KR20060112258A - 췌장암 진단용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 췌장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 췌장암 진단용 키트는 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 췌장암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 췌장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 췌장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 췌장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
마트릴린 3(matrilin 3), 트랜스티레틴(transthyretin, prealbumin, amyloidosis type I), 리포칼린 2(lipocalin 2) 및 스트라티핀(stratifin), 단백질 칩, 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA), 면역크로마토그래피, 스트립

Description

췌장암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Pancreas Cancer}
도 1은 본 발명의 췌장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다.
본 발명은 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 췌장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 비교적 활발히 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 식도암, 대장암, 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다. 한편, 췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율 이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상증세는 대부분이 서서히 발병하고, 식욕감퇴, 허약해지기 쉬우며, 체중감소는 가장 흔한 증세이다. 진단은 위, 십이지장의 X선 조영검사, 피부 및 간을 통한 담도촬영(膽道撮影)과 역행성 내시경 담도촬영술 등에 의해 시행되어 왔으나, 최근에 초음파촬영 및 전산화 단층촬영이 가장 많이 사용되는 진단방법이다. 이들 방법에 의하여, 질병의 병변이 발견되는 경우, 보다 정밀한 조직검사를 수행하여 진단하는 경우, 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있으나, 상기의 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 등 그 수행방법이 매우 불편하여 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 간편하고 신속하게 췌장암 여부를 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.
한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대하여는 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등에 대하여는 상당한 성과가 보고되고 있으나, 상대적으로 발병빈도가 낮은 췌장암의 경우에는 연구성과가 많지 않은 실정이다. 상기 유전자를 이용한 진단법의 경우, 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행되는데, 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암에서만 효과를 보이고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.
상술한 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방방, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었는데, 대한민국 특허 제 151823호에는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 395206호에는 CEA에 대한 단클론항체를 포함한 초고속 간암, 대장암, 전립선암 진단 스트립이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 CEA는 췌장암은 물론 다른 암조직에서도 발현되므로, 췌장암 특이적 항원이라 할 수 없으며, 아직까지 췌장암 환자에서만 특이적으로 발현되는 췌장암 특이적 항원은 보고된 바 없다.
따라서, 췌장암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 췌장암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자는 췌장암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 췌장암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 췌장암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였 으며, 전기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 췌장암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 췌장암 진단용 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 기판을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 췌장암 진단용 기판은 (ⅰ) 항-마트릴린 3 항체(anti-matrilin 3 antibody), 항-트랜스티레틴 항체(anti-transthyretin antibody), 항-리포칼린 2 항체(anti-lipocalin 2 antibody) 및 항-스트라티핀 항체(anti-stratifin antibody)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 4개의 항체; 및, (ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 췌장암 진단용 기판을 포함한다: 이때, 전기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막, 마이크로플레이트 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 전기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴리- L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 전기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 췌장암 진단용 키트는 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 췌장암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호복합체를 사용할 경우, 신호복합체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호복합체로서 사용할 경우에는 췌장암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 췌장암 진단용 키트는 췌장암 진단용 기판으로서 전기 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부 착된 NC(nitrocellulose) 막 또는 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막을 사용하고, 전기 췌장암 진단용 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).
도 1은 본 발명의 췌장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 전기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역 반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-마트릴린 3 항체, 항-트랜스티레틴 항체, 항-리포칼린 2 항체 및 항-스트라티핀 항체가 일시 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 결과 표시부재로서 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀에 각각 특이적인 다클론항체 밴드(판정라인, 3)와 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 4)가 고착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.
본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 췌장암 진단용 키트는, 췌장암 진단용 기판으로서 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 전기 췌장암 진단용 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA) 키트이다: 이때, 전기 마이크로플레이트는 항-마트릴린 3 항체, 항-트랜스 티레틴 항체, 항-리포칼린 2 항체 및 항-스트라티핀 항체가 부착되고, 전기 검출수단에는 전기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 전기 항-마트릴린 3 항체, 항-트랜스티레틴 항체, 항-리포칼린 2 항체 또는 항-스트라티핀 항체, 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 췌장암 진단용 키트는, 췌장암 진단용 기판으로서 전기 췌장암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 전기 췌장암 진단용 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 췌장암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 전기 항-마트릴린 3 항체, 항-트랜스티레틴 항체, 항-리포칼린 2 항체 및 항-스트라티핀 항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 전기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 전기 단백질 칩과 전기 항체에 각각 결합된 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 또는 스트라티핀을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 전기 검출수단은 전기 췌장암 특이적 항체에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-마트릴린 3 항체, 항-트랜스티레틴 항체, 항-리포칼린 2 항체, 항-스트라티핀 항체, 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 전기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것이 바람직하다.
본 발명의 췌장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 췌장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 췌장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 췌장암 특이 유전자의 선별
정상 뇌조직(BN) 6건, 뇌의 1기 성상세포종(astrocytoma) 조직(BA I) 19건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 37건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 13건, 정상폐조직(LN) 10건, 1기 폐암조직(L I) 71건, 정상 췌장조직(PN) 7건, 췌장암조직(AP) 8건 및 장액성 난소암조직(ovary cancer serous, OS) 27건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 전기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.
전기 선별된 5㎍의 RNA를 oligo(dT)24를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 전기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 polymerase in vitro 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 전기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 전기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 혼성화반응용액과 전기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼합하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.
반응이 종결된 후, 전기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 전기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti- streptavidin IgG)를 처리하고, 전기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 전기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 1).
각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과
유전자 AP MO R BN BA I CMSS CMSI L I LN PN OS
L01406 1346 105 12.88 -18 -6 -39 105 -46 25 -75 12
HG2190 2241 203 11.05 9 -90 -256 -345 -459 -446 203 -336
J00124 7676 406 18.91 406 262 209 285 202 116 557 642
M60047 3180 426 7.46 7 -17 282 426 179 186 -27 57
X82693 2552 312 8.18 312 46 178 89 167 170 172 72
AJ001047 396 57 3.96 -166 -108 -123 -69 11 -31 57 -126
L14565 6264 1807 3.47 1318 941 661 714 935 997 1807 941
M31551 354 109 3.24 -60 -134 -141 -131 -144 -164 109 -155
Y07755 15681 5141 3.05 455 540 1006 785 1408 1021 320 5141
D12763 328 129 2.55 -15 -25 -43 -35 35 129 80 -34
AC002077 2423 956 2.53 367 299 186 279 956 812 188 525
X62891 311 130 2.39 -191 -266 -337 -320 -321 -286 130 -319
X52426 2022 950 2.13 67 29 140 95 448 305 950 108
D85527 3205 1528 2.10 1528 1236 917 933 962 764 1582 1102
U12139 2358 1171 2.01 224 101 155 196 147 -8 1171 106
AF000562 6738 3087 2.2 2867 1892 1779 1812 2221 2280 3087 2205
X83863 1407 735 1.91 270 351 86 113 271 158 735 135
M15517 10438 5464 1.91 190 352 177 133 450 197 5464 179
M76482 518 250 2.1 203 114 247 250 129 141 -106 99
J04177 5801 2049 2.8 769 2049 1588 1466 1477 314 856 1384
M28249 778 419 1.86 66 72 419 351 271 127 149 61
U07919 1506 817 1.84 170 817 462 283 441 469 496 216
U19796 4963 1972 2.5 2732 1939 1700 1888 1760 1543 1972 1664
유전자 AP MO R BN BA I CMSS CMSI L I LN PN OS
X07696 1955 241 8.1 -87 -113 41 93 241 75 -86 -2
M11718 13921 2877 4.8 1085 1983 2877 2270 4127 2294 1740 2204
U52112 4170 2356 1.77 2356 1074 972 954 1203 1133 2348 1301
L42611 3326 928 3.6 557 499 867 835 850 583 928 884
M57506 181 107 1.68 82 79 17 25 51 7 107 39
J03779 1710 1019 1.68 490 589 856 527 674 1019 993 538
D30758 2530 1315 1.9 1238 762 553 621 1013 1277 1315 650
M64099 3628 2190 1.66 1021 2190 825 625 1321 1072 1123 755
M29610 228 126 1.8 49 71 67 78 46 0 126 38
L14754 1779 1083 1.64 1083 371 532 593 452 736 754 517
J00210 164 18 9.1 18 -8 -35 -49 -17 -43 -42 -69
K01396 22184 13712 1.62 390 1038 3262 9218 11095 13712 3019 1908
U58331 162 58 2.8 58 -27 -38 -22 -24 -48 40 -13
U21051 216 129 1.7 48 100 107 87 90 63 129 66
U17760 3308 1793 1.8 165 144 868 833 1793 661 37 1050
U40763 400 222 1.8 134 185 182 217 180 195 145 222
X99133 10786 6257 1.7 180 223 4492 6257 2085 757 1967 2923
AB000467 454 288 1.58 -67 124 63 123 2 38 288 37
X16707 157 13 1.57 -167 -169 -100 -244 -334 -371 13 -280
X52425 2147 1373 1.6 510 568 1177 1274 1373 1372 528 703
X57348 4564 2922 1.6 264 255 2214 2922 2660 1075 614 870
L12350 3264 1489 2.2 478 743 1489 1106 1427 655 297 776
X75546 597 395 1.51 40 77 55 212 142 135 352 395
유전자 AP MO R BN BA I CMSS CMSI L I LN PN OS
D17525 2004 1330 1.51 616 586 471 489 593 598 1330 522
Y08766 1388 861 1.6 502 587 330 292 705 483 861 616
AC000066 186 115 1.6 108 45 26 9 35 -21 115 7
Z19574 4813 1851 2.6 318 60 351 399 1851 273 50 1584
J02906 3666 2486 1.47 1068 846 653 713 771 806 2486 688
U21689 1458 989 1.47 592 331 277 206 197 311 989 336
L37033 10203 6964 1.47 6927 3972 1503 1223 2113 2224 6964 2168
M26041 5673 3886 1.46 610 997 1696 1376 2610 3886 2451 1542
X86779 3194 2106 1.5 2082 1509 1353 1452 1510 1098 2106 1523
D42055 420 241 1.7 67 277 197 168 164 167 241 92
U58096 344 204 1.7 204 96 103 116 134 105 189 115
M90657 5268 2859 1.8 -115 521 1075 461 2859 2486 809 3257
M20203 236 167 1.41 -39 -51 -51 -136 -3 19 167 -74
L37036 1429 663 2.2 280 179 421 201 663 238 205 260
L34155 3319 2360 1.41 26 12 781 869 875 608 377 2360
X57766 4783 3402 1.41 918 775 3402 1765 2322 542 1066 2436
U07424 2660 1770 1.5 1770 831 1357 1357 800 868 408 1304
유전자 AP MO R BN BA I CMSS CMSI L I LN PN OS
U62800 2135 1163 1.8 -79 -37 4 41 1154 1163 -58 320
D86479 4904 3616 1.36 1054 3616 1336 1200 2287 2067 944 1201
L38500 183 135 1.35 135 106 99 57 109 17 122 105
D50840 4626 2895 1.6 1484 1050 1197 842 2895 2701 1031 1887
U45983 140 66 2.1 66 -13 -20 -19 11 -24 59 -11
M55682 247 183 1.35 -48 -47 -62 -78 -50 -84 183 -10
M60094 198 90 2.2 90 72 67 45 70 25 90 57
M59371 1051 729 1.4 306 392 729 654 641 637 186 611
D50923 787 572 1.4 237 372 524 493 361 172 572 481
V00536 222 162 1.4 162 107 109 141 120 95 140 96
X70218 3877 2531 1.5 623 1260 2200 2186 2229 1382 1697 2531
M13452 3530 2656 1.33 1169 1089 1494 1790 2026 2656 2071 1588
X60382 376 184 2.0 91 33 116 126 184 -4 22 108
S66896 332 106 3.1 -9 52 27 41 96 97 106 38
M30607 300 229 1.31 -22 26 45 89 12 17 229 -3
X14830 573 352 1.6 352 334 235 218 316 222 254 205
U08191 457 250 1.30 126 135 124 90 170 178 350 197
U11863 8393 6444 1.30 3560 2432 2221 2389 2502 1690 6444 2267
X66610 164 110 1.5 42 44 41 82 36 -31 110 8
L40379 1809 1391 1.30 12 534 1047 1116 1041 1391 -43 1245
상기 표 1에서, AP는 췌장암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AP를 MO로 나눈 비율을 의미한다.
또한, 상기 표 1에서, 유전자 LO1406은 성장호르몬 방출 호르몬 수용체(growth hormone releasing hormone receptor)를, HG2190은 크리스탈린 베타 3(crystallin, beta 3))를, J00124는 케라틴 14(keratin 14(epidermolysis bullosa simplex, Dowling-Meara, Koebner))를, M60047은 헤파린 결합 성장인자 결합 단백질(heparin-binding growth factor binding protein)을, X82693은 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌위 D(lymphocyte antigen 6 complex, locus D)를, AJ001047은 마트릴린(matrilin) 3을, L14565는 페리페린(peripherin)을, M31551은 세린 또는 시스테인 단백질 가수분해효소 저해제(serine or cysteine proteinase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 2)를, Y07755는 S100 칼슘 결합 단백질 A2를, D12763은 인터루킨 1 수용체 유사단백질 1(interleukin 1 receptor-like 1)를, AC002077은 KIAA0677 유전자 산물을, X62891은 아르기닌 바소프레신(arginine vasopressin(neurophysin II, antidiuretic hormone, diabetes insipidus, neurohypophyseal))을, X52426은 케라틴 13을, D85527은 LIM 영역(domain) 키나제(kinase) 2를, U12139는 콜라겐 11형 알파 1을, AF000562는 유로플라킨(uroplakin) 2를, X83863은 프로스타글란딘 E 수용체 3(prostaglandin E receptor 3(subtype EP3))을, M15517은 트랜스티레틴(transthyretin(prealbumin, amyloidosis type I))을, M76482는 데스모글레인(desmoglein) 3(pemphigus vulgaris antigen)을, J04177은 콜라겐 11형 알파 1을, M28249는 인테그린 알파2(integrin, aplha 2(CD49B, alpha 2 subunit of VLA-2 receptor))를, U07919는 알데히드 탈수소효소 1군 A3(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3)를, U19796은 미토콘드리아 리보솜 단백질 L28을, X07696은 케라틴 15를, M11718은 콜라겐 유형 5 알파 2를, U52112는 L1 세포 부착(adhesion) 단백질을, L42611은 케라틴 6E를, M57506은 작은 유도성 사이토카인 A1(small inducible cytokine A1)을, J03779는 막 금속펩티드내부분해효소(membrane metallo endopeptidase)를, D30758은 센타우린(centaurin) 베타 1을, M64099는 감마 글루타밀트랜스퍼라제(gamma-glutamyltransferase-like activity 1)를, M29610은 글리코포린(glycophorin) E를, L14754는 면역글로불린 뮤 결합 단백질 2를, J00210은 인터페론 알파 1을, K01396은 세린(또는 시스테인) 단백질 가수분해효소 저해제를, U58331은 사르코글리칸 델타(sarcoglycan, delta)를, U21051은 G 단백질 결합 수용체 4를, U17760은 라미닌(laminin) 베타 3을, U40763은 펩티딜 프롤릴 이소머라제(peptidyl-prolyl isomerase) G를, X99133은 리포칼린(lipocalin) 2를, AB000467은 4번 염색체 ORF 9를, X16707은 FOS 유사 항원 1을, X52425는 인터루킨(interleukin) 4 수용체를, X57348은 스트라티핀(stratifin)을, L12350은 트롬보스폰딘(thrombospondin) 2를, X75546은 피브로모듈린(fibromodulin)을, D17525는 매넌 결합 렉틴 세린 단백질분해효소 1(mannan-binding lectin serine protease 1)을, Y08766은 스플라이싱 인자(splicing factor) 1을, AC000066은 키나제 고정 단백질(kinase anchor protein)을, Z19574는 케라틴 17을, J02906은 시토크롬(cytochrome) P450 2군 단백질을, F서브패밀리(subfamily) F 폴리펩티드 1을, U21689는 글루타치온 S 트랜스퍼라제(glutathione S-transferase) 파이(pi)를, L37033은 FK506 결합 단백질 8을 M26041은 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)를, X86779는 FAST 키나제를, D42055는 신경세포 전구체(neural precursor cell expressed, developmentally downregulated 4)를, U58096는 고환 특이성 단백질(testis specific protein, Y-linked)를, M90657은 막투과 단백질 그룹 1(transmembrane 4 superfamily member 1)을, M20203은 엘라스타제 2(elastase 2, neutrophil)을, L37036은 작은 유도성 사이토카인 서브패밀리 B(small inducible cytokine subfamily B(Cys-X-Cys), 멤버(member) 5(epithelial derived neutrophil-activating peptide 78))를, L34155는 라미닌(laminin) 알파 3을, X57766은 기질 금속성 단백질분해효소(matrix metalloproteinase) 11(stromelysin 3)을, U07424는 페닐알라닌-tRNA 합성효소 유사단백질(phenylalanine-tRNA synthetase-like protein)를, U62800은 시스타틴(cystatin) E/M을, U31201은 라미닌(laminin) 감마 2 칼리닌(kalinin) BM600을, D86479는 AE 결합 단백질 1을, L38500은 용질 운반체 5군(이노시톨 운반체(inositol transporter)) 멤버 3을, D50840은 UDP 글루코스 세라미드 글루코실트랜스퍼라제(UDP-glucose ceramide glucosyltransferase)를, U45983은 케모키네(C-C 영역) 수용체 8(chemokine(C-C motif) receptor 8)을, M55682는 마트릴린(matrilin) 1 카틸리지 기질 단백질(cartilage matrix protein)을, M60094는 H1 히스톤 계열 멤버 T(정소 특이성)(H1 histone family, member T(testis-specific))를, M59371은 EpHA2를, D50923은 KIAA0133 유전자 산물을, V00536은 인터페론 감마(interferon, gamma)를, X70218은 단백질 포스파타아제(protein phosphatase 4, catalytic subunit)를, M13452는 라민(lamin) A/C를, X60382는 콜라겐 X 유형 알파 1을, S66896은 세린(또는 시스테인) 단백질 가수분해효소 저해제 클레이드 B 멤버 3(serine(or cystein) proteinase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 3)을, M30607은 징크 핑거 단백질(zinc finger protein, Y-linked)을, X14830은 콜린 수용체 니코틴 베타 폴리펩티드 1(cholinergic receptor, nicotinic, beta polypeptide 1(muscle))을, U08191은 카파 B 결합 단백질 관련 핵 인자(nuclear factor related to kappa B binding protein)를, U11863은 아밀로리드(amiloride) 결합 단백질 1(구리 포함 아민 산화제)을, X66610은 폐 특이성 에놀라제 알파(enolase alpha, lung-specific)를, L40379는 티로이드 호르몬 수용체 인터액터 10(thyroid hormone receptor interactor 10)을 각각 의미한다.
전기 표 1에서 보듯이, 전기 유전자들은 췌장암조직에서의 발현정도가 정상 췌장조직은 물론, 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 웨스턴 블롯 분석
전기 95개의 췌장암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 6종의 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하여 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 췌장암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴블롯분석을 수행하였다. 전기 단백질은 마트릴린 3, 칼리닌, 트랜스티레틴, UDP 글루코스 세라미드 글루코실트랜스퍼라제, 리포칼린 2 및 스트라티핀이다.
먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 전기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동한 다음, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(poly vinylidene flouride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 전기 PVDF 막을 차단시켰다. 이어, 전기 차단된 PVDF 막에 항-마트릴린 3 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-칼리닌 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-트랜스티레틴 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-UDP 글루코스 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 토끼 다클론항체(Abcam, UK), 항-리포칼린 2 토끼 다클론항체(Abcam, UK) 및 항-스트라티핀 토끼 다클론항체(Alpha Diagnostic International, USA)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 전기 차단완충액에 희석하여 처리하고, 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horse raddish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 전기 세척된 PDVF막에 처리하고, 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.
그 결과, 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀의 경우 췌장암 환자의 혈액에서 뚜렷하게 검출되었다. 반면, 칼리닌, UDP 글루코스 세라미드 글루코실트랜스퍼라제는 췌장암에서 가장 뚜렷하게 검출되었으나, 일부 뇌암, 췌장암 및 난소암 환자의 혈액에서 검출되었다.
따라서, 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀이 췌장암에서 특이적으로 발현되는 단백질로서 췌장암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 스트립의 제작 및 분석
다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체를 포함한 췌장암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-1: 샘플패드의 제작
셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여 샘플패드(2)로 사용하였다.
실시예 3-2: 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체와 금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작
혈액시료내의 췌장암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 전기 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체간의 면역 반응이 일어나는 부분으로, 유리섬유(GF) 필터(2) 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체가 일시 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 전기 염화금 용액에 항-성장호르몬 방출 호르몬 수용체, 항-크리스탈린 베타 B3, 항-케라틴 14, 항-헤파린 결합 성장인자 결합 단백질 다클론항체를 각각 10㎍/㎖되게 부착시키고 PEG(polyethylene glycol) 용액으로 금입자를 안정화시켰다. 한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분을 한 다음, 전기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.
실시예 3-3: NC 막의 제조
NC 막(nictrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자른 후, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하고, 상기 대조라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 전기 췌장암 특이적 항원의 검출결과 판정라인으로서 본 발명에 포함된 항-성장호르몬 방출 호르몬 수용체, 항-크리스탈린 베타 B3, 항-케라틴 14, 항-헤파린 결합 성장인자 결합 단백질 다클론항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인과 검출결과 판정라인이 구비된 NC 막(4)을 제조하였다.
실시예 3-4: 흡수(absorbent)패드의 제조
흡수패드(7)는 면역 반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.
실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹
각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7)위에 전기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 전기 실시예 3-2에서 제작한 항-성장호르몬 방출 호르몬 수용체, 항-크리스탈린 베타 B3, 항-케라틴 14, 항-헤파린 결합 성장인자 결합 단백질 다클론항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결한 다음, 전기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 전기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 췌장암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석
정상인 5명, 대장암 환자 7명, 췌장암 환자 5명, 난소암 환자 4명, 뇌암 환자 3명으로부터 혈액을 채취한 다음, 전기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.
그 결과, 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀의 경우 췌장암 환자에게서만 특이적으로 검출되었다.
실시예 4: 췌장암 진단용 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA) 키트의 제작 및 분석
실시예 4-1: 췌장암 진단용 효소면역분석용 플레이트 제작
전기 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체를 1:50(v/v)의 농도로 각각 흡착용 코팅 완충용액(Na2CO3 0.188%(w/v), NaHCO3 0.271%(w/v), NaCl 0.731%(w/v), pH 9.6)에 희석한 다음, 효소면역분석용 플레이트(Nunc, USA)에 각각 50㎕/웰씩 분주하여, 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 전기 코팅된 플레이트는 PBS로 3회 세척 후, 비특이적인 결합을 차단하기 위해 차단 완충용액(3%(w/v) BSA, 0.05%(v/v) Tween 20 in PBS)로 상온에서 1시간 처리한 다음, 건조하여 밀봉하여 4℃의 조건으로 암소에서 사용할 때까지 보관하였다.
실시예 4-2: 혈액시료의 처리 및 분석
전기 코팅된 플레이트에 전기 암환자 및 정상인의 혈액시료를 각 웰당 200㎕씩 처리하고, 실온에서 1시간 천천히 흔들면서 결합반응을 시킨 다음, PBST로 5회 세척하였다. 이어, PBST에 1:200(v/v)으로 희석된 전기 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체를 각각 전기 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체가 각각 코팅된 웰에 50㎕씩 분주하고, 상온에서 2시간 처리한 다음, PBST로 세차례 세척을 하고, 차단 완충용액으로 1시간 동안 상온에서 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 이어, 세척을 두 번 더 수행하고, HRP(horse raddish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 차단 완충용액에 1:400(v/v)의 농도로 희석한 다음, 전기 항체를 처리한 웰에 각각 분주하고 상온에서 2시간 동안 천천히 흔들어주며 결합반응을 시켰다. 그런 다음, PBST로 4회 세척하고, 발색제 TMB(tetramethyl benzidine, Sigma, USA)를 제조사의 농도대로 첨가하여 발색시킨 후, 1.25M 황산 용액을 첨가하여 정지시켰다. 이어, 발색이 정지된 플레이트의 발색정도를 마이크로플레이트 판독기(Model 680 Microplate Reader, Biorad, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다(참조: 표 2).
정상인 및 각종암 환자의 혈액시료에 대한 효소면역분석 결과
암특이적 항원 정상인 췌장암 대장암 난소암 뇌암
마트릴린 3 0.081±0.016 0.254±0.039 0.076±0.021 0.077±0.024 0.092±0.031
트랜스티레틴 0.025±0.008 0.102±0.007 0.028±0.010 0.031±0.008 0.029±0.009
리포칼린 2 0.067±0.017 0.156±0.034 0.071±0.028 0.065±0.013 0.074±0.029
스트라티핀 0.055±0.011 0.136±0.032 0.061±0.019 0.054±0.012 0.061±0.013
상기 표 2에서 보듯이, 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀의 경우 정상인 및 다른 암환자에서 수득한 혈청에서의 흡광도보다 췌장암 환자에서 수득한 혈청에서의 흡광도가 두 배 이상 높게 나왔으므로, 효소면역분석을 통해 췌장암 발병여부를 판정할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 단백질 칩의 제작 및 분석
실시예 5-1: 단백질 칩의 제작
전기 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다.
먼저, 전기 항체들을 부착시키기 전에, 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리 하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 전기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 전기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 전기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였다. 그런 다음, 전기 항체들이 배열된 전기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 전기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.
실시예 5-2: 단백질 칩을 이용한 정상인 및 각종 암환자의 혈청분석
전기 실시예 5-1에서 제조된 단백질 칩을 전기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 전기 실시예 3-6에서 수득한 정상인 및 각종 암환자의 혈액시료를 각각 전기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 전기 세척된 단백질 칩을 전기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-마트릴린 3, 항-트랜스티레틴, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체를 전기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 전기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 전기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 전기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 전기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 3).
정상인 및 각종 암환자의 혈액시료에 대한 형광발색반응 측정
암특이적 항원 항체의 농도(v/v) 정상인 췌장암 대장암 난소암 뇌암
마트릴린 3 1:50 112.2 352.1 105.1 122.1 98.1
1:100 92.1 311.4 91.3 103.2 83.4
1:200 72.4 234.2 71.3 82.4 68.4
1:400 52.3 142.1 42.1 56.3 56.5
트랜스티레틴 1:50 31.1 68.1 29.6 33.7 33.1
1:100 27.1 58.1 22.1 26.5 27.2
1:200 18.2 32.3 16.5 18.2 19.1
1:400 10.2 18.3 13.5 12.5 13.1
리포칼린 2 1:50 102.4 234.5 106.5 98.3 86.1
1:100 84.1 201.5 86.3 83.1 74.1
1:200 62.3 163.3 64.2 74.1 62.3
1:400 48.1 91.3 52.1 56.3 46.3
스트라티핀 1:50 93.5 212.4 104.2 100.5 97.3
1:100 83.5 195.3 90.6 93.2 85.2
1:200 64.3 154.4 71.3 75.3 68.2
1:400 52.1 104.5 62.2 61.2 53.4
표 3에서 보듯이, 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀의 경우, 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 농도를 1:200(v/v) 이상으로 희석하여 점적하였을 때, 췌장암 환자의 혈액시료에서의 형광발색 정도가 정상인 또는 다른 암환자의 혈액시료에서의 형광발색정도보다 두 배 이상을 기록하였다. 그러나, 트랜스티레틴의 경우 항체의 농도를 1:100(v/v) 이상으로 희석하여 점적하였을 때, 췌장암 환자의 혈액시료에서의 형광발색 정도가 정상인 또는 다른 암환자의 혈액시료에서의 형광발색정도보다 두 배 이상 기록하여, 사용된 항체의 농도를 높일 경우, 췌장암 특이적 표지로서 기능할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석
전기 실시예 5-2의 결과를 토대로, 항-마트릴린 3, 항-리포칼린 2 및 항-스트라티핀 다클론항체의 농도를 1:200(v/v)으로 희석하고, 항-트랜스티레틴 다클론항체의 농도를 1:100(v/v)으로 희석하여 폴리-L-리신이 코팅된 슬라이드 글라스에 각각 점적하여 단백질 칩을 제작하고, 여기에 췌장암 내시경 촬영결과 폴립이 발견된 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 떨어뜨린 점을 제외하고는, 전기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 전기 단백질 칩의 형광발색정도를 측정하고, 분위수-표준화를 통하여 분석하였다(참조: 표 4). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.
단백질칩을 이용한 피검자에 대한 췌장암 진단
실험군 마트릴린 3 리포칼린 2 스트라티핀 트랜스티레틴
대조군 72.5 65.1 59.3 28.1
1 74.2 63.1 63.3 26.2
2 78.5 67.4 57.3 25.1
3 73.1 64.2 64.5 26.3
4 82.4 71.5 67.3 29.1
5 84.1 72.4 63.2 30.2
6 313.1 165.3 156.3 59.1
7 81.4 69.2 57.3 26.3
8 78.5 64.1 65.3 25.4
9 73.1 68.2 62.3 29.1
10 75.3 70.4 71.2 22.6
11 295.5 172.5 161.3 45.1
12 74.1 67.3 66.3 25.3
표 4에서 보듯이, 2명의 혈액시료(실험군 6 및 11)에서는 마트릴린 3, 트랜스티레틴, 리포칼린 2 및 스트라티핀에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀 검사를 수행한 결과, 두 명 모두 췌장암 환자임이 판명되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 췌장암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 췌장암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 췌장암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 췌장암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (11)

  1. (ⅰ) 항-마트릴린 3 항체(anti-matrilin 3 antibody), 항-트랜스티레틴 항체(anti-transthyretin antibody), 항-리포칼린 2 항체(anti-lipocalin 2 antibody) 및 항-스트라티핀 항체(anti-stratifin antibody)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 4개의 항체; 및,
    (ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 췌장암 진단용 기판.
  2. 제 1항에 있어서,
    고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 기판.
  3. 제 1항에 있어서,
    항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 기판.
  4. 제 1항에 있어서,
    항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 기판.
  5. 제 1항의 췌장암 진단용 기판 및 전기 췌장암 진단용 기판의 항체에 결합한 췌장암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 췌장암 진단용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
  7. 제 5항에 있어서,
    검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호복합체인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
  8. 제 7항에 있어서,
    신호복합체는 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
  10. 제 8항에 있어서,
    효소는 HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는
    췌장암 진단용 키트.
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