KR100970652B1 - 폐암 진단용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 폐암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 폐암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 폐암 진단용 키트는 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 폐암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 폐암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 폐암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 폐암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 릴랙신 2, 아포리포프로테인 F, 단백질 칩, 효소면역분석법, 면역크로마토그래피, 스트립

Description

폐암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Lung Cancer}
본 발명은 폐암 진단용 키드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 폐암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 폐암 진단용 키트에 관한 것이다.
폐암은 현재 우리나라 암 발생빈도 2위, 암으로 인한 사망률 1위 질환으로서 현대인의 생명을 위협하는 중요 질환이다. 폐암은 초기 증세가 거의 없고 기침이나 가래와 같은 증세로 인해 감기와 구별이 곤란하여, 초기에 발견하기가 어렵다. 따라서, 폐암으로 진단이 되면 이미 암세포가 확산된 뒤라서 치료 개시일로부터 5년 생존율은 15%에 불과하다.
폐암의 진단은 단순 방사선 영상(X선) 검사, 세포를 채취하기 위한 가래검사, 기관지경 또는 화이버스코프(fiberscope)라고 불리는 특수 내시경을 삽입하여 채취하는 기관지경 검사, 바늘을 넣어 폐의 세포를 채취하는 천자흡인세포 검진과 같은 조직세포 병리검사, 전산화 단층촬영(CT) 등의 방법을 통해 이루어진다. 그 러나, 기관지경 검사, 천자흡인세포 검진 등을 통해 검진을 할 경우 정확한 진단은 가능하나, 상기 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어서 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고도 신속하게 폐암을 진단할 수 있는 진단방법의 개발이 요구되어 왔다.
암과 같은 유전적 변이가 발생하는 질환에 대해서 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되었는데, 일반적으로, 이들 진단 방법은 암으로 의심되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행된다. 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성림프성백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암만을 진단할 수 있는 단점이 있고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.
상술한 종래의 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었는데, 대한민국 특허 제 151823호에는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 395206호에는 CEA에 대한 단클론항 체를 포함한 초고속 간암, 대장암, 전립선암 진단 스트립이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 CEA는 폐암은 물론 다른 암 조직에서도 발현되므로, 폐암 특이적 항원이라 할 수 없으며, 아직까지 폐암 환자에서만 특이적으로 발현되는 폐암 특이적 항원은 보고된 바 없다.
따라서, 폐암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 폐암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자는 폐암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 폐암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 폐암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 전기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 폐암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 폐암 진단용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 기판을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 피검자의 혈액시료에서 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 폐암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 폐암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 폐암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 폐암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
본 발명의 폐암 진단용 기판은(ⅰ) 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 8개의 항체; 및,(ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 폐암 진단용 기판을 포함한다: 이때, 전기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 전기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴 리-L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 전기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 폐암 진단용 키트는 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 폐암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호물질로서 사용할 경우에는 폐암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 폐암 진단용 키트는 폐암 진단용 기판으로서 전기 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 NC 막 또는 PVDF 막을 사용하고, 전기 폐암 진단용 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).
도 1은 본 발명의 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 전기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 결과 표시부재로서 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 고정된 다클론항체 밴드(판정라인, 3)와 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 4)가 부착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.
본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 폐암 진단용 키트는, 폐암 진단용 기판으로서 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 전기 폐암 진단용 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA) 키트이다: 이때, 전기 마이크로플레이트는 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 부착되고, 전기 검출수단에는 전기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체, 항-아포리포프로테인 F 항체 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 폐암 진단용 키트는, 폐암 진단용 기판으로서 전기 폐암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 전기 폐암 진단용 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 폐암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 전기 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 전기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 전기 단백질 칩과 전기 항체에 각각 결합된 파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 릴랙신 2 및 아포리포프로테인 F를 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 전기 검출수단은 전기 폐암 특이적 항원에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-파라옥소나제 3 항체, 항-바이글리칸 항체, 항-그랜자임 K 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체, 항-아포리포프로테인 F 항체 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 전기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP, RFP 또는 텍사스레드인 것이 바람직하다.
본 발명의 폐암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 폐암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 폐암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 폐암 특이 유전자의 선별
정상 뇌조직(BN) 6건, 뇌의 1기 성상세포종(astrocytoma) 조직(BA I) 19건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 37건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 13건, 정상폐조직(LN) 10건, 폐암조직(AL)71건, 정상 췌장조직(PN) 7건, 췌장암조직(PT) 8건 및 장액성 난소암조직(ovary cancer serous, OS) 27건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 전기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.
전기 선별된 5㎍의 RNA를 올리고(dT)24를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 전기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 polymerase in vitro 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 전기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 전기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 혼성화반응용액과 전기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼합 하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.
반응이 종결된 후, 전기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 전기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin IgG)를 처리하고, 전기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 전기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하여 폐암 조직에서 특이적 발현 유전자를 선별하였다(참조: 표 1).
각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과
유전자 AL MO R BN BA I CMSS CMSI LN PT PN OS
D10326 2830 699 4.05 292 265 239 247 112 247 699 183
X00948 2053 1870 1.10 288 206 1717 1870 110 962 334 522
X16281 1018 252 4.04 53 111 252 67 77 84 222 52
J04599 936 118 7.93 46 25 58 84 15 118 -19 6
M73239 2261 606 3.73 283 291 285 275 250 512 606 257
U26174 889 165 5.39 -49 -61 -103 -107 -140 121 165 -54
HG3137 677 158 4.28 -37 -22 -15 -13 -70 86 158 -28
X86816 1439 1207 1.19 165 222 440 1207 221 855 663 371
X98178 649 127 5.11 127 21 35 30 -41 106 -11 49
Z29074 1010 641 1.58 215 174 136 144 181 587 641 163
HG3044 2700 1753 1.54 129 729 1753 1265 507 718 282 277
L27050 505 226 2.23 117 59 74 122 68 226 57 142
HG1699 983 297 3.31 89 98 99 74 207 297 276 240
U03735 444 272 1.63 104 99 272 100 7 101 132 12
U05861 7348 1719 4.27 464 939 246 142 1719 702 462 138
M58569 423 91 4.65 54 3 24 24 -57 84 91 -2
M19888 637 317 2.01 227 129 175 155 155 149 317 164
L48516 1543 886 1.74 435 526 597 735 382 502 662 886
L32140 452 323 1.40 74 210 317 225 116 78 80 323
M10014 2278 667 3.42 374 134 103 108 667 157 227 91
M90656 1985 1177 1.69 1102 948 1177 944 603 903 1069 856
X60708 509 385 1.32 37 45 203 358 159 294 385 79
K02054 688 376 1.83 331 126 232 212 219 308 376 180
V00542 309 179 1.73 11 5 50 51 37 92 179 -5
유전자 AL MO R BN BA I CMSS CMSI LN PT PN OS
M74542 977 677 1.44 445 451 470 490 324 677 647 481
J04056 1278 939 1.36 566 939 753 860 424 366 85 479
상기 표 1에서, AL은 폐암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AL를 MO로 나눈 비율을 의미한다.
또한, 상기 표 1에서, 유전자 D10326는 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를, X00948는 릴랙신 2(relaxin 2)를, X16281는 징크핑거 단백질의 일종인 KOX 7(zinc finger protein, KOX 7)를, J04599는 바이글리칸(biglycan)을, M73239는 간세포성장인자인 헤파포이에틴 A(hepatocyte growth factor, hepapoietin A)를, U26174는 그랜자임 K(granzyme K)를, HG3137는 징크핑거 단백질의 일종인 HFZ20(zinc finger protein, HFZ20)를, X86816는 클라우딘 4(claudin 4)를, X98178는 카스파제 8(caspase 8)를, Z29074는 케라틴 9(keratin 9)를, HG3044는 피브로넥틴 1(fibronectin 1)을, L27050는 아포리포단백질 F(apolipoprotein F)를, HG1699는 에피몰핀(epimorphin)을, U03735는 흑색종 항원, 패밀리 A(melanoma antigen, family A)를, U05861는 알도-케토 환원효소 패밀리 1, 멤버 C1(aldo-keto reductase family 1, member C1(dihydrodiol dehydrogenase 1; 20-alpha(3-alpha)-hydroxysteroid dehydrogenase))을, M58569는 피브리노겐, A 알파 폴리펩티드(fibrinogen, A alpha polypeptide)를, M19888는 스몰 프롤린 리치 단백질 1B(small proline-rich protein 1B(cornifin))를, L48516는 파라옥소나제 3(paraoxonase 3)을, L32140은 아파민(afamin)을, M10014는 피브리노겐, 감마 폴리펩티드(fibrinogen, gamma polypeptide)를, M90656는 글루타메이트-시스테인 연결효소, 카탈라이틱 서브유닛(glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit)을, X60708은 다이펩티딜펩티다아제 IV(dipeptidylpeptidase IV(CD26, adenosine deaminase complexing protein 2))를, K02054는 가스트린-릴리징 펩티드(gastrin-releasing peptide)를, V00542는 인터페론 알파 14(interferon, alpha 14)를, M74542는 알데하이드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)를, J04056는 카르보닐 환원효소(carbonyl reductase)를 각각 의미한다.
전기 표 1에서 보듯이, 전기 유전자들은 폐암조직에서의 발현정도가 정상 폐조직은 물론, 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 웨스턴 블롯 분석
전기 26개의 폐암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하여 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 폐암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 전기 단백질은 파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 피브리노겐, 가스트린 분비 펩티드, 릴랙신 2 및 아포리포프로테인 F이다.
먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 전기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하고, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(polyvinylidenefluoride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해, 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 전기 PVDF 막을 차단시켰다. 이어, 전기 차단된 PVDF 막에 항-파라옥소나제 3 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-바이글리칸 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-그랜자임 K 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-피브로넥틴 1 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-아파민 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-인터페론 알파 14 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA), 항-릴랙신 2 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA) 및 항-아포리포프로테인 F 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 전기 차단완충액에 희석하여 처리하고, 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horse raddish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 전기 세척된 PDVF막에 처리하고, 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.
그 결과, 파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 릴랙신 2 및 아포리포프로테인 F의 경우 폐암 환자의 혈액에서만 뚜렷하게 검출되었다. 반면, 피브리노겐 및 가스트린 분비 펩티드은 폐암 뿐만 아니라, 정상인 또는 다른 암환자의 혈액에서도 뚜렷하게 검출되었다.
따라서, 파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 릴랙신 2 및 아포리포프로테인 F가 폐암에서 특이적으로 발현되는 단백질로서 폐암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 스트립의 제작 및 분석
다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-파라옥소나제 3 다클론항체, 항-바이글리칸 다클론항체, 항-그랜자임 K 다클론항체, 항-피브로넥틴 1 다클론항체, 항-아파민 다클론항체, 항-인터페론 알파 14 다클론항체, 항-릴랙신 2 다클론항체 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체를 포함한 폐암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-1: 샘플패드의 제작
셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여, 샘플패드(2)로 사용하였다.
실시예 3-2: 다클론항체-금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작
혈액시료내의 폐암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 전기 항-파라옥소나제 3 다클론항체, 항-바이글리칸 다클론항체, 항-그랜자임 K 다클론항체, 항-피브로넥틴 1 다클론항체, 항-아파민 다클론항체, 항-인터페론 알파 14 다클론항체, 항-릴랙신 2 다클론항체 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체간의 면역반응이 일어나는 부분인 유리섬유(GF) 필터(2)는 그의 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체인 다클론항체-금접합체가 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 전기 염화금 용액에 항-파라옥소나제 3 다클론항체, 항-바이글리칸 다클론항체, 항-그랜자임 K 다클론항체, 항-피브로넥틴 1 다클론항체, 항-아파민 다클론항체, 항-인터페론 알파 14 다클론항체, 항-릴랙신 2 다클론항체 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체를 각각 10㎍/㎖로 가하고, PEG(polyethyleneglycol) 용액으로 금입자를 안정화시켜서 다클론항체-금접합체를 제조하였다.
한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 전기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.
실시예 3-3: NC 막의 제조
NC 막(nictrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자르고, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하였다. 이어, 상기 대조라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 전기 폐암 특이적 항원의 검출결과 판정라인으로서 본 발명에 포함된 항-파라옥소나제 3 다클론항체, 항-바이글리칸 다클론항체, 항-그랜자임 K 다클론항체, 항-피브로넥틴 1 다클론항체, 항-아파민 다클론항체, 항-인터페론 알파 14 다클론항체, 항-릴랙신 2 다클론항체 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인과 검출결과 판정라인이 구비된 NC 막(4)을 제조하였다.
실시예 3-4: 흡수(absorbent) 패드의 제조
흡수패드(7)는 면역반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.
실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹
각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7) 위에 전기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 전기 실시예 3-2에서 제작한 각각의 다클론항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결한 다음, 전기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 전기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 폐암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석
정상인 5명, 대장암 환자 7명, 폐암 환자 5명, 난소암 환자 4명, 뇌암 환자 3명으로부터 혈액을 채취한 다음, 전기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.
그 결과, 폐암 환자에서 수득한 혈액시료만이 상기 면역 크로마토그래피 스트립의 각 항체의 판정라인에서 발색됨을 확인하였는 바, 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립이 폐암 환자를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 단백질 칩의 제작 및 이를 이용한 무작위적 표본에 대한 분석
실시예 4-1: 단백질 칩의 제작
전기 항-파라옥소나제 3 다클론항체, 항-바이글리칸 다클론항체, 항-그랜자임 K 다클론항체, 항-피브로넥틴 1 다클론항체, 항-아파민 다클론항체, 항-인터페론 알파 14 다클론항체, 항-릴랙신 2 다클론항체 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다.
먼저, 전기 항체들을 부착시키기 전에, 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 전기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 전기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 전기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였다. 그런 다음, 전기 항체들이 배열된 전기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 전기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.
실시예 4-2: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석
상기 실시예 4-1에서 제조된 단백질 칩을 상기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 여기에 폐암의 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 각각 상기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 상기 세척된 단백질 칩을 상기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-파라옥소나제 3 다클론항체(T1), 항-바이글리칸 다클론항체(T2), 항-그랜자임 K 다클론항체(T3), 항-피브로넥틴 1 다클론항체(T4), 항-아파민 다클론항체(T5), 항-인터페론 알파 14 다클론항체(T6), 항-릴랙신 2 다클론항체(T7) 및 항-아포리포프로테인 F 다클론항체(T8)를 상기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 상기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 상기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 상기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG(H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 상기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.
단백질칩을 이용한 피검자에 대한 폐암 진단
실험군 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
대조군 71.4 69.2 61.2 87.4 67.8 54.2 35.4 29.7
1 69.5 58.9 68.3 63.3 68.2 63.3 28.1 28.6
2 74.6 51.4 89.7 81.2 54.3 14.2 37.6 37.6
3 269.9 167.8 167.5 184.4 164.1 164.5 86.3 67.1
4 81.2 74.3 69.3 78.5 69.2 67.8 29.1 24.2
5 289.4 172.4 164.2 173.1 172.4 163.2 70.2 53.2
6 75.8 81.4 89.7 81.2 54.2 14.3 37.4 37.8
7 79.0 70.2 59.3 78.5 71.5 57.3 75.4 27.3
8 76.3 68.2 61.3 75.3 64.2 65.4 29.1 24.4
9 74.1 71.4 64.3 74.1 67.4 71.2 22.6 28.9
10 77.6 54.1 64.3 64.0 63.1 66.3 25.1 30.8
11 89.4 84.1 65.9 84.0 65.3 61.3 38.4 31.4
12 71.5 67.3 61.3 72.5 65.1 71.8 35.3 35.3
상기 표 2에서 보듯이, 2명의 혈액시료(실험군 3 및 5)에서는 파라옥소나제 3, 바이글리칸, 그랜자임 K, 피브로넥틴 1, 아파민, 인터페론 알파 14, 릴랙신 2 및 아포리포프로테인 F에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀검사를 수행한 결과, 두 명 모두 폐암 환자임이 판명되었다.
도 1은 본 발명에 따른 폐암 진단용 키트의 일실시태양인 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립의 개념을 모식적으로 나타내는 그림이다.

Claims (12)

  1. (ⅰ) 항-파라옥소나제 3 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 6개의 항체; 및,
    (ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 폐암 진단용 기판.
  2. 제 1항에 있어서,
    고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 기판.
  3. 제 1항에 있어서,
    항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 기판.
  4. 제 1항에 있어서,
    항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 기판.
  5. 제 1항의 폐암 진단용 기판 및 전기 폐암 진단용 기판의 항체에 결합한 폐암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 폐암 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  7. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    신호물질은 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  10. 제 8항에 있어서,
    효소는 HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는
    폐암 진단용 키트.
  12. (ⅰ) 샘플패드;
    (ⅱ) 금입자가 각각 결합된 항-파라옥소나제 3 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터;
    (ⅲ) 항-파라옥소나제 3 항체, 항-피브로넥틴 1 항체, 항-아파민 항체, 항-인터페론 알파 14 항체, 항-릴랙신 2 항체 및 항-아포리포프로테인 F 항체가 고정된 다클론항체 밴드인 판정라인과, 대조용 이차항체 밴드인 대조라인이 부착된 NC 막;
    (ⅳ) 흡수패드; 및,
    (ⅴ) 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는, 폐암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
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