 경우 상이한 표현형 상태 간에 차별되게 존재한다. 이 들 중 통계적 유의성에 대한 일반적인 시험은 t-테스트, ANOVA, 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis), 윌콕손(Wilcoxon), 만-화이트니(Mann-Whitney) 및 오즈비(odd ratio)를 포함한다. 바이오마커 단독 또는 이의 결합은 피검체가 하나의 표현형 상태 또는 다른 표현형 상태에 속하는 상대적 위험의 측정을 제공한다. 그러므로, 이는 질병(진단), 약물의 치료학적 유효성(치료) 및 약물 독성에 대한 마커로서 유용하다.
본 발명자들은 혈소판이 암 및 혈관형성(항-혈관형성을 포함) 활성의 차이로 특징되는 기타 병태에 대해 놀랍게도 바이오마커가 양호한 소스임을 발견하였다. 구체적으로, 혈소판-유래 바이오마커는 질병 현상의 변화를 매우 조기에 지시하고 비-암으로부터 암 뿐만 아니라 악성 종양으로부터의 양성 종양을 구별할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 암, 관절염 및 임신과 같은 다양한 임상 병태의 조기 진단을 위한 수단을 제공한다. 상이한 임상학적 병태는 각각의 임상학적 병태가 상이한 바이오마커의 변경 또는 다중 바이오마커의 클러스터를 초래할 수 있는 바와 같이, 본 발명을 사용하여 구별될 수 있다. 따라서, 제공된 임상학적 병태에 대한 바이오마커 발현 패턴은 질병의 지문 또는 프로파일 또는 대사 상태일 수 있다. 따라서, 본 발명은 질병 상태를 지시하는 바이오마커의 발현 수준을 검출하고 결정하거나, 혈관형성 활성의 변화와 관련한 대사 활성의 변화를 검출하고 결정하기 위한 키트, 방법 및 장치를 제공한다.
예를 들어 종양 성장의 변화를 검출하기 위한 본 발명의 능력은 본원에 제공된 도면 및 표에 기술되어 있다. 도면 및 표에 나타낸 데이타를 얻기 위해 사용되는 방법은 실시예에서 상세하게 기술되어 있다. 간단하게는, 마우스는 잠복성 또는 침습성 종양으로 이식되어 사전결정된 시간 동안 성장시켰다. 종양이 이식되지 않은 대조군 동물 또한 검사되었다. 혈소판은 실시예에서 기술된 바와 같이 마우스로부터 수득되고, 동질화되고, 처리되었으며, 당업자에 의해 수행되는 SELDI 질량 분광법 및 기타 방법을 사용하여 분석되었다. 이러한 방법을 사용하여, 질병 상태의 변화를 매우 조기에 지시할 수 있고 비-암으로부터 암을 구별할 수 있을 뿐만 아니라 양성 종양으로부터 악성 종양을 구별할 수 있는 혈소판 유래 바이오마커가 확인되었다. 예를 들어, 도면 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 바이오마커 PF4의 발현은 종양을 지닌 마우스로부터의 혈소판에서 향상된다. 놀랍게도, PF4 발현은 잠복성 종양 임플란트를 지닌 마우스에서 가장 높다. 도면 및 표 1은 대략 16.2 kDa의 질량을 갖는 이량체, 바이오마커 CTAPIII에 대해 유사한 결과를 나타낸다.
관찰된 피크의 모양 및 세기(도 1a 참조) 및 기타 파라미터가 또한 사용될 수 있지만, 바이오마커의 분자량은 검출하기에 적합한 바이오마커를 제조하는데 공지되어야 한다. 예를 들어, 바이오마커에 대한 항체가 사용될 수 있으며, 바이오마커의 활성이 공지된 경우, 효소 검정이 바이오마커를 검출하고 정량화하는데 사용될 수 있다.
II. 암 및 비-암 종양에 대한 혈소판 바이오마커
바이오마커
본 발명은 혈관형성 또는 항-혈관형성 활성으로 특징되는 병태, 구체적으로 암 대 정상(비-암) 또는 양성(즉, 잠복성) 종양 대 악성을 갖는 피검체의 혈소판에 차별되게 존재하는 폴리펩티드-계열 바이오마커를 제공한다. 바이오마커는 질량분석법에 의해 결정된 질량-대-전하 비율, 비행시간형 질량분석에서 이의 스펙트럼 피크의 모양 및 흡착제 표면에 이의 결합 특징에 의해 특징화된다. 이러한 특징은 구체적인 검출 생체분자가 본 발명의 바이오마커인지의 여부를 결정하는 한 방법을 제공한다. 이러한 특징은 생체분자의 고유한 특징으로 나타내며 생체분자가 식별되는 방식을 제한하지 않는다. 한 양태에서, 본 발명은 단리된, 예를 들어 정제된 형태의 바이오마커를 제공한다.
바이오마커는 시페르겐 바이오시스템사(Ciphergen Biosystems, Inc.; Fremont, CA)("Ciphergen")로부터의 ProteinChip 어레이를 이용한 SELDI 기술을 사용하여 발견되었다. 혈소판 샘플은 정상, 양성 종양, 악성 종양의 세가지 표현형 중 하나를 갖는 무린(murine) 피검체로부터 수집된다. 혈소판은 우레아 완충액으로 추출된 후 음이온교환, 양이온교환 또는 분석용 IMAC 구리 SELDI 바이오칩에 직접적으로 적용되거나, 음이온교환 비드 상에 분별된 후 분석용 양이온 SELDI 바이오칩에 적용된다. 샘플 중 폴리펩티드의 스펙트럼은 시페르겐 PBSII 질량 분석기 상에서 비행시간형 질량분석에 의해 발생된다. 따라서, 얻어진 스펙트럼은 시페르겐 바이오시스템사로부터의 바이오마커 위자드를 구비한 시페르겐 익스프레스 데이타 매니저 소프트웨어(Ciphergen Express™ Data Manager Software) 및 바이오마커 패턴 소프트웨어로 분석되었다. 각 군에 대한 질량 스펙트럼은 산란 플롯 분석으로 수행되었다. 만-화이트니(Mann-Whitney) 시험 분석이 수행되어 세개의 상이한 군을 비교하고, 단백질은 두개 군 간에 현저하게(P<0.0001) 상이한 것으로 선택된다. 이러한 방법은 실시예 섹션에서 더욱 상세히 기술된다.
따라서, 발견된 바이오마커는 표 1 및 표 2에 기술된 것이다. "단백질칩 어레이(ProteinChip assay)" 컬럼은 실시예에서 기술된 바와 같이, 바이오마커가 발견되는 음이온 크로마토그래피 분획물, 바이오마커가 결합하는 바이오칩의 타입 및 세척 상태를 언급한다.
표 1
마커 P-값 종양-함유 동물에서 상향 또는 하향 조절 ProteinChip® 검정
10.7, 34-39 kD 혈관내피성장인자(VEGF) <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
20-25.7 kD 혈소판-유래 성장인자(PDGF) <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
11, 14.7, 15, 16.5 kD 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
8206 Da 혈소판 인자 4(PF4) <0.01 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
8120 Da 결합조직 활성단백질 III(CTAPIII) <0.01 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 CM10상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
13.8, 20.3 kD 엔도스타틴 <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
13.8, 27.4 kD 텀스타틴 <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
13.6, 20.6, 23.9-24.7 kD 금속단백분해효소의 조직억제제 <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
27.9 kD 아포지단백질 AI <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척 IMAC30-Cu 상에 직접, 50 mM 트리스 HCl로 세척, pH 7.5 Q10상에 직접, 50 nm 트리스 HCl로 세척, pH 7.5
8.7, 8.9 kD IL8 <0.05 상향 분획물 1 및 2, WCX, 50 mM Na 아세테이트 pH 5로 세척
표 2
마커 P-값 ProteinChip® 검정
Figure 112007017223792-PCT00001
 <0.05 분획물 1 및 2, WCX 칩, 50 mM Na 아세테이트로 세척, pH 5
Figure 112007017223792-PCT00002
 <0.05 분획물 5, WCX 칩, 50 mM Na 아세테이트로 세척, pH 5
본 발명의 바이오마커는 질량 분석법에 의해 결정되는 질량 대 전하 비율로 특징된다. 각 바이오마커의 질량 대 전하 비("M" 값)는 표 1 및 표 2에서 "마커" 컬럼에 제공된다. 따라서, 예를 들어, M8206은 8206의 측정된 질량-대-전하 비율을 갖는다. 질량-대-전하 비율은 시페르겐 바이오시스템사(Ciphergen Biosystems, Inc.)의 PBSII 질량 분석기에서 산출한 질량 스펙트럼으로부터 결정된다. 본 장비는 약 +/-0.15 퍼센트의 질량 정밀도를 갖는다. 부가적으로, 장비는 약 400 내지 1000 m/dm의 질량 분해능을 갖으며, 여기서 m은 질량이며, dm은 0.5 피크 높이에서 질량 스펙트럼 피크폭이다. 바이오마커의 질량-대-전하 비율은 바이오마커 위자드(Biomarker Wizard™) 소프트웨어(Ciphergen Biosystems, Inc.)를 이용하여 결정된다. 바이오마커 위자드는 PBSII에 의해 결정된 바와 같이 모든 분석된 스펙트럼으로부터 동일한 피크의 질량-대-전하 비율을 클러스터링시키고, 클러스터에서 최대 및 최소 질량-대-전하 비율을 획득하고, 2로 나눔으로써 바이오마커에 질량-대-전하 비율을 지정한다. 따라서, 제공된 질량은 이러한 설명을 반영한다.
본 발명의 바이오마커는 추가로 비행시간형 질량분석에서 이들 스펙트럼 피크의 모양에 의해 특징된다. 바이오마커를 나타내는 피크가 기재된 질량 스펙트럼은 도면에 나타내었다.
본 발명의 바이오마커는 크로마토그래피 표면 상에 이들 결합 성질에 의해 추가로 특징된다. 예를 들어, 분획물 III(pH 5 세척)에서 발견된 마커는 pH 6에서 결합되지만 pH 5에서 세척과 함께 용리한다. 대부분의 바이오마커는 pH 5에서 50 mM 나트륨 아세테이트로 세척한 후 양이온 교환 흡착제(예를 들어 Ciphergen® WCX ProteinChip® 검정)에 결합하고, 많은 바이오마커는 IMAC 바이오칩에 결합한다.
본 발명의 특정 바이오마커의 확인은 표 1에서 지적된 바와 같이 결정된다. 이러한 결정이 이루어지는 방법은 실시예 섹션에 기술되어 있다. 이의 확인이 결정된 바이오마커에 대해, 바이오마커의 존재는 광학적 및 면역학적 검출을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명을 사용하여 검출가능한 바이오마커가 질량-대-전하 비율, 결합 성질 및 스펙트럼 형태에 의해 특징될 수 있기 때문에, 이는 이의 특이적 동정의 종래 지식없이 질량 분석에 의해 검출될 수 있다. 그러나, 요망되는 경우, 이의 동정이 결정되지 않는 바이오마커는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하므로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 단백질 바이오마커는 트립신 또는 V8 프로테아제와 같은 다수의 효소로 펩티드-맵핑하므로써 동정될 수 있으며, 소화 단편의 분자량을 매칭시키는 서열용 데이타베이스에 사용되는 소화 단편의 분자량은 맴핑에서 사용되는 프로테아제에 의해 산출된다. 대안적으로는, 단백질 바이오마커는 직렬 질량 분석법(MS) 기술을 사용하여 서열화될 수 있다. 본 방법에서, 단백질은 예를 들어, 젤 전기영동에 의해 분리된다. 바이오마커를 함유한 밴드는 절단되고 단백질은 프로테아제 소화를 수행한다. 개개 단백질 단편은 직렬 MS의 제 1 질량 분석기로 분리된다. 이후 단편은 충돌-유도 냉각시킨다. 이는 펩티드를 단편화하여 폴리펩티드 레이더(ladder)를 생산한다. 폴리펩티드 레이더는 직렬 MS의 제 2 질량 분석기로 분석될 수 있다. 폴리펩티드 레이더의 맴버의 질량 차이는 서열 중 아미노산을 동정한다. 전체적인 단백질은 이러한 방법에 의해 서열화될 수 있거나, 서열 단편은 데이타베이스 마이닝(database mining)을 수행하여 동정 후보물질을 발견할 수 있다.
바이오마커 검출을 위한 바람직한 생물학적 소스는 혈소판이다.
본 발명의 바이오마커는 생체분자이다. 따라서, 본 발명은 단리된 형태의 이들 생체분자를 제공한다. 바이오마커는 혈소판 또는 혈청과 같은 생물학적 유체로부터 단리될 수 있다. 이들은 이의 질량 및 결합 특징 모두를 기초로 하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 생체분자를 포함하는 샘플은 본원에 기술된 바와 같이 크로마토그래피 분획으로 수행되고 추가로 예를 들어 아크릴아미드 젤 전기영동에 의한 분리로 수행될 수 있다. 바이오마커 동정 지식은 또한 면역친화 크로마토그래피로 단리시킴을 포함한다.
개질된 형태의 혈소판-결합 바이오마커의 사용
단백질은 종종 검출가능한 상이한 질량에 의해 특징되는 다수의 상이한 형태로 샘플 중에 존재함이 발견되었다. 이러한 형태는 해독전 및 해독후 개질 각각 또는 둘모두로부터 초래될 수 있다. 해독전 개질된 형태는 대립유전자 변형체, 절편 변형체 및 RNA 에디팅 형(editing form)을 포함한다. 해독후 개질된 형태는 단백질분해 분열(예를 들어, 모 단백질의 단편), 글리코실화, 포스포릴화, 지질화, 산화, 메틸화, 시스틴화, 술폰화 및 아세틸화로부터 초래되는 형태를 포함한다. 특정 단백질 및 모든 개질된 형태를 포함하는 단백질의 수집은 본원에서 "단백질 클로스터"로 언급된다. 특정 단백질을 배제하는 특정 단백질의 모든 개질된 형태의 수집은 본원에서 "개질된 단백질 클러스터"로 언급된다. 본 발명의 임의의 바이오마커의 개질된 형태는 또한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 특정 경우에, 개질된 형태는 본원에 따른 특정 형태 보다 진단에서 보다 더 차별되는 능력을 나타낼 수 있다.
바이오마커의 개질된 형태는 바이오마커로부터 개질된 형태를 검출하고 구별할 수 있는 임의의 방법에 의해 초기에 검출될 수 있다. 초기 검출을 위한 바람직한 방법은 먼저 바이오마커 및 개질된 형태를 생체특이적 포획제를 포획한 후 포획된 단백질을 질량분석으로 검출함을 포함한다. 더욱 상세하게는, 단백질은 바이오마커 및 이의 개질된 형태를 인식하는 항체, 앱타머(aptamer) 또는 애피바디(affibody)와 같은 생체특이적 포획제를 사용하여 포획된다. 이러한 방법은 또한 단백질에 결합되거나 항체에 의해 인식되고 바이오마커일 수 있는 단백질 상호작용제의 포획으로 초래할 것이다. 바람직하게는, 생체특이적 포획제는 고체상에 결합된다. 이후, 포획된 단백질은 SELDI 질량 분석 또는 포획제로부터 단백질을 용리시키고 전통적인 MALDI 또는 SELDI로 용리된 단백질을 검출하므로써 검출될 수 있다. 질량 분석의 사용은 특히 관심을 갖게 되는데, 이는 표지을 위한 필요없이 질량을 기초로 한 단백질의 개질된 형태를 구별하고 정량화할 수 있기 때문이다.
바람직하게는, 생체특이적 포획제는 비드, 판, 막 또는 칩과 같은 고체상에 결합된다. 항체와 같은 생체분자를 고체상에 결합시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이는 예를 들어, 이작용성 연결제를 사용할 수 있거나, 고체상은 접촉면 상에 분자를 결합시키는 에폭시드 또는 이미다졸과 같은 반응성 기기와 유도체화될 수 있다. 상이한 타겟 단백질에 대한 생체특이적 포획제는 동일한 장소에서 혼합될 수 있거나, 이는 상이한 물리적 또는 지정가능한 위치에서 고체상에 부착될 수 있다. 예를 들어, 이는 유도체화된 비드와 함께 다중 컬럼을 로딩할 수 있으며, 각각의 컬럼은 단일 단백질 클러스터를 포획할 수 있다. 대안적으로는, 이는 다양한 단백질 클러스터에 대해 포획제로 유도체화된 상이한 비드를 갖는 단일 컬럼을 패킹하므로써, 단일 장소에서 분석물 모두를 포획한다. 따라서, 항체-유도체화된 비드-계열 기술, 예를 들어 루미넥스(Austin, TX)의 xMAP 기술은 단백질 클러스터를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 생체특이적 포획제는 상세하게는 이를 분화시키기 위한 클러스터의 맴버에 관한 것이어야 한다.
또다른 구체예에서, 바이오칩의 표면은 동일한 위치 또는 물리적으로 상이한 지정가능한 위치에서 단백질 클러스터에 대해 지시되는 포획제로 유도체화될 수 있다. 상이하게 지정가능한 위치에서 상이한 클러스터를 포획하는 한 잇점은 분석이 보다 단순하다는 것이다.
단백질의 개질된 형태의 동정 및 관심을 갖는 임상학적 파라미터와의 대비 후에, 개질된 형태는 본 발명의 임의의 방법에서 바이오마커로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 개질된 형태의 검출은 친화성 포획 후 질량분석 또는 상세하게는 개질된 형태를 지시하는 통상적인 면역학적 검정을 포함하는 임의의 특이적 검출법으로 수행될 수 있다 면역학적 검정은 분석물을 포획하기 위한 항체와 같은 생체특이적 포획제를 필요로 한다. 더욱이, 이러한 검정이 단백질 및 단백질의 개질된 형태를 상세하게 구별하도록 고안되어야 한다. 이는 예를 들어, 하나의 항체가 하나 이상의 형태 및 제 2의 별도의 표지된 항체를 포획, 상게하게는 결합하고, 다양한 형태의 별도의 검출을 제공하는 샌드위치 검정을 이용할 수 있다. 항체는 동물을 생체분자로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 본 발명은 ELISA를 포함하는 샌드위치 면역학적 검정 또는 형광-계열 면역학적 검정, 효소 면역학적 검정을 포함하는 통상적인 면역학적 검정을 고려한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 바이오마커에 결합되는 항체와 같은 생체특이적 포획제를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 바이오마커에 대해 지시되고 바이오마커에 결합되는 항체는 바이오마커를 검출하는데 유용하다. 한 구체예에서, 생체특이적 포획제는 고체 지지체, 예를 들어, 비드, 칩, 막, 또는 마이크로역가판에 결합된다.
III. 혈소판-결합 바이오마커의 검출
본 발명의 바이오마커는 임의의 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 검출 범례는 광학적 방법, 전기화학적 방법(전압측정법 및 전류측정법 기술), 원자력 현미경법, 및 라디오파 방법, 예를 들어 다극성 공명분광법을 포함한다. 현미경법, 공초점 및 비-공초점 둘모두 이외의 기술되는 광학적 방법은 형광, 발광, 화학발광, 흡수율, 반사율, 투과율 및 복굴절 또는 굴절률(예를 들어, 표면 플라스몬 공명, 타원편광법, 공명 거울법, 구배 연결기 파로방법 또는 간섭법)의 검출이다.
청구되는 발명을 사용하여 검출하기 전에, 바이오마커는 검출을 방해할 수 있는 혈액의 다른 성분으로부터 이를 분리하기 위해 분획될 수 있다. 분획은 다른 혈액 성분으로부터의 단리, 혈소판 성분의 세포내 분획 및/또는 크로마토그래피, 친화력 정제, 1D 및 2D 맵핑과 같은 기술을 사용하여 혈소판에서 발견되는 다른 생체분자로부터 요망되는 바이오마커의 분획, 및 당업자에게 공지된 정제를 위한 다른 방법들을 포함할 수 있다. 한 구체에에서, 샘플은 바이오칩에 의해 분석된다. 바이오칩은 대개 고체 기재를 포함하고, 대개 포획제(또는 흡착제 또는 친화제로 칭함)가 부착된 평평한 표면을 갖는다. 종종, 바이오칩의 표면은 여러 개의 지정가능한 위치를 포함하며, 각각은 결합되는 포획제를 갖는다.
단백질 바이오칩은 폴리펩티드의 포획을 위해 개조된 바이오칩이다. 많은 단백질 바이오칩은 당업계에 기술되어 있다. 이들로는 예를 들어 시페르겐 바이오시스템사(Fremont, CA), 팩카드 바이오사이언스 컴포니(Packard BioScience Company; Meriden CT), 지오믹스(Zyomyx; Hayward, CA), 필로스(Phylos; Lexington, MA), 및 바이아코어(Biacore; Uppsala, Sweden)에 의해 생산되는 단백질 바이오칩을 포함한다. 이러한 단백질 바이오칩의 예는 하기 특허 또는 공개된 특허출원에 기술되어 있다: 미국특허번호 제6,225,047호; PCT국제공개특허번호 WO 99/51773호; 미국특허번호 제6,329,209호; PCT국제공개특허번호 WO 00/56934호 및 미국특허번호 제5,242,828호.
질량 분석법에 의한 검출
바람직한 구체예에서, 본 발명의 바이오마커는 질량분석법에 의해 검출되며, 이러한 방법은 질량분석기를 사용하여 기체상 이온을 검출한다. 질량분석기의 예로는 비행시간형, 자기 섹터, 4중극 필터, 이온 트랩, 이온 사이클로트론 공명, 정전기적 섹터 분석기 및 이들의 합성이 있다.
다른 바람직한 방법에서, 질량분석기로는 레이저 탈착/이온화 질량분석기가 있다. 레이저 탈착/이온화 질량분석법에서, 분석물은 질량분석 프로브의 표면에 배치되고, 장치는 질량 분석기의 프로브 경계면을 당기고 이온화 및 질량 분석기로의 도입을 위한 이온화 에너지를 분석물에 존재하도록 개조된다. 레이저 탈착 질량 분석기는 통상적으로 자외선 에너지 뿐만 아니라 적외서 레이저로부터의 레이저 에너지를 사용하여 표면으로부터 분석물을 탈착시키고, 이를 휘발성화시키고 이온화시키며 질량 분석기의 이온 광학에 이용가능하게 한다.
SELDI
본 발명에서 사용하는 바람직한 질량 분석 기술로는 예를 들어 미국특허번호 제5,719,060호 및 제6,225,047호(Hutchens and Yip)에 기술된 "Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization" 또는 "SELDI"가 있다. 이는 분석물(여기서는 하나 이상의 바이오마커)이 SELDI 질량 분석 프로브의 표면에 포획되는 탈착/이온화 가스상 이온 분석(예를 들어, 질량 분석) 방법을 칭한다. 수개의 SELDI의 버젼이 존재한다.
하나의 SELDI 버젼은 "친화성 포획 질량 분석"으로 칭한다. 이는 또한 "표면-향상된 친화성 포획(Surface-Enhanced Affinity Capture)" 또는 "SEAC"로 칭한다. 이러한 버젼은 물질과 분석물 간의 비공유 친화도 상호작용(흡수)를 통해 분석물을 포획하는 프로브 표면 상에 물질을 갖는 프로브의 사용을 포함한다. 이러한 물질은 "흡착제", "포획제", "친화제" 또는 "결합 부분"으로 다양하게 불리운다. 이러한 프로브는 "친화 포획 프로브" 또는 "흡착표면"을 갖는 것으로 언급될 수 있다. 이러한 포획제는 분석물을 결합시킬 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 포획제는 선택적 표면의 기재에 직접적으로 부착될 수 있거나 기재가 공유 또는 배위 공유 결합을 형성시키는 반응을 통해 포획제를 결합시킬 수 있는 반응 부분을 수반하는 반응성 표면을 갖을 수 있다. 에폭시드 및 카르보디이미다졸은 유용한 반응성 부분으로 항체 또는 세포 수용체와 같은 폴리펩티드 포획제를 공유적으로 결합시킨다. 니트로아세트산 및 이미노디아세트산은 히스티딘 함유 펩티드와 비교유적으로 상호작용하는 금속 이온을 결합시키는 킬레이트제로서 작용하는 유용한 반응성 부분이다. 흡착제는 일반적으로 크로마토그래피 흡착제 및 생체특이적 흡착제로서 분류된다.
"크로마토그래피 흡착제"는 크로마토그래피에서 통상적으로 사용되는 흡착 물질을 언급하는 것이다. 크로마토그래피 흡착제는 예를 들어, 이온교환 물질, 금속 킬레이트제(예를 들어, 니트로아세트산 또는 이미노디아세트산), 고정된 금속 킬레이트, 소수성 상호작용 흡착제, 친수성 상호작용 흡착제, 염료, 단순한 생체분자(예를 들어, 뉴클레오티드, 아미노산, 간단한 당 및 지방산) 및 혼합된 모드 흡착제(예를 들어, 소수성 인력/정전기적 반발 흡착제)를 포함한다.
"생체특이적 흡착제"는 생체분자, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어, 아프타머), 폴리펩티드, 다당류, 지질, 스테로이드 또는 이들의 콘쥬게이트(예를 들어, 글리코단백질, 지질단백질, 글리코지질, 핵산(예를 들어, DNA)-단백질 콘쥬게이트)를 포함하는 흡착제를 언급한다. 특정 예에서, 생체특이적 흡착제는 다중단백질 착물, 생물학적 막 또는 바이러스와 같은 가대분자 구조일 수 있다. 생체특이적 흡착제의 예로는 항체, 수용체 단백질 및 핵산이 있다. 생체특이적 흡착제는 통상적으로 크로마토그래피 흡착제 보다 타겟 분석물에 대해 높은 특이성을 갖는다. SELDI에 사용되는 흡착제의 또다른 예는 미국특허번호 제6,225,047호에서 확인될 수 있다. "생체선택적 흡착제"는 10-8M 이상의 친화력을 갖는 분석물에 결합하는 흡착제를 언급한다.
시페르겐 바이오시스템사에 의해 생산되는 단백질 바이오칩은 지정가능한 위치에 부착되는 크로마토그래피 또는 생체특이적 흡착제를 갖는 표면을 포함한다. 시페르겐 바이오칩 검정은 NP20(친수성); H4 및 H50(소수성); SAX-2, Q-10 및 LSAX-30(음이온 교환); WCX-2, CM-10 및 LWCX-30(양이온 교환); IMAC-3, IMAC-30 및 IMAC-40(금속 킬레이트); 및 PS-10, PS-20(카르보이미다졸, 에폭시드를 갖은 반응성 표면) 및 PG20(카르보이미다졸을 통해 결합된 단백질 G)을 포함한다. 소수성 단백질칩 어레이는 이소프로필 또는 노닐페녹시-폴리(에틸렌 글리콜)메타크릴레이트 작용성을 갖는다. 음이온 교환 단백질칩 어레이는 4차 암모늄 작용성을 갖는다. 양이온 교환 단백질칩 어레이는 카르복실레이트 작용성을 갖는다. 고정된 금속 킬레이트 단백질칩 어레이는 전이금속이온, 예를 들어 구리, 니켈, 아연 및 갈륨을 킬레이트화에 의해 흡착시키는 니트롤로아세트산 작용성을 갖는다. 미리 활성화된 단백질칩 어레이는 공유 결합을 위한 단백질 상에 기와 반응할 수 있는 카르보이미다졸 또는 에폭시드 작용기를 갖는다.
이러한 바이오칩은 또한 미국특허번호 제6,579,719호(Hutchens and Yip, "Retentate Chromatography," 2003, 6월 17일); PCT국제특허공개번호 WO00/66265(Rich et al., "Probes for a Gas Phase Ion Spectrometer," 2000년 11월 9일); 미국특허번호 제6,555,813호(Beecher et al., "Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase Mass Spectrometer," 2003년 4월 29일); 미국특허출원번호 제2003-0032043 A1호(Pohl and Papanu, "Latex Based Adsorbent Chip," 2002년 7월 16일); 및 PCT 국제특허공개번호 WO 03/040700호(Um et al., "Hydrophobic Surface Chip," 2003년 5월 15일); 미국특허출원번호 US 2003/0218130 A1호(Boschetti et al., "Biochips With Surface Coated with Polysaccharide-Based Hydrogels," 2003년4월 14일) 및 미국특허출원번호 제60/448,467호("Photocrossslinked Hydrogel Surface Coatings" Huang et al., 2003년2월 21일 출원)에 기재되어 있다.
일반적으로, 흡착제 표면을 갖는 프로브는 샘플 중에 존재할 수 있는 바이오마커를 흡착제에 결합시키기에 충분한 시간 동안 샘플과 접촉된다. 인큐베이션 기간 후에, 기재는 세척되어 비결합된 물질을 제거한다. 임의의 적합한 세척 용액이 사용되며, 바람직하게는 수용액이 사용된다. 분자가 결합을 유지하는 범위는 엄중하게 세척을 조절하므로써 조절될 수 있다. 세척 용액의 용리 특성은 예를 들어, pH, 이온강도, 소수성, 카오트로피즘(chaotropism) 정도, 세정 강도, 및 온도에 따를 수 있다. 프로브가 SEAC 및 SEND 성질(본원에 기술됨) 모두를 갖지 않는 한, 이후 에너지 흡수 분자가 결합된 바이오마커와 함께 기재에 적용된다.
기재에 결합된 바이오마커는 비행시간형 질량 분석기와 같은 기체상 이온 분석기에서 검출된다. 바이오마커는 레이저와 같은 이온화 소스에 의해 이온화되며, 발생된 이온은 광학 어셈블리에 의해 수집된 후 질량 분석기는 통과 이온을 분산시키고 분석한다. 이후 검출기는 검출된 이온의 정보를 질량-대-전하 비율로 해석한다. 바이오마커의 검출은 통상적으로 단일 강도의 검출을 포함할 것이다. 따라서, 바이오마커의 양 및 질량이 결정될 수 있다.
SELDI의 다른 버젼은 표면-향상된 순탈착(SEND)이며, 이는 프로브 표면("SEND 프로브")에 화학적으로 결합되는 에너지 흡수 분자를 포함하는 프로브의 사용을 포함한다. 구 "에너지 흡수 분자"(EAM)는 레이저 탈착/이온화 소스로부터 에너지를 흡수할 수 있는 분자를 의미하며, 이후 이와 접촉하여 분석물 분자를 탈착시키고 이온화하는데 기여한다. EAM 카테고리는 종종 "매트릭스"로 언급되는 MALDI에서 사용되는 분자를 포함하고, 신남산 유도체, 시나핀산(SPA), 시아노-히드록시-신남산(CHCA) 및 디히드록시벤조산, 페룰산, 및 히드록시아세토-페논 유도체로 예시된다. 특정 구체예에서, 에너지 흡수 분자는 선형 또는 가교 중합체, 예를 들어 폴리메타크릴레이트에 도입된다. 예를 들어, 조성물은 α-시아노-4-메타크릴로일옥시신남산과 아크릴레이트의 공중합체일 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 α-시아노-4-메타크릴로일옥시신남산, 아크릴레이트 및 3-(트리-에톡시)실릴 프로필 메타크릴레이트의 공중합체이다. 다른 구체예에서, 조성물은 α-시아노-4메타크릴로일옥시신남산 및 옥타데실메타크릴레이트의 공중합체("C18 SEND")이다. SEND는 또한 미국특허번호 제6,124,137호 및 PCT 국제특허공개번호 WO 03/64594호(Kitagawa, "Monomers And Polymers Having Energy Absorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes," 2003년 8월 7일)에 기재되어 있다.
SEAC/SEND는 포획제와 에너지 흡수 분자 모두가 표면이 존재하는 샘플에 부착되는 SELDI의 버젼이다. 그러므로, SEAC/SEND 프로브는 외부 매트릭스의 적용을 필요로 하지 않고 친화성 포획 및 이온화/탈착을 통해 분석물을 포획할 수 있다. C18 SEND 바이오칩은 포획제로서 작용하는 C18 부분, 및 에너지 흡수 부분으로서 작용하는 CHCA 부분을 포함하는 SEAC/SEND의 버젼이다.
표면-향상된 광불안정한 부착 및 박리(SEPAR)로 불리우는 SELDI의 다른 버젼은 분석물을 공유적으로 결합시킨 후 광, 예를 들어 레이저 광에 노출시킨 후 부분에 광불안정한 결합을 깨트려 분석물을 방출할 수 있는 표면에 부착된 부분을 갖는 프로브의 사용을 포함한다(참조, 미국특허번호 제5,719,060호). SEPAR 및 SELDI의 다른 형태는 본 발명과 관련하여 바이오마커 또는 바이오마커 프로필을 검출하기 위해 용이하게 개조된다.
기타 질량 분석법
기타 질량 분석법에서, 바이오마커는 먼저 바이오마커를 결합시키는 크로마토그래피 성질을 갖는 크로마토그래피 수지 상에 포획될 수 있다. 본 예에서, 이는 다양한 방법을 포함할 수 있다. 한 방법으로는 예를 들어, 양이온 교환수지, 예를 들어 CM Ceramic HyperD F 수지 상에 바이오마커를 포획하고, 수지를 세척하고, 바이오마커를 용리하고 MALDI에 의해 검출시킬 수 있다. 대안적으로는, 이러한 벙법은 양이온 교환 수지에 적용시키기 전에 음이온 교환 수지 상에 샘플을 분획하여 선행될 수 있다. 다른 대안으로는, 한 방법으로는 음이온 교환 수지 상에서 분획하고 직접적으로 MALDI에 의해 검출할 수 있다. 또다른 방법으로, 한 방법은 바이오마커를 결합하는 항체를 포함하여 면역-크로마토그래피 수지 상에 바이오마커를 포획하고, 수지를 세척하여 비결합된 물질을 제거하고, 바이오마커를 수지로부터 용리하고, 용리된 바이오마커를 MALDI 또는 SELDI에 의해 검출할 수 있다.
데이타 분석
비행시간형 질량 분석에 의한 분석물의 분석은 비행시간형 스펙트럼을 생산한다. 궁극적으로 분석된 비행시간형 스펙트럼은 통상적으로 다수의 펄스로부터 신호의 합 보다는 샘플에 대해 이온화 에너지의 단일 펄스로부터의 신호를 나타내지 않는다. 이는 잡음을 감소시키고 동적 범위를 증가시킨다. 이후 이러한 비행시간형 데이타는 데이타 프로세싱으로 수행된다. 시페르겐의 ProteinChip® 소프트웨어에서, 데이타 프로세싱은 통상적으로 질량 스펙트럼을 생산하는 TOF-대-M/Z 변환, 기기 오프셋을 제거하기 위한 베이스라인 삭감, 및 고주파수 잡음을 감소시키기 위한 고주파수 잡음 필터링을 포함한다.
바이오마커의 탈착 및 검출에 의해 생산된 데이타는 프로그램가능한 디지탈 컴퓨터를 사용하여 분석될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 데이타를 분석하여 검출된 다수의 바이오마커, 및 임의적으로 검출된 각각의 바이오마커에 대한 신호의 강도 및 결정된 분자 질량을 지시한다. 데이타 분석은 바이오마커의 신호 강도를 결정하고, 사전결정된 통계적 분포로부터 벗어난 데이타를 제거하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 관찰된 피크는 일부 기준과 비교하여 각 피크의 높이를 계산하므로써 표준화될 수 있다. 이러한 기준 배경 잡음은 기기 및 0의 치수로 세팅된 에너지 흡수 분자와 같은 화학물질에 의해 생산된다.
컴퓨터는 디스플레이를 위해 다양한 포멧으로 얻어진 데이타를 변환시킬 수 있다. 표준 스펙트럼이 디스플레이될 수 있으나, 하나의 유용한 포멧에서 피크 높이 및 질량 정보만이 스펙트럼으로부터 유지되어 보다 깨끗한 이미지를 수득하고 거의 동일한 분자량을 갖는 바이오마커를 보다 용이하게 볼 수 있다. 다른 유용한 포멧에서, 두개 이상의 스펙트럼은 비교되어 통상적으로 중요한 유일한 바이오마커가 샘플 간의 상향- 또는 하향-조절된다. 이들 임의의 포멧을 사용하여, 특정 바이오마커거 샘플 중에 존재되는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
분석은 일반적으로 분석물로부터 신호를 나타내는 스펙트럼에서 피크의 확인을 포함한다. 피크 선택은 시각적으로 수행될 수 있지만, 피크의 검출을 자동화할 수 있는 시페르겐의 ProteinChip® 소프트웨어 페키지의 일부로서 소프트웨어가 이용가능하다. 일반적으로, 이러한 소프트웨어는 선택적 출발점을 초과하는 신호-대-잡음 비율을 갖는 신호를 확인하고 피크 신호의 중심에 피크의 징량을 표지하므로써 작용한다. 한 유용한 적용에서, 많은 스펙트럼은 질량 스펙트럼의 일부 선택된 백분뮬에 존재하는 동일한 피크를 확인하기 위해 비교된다. 이러한 소프트웨어의 한 버젼은 규정된 질량 범위내에 다양한 스펙트럼에 나타나는 모든 피크를 클러스터링하고, 질량(M/Z) 클러스터의 중간점 가까이에 모든 피크에 대한 질량(M/Z)을 할당한다.
데이타를 분석하기 위해 사용되는 소프트웨어는 신호가 본 발명에 따라 바이오마커에 대응하는 신호의 피크를 나타내는 지의 여부를 결정하기 위해 신호의 분석에 알고리즘을 적용하는 코드를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 또한 관찰된 바이오마커 피크와 관련한 데이타를 분류 트리(tree) 또는 ANN 분석을 수행하여 시험하에서 특정 임상적 파라미터의 상태를 지시하는 바이오마커 피크 또는 바이오마커 피크의 조합이 존재하는 지의 여부를 결정한다. 데이타의 분석은 샘플의 질량 분광분석으로부터 직접 또는 간접적으로 수득되는 다양한 파라미터의 열쇠가 될 수 있다. 이러한 파라미터는 하나 이상의 피크의 존재 또는 부재, 피크 또는 피크의 군의 형태, 하나 이상의 피크의 높이, 하나 이상의 피크의 log 높이, 및 피크 높이 데이타의 다른 등차 조작을 포함한다.
혈소판-결합 바이오마커의 SELDI 검출을 위한 일반적인 프로토콜
상술된 바와 같이, SELDI 질량 분석은 바이오마커의 검출을 위해 본 발명에 의해 고려되는 바람직한 프로토콜이다. SELDI를 이용한 바이오마커의 검출을 위한 일반적인 프로토콜은 분획되는 바이오마커를 함유한 샘플과 함께 개시되므로써 샘플의 다른 성분으로부터 관심을 갖는 바이오마커를 적어도 부분적으로 분리시킨다. 샘플의 조기 분획은 이의 방법이 종종 청구되는 발명의 감도를 개선시키기 때문에 바람직하다. 사전 분획의 바람직한 방법은 Q HyperD(BioSepra, SA)와 같은 음이온교환 크로마토그래피 물질과 샘플을 접촉시킴을 포함한다. 이후 결합된 물질은 수집되는 바이오마커를 함유한 분획물로 pH 9, pH 7, pH 5 및 pH 4의 완충액을 사용하여 순차적인 pH 용리를 수행하였다.
이후 시험된 샘플(바람직하게는 사전 분획된)은 양이온교환 흡착제(바람직하게는 WCX 단백질칩 어레이(Ciphergen Biosystems, Inc.) 또는 IMAC 흡착제(바람직하게는 IMAC3 단백질칩 어레이(Ciphergen Biosystems, Inc.))를 포함하는 친화력 프로브와 접촉된다. 이후 프로브는 비결합된 분자를 세척하면서 바이오마커를 보유한 완충액으로 세척된다. 바이오마커는 레이저 탈착/이온화 질량 분석법에 의해 검출된다.
대안적으로는, PF4 및 CTAP III의 경우와 같이 이용가능한 바이오마커를 이식하는 항체인 경우, 생체특이적 프로브가 구성될 수 있다. 이러한 프로브는 항체를 작용화된 프로브, 예를 들어 사전활성화된 PS10 또는 PS20 단백질칩 어레이(Ciphergen Biosystems, Inc.)의 표면에 접촉하므로써 형성될 수 있다. 프로브의 표면에 부착되자 마자, 프로브는 프로브의 표면 상에 샘플로부터의 바이어마커를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 이후 바이오마커는 예를 들어, 레이저 탈착/이온화 질량 분석법에 의해 검출될 수 있다.
면역학적 검정에 의한 검출
다른 구체예에서, 본 발명의 바이오마커는 면역학적 검정에 의해 측정될 수 있다. 면역학적 검정은 바이오마커를 포획하기 위해 항체와 같은 생체특이적 포획제를 요구한다. 항체는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 동물을 바이오마커로 면역시키므로써 형성될 수 있다. 바이오마커는 이들의 결합 특정을 기초로 하여 샘플로부터 단리된다. 대안적으로는 폴리펩티드 바이오마커의 아미노산 서열이 공지된 경우, 폴리펩티드는 합성될 수 있으며, 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 항체를 형성시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 예를 들어, ELISA 또는 형광-계열 면역학적 검정을 포함하는 샌드위치 면역학적 검정, 및 기타 효소 면역학적 검정을 포함하는 통상적인 면역학적 검정이 고려된다. SELDI-계열 면역학적 검정에서, 바이오마커용 생체특이적 포획제는 MS 프로브, 예를 들어 활성화된 단백질칩 어레이의 표면에 부착된다. 이후 바이오마커는 이러한 시약을 통해 바이오칩 상에 명확하게 포획되며, 포획된 바이오마커는 질량 분석법에 의해 검출된다.
IV. 혈관형성 현상에 대한 바이오마커 발현의 변화의 대비
본 발명의 용도는 전문가가 증가된 혈관형성 활성과 관련된 개개의 대사 상태의 변화를 진단하기 위한 것이다. 이는 검출될 수 있는 변경된 대사 상태와 관련된 혈관형성 활성으로부터 초래되는 혈소판-결합 바이오마커의 발현 수준의 변화를 모너터링하므로써 수행된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 바이오마커는 혈관형성 또는 지혈과 관련되지만, 적합한 바이오마커의 정확한 확인은 이러한 바이오마커를 사용하여 본 발명을 수행하는 것을 선행하지 않는다. 기술된 방식의 본 발명의 실행은 개개 또는 군이 암, 감염, 임신, 조직 손상 등과 같은 생리학적 변형과 관련된 혈관형성 활성의 개질에 대한 반응으로 발현 수준이 변형되는 단일 검출가능한 마커 또는 다중 검출가능한 마커와 함께 수행될 수 있다.
바이오마커 발현은 여러 방법으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 단일 샘플은 대표적인 대조 집단을 샘플링하는 것으로부터 결정되는 대조군 출발점과 실질적으로 비교되는 바이오마커 발현 수준에 대해 분석될 수 있다. 대안적으로는 시간 경과에 걸쳐 획득된 단일 환자로부터의 여러 샘플은 바이오마커 발현 수준이 증가하거나 감소하는지의 여부를 결정하기 위해 비교될 수 있다. 이러한 방법은 구체적으로 바이오마커 발현에 영향을 미치는 질병을 치료한 후에 환자의 예후를 평가는 경우 유용하다. 다른 바이오마커 평가는 과도한 실험없이 분석을 수행할 수 있는 당업자에게 용이하게 자명하게 될 것이다.
단일 마커
개개 바이오마커의 검출은 본 발명에 대해 고려되며, 단 바이오마커가 상술된 기준을 충족하는 한 구체적으로 질병 또는 대사 상태의 변화와의 상관은 본 발명의 사용을 통하여 검출될 수 있다. 단일 바이오마커는 피검체의 혈관형성 현상을 평가하기 위한, 예를 들어 암의 존재 또는 환자의 혈관형성 활성에 영향을 미치는 특정 암과 같은 질병의 경로의 변경을 진단하기 위한 진단 시험에 유용할 수 있다. 구 "혈관형성 현상"은 그 중에서도 특히, 질병 대 비-질병, 및 구체적으로 침습성 암 대 잠복성 암 또는 침습성 암 대 비-암을 구별함을 포함한다. 또한, 혈관형성 현상은 다양한 타입의 암을 포함할 수 있다. 이러한 현상을 기초로 하여, 추가 진단 시험 또는 치료 과정 또는 요법을 포함하는 추가 과정이 지시될 수 있다.
표 1 및 표 2에 기술된 각각의 바이오마커는 환자에게서 혈관형성의 변화에 반응하여 구별되게 발현된다. 그러므로, 이들 바이오마커 각각은 개별적으로 혈관형성 현상의 결정에 유용하게 도움이된다. 본 발명의 일부 구체예는 예를 들어, 혈소판 제조물에서 선택적 바이오마커의 발현 수준을 측정함을 포함한다. 동일한 개객에서 바이오마커의 발현 수준을 조기-결정된 발현과 비교하므로써, 당업자는 질병의 경로, 또는 치료에 대한 질병의 반응을 결정할 수 있다. 대안적으로는, 검출된 바이오마커의 발현 수준은 예를 들어 적절하게 공지된 표현형을 나타내는 개객의 집단을 조사하므로써 결정되는, 하나 이상의 질병 상태에 대한 출발 값과 비교될 수 있다. 본 발명으로 개별적으로 검출하여 진단 또는 예후 목적에 적합할 수 있는 대표적으로 공지된 바이오마커로는 VEGF, PDGF, bFGF, CTAPIII, 엔도스타틴, 텀스타틴, 금속단백분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘.
혈관형성 활성의 변화 지시제로서 개개의 바이오마커의 용도는 통상적으로 바이오마커를 검출한 후 결정된 바이오마커 발현 수준을 특정 질병 또는 대사상태의 변화와 관련된 출발점 수준과 대비함을 포함한다. 예를 들어, SELDI 바이오칩 상의 포획은 질량 분석으로 검출하고, 네가티브 혈관형성 현상으로부터 포지티브 혈관형성 현상을 구별하는 진단 양 또는 컷-오프(cut-off)를 측정함을 포함한다. 진단 양은 피검체가 특정 혈관형성 현상을 갖는 것으로 분류되는 것 이상 또는 이하의 바이오마커의 측정된 양을 나타낸다. 예를 들어, 바이오마커가 종양 형성 동안 정상과 비교하여 상향 조절되는 경우, 진단 컷-오프를 초과하는 측정된 양은 암의 진단을 제공한다. 대안적으로는, 바이오마커가 침습성 종양의 치료 동안 하향 조절되는 경우, 진단 컷-오프 미만의 측정된 양은 종양 퇴화의 진단을 제공하거나, 잠복성 상태로의 종양의 진행을 제공한다.
바이오마커의 측정된 수준은 또한 암의 특정 타입의 진단을 용이하게 하거나 상이한 암 타입을 구별하는데 사용될 수 있다. 에를 들어, 바이오마커 또는 바이오마커의 조합이 다른 것과 비교하여 암의 특정 타입의 특정 수준을 초과하여 상향 조절되는 경우, 진단 컷-오프를 초과한 바이오마커의 측정된 양은 특정 타입의 암이 존재하는 것으로 지시됨을 제공한다. 더욱이, 바이오마커의 조합은 하기에 기술된 바와 같이, 추가 진단 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커 및 기술을 이용하여 식별되고 서로 구별될 수 있는 암 타입의 일부예로는 유방암, 간암, 폐암, 혈관아세포종, 신경모세포종, 방광암, 췌장암, 위암, 뇌암, 결장암을 포함한다. 암종, 육종, 백혈병, 임파종 및 골수종은 또한 본원에 기술된 바이오마커 및 방법을 사용하여 구별될 수 있다. 더욱이, 상이한 암 타입은 상이한 패턴의 바이오마커를 발현시키고, 이에 의해 서로 구별된다. 각 암 타입의 패턴 특징은 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 각 암 타입으로부터의 샘플을 학습 알고리즘으로 분석하여 암 타입을 기초로 하여 샘플을 분류할 수 있는 분류 알고리즘을 형성시키므로써 결정될 수 있다.
검정법에서 사용되는 특정 진단 컷-오프를 조절하므로써, 당업계에서 널리 이해되는 바와 같이, 진단자의 선택에 따라 진단 검정의 감도 또는 특이성이 증가될 수 있다. 특정 진단 컷-오프는 예를 들어 바이오마커의 양을 상이한 혈관형성 현상을 갖는 피검체로부터의 샘플의 통계적으로 현저한 수로 측정하고, 진단자의 특이성 및 감도의 요망되는 수준에 적합하게 컷-오프를 이끌어내므로써 결정될 수 있다.
마커의 조합
개개의 바이오마커가 유용한 진단 바이오마커인 경우, 바이오마커의 조합이 단일 바이오마커 보다 큰 특정 현상의 예측 값을 제공할 수 있음을 발견하였다. 상세하게는 샘플 중 다수의 바이오마커의 검출은 시험의 감도 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 적어도 2개, 바람직하게는 3, 4, 5, 6 또는 7, 더욱 바람직하게는 10, 15, 또는 20개의 상이한 바이오마커 발현 수준이 질병의 진단 또는 대사상태의 변화에서 결정된다. 조합으로 사용될 수 있는 대표적인 바이오마커로는 PF4, VEGF, PDGF, bFGF, PDECGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 앤도스타틴, 및 트롬보스폰딘을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 bFGF포함하는 다수의 바이오마커, 및 VEGF, PDGF, bFGF, PDECGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, PF4, 앤지오스타틴, 앤도스타틴, 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기타 바이오마커를 검출한다. 대안적인 바람직한 구체예는 PF4를 포함하는 다수의 바이오마커, 및 VEGF, PDGF, bFGF, PDECGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 앤도스타틴, 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기타 바이오마커를 검출한다.
V. 종양 상태를 검정하기 위한 분류 알고리즘의 형성
상술된 바와 같이, 검출된 바이오마커 발현 수준의 분석은 수작업으로 수행되거나 컴퓨터 소프트 웨어를 사용하여 자동화될 수 있다. 단일 샘플 분석이 수행되거나, 다중 샘플 분석이 개시되면서, 다중 샘플 각각이 치료 또는 평가 과정 동안 적절한 시간의 연구하에서 개개로부터 획득된다. 분석의 정확성은 구체적으로 질병의 치료 또는 대사상태의 변화 동안의 진행을 모니터링하고 질병 또는 대사상태의 변화를 진단을 하기 위해 사용될 수 있는 결정으로서 중요하다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 관리하는 환자 치료는 발현 수준의 분류를 기초로 하여 평가 하에서 질병 또는 환자의 대사상태를 정확하게 반영한다.
본 발명에 사용되기에 적합한 많은 상이한 카테고리 전략은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 전략은 별도의 바이오마커의 발현 수준을 질병 진행의 별도의 단계로 식별한다. 예를 들어, 종양 성장에서 종양은 초기 형성에서 전이까지 일련의 단계를 통해 진행할 것이다. 따라서, 적합한 카테고리 식은 종양 성장 및/또는 전이 활성을 특징으로 하는 "침습성"; 성장하지 않거나 활동적으로 전이되지 않는 종양을 식별하기 위한, 잠복성; 예를 들어 화학요법 후 줄어드는 종양을 식별하는 퇴화성; 및 비 종양을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, "공지된 샘플"과 같은 샘플을 사용하여 발생되는 스펙트럼(예를 들어 비행시간형 질량 스펙트럼)으로부터 유도된 데이타는 분류 모델을 "트레이닝"하는데 사용될 수 있다. "공지된 샘플"은 미리 분류된 샘플이다. 스펙트럼으로부터 유도되고 분류 모델을 형성하는데 사용되는 데이타는 "트레이닝 데이타 시트"로서 언급될 수 있다. 트레이닝 후에, 분류 모델은 비공지된 샘플을 사용항 발생된 스펙트럼으로부터 유도된 데이타에서 패턴을 인식할 수 있다. 이후 분류 모델은 공지된 샘플을 부류들로 분류하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 특정 생물학적 샘플이 특정 생물학적 조건(예를 들어, 질병화되는 것 대 비-질병화됨)과 관련되는지의 여부를 예측하는데 유용할 수 있다.
분류 모델을 형성하는데 사용되는 트레이닝 데이타 세트는 미가공 데이타 또는 사전-가공된 데이타를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 미가공된 데이타는 비행시간형 스펙트럼 또는 질량 스펙트럼으로부터 직접적으로 얻을 수 있고, 이후 상술된 바와 같이, 임의적으로 "사전-가공"될 수 있다.
분류 모델은 데이타에 존재하는 대상 파라미터를 기초로한 부류로 데이타 몸체를 분리하는 임의의 적합한 통계적 분류(또는 "학습"(learning))을 사용하여 형성될 수 있다. 분류 방법은 관리되거나 비관리될 수 있다. 관리되고 비관리되는 분류 공정의 예는 문헌[Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No.1, 2000년 1월]에 기술되어 있으며, 이의 교시는 참고문헌으로 포함된다.
관리되는 분류에서, 공지된 카테고리의 예를 함유하는 트레이닝 데이타는 학습 메카니즘으로 나타내며, 이는 공지된 부류 각각을 규정하는 하나 이상의 관계 세트를 학습하는 것이다. 이후 새로운 데이타는 학습 메카니즘에 적용될 수 있으며, 이후 학습된 관계를 사용하여 새로운 데이타를 분류한다. 관리되는 분류 공정의 예로는 선형회귀 공정(예를 들어 다중 선형 회귀(MLR), 부분최소자승(PLS) g회귀 및 주성분 회귀(PCR), 이성분 결정 트리(예를 들어 CART와 같은 회귀분할 공정 - 분류 및 회귀 트리), 인공적 신경 네트워크, 예를 들어 역증식 네트워크, 판벽 분석(예를 들어 바이에션 분류자 또는 피셔 분류), 논리적 분류자 및 지지 벡터 분류자(지지 벡터 기계)를 포함한다.
바람직한 관리되는 분류 방법은 회귀분할 공정이다. 회귀분할 공정은 회귀분할 트리를 사용하여 공지되지 않은 샘플로부터 유도된 스펙트럼을 분류한다. 회귀분할 공정에 대한 상세한 설명은 미국특허출원번호 제2002 0138208 A1호(Paulse et al., "Method for analyzing mass spectra")에서 제공된다.
다른 구체예에서, 생성되는 분류 모델은 비관리되는 학습법을 사용하여 형성될 수 있다. 비관리되는 분류는 트레이닝 데이타 세트가 유도되는 것으로부터 스펙트럼을 사전분류하지 않고 트레이닝 데이타 세트의 유사성을 기초로 하여 분류를 수행하려고 시도된다. 비관리되는 학습 방법은 클러스터 분석을 포함한다. 클러스터 분석은 "클러스터" 또는 서로 매우 유사하고, 다른 클러스터의 맴버와 매우 유사하지 않는 맴버를 이상적으로 갖을 수 있는 군으로 데이타를 나눈다. 이후 유사성은 일부 거리 미터법으 사용하여 측정되며, 이는 데이타 아이템과 서로 밀접한 데이타 아이템과 결합한 클러스터 간의 거리를 측정한다. 클러스터화 기술은 맥퀸의 K-수단(MacQueen's K-means) 알고리즘 및 코호넨의 자기-조직화 맵 알고리즘을 포함한다.
생물학적 정보를 분류하는데 사용하기 위해 가정되는 학습 알고리즘은 예를 들어, PCT 국제특허공개번호 WO 01/31580호(Barnhill et al., "Methods and devices for identifying patterns in biological systems and methods of use thereof"), 미국특허출원번호 제2002-0193950A1호(Gavin et al., "Method or analyzing mass spectra"), 미국특허출원번호 제2003-0004402A1호(Hitt et al., "Process for discriminationg between biological states based on hidden pattersn from biological data"), 및 미국특허출원번호 제2003-0055615A1호(Zhang and Zhang, "Systems and methods for processing biological expression data")에 기술되어 있다.
분류 모델은 임의의 적합한 디지탈 컴퓨터 상에 형성되고 사용될 수 있다. 적합한 디지탈 컴퓨터는 작동 시스템을 기초로 한 유닉스, 윈도우 또는 리눅스와 같은 임의의 표준화 또는 특수한 작동 시스템을 사용하는 마이크로, 작은, 또는 큰 컴퓨터를 포함한다. 사용되는 디지탈 컴퓨터는 물리학적으로 관심을 갖는 스펙트럼을 생성시키는데 사용되는 질량 분석기와 분리될 수 있거나 질량 분석기에 결합될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 트레이닝 데이타 세트 및 분류 모델은 디지탈 컴퓨터에 의해 실행되거나 사용되는 컴퓨터 코드에 의해 구현될 수 있다. 컴퓨터 코드는 광학적 또는 자기 디스크, 스틱, 테이프 등을 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터 해독가능한 매체 상에 저장될 수 있으고, C, C++, 비쥬얼 베이직 등을 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터 프로그래밍 언어로 작성될 수 있다.
상술된 학습 알고리즘은 이미 발견된 바이오마커, 혈관형성 현상을 결정하기 위한 발견된 신규한 바이오마커용 분류 알고리즘을 개발하는데 유용하다. 분류 알고리즘은 단일 또는 조합하여 사용되는 바이오마커에 대해 진단 값(예를 들어, 컷-오프 점)을 제공하므로써 진단 시험에 대한 기준을 형성한다.
VI. 환자 진료의 관리
질병 상태의 진단 및 예후의 평가를 위한 방법 키트 및 장치를 제공함에 있어서, 본 발명은 환자 진료의 관리를 위한 도구를 제공하는데 유용성을 갖는다. 구체적으로, 본 발명은 환자의 혈관형성 활성 변화를 초래하는 여러 질병의 치료를 진단 및 평가하는데 사용함을 발견하였다. 이러한 병태로는 예를 들어, 암, 임신, 감염(예를 들어, 간염), 손상 및 관절염 병태를 포함할 수 있다. 혈관형성 현상을 검정하는 본 발명의 특정 구체예에서, 본 방법은 추가로 현상을 기초로 한 피검체 치료를 관리함을 포함한다. 이러한 관리는 질병 상태를 결정하기 위한 외과의 또는 임사의의 행동을 포함한다. 예를 들어, 외과의가 침습성 암을 진단한 경우, 치료요법 또는 수술과 같은 특정 치료 요법이 따르게 될 것이다. 대안적으로는, 비-종양 또는 잠복성 종양의 진단은 추가 시험으로 이루어져 환자에게 영향을 미치는 특정 질병을 결정할 수 있다.
본 발명의 구체적으로 유용한 양태는 상술된 바와 같이 잠재적으로 생명을 위협하는 병태의 조기 검출을 제공한다. 조기 진단은 병태를 조기 치료하므로써 회복에 대한 예후를 향상시킨다. 예를 들어, 암의 조기 검출은 전이 전에 화학요법 또는 임의의 종양의 외과적 제거를 보다 빨리 그리고 보다 작게 쇠약화시킬 수 있다. 관절염의 조기 검출은 조인트 손상의 발생을 완화시키기전에 약물 조정이 염증을 조절하도록 하여 질병의 증상을 느리게 한다.
일 구체예에서, 본 발명은 피검체의 암 진행 또는 암 재발의 경로를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 시간에 따라, 바이오마커의 양 및 상대적 양(예를 들어, 페턴)은 변화한다. 예를 들어, 표 1의 텀스타틴 바이오마커는 혈관형성 동안 증가된다. 그러므로, 시간에 따라 증가하는 바이오마커의 동향은 피검체의 혈관형성이 증가함을 나타내는 것이다. 마찬가지로, 텀스타틴 수준의 감소는 피검체의 혈관형성이 감소함을 나타내는 것이다. 따라서, 본 방법은 적어도 두개의 상이한 시간점, 예를 들어 제 1 시간 및 제 2 시간에서 피검체 중 하나 이상의 바이오마커를 측정하고, 임의의 경우 이들 양의 변화를 비교함을 포함한다. 질병, 예를 들어 암 진행 또는 재발의 경로는 이들 비교를 기초로 하여 결정된다.
진단 후에, 본 발명을 이용한 바이오마커의 검출은 사용될 수 있는 치료 요법의 유효성을 평가할 수 있다. 예르 들어, 암에서, 잠복성 종양의 치료 후에 CTAPIII 바이오마커의 발현 감소의 검출은 침습성 종양으로의 표현형을 변화하는 종양과 대비한다. 반대로, CTAPIII의 실질적 증가의 검출은 침습성으로부터 잠복성 또는 부재로 종양 표현형의 변화와 대비한다.
본 발명의 추가 구체예는 예를 들어, 기술자, 외과의 또는 환자의 검정 결과 또는 진단, 둘 모두를 전하는 것과 관련된다. 특정 구체예에서, 컴퓨터는 관심을 갖는 부분, 예를 들어, 외과의 및 이들의 환자에게 검정 결과 또는 진단 또는 둘모두를 전하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 검정은 수행되거나 검정 결과는 결과 또는 진단이 연계되는 지역 또는 관할과 상이한 지역 또는 관할에서 분석된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 질병 또는 대사상태를 나타내는 바이오마커의 시험 피검체에 존재하거나 부재함을 기초로 한 진단은 진단이 획득된 후에 가능한한 빨리 피검체에게 전달된다. 진단은 피검체의 치료 외과의에 의해 피검체에 전달될 수 있다. 대안적으로는, 진단은 이메일에 의해 시험 피검체에게 보내어지거나 전화로 피검체에 전달될 수 있다. 컴퓨터는 진단을 이메일 또는 전화로 전달되는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 진단 시험 결과를 함유한 메세지는 전기 통신업자에게 잘 알려진 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 사용하여 발생되고 피검체에게 자동적으로 전달될 수 있다. 건강관리-지향 통신 시스템의 한예는 미국특허번호 제6,283,761호에 기술되어 있으나, 본 발명은 이러한 통신 시스템을 사용하는 방법으로 제한되지 않는다. 본 발명의 방법의 특정 구체예에서, 샘플을 검정하고, 질병을 진단하고, 검정 결과와 진단을 연계함을 포함하는 방법 단계의 모두 도는 일부는 다른(예를 들어 외국) 관할에서 수행될 수 있다.
VII. 암 및 비-암 종양을 위한 혈소판-결합 바이오마커의 검출용 키트
다른 양태에서, 본 발명은 혈관형성과 관련된 질병 상태 또는 대사활성의 변화를 검정하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본 발명에 따른 바이오마커를 검출하기 위해 사용된다. 한 구체예에서, 키트는 고체 지지체, 예를 들어, 칩, 마이크로역가판, 비드 또는 이에 부착된 흡착제를 갖는 수지를 포함하며, 여기서 흡착제는 본 발명의 바이오마커를 결합한다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 키트는 SELDI용 질량 분석 프로브, 예를 들어 단백질칩 어레이를 포함할 수 있다. 생체특이적 흡착제의 경우에, 키트는 반응성 표면을 갖는 고체 지지체, 및 생체특이적 흡착제를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 지지체는 표 1 및 표 2에 따른 것과 같은 적어도 1, 바람직하게는 적어도 2, 3 또는 4개의 바이오마커를 결합시킬 수 있는 하나 이상의 흡착제에 결합된다. 바람직한 구체예에서, 바이오마커는 PF4, VEGF, PDGF, bFGF, PDECGF, CTGF, 앤지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴, 앤도스타틴, 및 트롬보스폰딘 및 이의 조합물을 포함한다. 고체 지지체에 결합하기 위한 바람직한 흡착제는 양이온 및 음이온 교환, 소수성 및 생체 특이적 흡착제를 포함한다. 바람직한 생체특이적 흡착제는 항체, 앱타머, 보완적 핵산, 에피바디(affibody) 등을 포함한다. 추가 생체특이적 흡착제는 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다.
키트는 또한 세척용액 또는 세척용액을 제조하기 위한 설명서를 포함하며, 여기서 포획제 및 세척 용액의 조합은 예를 들어 질량 분석에 의한 검출용 고체 지지체 상에 바이오마커를 포획할 수 있다. 키트는 흡착제 이외를 포함할 수 있으며, 각각은 상이한 고체 지지체 상에 존재한다.
또다른 구체예에서, 이러한 키트는 라벨 또는 별도의 삽입물 형태의 적합한 작동 파라미터용 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 설명서는 샘플을 수집하는 방법, 프로브를 세척하는 방법 또는 검출되는 특정 바이오마커를 세척하는 방법에 대해 소비자에게 알려줄 것이다.
또다른 구체예에서, 키트는 눈금용 표준으로서 사용될 수 있는 바이오마커 샘플을 구비한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
VIII. 진단 시스템
본 발명은 도한 발현이 환자의 혈관형성 활성의 변화에 반응하여 변화되는 바이오마커를 검출하기 위한 진단 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 진단 시스템은 바람직하게는 단일 단계로 작동하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 구체예는 다수의 혈소판-결합 바이오마커를 결합하는 다수의 흡착제 표면을 포함한다. 바람직하게는, 흡착제는 상세하게는 관심을 갖는 바이오마커를 흡착시키는 생체특이적 흡착제이다. 본 발명의 진단 시스템은 또한 질량 분석기일 수 있는 관심을 갖는 바이오마커를 검출하기 위한 수단을 갖는다.
예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예는 소결된 프릿 상에 혈장 균질현탁액을 포함한다. 프릿은 액체의 모세관 흐름을 지지할 수 있는 흡수성 물질과 유체 연결된다. 흡수성 물질로는 상세하게는 검출될 수 있는 바이오마커를 인식하는 유체적으로 이동성 생체특이적 흡착제를 포함하는 제제이다. 바람직하게는, 유체적으로 이동성 생체특이적 흡착제로는 검출가능한 라벨, 더욱 바람직하게는, 시각적으로 볼 수 있는 라벨을 포함한다. 또한, 흡수성 물질의 다운스트림은 검출될 수 있는 바이오마커를 인식하는 고정된 생체특이적 흡착제이다.
상기와 같이 기술된 단순한 장치를 사용하여, 소결된 스릿에 도입된 혈장 균일현탁액은 세포 파편없이 여과된다. 잔류하는 액체는 흡수성 물질에 진행되고, 이는 이의 길이에 따라 액체를 삼출시킨다. 흡수성 물질을 가로지름에 있어서, 유체적으로 이동성 생체특이적 흡착제는 용해화되고 검출되는 바이오마커에 결합되어 착물을 형성한다. 액체가 추가로 흡수성 물질을 통해 진행하기 때문에, 착물은 충돌하고 고정된 생체특이적 흡착제에 결합한다. 착물이 고정된 생체특이적 흡착제에 결합하기 때문에, 고정된 생체특이적 흡착제가 흡수성 물질이 부착되는 점에서 농축되며, 여기서 검출될 수 있다. 장치는 임의적으로 본래 균일현탁액 중에 존재하는 잠재적으로 방해하는 물질을 제거하기 위해 착화 결합 후에 세척 완충액으로 세척될 수 있다.
당업자는 용이하게는 실질적으로 상술된 바람직한 장치와 동일한 방식으로 수행하는 여러 변형 장치 포맷임을 인식할 것이다. 예를 들어, 장치는 아미크로역가판 웰의 바닥에 결합된 생체특이적 제제를 사용하여 ELISA-타입 방식으로 필수적으로 수행될 수 있다. 이러한 포맷에서, 균일현탁액은 웰에 첨가된다. 이후 과량의 균일현탁액은 제거되고, 웰은 세척 완충액으로 세척된다. 마지막으로, 표지된 항체는 첨가되고 얻어진 착물은 검출된다.
당업자는 본 발명의 범위내에서 벗어나는 수많은 변형체와 함께 널리 공지된 상술된 장치의 포맷을 용이하게 인식할 것이다. 예를 들어, 유사한 장치는 미국특허번호 제5,409,664호, 제6,146,589호, 제4,960,691호, 제5,260,193호, 제5,202,268호 및 제5,766,961호에 기술되어 있다.
IX. 스크리닝 검정에서 암에 대한 바이오마커의 용도 및 암을 치료하는 방법
본 발명의 방법은 또한 다른 적용을 갖는다. 예를 들어, 바이오마커는 시험관내 또는 생체내에서 바이오마커의 발현을 조절하는 화합물을 스크린하는데 사용될 수 있으며, 이는 화합물이 환자의 함을 치료하거나 예방하거나, 잠복성 종양에서 침습성 종양으로 종양의 변형을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다. 다른 예에서, 바이오마커는 암의 치료에 대한 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 바이오마커는 피검체가 암을 발달할 위험이 있는지를 결정하기 위한 유전형질 연구에 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 키트는 소수성 작용을 갖는 고체 지지체, 예를 들어, 단백질 바이오칩(예를 들어, Ciphergen H50 ProteinChip 에러이, 예를 들어, ProteinChip 어레이) 및 기재를 세척하기 위한 나트륨 아세테이트 완충액, 칩 상에 본 발명의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하고 예를 들어 암을 진단하기 위해 이들 측정을 사용하기 위한 프로토콜을 제공하는 설명설르 포함할 수 있다.
치료학적 시험에 대해 적합한 화합물은 표 1 및 표 2에 기술된 하나 이상의 바이오마커와 작용하는 화합물을 초기에 식별하므로써 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝은 표 1 또는 표 2에 기술된 바이오마커를 재조합으로 발현시키고, 바이오마커를 정제하고, 바이오마커를 기재에 부착시킴을 포함한다. 이후 시험 화합물은 통상적으로 수성 조건에서 기재와 접촉될 것이며, 시험 화합물과 바이오마커의 상호작용은 예를 들어 염 농도의 함수에 따라 용리 속도를 측정하므로써 측정된다. 특정 단백질은 표 1 또는 표 2의 하나 이상의 바이오마커를 인식하고 분열시킬 수 있으며, 이러한 경우에, 단백질은 표준 검정에서 하나 이상의 바이오마커의 소화를 모니터링하므로써, 예를 들어 단백질의 젤 전기영동으로써 검출될 수 있다.
관련된 구체예에서, 표 1 또는 표 2의 하나 이상의 바이오마커의 능력을 억제하기 위한 시험 화합물의 능력이 측정될 수 있다. 당업자는 특정 바이오마커의 활성을 측정하는데 사용되는 기술이 바이오마커의 기능 및 성질에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 검정될 수 있는 바이오마커의 효소 활성은 적당한 기재가 이용가능하게 제공되고, 기재의 농도 또는 반응 산물의 형태가 용이하게 측정가능함을 제공한다. 제공된 바이오마커의 활성을 억제하거나 향상시키는 잠재적으로 치료학적 시험 화합물의 능력은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 촉매작용의 속도를 측정하므로써 결정될 수 있다. 표 1 또는 표 2의 바이오마커 중 하나의 비-효소적(예를 들어, 구조적) 기능 또는 활성을 방해하는 시험 화합물의 능력은 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, 표 1 및 표 2의 바이오마커 중 하나를 포함하는 다중-단백질 착물의 자기-어셈블리는 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 분광법에 의해 모니터링될 수 있다. 대안적으로는, 바이오마커가 전사의 비-효소적 개선제인 경우, 전사를 향상시키기 위한 바이오마커의 능력으로 방햐하는 시험 화합물은 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 시험관내 또는 생체내에서 바이오마커-의존 전사의 수준을 평가하므로써 식별될 수 있다.
표 1 또는 표 2의 임의의 바이오마커의 활성을 조절할 수 있는 시험 화합물은 암으로부터 고통당하거나 이로 발달할 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정 바이오마커의 활성을 증가시키는 시험 화합물의 투여는 생체내 특정 바이오마커의 활성이 암에 대한 단백질의 축적을 방지하는 경우, 환자에게 암 위험을 감소시킬 수 있다. 반대로, 특정 바이오마커의 활성을 감소시키는 시험 화합물의 투여는 바이오마커의 증가된 활성이 적어도 일부 암의 개시의 원인이 되는 경우, 환자에게서 암의 위험을 감소시킬 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 표 1 및 표 2의 혈소판-결합 바이오마커의 개질된 형태의 증가된 수준과 관련된 암과 같은 질병을 치료한느데 유용한 화합물을 식별하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 세포 추출물 또는 발현 라이브러리는 전체 길이 바이오마커의 분열을 촉매화하여 절단된 형태를 형성하는 화합물에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝 검정의 일 구체예에서, 바이오마커의 분열은 바이오마커가 분열되지 않는 경우 켄칭됨을 유지하지만 바이오마커가 분열되는 경우 형광을 내는 형광체를 바이오마커에 부착시키므로써 검출될 수 있다. 대안적으로는, 분열되지 않는 특정 아미노산 간의 아미드 결합을 제공하기 위해 개질된 전체 길이 바이오마커의 버젼은 생체내에서 이러한 사이트에 전체 길이 바이오마커를 분열시키는 세포 단백질분해효소를 선택적으로 결합하거나 "트래핑"시키는데 사용될 수 있다. 단백질분해효소 및 이들의 타겟을 스크리닝하고 식별하기 위한 방법은 과학문헌[예를 들어, Lopez-Ottin et al., (Nature Reviews, 3:509-519(2002))]에 기술되어 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약제학적 약물, 예를 들어 항-혈관형성 또는 항-종양형성 화합물의 치료학적 효능을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 약물의 임상적 시험을 수행하고, 약물에 대한 환자의 진행을 모니터링하는데 유용하다. 치료법 또는 임상적 시험은 특정 요법에서 약물을 투여함을 포함한다. 이러한 요법은 약물의 단일 투약 또는 시간에 걸쳐 약물의 다중 투약을 포함할 수 있다. 의사 도는 임상 연구자는 투여 경로에 따라 환자 또는 피검체에 약물의 효과를 모니터링한다. 약물이 병태에 대해 약리학적 효과를 갖는 경우, 본 발명의 바이오마커의 양 또는 상대적인 양(예를 들어 패턴 또는 프로필)은 비-질병 프로필쪽으로 변한다. 예를 들어, 표 1의 PF4 및 CTAPIII 바이오마커는 종양을 지닌 피검체로부터의 혈소판에서 증가한다. 그러므로, 종양을 치료하는 과정 동안 피검체 중 이들 바이오마커의 양의 경로를 따를 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 약물 치료법을 수용하는 피검체 중 하나 이상의 바이오마커를 측정하고, 바이오마커의 양을 피검체의 질병 상태와 대비함을 포함한다. 본 방법의 한 구체예는 약물 치료법의 과정 동안 두개 이상의 상이한 시점, 예를 들어 제 1 시간 및 제 2 시간에 바이오마커의 수준을 결정하고, 임의의 경우 바이오마커 양의 변화를 비교함을 포함한다. 예를 들어, 바이오마커는 약물 투여 전 및 후에, 또는 약물 투여 동안 두개의 상이한 시점에서 측정될 수 있다. 치료법의 효과는 이들 비교를 기초로 하여 결정된다. 치료가 효과적인 경우, 바이오마커는 정상으로 향할 것이며, 반면 치료가 비효과적인 경우, 바이오마커는 질병 지시쪽으로 향할 것이다. 치료가 효과적인 경우, 바이오마커는 정상쪽으로 향할 것이고, 반면 치료가 비효과적인 경우, 바이오마커는 질병 지시쪽으로 향할 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 절단된 바이오마커의 증가된 수준과 관련되는 질병, 예를 들어 암의 진행 또는 가능성을 치료하거나 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 하나 이상의 단백질이 표 1 또는 2의 전체 길이 바이오마커를 분열시키는 것으로 식별된 후에, 조합 라이브러리는 식별된 단백질의 분열 활성을 억제하는 화합물에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 화합물의 화학물질 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[참조, Lopez-Otin et al. (2002)]. 대안적으로, 억제 화합물은 혈소판-결합 바이오마커의 구조를 기초로 하여 고안될 수 있다.
임상 수준에서, 시험 화합물의 스크리닝은 피검체가 시험 화합물에 되기전 및 후에 시험 피검체로부터의 샘플을 수득함을 포함한다. 표 1 및 표 2에 기술된 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커의 샘플 수준은 측정되고 분석되어 시험 화합물에 노출된 후 바이오마커의 수준이 변화되었는지의 여부를 결정하기 위해 측정되고 분석될 수 있다. 샘플은 상술된 바와 같이, 질량 분석에 의해 분석될 수 있거나, 샘플은 당업자에게 공지된 임의의 적당한 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 표 1 및 표 2에 기술된 하나 이상의 바이오마커의 수준은 상세하게는 바이오마커에 결합되는 라디오- 또는 형광-표지된 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 직접적으로 측정될 수 있다. 대안적으로는, 하나 이상의 바이오마커를 엔코딩하는 mRNA 수준의 변화는 피검체에 제공된 시험 화합물의 투여와 함께 측정되고 대비될 수 있다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 수준의 변화는 시험관내 방법 물질을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 표 1 및 표 2의 하나 이상의 바이오마커를 발견시키거나 발현시킬 수 있는 세포가 배양된 인간 조직은 시험 화합물과 접촉될 수 있다. 시험 화합물로 처리된 피검체는 치료로부터 여기될 수 있는 임의의 생리학적 효과에 대해 일반적으로 시험될 것이다. 구체적으로, 시험 화합물은 피검체에 질병 가능성을 감소시키는 능력에 대해 평가될 것이다. 대안적으로는, 시험 화합물이 종래 암으로 진단된 피검체에 투여되는 경우, 시험 화합물은 이러한 적용의 정신 및 영역 및 첨부된 청구항의 범위 내에 암의 진행을 느리게 또는 멈추게하는 능력에 대해 스크리닝될 것이다.
X. 실시예
실시예 1: 암에 대한 바이오마커의 식별
A. 샘플 제조:
마취된 마우스로부터 직접 심장 구멍으로 3.2% 나트륨 시트레이트 폴리에틸렌 튜브에 혈액을 수집하고 가능한 한 200 g으로 스피닝하였다. 상층 상인 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 새로운 튜브에 옮기고, 혈소판(P)을 800g으로 원심분리하여 분리하였다. 단리된 혈소판 펠렛(P) 및 혈소판이 부족한 혈장(PPP) 상청액을 별도로 분석하였다.
각 마우스로부터의 혈소판 펠렛(P)을 9M 우레아, 2% CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸아미노니오]-1-프로판술포네이트), 50 mM 트리스 HCl, pH 9로 추출하고, 4℃에서 1 분 동안 10,000 × g으로 원심분리하고, 혈소판 추출물을 하기에 기술된 바와 같이 분획하였다. 각 마우스로부터의 20 ㎕의 PPP를 40 ㎕의 U9 완충액으로 조직을 1회용 막자로 분쇄하고 4℃에서 15 분 동안 보텍싱하므로써 추출하였다. 추출된 단백질을 4℃에서 10 분 동안 10,000 × g으로 원심분리하여 수확하였다. 순수한 종양 추출물을 하기에 기술된 바와 같이 분획하였다.
B. 샘플 분획:
종양, 혈소판 펠렛 및 혈장 샘플을 EDM 혈청 분획 프로토콜(Ciphergen®, Fremont, CA) 후에 개질된 음이온-교환 크로마토그래피로 분획하였다. 분획을 DPC® 마이크로믹스 5 쉐이커가 장착된 베크만 바이오멕(Beckmann Biomek®) 2000 실험실 작업 스테이션 상에서 96-웰 포멧 필터로 수행하였다. 20 ㎕의 혈소판 및 종양 추출물 분취액, 60 ㎕의 변성된 혈장을 100 ㎕의 50 mM 트리스 HCl pH9로 희석시키고, 50 mM 트리스 HCl, pH 9로 탈수된 바이오세프라 큐 세라믹 하이퍼디(BioSepra Q Ceramic HyperD®) F 흡착제 비드로 사전 충전된 여과기 바다 96-웰 마이크로플레이트에 옮기고, 50 mM 트리스-HCl, pH9.0으로 미리 평형을 유지시켰다. 모든 액체를 다중스크린 진공 매니폴드(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 여과 플레이트로부터 제거하였다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 분획물 I로서 수집하였다. 분획 플레이트를 2 × 100 ㎕의 하기 완충액으로 인큐베이션하여 하기 분획을 수득하였다: 1M 우레아, 0.1% CHAPS, 50 mM NaCl, 2.5% 아세토니트릴, 50 mM 트리스 HCl, pH7.5 (분획물 II), 1M 우레아, 0.1% CHAPS, 50 mM NaCl, 2.5% 아세토니트릴, 50 mM Na아세테이트, pH5.0 (분획물 III), 1M 우레아, 0.1% CHAPS, 50 mM NaCl, 2.5% 아세토니트릴, 50 mM Na아세테이트, pH4.0 (분획물 IV), 1M 우레아, 0.1% CHAPS, 50 mM NaCl, 2.5% 아세토니트릴, 50 mM Na아세테이트, pH3.0 (분획물 V), 및 33.3% 이소프로판올/16.7% 아세토니트릴/8% 포름산(분획물 VI).
C. 단백질칩 어레이 상의 발현 상이한 맴핑
약한 양이온교환 크로마토그래피 단백질 어레이(WCX2 ProteinChip™ 어레이; Ciphergen®, Fremont, CA)를 96-웰 바이오프로세서 상에 로딩하고, 50 mM 나트륨 아세테이트/0.1% 옥틸 글루코시드(Sigma, St.Louis, MO), pH 5.0으로 균질화시켰다. 40 ㎕ 음이온교환 크로마토그래피 분획물을 각 어레이점 상에서 100 ㎕의 동일한 완충액으로 희석시키고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 어레이 스팟을 100 ㎕의 50 mM 나트륨 아세테이트/0.1% 옥틸 글루코시드(Sigma, St.Louis, MO), pH 5.0로 3분 동안 세척하였다. 물로 린싱한 후, 2×1 ㎕의 시나핀산 용액을 어레이 스팟 당 첨가하였다.
D. SELDI-TOF MS로의 단백질 프로파일링
어레이를 Protein Biology System II SELDI-TOF 질량 분석기(Ciphergen®, Fremont, CA)를 이용하여 판독하였다. 판독기를 공지된 분자량의 펩티드 표준 보정제(Ciphergen®, Fremont, CA)를 이용하여 매일 외부적으로 보정하였다.
E. SELDI-TOF 질량 스펙트럼의 가공
스펙트럼을 ProteinChip 소프트웨어 바이오마커 에디션, 버젼 3.2.0(Ciphergen, Fremont, CA)으로 처리하였다. 베이스라인 삭제 후, 3의 신호-대-잡음 비를 사용하여 바이오마커 위자드 소프트웨어(Ciphergen, Fremont, CA)로 수행된 총 이온 전류방법 피크 검출로 스펙트럼을 표준화하였다.
F. 단백질 마커 식별
단백질 마커를 IgG 스핀 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피로 정제하였다. 각 단계의 순도를 Normal Phase ProteinChip Array로 모니터링하였다. 주요 분획물을 5 mM DTT pH9로 감소시키고, 50 mM 요오도아세트아미드로 어두운 곳에서 2 시간 동안 알킬화시켰다. 최종 분리는 16% Tricine SDS PAGE 젤 상에서 수행하였다. 젤을 콜로이드성 블루 염색 키트(Invitrogen)으로 염색하였다. 선택된 단백질 밴드를 추출하고, 200 ㎕의 50% 메탄올/10% 아세트산으로 30 분 동안 세척하고, 100 ㎕의 ACN으로 15 분 동안 탈수시키고, 격렬하게 흔들어주면서 70 ㎕의 50% 포름산, 25% ACN, 15% 이소프로판올, 10% 물로 실온에서 2시간 동안 추출하였다. 추출물 중의 단백질 마커를 Normal Phase ProteinChip Array 상에서 2 ㎕의 분석물로 확인하였다. 잔류하는 추출물을 20 ㎕의 50 mM 암모늄 비카르보네이트(pH 8) 중 10 ng/㎕의 개질된 트립신(Roche Applied Science)으로 37℃에서 3 시간 동안 침지시켰다.
단일 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 시페르겐 PCI-1000 단백질칩 인터페이스가 구비된 QSTAR 질량 분석기 상에서 획득하였다. 1 ㎕의 각 단백질분해효소 소화 분취액을 CHCA의 존재하에 NP20 단백질칩 어레이 상에서 분석하였다.
스펙트럼을 단일 MS 모드에서 0.9 내지 3 kDa로 수집하였다. 스펙트럼을 확인한 후, 특정 이온을 수집하고, CID 분절을 위해 충돌 세포로 도입하였다. CID 스펙트럼 데이타를 식별을 위한 데이타베이스-마이닝 도구 Mascot(Matrix Sciences)로 수행하였다.
실시예 2: SELDI를 이용한 바이오마커의 식별
본 실시예는 본 발명이 환자를 진단하고 환자의 치료 후에 예후를 결정하기 위한 유용한 바이오마커를 식별하는데 사용될 수 있는 방법을 기술한 것이다.
본 발명을 실행하는데 유용한 바이오마커를 식별하기 위해, 기준 바이오마커 프로필을 먼저 환자의 두 집단에 대해 설정하였다. 한 집단은 제 1 표현형으로 나타내는 "대조군"으로서 작용한다. 제 2 집단은 바이오마커의 검출을 통한 진단하는 표현형을 나타내는 "시험군"이다. 본 실시예에서, 시험군은 연구 과정 동안 전이 가능성을 나타낸 종양에 영향을 미쳤거나 계속적으로(6개월내) 영향을 미치는 개체이다. 대조군은 연구 완료 후 12개월 이상 후에 임의의 타입의 암에 의한 고통을 나타내지 않는 집단이다.
집단들 간의 바이오마커를, 혈소판으로부터 분리된 생체분자의 발현을 비교하므로써 식별하였다. 시험용 혈액샘플의 제조는 하기에 기술된 바와 같다. 형성된 혈소판 균일현탁액을 실질적으로 Q10,IMAC30-Cu(II) 및 CM10 SELDI 프로브 단백질칩 어레이 상에서 프로파일링하였다. 바이오마커를, 바이오마커에 의해 생산된 이온종에 대해 형성된 피크 아래 영역에 의해 결정된 바와 같이 균일현탁액으로부터의 하나 이상의 혈소판-결합 생체분자의 발현의 상이한 수준으로 식별하였다. 이후 통계적 분석을 데이타로 수행하여 현저하고 정확하게 전이성 암으로 대비되는 바이오마커 발현의 변화를 확인하였다.
실시예 3: 바이오마커의 사용하여 치료 동안 암 환자의 진단 예측
본 실시예는 바이오마커를 사용하여 암을 완화시키기 위한 치료 후 암 환자의 예후를 결정함을 기술한 것이다.
혈액 샘플을 예를 들어, 0, 2, 5, 10, 14, 21, 30, 60, 및/또는 90일의 평가 과정 동안에 하나 이상의 상이한 시간에 평가되는 환자로부터 획득하였다. 혈액 샘플을 바람직하게는 새로운 것으로 평가할 수 있지만 평가를 위해 적절한 시간까지 냉동 저장된 것일 수 있다. 환자의 평가는 병원 또는 의료기관에 환자가 도착한 첫날에 개시되고, 암 병태에 대한 치료를 중지한 후 수주 이상 동안 계속하였다.
혈액 샘플의 분석을 먼저 혈소판을 분리하고 시험을 위해 적합한 혈소판 균일현탁액을 형성하므로써 수행하였다. 혈소판을 당업자에게 널리 공지된 설정된 과정을 사용하여 개개의 혈액 샘플로부터 분리하였다. 이후 혈소판 추출물을 얼음-냉각 등장 완충액 중 분리된 혈소판(1 부피 혈소판: 3 부피의 완충용액)을 현탁시킨 후 15 초동안 혈소판 현탁액을 초음파처리하여 제조하였다. 이후 각각의 혈소판 추출물을 이온-교환 비드(Q HyperD)를 사용하여 분획하고, WCX2 단백질칩 어레이 상에서 평가하였다. 어레이 상에 잔류하는 단백질을 SELDI 질량 분광기로 검출하고, 각 이온종의 양을, 생산된 이온 피크의 아래 영역을 결정하여 정량화하였다. 결과는 표로 만들었고, 각 샘플에 대해 BF4 및 CTAPIII에 상응하는 바이오마커의 양을 결정하였다.
이후 표로 만들어진 결과를 사용하여 환자의 예후를 설정하였다. 예후를 각 샘플로부터 BF4 및 CTAPIII 관련 이온종의 상대적 양을 비교하여 결정하였다. 침습성 암을 치료하기 위해 치료법을 수행한 환자에 대해, 측정된 바이오마커의 증가는 종양이 신규한 조직 환경에서 침습성 공격을 중지하고 지금 잠복성임을 나타내는 것이다. 이러한 상황에서, 환자는 침습성 표현형으로 바뀌는 종양을 지시하는 마커 수준의 임의의 감소를 위한 치료 후 정기적으로 모니터링하였다.
침습성 종양의 외과적 제거를 수행한 환자에 대해, 환자를 치료 후 수주 동안 재발에 대해 평가하였다. 시간 추이는 필수적으로 제거되는 종양에 독립적으로 외과 수술에 의한 바이오마커 유동화(fluxuation) 원인을 안정화시킬 수 있다. 이러한 상황하에서, 종양의 성공적인 제거를 BF4 및 CTAPIII 마커의 소실로 수행하였다.
본원에 기술된 예 및 구체예는 단지 설명하기 위한 목적으로, 이의 다양한 변형 또는 변화는 당업자에게 제안될 것이며 본원에 인용된 특허 및 특허출원은 모든 목적에 대해 전체적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 이해된다.

Claims (77)

  1. 피검체에서 혈관형성 현상을 검정하는 방법으로서,
    a. 피검체로부터의 생물학적 샘플 중 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하는 단계로서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택되는 단계; 및
    b. 상기 측정을 혈관형성 현상과 대비시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 검출된 바이오마커 중 하나 이상이 혈관내피성장인자(VEGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF), 혈소판 인자 4(PF4), 결합조직 활성단백질 III(CTAP III), 앤도스타틴(endostatin), 텀스타틴(tumstatin), 금속단백질분해효소의 조직억제제, 아포지단백질 A1, IL8, 혈소판-유래 내피세포 성장인자(PDECGF), 결합조직 성장인자(CTGF), 엔지오제닌(angiogenin), 앤지오포이에틴(angiopoietin), 앤지오스타틴 및 트롬보스폰 딘(thrombospondin)으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 혈관형성 현상이 암 대 비-암(non-cancer)인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 혈관형성 현상이 양성 종양 대 악성 종양인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 혈관형성 현상이 침습성 암 대 잠복성 암인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 혈관형성 현상이 암 타입이며, 상기 암 타입이 유방암, 간암, 폐암, 혈관모세포종, 방광암, 전립선암, 위암, 뇌암, 신경모세포종, 결장암, 암종, 육종, 백혈병, 임파종 및 골수종으로 구성된 군으로부터 선택된 방법
  9. 제 1항 및 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가 바이오마커의 크로마토그래피 검출, 면역학적 검출, 흐름 세포측정 검출 또는 질량 분광광도 검출을 포함하는 방법.
  10. 제 1항 및 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가 bFGF를 포함하는 다수의 바이오마커 및 VEGF, PDGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 바이오마커를 검출함을 포함하는 방법.
  11. 제 1항 및 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 단계가 PF4를 포함하는 다수의 바이오마커 및 VEGF, PDGF, bFGF, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 바이오마커를 검출함을 포함하는 방법.
  12. 제 5항에 있어서, 암이 잠복성, 침습성, 지속된 침습성, 퇴화성 또는 불변성으로 분류되는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 감소의 검출이 침습성으로서 분류되는 암과 대비되는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가의 검출이 잠복성 또는 퇴화성으로서 분류되는 암과 대비되는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 면역학적 검정에 의해 검출되는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 대비 단계가 소프트웨어 분류 알고리즘에 의해 수행되는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 SELDI 프로브의 흡착제 표면 상에 바이오마커를 포획한 후에 레이저 탈착-이온화 질량분석에 의해 검출되는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 흡착제가 이온교환흡착제인 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 흡착제가 생체특이적 흡착제인 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 생체특이적 흡착제가 항체인 방법.
  21. 제 13항에 있어서, (c) 혈관형성 현상을 기초로 하여 피검체 치료를 관리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제 5항 또는 제 13항에 있어서, (c) 암의 분류를 기초로 하여 피검체 치료를 관리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 암이 침습성으로 분류되고, 피검체 치료의 관리가 외과적으로 암을 고침을 포함하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, (d) 피검체 치료 후에 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커의 후속적 증가의 검출이 침습성 암으로부터 잠복성 암 또는 이의 부재로의 변화에 대비되는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커의 후속적 증가의 검출이 침습성으로 잔류하는 암과 대비되는 방법.
  27. a. 피검체로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커의 발현을 검출하는 단계로서, 하나 이상의 검출된 바이오마커의 발현이 내인성 혈관형성 활성의 변화와 관련하여 개질되는 단계;
    b. 검출된 바이오마커의 발현을 종래 결정된 동일한 바이오마커에 대한 발현과 비교하므로써, 하나 이상의 검출된 바이오마커의 발현을 내인성 혈관형성 활성의 변화와 대비시키는 단계를 포함하여, 피검체의 내인성 혈광형성 활성의 변화를 결정하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 검출된 바이오마커 중 하나 이상이 혈관내피성장인자(VEGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 염기성 섬유모세포성장인자(bFGF), 혈소판 인자 4(PF4), 결합조직 활성단백질 III(CTAP III), 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직억제제, 아포지단백질 A1, IL8, 혈소판-유래 내피세포 성장인자(PDECGF), 결합조직 성장인자(CTGF), 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 피검체의 내인성 혈관형성 활성의 변화가 종양 형성, 종양 성장, 임신, 조직 손상 및 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 의학적 병태로부터 초래되는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 의학적 병태가 종양 형성 또는 암과 관련된 종양 성장인 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 검출 단계가 바이오마커의 크로마토그래피 검출, 면역학적 검출, 흐름 세포측정 검출 또는 질량 분광광도 검출을 포함하는 방법.
  32. 제 27항에 있어서, 검출 단계가 bFGF를 포함하는 다수의 바이오마커 및 VEGF, PDGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 바이오마커를 검출함을 포함하는 방법.
  33. 제 27항에 있어서, 검출 단계가 PF4를 포함하는 다수의 바이오마커 및 VEGF, PDGF, bFGF, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다른 바이오마커를 검출함을 포함하는 방법.
  34. 제 27항에 있어서, 피검체의 내인성 혈관형성 활성의 변화가 잠복성, 침습성, 지속된 침습성, 퇴화성 또는 불변성으로서 분류되는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커의 발현의 감소의 검출이 침습성으로의 혈관형성 활성의 변화에 대비되는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커의 발현 증가의 검출이 잠복성 또는 퇴화성으로의 혈관형성 활성의 변화에 대비되는 방법.
  37. 제 27항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가 면역학적 검정에 의해 검출되는 방법.
  38. 제 27항에 있어서, 대비 단계가 소프트웨어 분류 알고리즘에 의해 수행되는 방법.
  39. 제 27항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커가, SELDI 프로브의 흡착제 표면 상에 바이오마커를 포획한 후 레이저 탈착-이온화 질량 분석에 의해 검출되는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 흡착제 표면이 이온교환 흡착제인 방법.
  41. 제 39항에 있어서, 흡착제 표면이 생체특이적 흡착제인 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 생체특이적 흡착제가 항체인 방법.
  43. 제 34항에 있어서, (c) 내인성 혈관형성 활성의 분류된 변화를 기초로 하여 피검체 치료를 관리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 내인성 혈관형성 활성의 변화가 침습성으로 분류되고, 피검체 치료의 관리가 침습성 내인성 혈관형성 활성의 원인을 외과적으로 고침을 포함하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, (d) 피검체 치료 후에 다수의 혈소판-결합 바이오마커의 발현을 검출함을 추가로 포함하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커 발현의 후속적 증가의 검출이 내인성 혈관형성 활성의 침습성으로부터 잠복성 또는 부재로의 변화에 대비되는 방법.
  47. 제 45항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커 발현의 후속적 증가의 검출이 지속된 침습성 내인성 혈관형성 활성에 대비되는 방법.
  48. (a) 고체 지지체에 부착되는 두개 이상의 별개의 흡착제 표면을 포함하는 고체 지지체, 및
    (b) 고체 지지체를 사용하여 바이오마커를 검출하기 위한 설명서를 포함하며,
    상기 흡착제 표면이 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 다수의 혈소판-결합 바이오마커를 결합시키는 키트.
  49. 제 48항에 있어서, 혈소판-결합 바이오마커가 표 1의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 키트.
  50. 제 48항에 있어서, 혈소판-결합 바이오마커가 VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 키트.
  51. 제 48항에 있어서, (c) 흡착제 표면에 의해 결합되는 두개 이상의 바이오마커를 함유한 용기를 부가적으로 포함하는 키트.
  52. 제 48항에 있어서, 검출되는 바이오마커에 대한 피검체의 정상 검출범위를 포함하는 차트를 추가로 포함하는 키트.
  53. 제 48항에 있어서, 고체 지지체가 SELDI 프로브인 키트.
  54. 제 53항에 있어서, SELDI 또는 MALDI 질량분석에서 사용하기에 적합한 매트릭스 물질을 추가로 포함하는 키트.
  55. 제 53항에 있어서, SELDI 프로브가 양이온교환 흡착제를 포함하는 키트.
  56. 제 55항에 있어서, SELDI 프로브가 음이온 교환 크로마토그래피 흡착제를 추 가로 포함하는 키트.
  57. 제 53항에 있어서, SELDI 프로브가 생체특이적 흡착제를 포함하는 키트.
  58. 제 57항에 있어서, 생체특이적 흡착제가 항체인 키트.
  59. a. 피검체로부터 획득된 샘플에 귀착되는 데이타를 액세스하는 코드로서, 상기 데이타가 샘플 중 다수의 혈소판-결합 바이오마커의 검출된 발현 수준을 포함하고, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택되는 코드; 및
    b. 샘플 중 바이오마커의 측정 함수로서 피검체의 내인성 혈관형성 활성의 변화를 분류하는 분류 알고리즘을 실행하는 코드를 포함하는 소프트웨어 제품.
  60. 피검체로부터의 샘플에서 다수의 혈소판-결합 바이오마커의 대비로부터 결정된 피검체의 내인성 혈관형성 활성의 변화를 피검체와 연계시키는 방법으로서, 상기 혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 진단이 컴퓨터-산출 매체를 통해 피검체와 연계되는 것인 방법.
  62. a. 다수의 혈소판-결합 바이오마커를 결합시키는 다수의 흡착제 표면, 및
    b. 결합 부위에 결합되는 혈소판-결합 바이오마커를 검출하기 위한 검출기를 포함하며,
    혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로부터 선택되고, 혈소판-결합 바이오마커 중 하나 이상의 발현이 피검체 중 암의 존재에 의해 개질되는, 피검체 중 암의 존재를 검출하기 위한 진단 시스템.
  63. 제 62항에 있어서, 흡착제 표면 중 하나 이상이 SELDI 프로브 표면의 일부인 시스템.
  64. 제 62항에 있어서, 흡착제 표면 중 하나 이상이 이온교환 흡착제인 시스템.
  65. 제 62항에 있어서, 검출기가 질량분석기인 시스템.
  66. 제 62항에 있어서, 검출기가 흡착제에 의해 결합되는 바이오마커에 대해 특이적인 하나 이상의 표지된 항체를 포함하는 시스템.
  67. 제 62항에 있어서, 바이오마커 중 하나 이상이 VEGF, PDGF, bFGF, PF4, CTAPIII, 앤도스타틴, 텀스타틴, 금속단백질분해효소의 조직 억제제, 아포지단백질 A1, IL8, TGF, NGAL, MIP, 금속단백질분해효소, BDNF, NGF, CTGF, 엔지오제닌, 앤지오포이에틴, 앤지오스타틴 및 트롬보스폰딘으로 구성된 군으로부터 선택된 시스템.
  68. 제 62항에 있어서, 흡착제 표면 중 하나 이상이 생체특이적 흡착제인 시스템.
  69. 제 68항에 있어서, 생체특이적 흡착제가 항체인 방법.
  70. a. 피검체로부터의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하는 단계로서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 표 1 및 표 2의 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택되는 단계; 및
    b. 상기 측정을 하나 이상의 암 타입과 대비시키는 단계를 포함하여, 피검체에서 암 타입을 구별하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 암 타입이 유방암, 간암, 폐암, 혈관모세포종, 방광암, 전립선암, 위암, 뇌암, 신경모세포종, 결장암, 암종, 육종, 백혈병, 임파종 및 골수종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  72. 제 70항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 면역학적 검정으 로 측정되는 방법.
  73. 제 70항에 있어서, 하나 이상의 혈소판-결합 바이오마커가 질량 분석으로 측정되는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 측정 단계가 질량 분석 전에 고체상에 결합된 흡착제 상에 하나 이상의 혈소판-유래 바이오마커를 포획함을 추가로 포함하는 방법.
  75. 제 73항에 있어서, 질량 분석이 레이저 탈착/이온화 질량 분석인 방법.
  76. 제 73항에 있어서, 대비 단계가 측정 또는 측정들을, 샘플을 암 타입으로 분류하는 분류 모델을 수행하는 알고리즘에 제공함을 포함하는 방법.
  77. 제 70항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 혈소판-결합 바이오마커를 측정하고 대비함을 포함하는 방법.
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