KR100970650B1

KR100970650B1 - 위암 진단용 키트

Info

Publication number: KR100970650B1
Application number: KR1020080028912A
Authority: KR
Inventors: 남명진
Original assignee: 남명진
Priority date: 2007-10-26
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2010-07-15
Also published as: KR20090042701A

Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 위암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 위암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 위암 진단용 키트는 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 위암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 위암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 위암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 위암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A, 단백질 칩, 효소면역분석법, 면역크로마토그래피, 스트립

Description

위암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Stomach Cancer}

본 발명은 위암 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 위암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 위암 진단용 키트에 관한 것이다.

위암은 우리나라에서 가장 높은 발병 빈도를 나타내는 암으로서, 위암으로 인한 사망률은 2위에 이른다. 위암은 초기에는 증세가 없거나, 속쓰림 등의 미약한 증세로 인하여, 일반적인 위장질환과 구분이 용이하지 않으며, 암의 진행이 이루어진 후에야 체중감소, 복통, 오심, 구토, 출혈, 식욕감퇴, 연하곤란 등의 증세가 나타나게 되므로, 위암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기발견의 필요성이 더욱 요구된다.

일반적으로, 위암의 진단은 위내시경을 통한 검진과 조직검사, 위장관촬영(X선 검사), 복부 초음파, 전산화 단층촬영 등의 방법을 통해 이루어진다. 이들 방법에 의하여 질병의 병변이 발견되는 경우, 정밀한 조직검사를 통해서 비교적 정확 한 검사결과를 얻을 수도 있으나, 상기 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어서 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고도 신속하게, 특히 조기에 위암을 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대해서 유전자를 이용하는 진단 방법이 개발되고 있다. 이러한 유전자를 이용한 진단법의 경우, 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행되는데, 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성림프성백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암만을 진단할 수 있는 단점이 있고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.

상술한 종래의 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었는데, 대한민국 특허 제 151823호에는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 395206호에는 CEA에 대한 단클론항체를 포함한 초고속 간암, 대장암, 전립선암 진단 스트립이 개시되어 있다. 그러 나, 전술한 바와 같이 CEA는 위암은 물론 다른 암조직에서도 발현되므로, 위암 특이적 항원이라 할 수 없으며, 아직까지 위암 환자에서만 특이적으로 발현되는 위암 특이적 항원은 보고된바 없다.

따라서, 위암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 위암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자는 위암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 위암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 위암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 전기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 위암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 위암 진단용 기판을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 기판을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 위암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 위암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 위암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 위암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 위암 진단용 기판은(ⅰ) 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체 및 소마토메딘 A 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 8개의 항체; 및,(ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 위암 진단용 기판을 포함한다: 이때, 전기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 전기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 전기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 위암 진단용 키트는 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 위암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호물질로서 사용할 경우에는 위암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 위암 진단용 키트는 위암 진단용 기판으로서 전기 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 NC 막 또는 PVDF 막을 사용하고, 전기 위암 진단용 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).

도 1은 본 발명의 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 전기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체 및 소마토메딘 A 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 결과 표시부재로서 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체 및 소마토메딘 A 항체가 고정된 다클론항체 밴드(판정라인, 3)와 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 4)가 부착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 위암 진단용 키트는, 위암 진단용 기판으로서 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 전기 위암 진단용 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 키 트이다: 이때, 전기 마이크로플레이트는 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체 및 소마토메딘 A 항체가 부착되고, 전기 검출수단에는 전기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체, 소마토메딘 A 항체, 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 위암 진단용 키트는, 위암 진단용 기판으로서 전기 위암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 전기 위암 진단용 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 위암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 전기 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체 및 소마토메딘 A 항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 전기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 전기 단백질 칩과 전기 항체에 각각 결합된 아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리 포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A를 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 전기 검출수단은 전기 위암 특이적 항원에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 아포리포프로테인 B 항체, 비트로넥틴 항체, 아포리포프로테인 A-I 항체, 아포리포프로테인 C-III 항체, 리포칼린 2 항체, 펄레칸 항체, 소마토메딘 A 항체 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 전기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP, RFP 또는 텍사스레드인 것이 바람직하다.

본 발명의 위암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 위암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 위암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 위암 특이 유전자의 선별

위암 조직(AS) 22건, 정상 위조직(SN) 8건, 정상 뇌조직(BN) 6건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 45건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 16건, 정상폐조직(LN) 10건, 1기 폐암조직(LI) 71건, 정상 췌장조직(PN) 5건, 췌장암조직(AP) 10건 및 장액성 난소암조직(ovary cancer serous, OS) 10건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 전기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.

전기 선별된 5㎍의 RNA를 올리고(dT)24를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 전기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 polymerase in vitro 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 전기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 전기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분 동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 혼성화반응용액과 전기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼 합하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.

반응이 종결된 후, 전기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 전기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin IgG)를 처리하고, 전기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 전기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 1).

각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과

유전자	AS	MO	R	SN	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
V05141	1218	54	22.56	54	39	14	73	38	20	16	41	1
X04898	2481	426	5.82	126	91	65	171	104	426	55	105	126
L18920	918	263	3.49	35	103	64	94	104	263	29	34	56
M86757	1435	444	3.23	31	83	252	124	185	444	234	257	63
X03168	1994	1007	1.98	267	392	169	193	182	639	288	1007	293
M19828	391	176	2.22	176	-9	-21	34	14	104	-38	-14	-4
X05855	3289	1367	2.41	1101	6	1279	1367	992	700	538	46	799
M16961	1013	510	1.99	241	215	136	168	160	510	165	247	205
L10343	6036	1759	3.43	920	279	1565	1577	4885	643	305	521	1759
L00205	1759	950	1.85	950	393	317	376	322	829	536	475	834
M76482	349	213	1.64	71	139	60	187	213	89	99	-68	91
D50920	3693	1990	1.86	1990	1305	1221	1437	1340	1112	972	1222	1052
U66083	279	125	2.23	72	125	124	70	80	102	72	70	59
M34276	243	100	2.43	5	23	13	39	100	56	33	5	47
M77481	371	146	2.54	25	24	146	12	39	125	43	32	34
M11025	336	147	2.29	80	119	41	73	97	147	81	105	70
HG2197-HT2267	1132	667	1.70	566	561	493	606	518	481	302	483	667
L00205	1014	621	1.63	12	89	57	621	388	98	44	27	395

유전자	AS	MO	R	SN	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
X01038	3505	2154	1.63	351	94	2154	210	16	127	-21	-31	49
U10690	425	215	1.98	215	187	115	127	131	182	113	176	74
U10687	297	184	1.61	45	33	184	36	40	85	16	100	17
X01388	3525	2261	1.56	2190	1943	938	1016	859	1092	1069	2261	997
X07173	265	154	1.72	47	154	22	43	56	89	27	70	60
AC002045	569	362	1.57	362	193	304	282	170	185	77	232	168
J03242	1088	547	1.99	111	324	547	126	207	154	82	141	170
S71129	360	234	1.54	222	141	110	151	159	140	109	119	234
M21642	176	116	1.52	63	116	20	49	42	39	17	14	17
U07695	632	393	1.61	212	282	367	381	393	337	123	109	206
M34276	161	109	1.48	109	-63	-51	-49	-65	-20	-9	25	-39
M95178	3065	2197	1.40	1042	363	1515	1669	1625	1110	711	406	2197
X80198	3999	2872	1.39	2750	2427	1685	1753	1342	2016	1800	2872	1877
AB003102	3406	2233	1.53	1550	1125	1488	2233	2223	1932	1009	778	1742
Y07828	159	120	1.33	74	62	8	120	118	45	-6	86.2	44
M34276	565	333	1.70	285	333	270	274	262	248	217	370	264
L17131	10476	7979	1.31	3974	1147	6017	7979	7050	4503	1005	304	6803
X62515	2257	2132	1.06	543	60	403	1761	2132	698	689	903	572

유전자	AS	MO	R	SN	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
D87071	2531	1919	1.32	1858	933	1115	1919	1836	1637	1483	1553	1889
Z14982	2886	2937	0.98	1883	40	1267	2343	2937	1539	1491	67	1618
D80008	1218	993	1.23	418	121	871	993	752	252	91	71	198
K02100	241	200	1.21	200	129	46	61	67	34	45	196	31
M29064	7143	6590	1.08	4966	2957	5274	5960	6590	3881	4372	3021	3635
S75256	16312	9495	1.72	13615	110	2651	4897	7842	2217	946	659	9495

상기 표 1에서, AS는 위암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AS를 MO로 나눈 비율을 의미한다.

V01514S는 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)을, X04898는 아포리포단백질A-II(apolipoprotein A-II)를, L18920는 멜라노마 항원, 패밀리 A, 12(melanoma antigen, family A, 12)를, M86757은 S100 칼슘-결합 단백질 A7(calcium-binding protein A7(psoriasin 1))을, X03168은 비트로넥틴(vitronectin(serum spreading factor, somatomedin B, complement S-protein))을, M19828은 아포리포단백질 B(apolipoprotein B(including Ag(x) antigen))를, X05855은 H3 히스톤, 패밀리 3A(H3 histone, family 3A)를, M16961은 알파-2-HS 당단백질(alpha-2-HS-glycoprotein)을, L10343은 프로티아제 저해제 3(protease inhibitor 3, skin-derived(SKALP))을, L00205는 케라틴 6B(keratin 6B)을, M76482는 데스모글레인 3(desmoglein 3(pemphigus vulgaris antigen))을, D50920은 갑상선 호르몬 수용체-연관 단백질(thyroid hormone receptor-associated protein(100 kDa))을, U66083은 멜라노마 항원, 패밀리 A, 9(melanoma antigen, family A, 9)를, M34276은 플라스미노겐(plasminogen)을, M77481은 멜라노마 항원, 패밀리A, 1(melanoma antigen, family A, 1(directs expression of antigen MZ2-E))을, M11025는 아시알로당단백질 수용체 2(asialoglycoprotein receptor 2)를, HG2197-HT2267는 콜라겐 VII형, 알파 1(collagen, type VII, alpha 1(epidermolysis bullosa, dystrophic, dominant and recessive))을, L00205는 케라틴 6B(keratin 6B)를, X01038은 아포리포단백질 A-I(apolipoprotein A-I)을, U10690은 멜라노마 항원, 패밀리 A 5(melanoma antigen, family A, 5)를, U10687은 멜라노마 항원, 패밀리 A 4(melanoma antigen, family A, 4)를, X01388은 아포리포단백질 C-III(apolipoprotein C-III)을, X07173은 인터-알파(글로불린) 저해제, H2 폴리펩티드(inter-alpha(globulin) inhibitor, H2 polypeptide)를, AC0024045는 핵공복합체 작용 단백질(nuclear pore complex interacting protein)을, J03242는 인슐린 유사 성장인자 2인 소마토메딘 A(insulin-like growth factor 2, somatomedin A)를, S71129는 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase(YT blood group))를, M21642는 세린(또는 시스테인) 프로티나아제 저해제 C군, 멤버 1(serine(or cysteine) proteinase inhibitor, clade C(antithrombin), member 1)을, U07695는 EphB4를, M34276은 플라스미노겐(plasminogen)을, M95178는 액티닌, 알파 1(actinin, alpha 1)을, X80198은 스테로이드의 생산 조절 단백질(steroidogenic acute regulatory protein related)을, AB003102는 프로테아좀 26S 서브유닛(proteasome(prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 11)을, Y07828은 트라이파타이트 모티프-컨테이닝 31(tripartite motif-containing 31)을, M34276은 플라스미노젠(plasminogen)을, L17131은 유비퀴틴 접합 효소인 E2M(ubiquitin-conjugating enzyme E2M(homologous to yeast UBC12))을, X62515는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 2인 펄레칸(heparan sulfate proteoglycan 2, perlecan)을, D87071은 KIAA0233 유전자 산물(KIAA0233 gene product)을, Z14982는 프로테아좀 서브유닛, 베타 타입 8(proteasome(prosome, macropain) subunit, beta type, 8(large multifunctional protease 7))를, D80008은 KIAA0186 유전자 산물(KIAA0186 gene product)를, K02100은 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase)를, M29064는 헤테로지니어스 핵 리보핵단백질 A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1)을, S75256은 리포칼린 2(lipocalin 2(oncogene 24p3))를 각각 의미한다.

전기 표 1에서 보듯이, 전기 유전자들은 위암조직에서의 발현정도가 정상 위조직은 물론, 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 웨스턴 블롯 분석

전기 43개의 위암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하여 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 위암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 전기 단백질은 아포리포프로테인 A-II, 소리아신 1, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 플라스미노겐, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A이다.

먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 전기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하고, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(polyvinylidenefluoride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해, 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 전기 PVDF 막을 차단시켰다. 이어, 전기 차단된 PVDF 막에 항-아포리포프로테인 A-II 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-아포리포프로테인 B 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-비트로넥틴 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-아포리포프로테인 A-I 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-아포리포프로테인 C-III 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-리포칼린 2 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-펄레칸 토끼 다클론항체(Abcam, UK) 및 항-소마토메딘 A 토끼 다클론항체(Abcam, UK)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 전기 차단완충액에 희석하여 처리하고, 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horse raddish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 전기 세척된 PDVF막에 처리하고, 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.

그 결과, 아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A의 경우 위암 환자의 혈액에서만 뚜렷하게 검출되었다. 반면, 소리아신 1 및 플라스미노겐은 위암 뿐만 아니라, 정상인 또는 다른 암환자의 혈액에서도 뚜렷하게 검출되었다.

따라서, 아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A가 위암에서 특이적으로 발현되는 단백질로서 위암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 스트립의 제작 및 분석

다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체, 아포리포프로테인 B 다클론항체, 비트로넥틴 다클론항체, 아포리포프로테인 A-I 다클론항체, 아포리포프로테인 C-III 다클론항체, 리포칼린 2 다클론항체, 펄레칸 다클론항체 및 소마토메딘 A 다클론항체를 포함한 위암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-1: 샘플패드의 제작

셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여, 샘플패드(2)로 사용하였다.

실시예 3-2: 다클론항체-금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작

혈액시료내의 위암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 전기 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체, 아포리포프로테인 B 다클론항체, 비트로넥틴 다클론항체, 아포리포프로테인 A-I 다클론항체, 아포리포프로테인 C-III 다클론항체, 리포칼린 2 다클론항체, 펄레칸 다클론항체 및 소마토메딘 A 다클론항체간의 면역반응이 일어나는 부분인 유리섬유(GF) 필터(2)는 그의 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체인 다클론항체-금접합체가 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 전기 염화금 용액에 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체, 아포리포프로테인 B 다클론항체, 비트로넥틴 다클론항체, 아포리포프로테인 A-I 다클론항체, 아포리포프로테인 C-III 다클론항체, 리포칼린 2 다클론항체, 펄레칸 다클론항체 및 소마토메딘 A 다클론항체를 각각 10㎍/㎖되게 가하고, PEG(polyethyleneglycol) 용액으로 금입자를 안정화시켜서 다클론항체-금접합체를 제조하였다.

한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 전기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.

실시예 3-3: NC 막의 제조

NC 막(nictrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자르고, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하였다. 이어, 상기 대조라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 전기 위암 특이적 항원의 검출결과 판정라인으로서 본 발명에 포함된 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체, 아포리포프로테인 B 다클론항체, 비트로넥틴 다클론항체, 아포리포프로테인 A-I 다클론항체, 아포리포프로테인 C-III 다클론항체, 리포칼린 2 다클론항체, 펄레칸 다클론항체 및 소마토메딘 A 다클론항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인과 검출결과 판정라인이 구비된 NC 막(4)을 제조하였다.

실시예 3-4: 흡수(absorbent) 패드의 제조

흡수패드(7)는 면역반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.

실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹

각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7) 위에 전기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 전기 실시예 3-2에서 제작한 각각의 다클론항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결한 다음, 전기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 전기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 위암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석

정상인 5명, 대장암 환자 7명, 위암 환자 5명, 난소암 환자 4명, 뇌암 환자 3명으로부터 혈액을 채취한 다음, 전기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.

그 결과, 위암 환자에서 수득한 혈액시료만이 상기 면역 크로마토그래피 스트립의 각 항체의 판정라인에서 발색됨을 확인하였는 바, 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립이 위암 환자를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 단백질 칩의 제작 및 이를 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

실시예 4-1: 단백질 칩의 제작

전기 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체, 아포리포프로테인 B 다클론항체, 비트로넥틴 다클론항체, 아포리포프로테인 A-I 다클론항체, 아포리포프로테인 C-III 다클론항체, 리포칼린 2 다클론항체, 펄레칸 다클론항체 및 소마토메딘 A 다클론항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다.

먼저, 전기 항체들을 부착시키기 전에, 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 전기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 전기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 전기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였다. 그런 다음, 전기 항체들이 배열된 전기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 전기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.

실시예 4-2: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

상기 실시예 4-1에서 제조된 단백질 칩을 상기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 여기에 위암의 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 각각 상기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 상기 세척된 단백질 칩을 상기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-아포리포프로테인 A-II 다클론항체(T1), 아포리포프로테인 B 다클론항체(T2), 비트로넥틴 다클론항체(T3), 아포리포프로테인 A-I 다클론항체(T4), 아포리포프로테인 C-III 다클론항체(T5), 리포칼린 2 다클론항체(T6), 펄레칸 다클론항체(T7) 및 소마토메딘 A 다클론항체(T8)를 상기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 상기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 상기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 상기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG(H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 상기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.

단백질칩을 이용한 피검자에 대한 위암 진단

실험군	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8
대조군	71.4	69.2	61.2	87.4	67.8	54.2	35.4	29.7
1	69.5	58.9	68.3	63.3	68.2	63.3	28.1	28.6
2	74.6	201.4	189.7	81.2	54.3	14.2	37.6	37.6
3	69.9	67.8	67.5	84.4	64.1	64.5	26.3	27.1
4	81.2	74.3	69.3	78.5	69.2	67.8	29.1	24.2
5	89.4	72.4	64.2	73.1	72.4	63.2	30.2	33.2
6	75.8	81.4	89.7	81.2	54.2	14.3	37.4	37.8
7	279.0	170.2	159.3	178.5	171.5	157.3	75.4	67.3
8	76.3	68.2	61.3	75.3	64.2	65.4	29.1	24.4
9	74.1	71.4	64.3	74.1	67.4	71.2	22.6	28.9
10	77.6	54.1	64.3	64.0	63.1	66.3	45.1	30.8
11	89.4	84.1	65.9	84.0	65.3	61.3	48.4	31.4
12	271.5	167.3	161.3	272.5	165.1	171.8	75.3	65.3

상기 표 2에서 보듯이, 2명의 혈액시료(실험군 7 및 12)에서는 아포리포프로테인 A-II, 아포리포프로테인 B, 비트로넥틴, 아포리포프로테인 A-I, 아포리포프로테인 C-III, 리포칼린 2, 펄레칸 및 소마토메딘 A에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀검사를 수행한 결과, 두 명 모두 위암 환자임이 판명되었다.

도 1은 본 발명에 따른 위암 진단용 키트의 일실시태양인 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립의 개념을 모식적으로 나타내는 그림이다.

Claims

(ⅰ) 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 항-아포리포프로테인 B 항체, 항-아포리포프로테인 C-III 항체, 항-펄레칸 항체 및 항-소마토메딘 A 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 5개의 항체; 및,

(ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 위암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는

위암 진단용 기판.
제 1항의 위암 진단용 기판 및 전기 위암 진단용 기판의 항체에 결합한 위암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 위암 진단용 키트.
제 5항에 있어서,

검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
제 5항에 있어서,

검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
제 7항에 있어서,

신호물질은 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
제 8항에 있어서,

형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
제 8항에 있어서,

효소는 HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
제 10항에 있어서,

효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는

위암 진단용 키트.
(ⅰ) 샘플패드;

(ⅱ) 금입자가 각각 결합된 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 항-아포리포프로테인 B 항체, 항-아포리포프로테인 C-III 항체, 항-펄레칸 항체 및 항-소마토메딘 A 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터;

(ⅲ) 항-아포리포프로테인 A-II 항체, 항-아포리포프로테인 B 항체, 항-아포리포프로테인 C-III 항체, 항-펄레칸 항체 및 항-소마토메딘 A 항체가 고정된 다클론항체 밴드인 판정라인과, 대조용 이차항체 밴드인 대조라인이 부착된 NC 막;

(ⅳ) 흡수패드; 및,

(ⅴ) 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는, 위암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.