KR100970654B1 - 대장암 진단용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 대장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 대장암 진단용 키트는 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 대장암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 대장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 대장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 대장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
α6 디펜신(α6 defensin), 암피레귤린(amphiregulin), 갈라닌(galanin), MIP3-α, 단백질 칩, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA), 면역크로마토그래피, 스트립

Description

대장암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Colon Cancer}
도 1은 본 발명의 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다.
본 발명은 대장암 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 대장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 비교적 활발히 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 식도암, 대장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다. 한편, 대장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않기 때문에 정기적인 진단이 매우 중요하며, 특히, 40대 이상에서 소화 불량이나 배변 습관의 변화, 혈변, 동통 및 빈혈의 징후가 있으면, 반드시 대장암 검사를 받아보는 것이 바람직하다. 전기 대장암 검사는 직장수지 검사(digital rectal examination), 결장경검사(sigmoidoscopy), 대장내시경(colonoscopy) 또는 대장조영술(barium enema) 등의 방법으로 수행된다. 직장수지 검사는 검진자가 장갑을 착용하고 윤활제를 바른 다음, 직장에 손을 삽입하여 촉진을 통해 대장의 정상여부를 알아보는 방법이며, 결장경검사는 거울이 달린 길고 유연한 튜브를 직장을 통해 결장과 대장까지 삽입하여 직접 관찰하고, 대장내시경검사는 내시경을 이용하여 직접적으로 대장내부를 검사하는 방법이고, 대장조영술은 조영제를 투입한 후, 단층촬영하여 대장에 분포된 혈관의 이상을 검진하는 방법이다. 이러한 검사법은 대장의 이상유무를 단순히 판단하는 방법이며, 이들 방법에 의하여, 질병의 병변이 발견되는 경우, 보다 정말한 조직검사를 수행하게 된다. 질병의 병변이 발견되어 조직검사를 수행하여 진단하는 경우, 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있으나, 상기의 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행방법이 매우 불편하여 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 대장암 여부를 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.
한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대하여는 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등에 대하여는 상당한 성과가 보고되고 있으나, 상대적으로 발병빈도가 낮은 대장암의 경우에는 연구성과가 많지 않은 실정이다. 상기 유전자를 이용한 진단법의 경우, 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거 나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행되는데, 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성림프성백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암에서만 효과를 보이고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.
상술한 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방방, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었는데, 대한민국 특허 제 151823호에는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 395206호에는 CEA에 대한 단클론항체를 포함한 초고속 간암, 대장암, 전립선암 진단 스트립이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 CEA는 대장암은 물론 다른 암조직에서도 발현되므로, 대장암 특이적 항원이라 할 수 없으며, 아직까지 대장암 환자에서만 특이적으로 발현되는 대장암 특이적 항원은 보고된 바 없다.
따라서, 대장암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 대장암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대 두되었다.
이에, 본 발명자는 대장암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 대장암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 대장암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 전기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 대장암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 대장암 진단용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 기판을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 대장암 진단용 기판은 항-α6 디펜신 항체(anti-α6 defensin antibody), 항-암피레귤린 항체(anti-amphiregulin antibody), 항-갈라닌 항체(anti-galanin antibody) 및 항-MIP3-α 항체(anti-macrophage inflammatory protein 3-α antibody)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1개 이상의 항체 및, 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함한다: 이때, 전기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막, 마이크로플레이트 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 전기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 전기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 대장암 진단용 키트는 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 대장암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호복합체를 사용할 경우, 신호복합체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호복합체로서 사용할 경우에는 대장암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 대장암 진단용 키트는 대장암 진단용 기판으로서 전기 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 NC(nitrocellulose) 막 또는 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막을 사용하고, 전기 대장암 진단용 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).
도 1은 본 발명의 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 전기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역 반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린, 항-갈라닌 및 항-MIP3-α다클론항체가 일시 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 3)와 결과 표시부재로서 α6 갈라닌, 암피레귤린, 갈라닌 및 MIP3-α에 각각 특이적인 다클론항체 밴드(판정라인, 4)가 고착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.
본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 대장암 진단용 키트는, 대장암 진단용 기판으로서 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 전기 대장암 진단용 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA) 키트이다: 이때, 전기 마이크로플레이트는 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린, 항-갈라닌 또는 항-MIP3-α항체가 부착되고, 전기 검출수단에는 전기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 전기 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린, 항-갈라닌 또는 항-MIP3-α다클론항체, 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 대장암 진단용 키트는, 대장암 진단용 기판으로서 전기 대장암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 전기 대장암 진단용 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 대장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 전기 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린, 항-갈라닌 또는 항-MIP3-α다클론항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 전기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 전기 단백질 칩과 전기 항체에 각각 결합된 α6 디펜신, 암피레귤린, 갈라닌 또는 MIP3-α 단백질을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 전 기 검출수단은 전기 대장암 특이적 항체에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 전기 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린, 항-갈라닌 또는 항-MIP3-α항체, 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 전기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것이 바람직하다.
본 발명의 대장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 대장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 대장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장암 특이 유전자의 선별
정상 뇌조직(BN) 6건, 뇌의 1기 성상세포종(astrocytoma) 조직(BA I) 19건, 정상 대장조직(CN) 8건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 38건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 13건, 정상폐조직(LN) 10건, 1기 폐암조직(L I) 37건, 정상 췌장조직(PN) 7건, 췌장암조직(PT) 8건 및 장액성 난소암조직(ovarian cancer serous, OS) 24건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 전기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.
전기 선별된 5㎍의 RNA를 oligo(dT)24를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 전기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 중합효소 실험실 조건에서의 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 전기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 전기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 혼성화반응용액과 전기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼합하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.
반응이 종결된 후, 전기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(Streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 전기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin IgG)를 처리하고, 전기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 전기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-정규화(quantile-normalization)을 통하여 분석하였다(참조: 표 1).
각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과
유전자 AC MO R BN BA I CN CMSS CMSI LN L I PN PT OS
U51096 1013 111 9.16 -19 16 111 1086 805 21 31 57 31 2
X05232 855 158 5.41 33 27 99 777 1076 -4 32 43 158 -4
U22376 1758 199 8.85 42 -9 -19 1956 1195 127 149 56 -31 199
U51095 2498 438 5.70 33 93 193 2474 2564 58 51 438 179 54
X14253 1103 236 4.68 58 65 85 1349 405 22 57 236 80 48
L21998 6963 1345 5.18 859 1037 245 6139 9306 893 1141 1345 1057 1292
U30246 1578 288 5.48 93 29 288 1374 2160 70 151 108 80 100
U33317 1381 405 3.41 171 149 405 1494 1058 59 134 76 31 127
U79725 2424 730 3.32 65 26 730 2622 1862 345 102 10 49 74
L02785 1293 337 3.84 68 67 337 1710 108 13 32 87 213 31
M10050 7363 2652 2.78 -91 -135 2652 9101 2416 -148 -81 -12 -68 -145
L41349 628 188 3.33 108 79 61 701 421 79 47 188 98 65
X83228 4316 626 6.89 -35 -27 626 4641 3389 -45 41 56 147 -35
M30496 1777 572 3.11 356 341 290 1954 1273 382 435 189 478 572
Z29067 796 278 2.86 178 278 165 914 459 192 187 129 203 186
L41939 851 292 2.91 180 189 40 917 664 272 185 201 64 292
U07969 5795 626 9.25 180 181 626 5962 5317 127 234 -10 383 115
U26726 1773 463 3.83 91 43 463 1882 1464 97 237 309 347 321
X12901 1374 205 6.72 -21 13 188 1578 791 -44 183 205 141 -26
M73489 1406 686 2.05 204 169 362 1553 987 106 172 686 168 138
M76180 2273 647 3.52 6 14 647 2615 1300 116 326 580 189 48
L25931 2044 702 2.91 166 571 386 2177 1665 618 702 341 483 664
U55206 2009 613 3.28 117 162 159 2311 1149 141 292 38 124 613
M77140 578 188 3.08 22 29 188 637 412 -24 29 41 48 9
M30703 1054 537 1.96 -26 64 102 1214 595 487 537 22 239 -16
M29540 22036 5652 3.90 -12 5 331 23943 16608 83 5652 85 4015 -45
M63967 432 198 2.18 42 58 145 459 355 60 168 171 198 176
U64197 1063 470 2.26 109 60 470 1115 913 123 401 178 378 276
X98311 927 361 2.57 185 173 72 988 754 81 223 249 361 157
M15796 2201 1175 1.87 85 261 556 2028 2694 369 641 123 398 1175
(다음 면에서 계속)
D13645 1039 512 2.03 104 114 97 1080 921 277 332 230 345 512
M85085 282 153 1.84 67 66 22 265 328 -19 112 -26 81 153
L25876 1340 712 1.88 273 160 145 1250 1596 107 404 288 665 712
J04102 2466 1036 2.38 88 153 369 2605 2072 1036 851 -142 306 76
L00058 2309 998 2.31 42 282 374 2465 1866 735 566 422 463 998
M14758 615 344 1.79 242 251 76 768 179 344 58 94 77 95
D63486 8118 4381 1.85 3349 4381 4114 7767 9115 3169 4242 2799 2499 3738
U41813 570 325 1.75 48 26 325 548 631 -18 14 63 16 -3
M36067 338 195 1.73 102 3 -19 338 339 22 35 -3 -3 195
D87682 588 340 1.73 167 107 102 627 476 82 175 -29 84 340
X59543 1558 918 1.70 141 444 239 1440 1894 504 538 151 605 918
Z48541 1227 453 2.71 453 295 46 1530 366 313 144 210 75 98
U27333 4958 2009 2.47 -178 -192 2009 4630 5891 309 1258 -6 1139 104
X53586 2342 1376 1.70 188 355 1376 2349 2322 792 555 729 1136 571
U19523 559 314 1.78 -22 -18 196 512 692 314 304 65 214 160
U09564 2552 1438 1.77 724 519 735 2661 2242 638 1209 842 1438 1406
M29536 7070 4360 1.62 1945 2264 3891 7747 5144 2602 3279 2738 3016 4360
X68314 14315 9168 1.56 454 343 9168 15115 12039 162 3248 437 3224 254
D87716 479 303 1.58 149 197 63 410 674 146 207 58 303 288
L23808 2965 1471 2.02 27 -23 536 2716 3674 30 1471 126 254 496
U78525 4288 2719 1.58 1148 1391 1566 4606 3383 1070 2528 1169 2719 2412
D50919 446 274 1.63 -49 163 274 424 510 237 253 17 235 274
X60486 1950 1282 1.52 476 317 648 1710 2631 618 603 390 545 1282
U24169 2148 1414 1.52 338 537 496 2265 1815 415 966 209 1084 1414

상기 표 1에서, AC는 대장암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AC를 MO로 나눈 비율을 의미하고, BN은 정상 뇌조직의 시료를 나타내고, BA I은 뇌의 1기 성상세포종의 시료를 나타내며, CN은 정상 대장조직의 시료를 나타내고, CMSS는 MSS 대장암조직의 시료를 나타내며, CMSI는 MSI 대장암조직의 시료를 나타내고, LN은 정상 폐조직의 시료를 나타내며, L I는 1기 폐암조직의 시료를 나타내고, PN은 정상 췌장조직의 시료를 나타내며, PT는 췌장암조직의 시료를 나타내고, OS는 장액성 난소암조직의 시료를 나타낸다.상기 표 1에서, AC는 대장암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AC를 MO로 나눈 비율을 의미하고, BN은 정상 뇌조직의 시료를 나타내고, BA I은 뇌의 1기 성상세포종의 시료를 나타내며, CN은 정상 대장조직의 시료를 나타내고, CMSS는 MSS 대장암조직의 시료를 나타내며, CMSI는 MSI 대장암조직의 시료를 나타내고, LN은 정상 폐조직의 시료를 나타내며, L I는 1기 폐암조직의 시료를 나타내고, PN은 정상 췌장조직의 시료를 나타내며, PT는 췌장암조직의 시료를 나타내고, OS는 장액성 난소암조직의 시료를 나타낸다.
또한, 상기 표 1에서, 유전자 U51096는 꼬리형 호메오상자 전사인자 2(caudal type homeo box transcription factor 2), X05232는 세포간질 금속성 단백질 분해효소 3(matrix metalloproteinase 3), U22376는 v-myb 조류 골수아세포증 바이러스성 암유전자 유사유전자(avian myeloblastosis viral oncogene homolog), U51095는 꼬리형 호메오상자 전사인자 1(caudal type homeo box transcription factor 1), X14253는 기형암종-유래 성장인자 1(teratocarcinoma-derived growth factor 1: TDGF1), L21998는 소장/기관 특이적 뮤신 2(intestinal/tracheal mucin 2), U30246는 나트륨/칼륨/염소 수송체(sodium/potassium/chloride transporter)인 용질 수송체 12군 멤버 2(solute carrier family 12, member 2), U33317은 파네스세포 특이적 α6 디펜신(Paneth cell-specific defensin, alpha 6), U79725는 막투과 당단백질 A33(trans-membrane glycoprotein A33), L02785는 용질 수송체 26군 멤버 3(solute carrier family 26, member 3), M10050은 지방산 결합단백질 1(fatty acid binding protein 1), L41349는 포스포리파제 C 베타 4(phospholipase C, beta 4), X83228은 간-소장 카드헤린(liver-intestine cadhedrine)인 카드헤린 17(cadherin 17), M30496은 유비퀴틴 티올에스테라제(ubiquitin thiolesterase)인 유비퀴틴 카르복실-말단 에스테라제 L3(ubiquitin carboxyl-terminal esterase L3), Z29067은 NIMA(never in mitosis gene a)-연관 키나제(NIMA-related kinase) 3, L41939는 EphB2, U07969는 간-소장 카드헤드린(liver-intestine cadhedrine)인 카드헤드린 17(cadherin 17), U26726는 하이드록시스테로이드(11-베타) 탈수소효소 2(hydroxysteroid (11-beta) dehydrogenase 2), X12901는 빌린 1(villin 1), M73489는 열안정성 엔테로톡신 수용체(heat stable enterotoxin receptor)인 구아닐레이트 환형화효소 2C(guanylate cyclase 2C), M76180은 방향성 L-아미노산 디카르복실화효소(aromatic L-amino acid decarboxylase)인 도파 탈카르복실화효소(DOPA decarboxylase), L25931은 라민 B 수용체(lamin B receptor), U55206은 접합효소(conjugase)이자 폴릴폴리감마글루타밀 가수분해효소(folylpolygamma-glutamyl hydrolase)인 감마-글루타밀 가수분해효소(gamma-glutamyl hydrolase), M77140은 갈라닌(galanin), M30703은 신경초종-유래 성장인자(schwannoma-derived growth factor)인 암피레귤린(amphiregulin), M29540은 암태아성 항원-연관 세포유착분자 5(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5), M63967은 알데히드 탈수소효소 5(aldehyde dehydrogenase 5), U64197은 대식세포 염증 단백질 3 알파(macrophage inflammatory protein 3-α: MIP3-α), X98311은 암태아성 항원-연관 세포유착분자 7(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7), M15796은 증식세포 핵항원(proliferating cell nuclear antigen: PCNA), D13645는 KIAA0020 유전자 산물, M85085는 64kD 크기의 분열 촉진인자 소단위체 2(cleavage stimulation factor, subunit 2), L25876은 CDK2-연관 이중 특이성 탈인산화효소(CDK2-associated dual specificity phosphatase)인 싸이클린-의존성 키나제 억제제 3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3), J04102는 v-ets 조류 적아세포증 바이러스 E26 암유전자 유사유전자 2(avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 2), L00058은 v-myc 조류 골수세포종증 바이러스성 암유전자 유사유전자(avian myelocytomatosis viral oncogene homolog), M14758는 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 멤버 1(ATP-binding cassette, sub-family B, member 1), D63486은 KIAA0152 유전자 산물, U41813은 호메오 상자 A9(homeo box A9), M36067은 ATP-의존성 DNA 리가제 I(ATP-dependent DNA ligase I), D87682는 KIAA0241 단백질, X59543는 리보핵산 환원효소 M1(ribonucleotide reductase M1), Z48541는 수용체형(receptor type)인 단백질 티로신 탈인산화효소 O(protein tyrosine phosphatase O), U27333은 갈락토시드 3(4)-L-푸코실전이효소(galactoside 3(4)-L-fucosyltransferase)인 푸코실전이효소 3(fucosyltransferase 3), X53586는 인테그린 알파 6(integrin alpha 6), U19523은 GTP 사이클로히드롤라제 1(GTP cyclohydrolase 1), U09564은 SFRS(splicing factor serine/arginine specific) 단백질 키나제 1(protein kianse 1), M29536은 38kD 크기의 진핵생물 번역개시인자 2 소단위체 2(eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 2), X68314은 글루타티온 과산화효소 2(glutathione peroxidase 2), D87716은 KIAA0007 단백질, L23808은 대식세포 엘라스타제(macrophage elastase)인 세포간질 금속성 단백질 분해효소 12(matrix metalloproteinase 12), U78525는 116kD 크기의 진핵생물 번역개시인자 3 소단위체 9(eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 9), D50919는 KIAA0129 유전자산물, X60486은 H4 히스톤 계열, 멤버 G(H4 histone family, member G) 및 U24169는 JTV1 유전자산물을 각각 의미한다.
전기 표 1에서 보듯이, 전기 유전자들은 대장암조직에서의 발현정도가 정상 대장조직은 물론 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 웨스턴 블롯 분석
전기 54개의 대장암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 6종의 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하여 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 대장암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴블롯분석을 수행하였다. 전기 단백질은 TDGF1, 뮤신 2, MIP3-α, 갈라닌, 암피레귤린 및 α6 디펜신이다.
먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으부터 혈청을 분리한 다음, 전기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동한 다음, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(polyvinylidene flouride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 전기 PDVF 막을 차단시켰다. 이어, 전기 차단된 PDVF 막에 항-TDGF1 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-뮤신2 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-MIP3-α 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-갈라닌 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-암피레귤린 토끼 다클론항체(Abcam, UK) 및 항-α6 디펜신 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 전기 차단완충액에 희석하여 처리하고 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 전기 세척된 PDVF막에 처리하고 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.
결과, α6 디펜신, 뮤신 2, MIP3-α 및 암피레귤린의 경우 대장암 환자의 혈액에서 뚜렷하게 검출되었다. 반면, 뮤신 2를 제외하고는 정상인의 혈액이나 다른 종류의 암환자의 혈액으로부터는 검출되지 않았음을 확인할 수 있었으며, 뮤신 2는 대장암에서 가장 뚜렷하게 검출되었으나, 일부 뇌암, 췌장암 및 난소암 환자의 혈액에서 검출되었다. 한편, TDGF1과 갈라닌의 경우 대장암 환자의 혈액에서 유의한 결과를 확인할 수 없었으나, 항체의 농도를 높여서 재실험한 결과, 갈라닌의 경우 대장암 환자의 혈액에서 신호를 검출할 수 있었다.
따라서, α6 디펜신, 갈라닌, 암피레귤린 및 MIP3-α가 대장암에서 특이적으로 발현되는 단백질로서 대장암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 스트립의 제작 및 분석
다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α 다클론항체를 포함한 대장암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-1: 샘플패드의 제작
셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여 샘플패드(1)로 사용하였다.
실시예 3-2: 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 또는 항-MIP3-α다클론 항체와 금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작
혈액시료내의 대장암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 전기 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α 다클론 항체간의 면역 반응이 일어나는 부분으로, 유리섬유(GF) 필터(2) 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체가 일시 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 전기 염화금 용액에 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 또는 항-MIP3-α다클론 항체를 각각 10㎍/㎖되게 부착시키고 PEG(polyethylene glycol) 용액으로 금입자를 안정화시켰다. 한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분을 한 다음, 전기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.
실시예 3-3: NC 막의 제조
NC 막(nitrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자른 후, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인(3)으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하고, 상기 대조라인(3)에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 전기 대장암 특이적 항원의 검출결과 판정라인(4)으로서 본 발명에 포함된 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인(3)과 검출결과 판정라인(4)이 구비된 NC 막(5)을 제조하였다.
실시예 3-4: 흡수(absorbent)패드의 제조
흡수패드(6)는 면역반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.
실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹
각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7)위에 전기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 전기 실시예 3-2에서 제작한 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결 한 다음, 전기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 전기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 대장암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석
정상인 5명, 대장암 환자 7명, 췌장암 환자 5명, 난소암 환자 4명, 뇌암 환자 3명으로부터 혈액을 채취한 다음, 전기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드(6)에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.
그 결과, α6 디펜신 및 MIP3-α의 경우 대장암 환자에게서만 특이적으로 검출되었으며, 암피레귤린의 경우 폐암 환자에서도 약하게 나마 신호가 검출되었다. 반면, 갈라닌의 경우 대장암 환자에게서 매우 희미하게 신호가 검출되었다. 이를 통해 α6 디펜신 및 MIP3-α의 경우 스트립 형태의 검사하였을 때 대장암에 대한 표지로 사용될 수 있으며, 암피레귤린의 경우 전기 α6 디펜신 및 MIP3-α과 동시에 사용할 경우, 진단의 정확성을 높일 수 있음을 확인하였다. 그러나, 갈라닌의 경우 항체의 농도를 상향조정하거나 민감도가 더 높은 진단방법에 적용하는 것이 타당함을 확인하였다.
실시예 4: 대장암 진단용 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA) 키트의 제작 및 분석
실시예 4-1: 대장암 진단용 효소면역분석용 플레이트 제작
전기 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체를 를 1:50(v/v)의 농도로 각각 흡착용 코팅 완충용액(Na2CO3 0.188%(w/v), NaHCO3 0.271%(w/v), NaCl 0.731%(w/v), pH 9.6)에 희석한 다음, 효소면역분석용 플레이트(Nunc, USA)에 각각 50㎕/웰씩 분주하여, 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 전기 코팅된 플레이트는 PBS로 3회 세척 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위해 차단 완충용액(3%(w/v) BSA, 0.05%(v/v) Tween 20 in PBS)로 상온에서 1시간 처리한 다음, 건조하여 밀봉하여 4℃의 조건으로 암소에서 사용할 때까지 보관하였다.
실시예 4-2: 혈액시료의 처리 및 분석
전기 코팅된 플레이트에 전기 암환자 및 정상인의 혈액시료를 각 웰당 200㎕씩 처리하고, 실온에서 1시간 천천히 흔들면서 결합반응을 시킨 다음, PBST로 5회 세척하였다. 이어, PBST에 1:200(v/v)으로 희석된 전기 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체를 각각 전기 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체가 각각 코팅된 웰에 50㎕씩 분주하고, 상온에서 2시간 처리한 다음, PBST로 세차례 세척을 하고, 차단 완충용액으로 1시간 동안 상온에서 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 이어, 세척을 두 번 더 수행하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 차단 완충용액에 1:400(v/v)의 농도로 희석한 다음, 전기 항체를 처리한 웰에 각각 분주하고 상온에서 2시간 동안 천천히 흔들어주며 결합반응을 시켰다. 그런 다음, PBST로 4회 세척하고, 발색제 TMB(tetramethyl benzidine, Sigma, USA)를 제조사의 농도대로 첨가하여 발색시킨 후, 1.25M 황산 용액을 첨가하여 정지시켰다. 이어, 발색이 정지된 플레이트의 발색정도를 마이크로플레이트 판독기(Model 680 Microplate Reader, Biorad, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다(참조: 표 2).
정상인 및 각종암 환자의 혈액시료에 대한 효소면역분석 결과
암특이적 항원 정상인 대장암 췌장암 난소암 뇌암
α6 디펜신 0.083±0.016 0.251±0.039 0.075±0.021 0.078±0.024 0.091±0.031
갈라닌 0.027±0.008 0.032±0.007 0.028±0.010 0.030±0.008 0.029±0.009
암피레귤린 0.069±0.017 0.157±0.034 0.072±0.028 0.065±0.013 0.073±0.029
MIP3-α 0.057±0.011 0.137±0.032 0.062±0.019 0.054±0.012 0.063±0.013

표 2에서 보듯이, α6 디펜신, 암피레귤린 및 MIP3-α의 경우 정상인의 경우 정상인 및 다른 암환자에서 수득한 혈청에서의 흡광도보다 대장암 환자에서 수득한 혈청에서의 흡광도가 두 배 이상 높게 나왔으므로, 효소면역분석을 통해 대장암 발병여부를 판정할 수 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 갈라닌의 경우, 유의한 차이를 구할 수 없었다.
실시예 5: 단백질 칩의 제작 및 분석
실시예 5-1: 단백질 칩의 제작
전기 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다.
먼저, 전기 항체들의 부착시키기 전에, 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리 하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 전기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 전기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 전기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였 다. 그런 다음, 전기 항체들이 배열된 전기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 전기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.
실시예 5-2: 단백질 칩을 이용한 정상인 및 각종 암환자의 혈청분석
전기 실시예 5-1에서 제조된 단백질 칩을 전기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 전기 실시예 3-6에서 수득한 정상인 및 각종 암환자의 혈액시료를 각각 전기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 전기 세척된 단백질 칩을 전기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-α6 디펜신, 항-갈라닌, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α다클론 항체를 전기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 전기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 전기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 전기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 전기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-정규화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 3).
정상인 및 각종 암환자의 혈액시료에 대한 형광발색반응 측정
암특이적 항원 항체의 농도
(v/v)		 정상인 대장암 췌장암 난소암 뇌암
α6 디펜신 1:50 112.2 352.1 105.1 122.1 98.1
1:100 92.1 311.4 91.3 103.2 83.4
1:200 72.4 234.2 71.3 82.4 68.4
1:400 52.3 142.1 42.1 56.3 56.5
갈라닌 1:50 31.1 68.1 29.6 33.7 33.1
1:100 27.1 58.1 22.1 26.5 27.2
1:200 18.2 32.3 16.5 18.2 19.1
1:400 10.2 18.3 13.5 12.5 13.1
암피레귤린 1:50 102.4 234.5 106.5 98.3 86.1
1:100 84.1 201.5 86.3 83.1 74.1
1:200 62.3 163.3 64.2 74.1 62.3
1:400 48.1 91.3 52.1 56.3 46.3
MIP3-α 1:50 93.5 212.4 104.2 100.5 97.3
1:100 83.5 195.3 90.6 93.2 85.2
1:200 64.3 154.4 71.3 75.3 68.2
1:400 52.1 104.5 62.2 61.2 53.4

표 3에서 보듯이, α6 디펜신, 암피레귤린 및 MIP3-α의 경우, 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 농도를 1:200(v/v) 이상으로 희석하여 점적하였을 때, 대장암 환자의 혈액시료에서의 형광발색 정도가 정상인 또는 다른 암환자의 혈액시 료에서의 형광발색정도보다 두 배이상을 기록하였다. 그러나, 갈라닌의 경우 항체의 농도를 1:100(v/v) 이상으로 희석하여 점적하였을 때, 대장암 환자의 혈액시료에서의 형광발색 정도가 정상인 또는 다른 암환자의 혈액시료에서의 형광발색정도보다 두 배 이상 기록하여, 사용된 항체의 농도를 높일 경우, 대장암 특이적 표지로서 기능할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석
전기 실시예 5-2의 결과를 토대로, 항-α6 디펜신, 항-암피레귤린 및 항-MIP3-α 다클론 항체의 농도를 1:200(v/v)으로 희석하고, 항-갈라닌 다클론 항체의 농도를 1:100(v/v)으로 희석하여 폴리-L-리신이 코팅된 슬라이드 글라스에 각각 점적하여 단백질 칩을 제작하고, 여기에 대장암 내시경 촬영결과 폴립이 발견된 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 떨어뜨린 점을 제외하고는, 전기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 전기 단백질 칩의 형광발색정도를 측정하고, 분위수-정규화를 통하여 분석하였다(참조: 표 4). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.
단백질칩을 이용한 피검자에 대한 대장암 진단
실험군 α6 디펜신 암피레귤린 MIP3-α 갈라닌
대조군 72.5 65.1 59.3 28.1
1 74.2 63.1 63.3 26.2
2 78.5 67.4 57.3 25.1
3 73.1 64.2 64.5 26.3
4 82.4 71.5 67.3 29.1
5 84.1 72.4 63.2 30.2
6 313.1 165.3 156.3 59.1
7 81.4 69.2 57.3 26.3
8 78.5 64.1 65.3 25.4
9 73.1 68.2 62.3 29.1
10 75.3 70.4 71.2 22.6
11 295.5 172.5 161.3 45.1
12 74.1 67.3 66.3 25.3

표 4에서 보듯이, 1명의 혈액시료에서는 α6 디펜신, 암피레귤린 및 MIP3-α에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였으며, 다른 1명의 혈액시료에서는 α6 디펜신, 암피레귤린, MIP3-α 및 갈라닌에 대한 형광발색정도 모두 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀 검사를 수행한 결과, 두 명 모두 1기 MSI 대장암 환자임이 판명되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 대장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 대장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 대장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 대장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (11)

  1. 항-갈라닌 항체(anti-galanin antibody) 및 상기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 대장암 진단용 기판.
  2. 제 1항에 있어서,
    고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 기판.
  3. 제 1항에 있어서,
    항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 기판.
  4. 제 1항에 있어서,
    항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 기판.
  5. 제 1항의 대장암 진단용 기판 및 전기 대장암 진단용 기판의 항체에 결합한 대장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 대장암 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
  7. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    신호복합체는 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
  10. 제 8항에 있어서,
    효소는 HRP(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는
    대장암 진단용 키트.
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