KR100661931B1

KR100661931B1 - 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법및 이를 이용한 진단키트

Info

Publication number: KR100661931B1
Application number: KR1020040075982A
Authority: KR
Inventors: 고정헌; 조은위; 김용삼; 황수영; 오세정; 유종신; 김남순
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2006-12-28
Also published as: KR20060027135A

Abstract

본 발명은 암 발생 및 전이시 당쇄 변화를 나타내는 단백질인 트랜스페린(transferrin)을 이용하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로서, 구체적으로 트랜스페린의 N-연결형 당쇄인 β1,6-N-아세틸글루코사민의 첨가 유무를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단방법 및 진단키트는 기존의 암 진단 방법에 비하여 정확하고 간편하므로, 한국인에 많은 위암을 비롯하여 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암 등의 여러 가지 암을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트{A method for the diagnosis of cancers by measuring the changes of glycosylation of transferrin and the diagnosis kit using the same}

도 1은 6개의 당 전이 효소와 이들이 촉매하여 얻어지는 N-연결형 당쇄들을 나타낸 모식도이고,

도 2는 당 전이 효소 GnT-V에 의하여 β1,6 N-아세틸글루코사민(GlcNAcβ1)이 부가되는 반응을 나타낸 것이고,

도 3은 정상인 혈청(N, normal)과 위암 환자 혈청(T, tumor)에서 당단백질만을 모아 2차원 전기영동을 실시한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색한 것이고(①, ②는 각 혈청 시료가 유래된 환자),

도 4는 정상인 혈청과 위암 환자 혈청에서 당단백질만을 모아 2차원 전기영동을 실시한 후, 렉틴 블럿팅을 한 것이고,

도 5는 트랜스페린에 대하여 각 시료의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색과 렉틴 블럿팅을 비교한 것이고(①, ②는 각 혈청 시료가 유래된 환자),

도 6은 햅토글로빈(haptoglobin)에 대하여 각 시료의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색과 렉틴 블럿팅을 비교한 것이고(①, ②, ③은 각 혈청 시료가 유래된 환 자),

도 7은 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF(Quadrupole Time of Flight)를 이용하여 트랜스페린 아미노산 서열을 분석한 것이고,

도 8은 트랜스페린 항체를 이용한 진단키트의 원리를 보여주는 모식도이고,

도 9는 트랜스페린 항체를 이용한 진단키트를 이용하여 사람이나 마우스의 혈청에 대하여 암 발생 여부를 검사한 것이다.

1, 2 : 정상 혈청

3, 4, 5, 6 : 암 환자 혈청

본 발명은 암 발생 및 전이시 당쇄 변화를 나타내는 단백질인 트랜스페린(transferrin)을 이용하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 트랜스페린의 N-연결형 당쇄인 β1,6-N-아세틸글루코사민의 첨가 유무를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.

단백질 기능을 분석하기 위하여 과거에는 2차원 전기영동 방법을 많이 사용하여 왔으나 최근 들어 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight)와 같은 질량분석기기가 발달하고 N-말단 아미노산 서열을 결정하기가 용이해지면서 포스트 게놈(Post-Genome) 시대의 단백질 기능 분석 방법으로서 ‘단백질체학’으로 정의되는 프로테오믹스(proteomics)가 등장하였다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에서 정지된 한 시점만을 선택하여 분석하므로 복잡한 신호 전달의 결과로 발생하는 암에 관하여 연구하는 데는 한계가 있다.

암 발생과 전이는 새로운 단백질의 생성보다는 신호전달의 결과로서 특정 단백질의 발현이 증가하거나 번역 후 단백질이 변형(post-translational modification)되는 양상으로 나타나는 것이 일반적이다. 특히, 2차원 전기영동 시에 나타나는 단백질들은 대단히 소량이어서 단순 염색만으로는 고도화된 분석이 어려운 실정이다.

이러한 문제점을 해결할 수 있는 것이 렉틴을 이용하여 단백질의 당쇄화(glycosylation)를 분석하는 것인데, 대조군과 비교할 때 전기영동으로는 스팟의 차이를 발견할 수 없는 경우에도 이를 이용하면 둘 사이에 확연히 다른 양상이 나타난다. 프로테오믹스에 대응하여 상기와 같이 당쇄의 변화를 분석하는 것을 글리코믹스(glycomics)라 하며, 이는 이미 진행되고 있는 프로테오믹스의 분석상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 방법으로 여겨지고 있다.

암 발생 및 전이의 과정에서 나타나는 세포 생물학적 변화를 살펴보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질이 암 유전자(oncogene)인 라 스(ras), 라프(raf) 등의 신호를 받아 “잘못된 당질화(aberrant glycosylation)”를 일으키고 이로 인한 당쇄(sugar chain)변화가 세포간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 주어 암 발생 및 전이를 일으킨다(Hakomori and Kannagi, J. Natl. Cancer Inst. 71:231-251, 1983; Feizi, Nature, 314:53-57, 1985). 일단 소포체(ER)에서 당단백질의 기본적인(core) 당쇄가 만들어지고 이어 세포내 당질화 공장인 골지체로 이동하여 세포 내ㆍ외부의 여러 자극과 신호에 따라 여러 당쇄가 부가되는데 잘 알려진 당쇄 가지와 이를 촉매하는 당 전이 효소가 도 1에 나타나 있다. 외부 자극에 의하여 특정 암유전자인 라스(ras)ㆍ라프(raf), 전사인자 이티에스(ets) 등의 신호전달을 거쳐 도 1의 여러 당 전이 효소가 활성화 된다.

당 전이 효소 GnT-V (N-acetylglucosaminyltransferase)는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 공격(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al., Science, 236:582-585, 1987). 일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 ER(endoplasmic reticulum)에서 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 여러 당 전이 효소에 의한 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민은 여섯 종류(I-Ⅵ)의 당 전이 효소가 촉매하여 만들어지며 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민을 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다.

GnT-V 유전자가 결실(knock-out)된 생쥐의 수정란 줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)의 세포주를 만들어, 상기 세포주에 폴리오마바이러스 (polyomavirus)의 중간(middle) T 항원(이하 “PyMT”라 칭함) 바이러스성 암유전자를 도입하여 암을 유발시켰다. 그 결과 정상 생쥐에 PyMT를 과발현시킨 것에 비하여 GnT-V 유전자가 결실된 생쥐에 PyMT를 과발현시킨 것이 암 발생과 전이가 크게 억제됨을 확인하였다(Granovsky et al. Nature Med., 6:306-312, 2000).

또한, 최근의 연구에서 33가지 유형의 검증된 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직에 대하여 GnT-V의 활성을 분석한 결과 정상조직에 비하여 50배, 암 주변 조직에 비하여는 4배의 높은 효소 활성이 관찰되었고(Yao et al., J Cancer Res. Clin. Oncol., 124:27-30, 1998) 동물 내에서 β1,6의 가지화가 일어나면 쥐 유방암의 전이가 활성화 된다는 것이 보고되었다.

GnT-V와 암 발생 및 전이가 밀접한 관련을 맺고 있는 것으로 알려진 만큼 GnT-V의 목표 단백질, 즉 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지가 첨가되는 단백질에 관한 연구 또한 활발해지고 있다. 세포 표면 단백질인 gp130(glycoprotein 130)도 GnT-V의 목표 단백질 중의 하나인데, β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄 가지가 이 단백질에 부가되면 암 전이가 활발해진다는 것이 이미 밝혀져 있고 그 외에도 GnT-V의 목표 단백질이 다수 존재할 것으로 여겨지고 있다.

이에, 본 발명자들은 프로테오믹스 기법을 이용하여 암 발생과 전이 시에 당쇄 변화를 보여주는 단백질을 찾아낸 결과, 이 단백질이 트랜스페린임을 확인하고 상기 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 암 발생 및 전이를 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 발생 및 전이시 당쇄 변화를 나타내는 단백질인 트랜스페린(transferrin)을 이용하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 진단키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

상기에서 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 모든 종류의 암이 포함될 수 있다.

세포막 표면에 존재하는 당단백질이나 당지질이 암 유전자 등의 신호를 받아 “잘못된 당질화(aberrant glycosylation)”를 일으키고 이로 인한 당쇄(sugar chain)변화가 세포간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 주어 암 발생 및 전이가 나타난다. 당단백질은 ER(endoplasmic reticulum)에서 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민은 여섯 종류(I-Ⅵ)의 당 전이 효소가 촉매하여 만들어지며 이중 GnT-V에 의해 만들어지는 β1,6-N-아세틸글루코사민이 암의 발생과 전이에 가장 많이 관련되어 있다고 알려져 있다.

본 발명자들은 암 발생과 전이시에 당쇄변화를 보여주는 당백질을 찾아낸 결과 상기 단백질이 혈청속에 흡수된 2 분자의 3가 철이온(Fe³⁺)과 결합하여 세포 증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 수용체 매개 하에 세포내로 공급하는 분자량 약 75,000의 트랜스페린임을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 한국인에 많은 위암 환자의 혈액에서 혈청을 확보한 후 이에 다량 함유된 알부민, 감마-글로불린을 제거하고 LCA(Lens Culinaris Agglutinin)-아가로스(agarose) 컬럼(SIGMA사)으로 용출된 당단백질만으로 2차원 전기영동을 실시하였다. 이 겔(gel)에 쿠마시 브릴리언트 블루 염색(도 3 참조)과 렉틴 블럿팅(도 4 참조)을 수행하여 당쇄 변화를 나타내는 단백질을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).

구체적으로, 전이된 암세포 배양액에 대하여 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하고, 각각 2 장의 겔을 확보한 후 한 장은 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 다른 한 장은 렉틴 블럿팅을 수행하여, 정상세포에 비하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄 변화를 일으키는 단백질을 선별하였다(도 5 및 도 6 참조). β 1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 렉틴 블럿의 경우 대조군에 비하여 암세포의 경우에 몇 군데에서 진한 강도의 스팟이 나타났는데, 상기 스팟에 해당하는 단백질이 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄 변화를 나타내는 단백질이다. 겔 상에서 이에 해당하는 스팟을 잘라내고, 단백질을 절단한 후 생성된 펩타이드를 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF(Quadrupole Time of Flight) 질량 분석기(Micromass사)를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다(도 7 참조). 상기 확인된 아미노산 서열을 기존의 단백질 데이터베이스와 비교한 결과 상기 당쇄 변화를 일으키는 단백질이 트랜스페린임을 확인하였다.

암 환자의 경우에 트랜스페린 발현량에는 변화가 없는 반면 렉틴의 블럿에서는 당쇄 가지인 β 1,6-N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine)의 첨가로 인해 전체적으로 pH가 염기성 쪽으로 치우치며 그 강도도 세게 나타남을 확인하였다.

따라서, 암 세포와 정상세포에서 당쇄변화의 차이를 나타내는 트랜스페린을 이용하여 상기 단백질의 당쇄 첨가를 측정하여 비교함으로써 암을 진단할 수 있다.

상기 트랜스페린의 당쇄 변화의 측정 방법은 ELISA 등의 면역측정법인 것을 특징으로 한다.

즉, 트랜스페린 항체와 검체시료를 반응시키면 바이오틴으로 표지된 렉틴이 검체시료에 포함된 트랜스페린의 당쇄 가지를 인지하여 결합하게 되고 바이오틴에 특이적인 발색효소나 형광물질 및 발색 기질을 첨가함으로써 트랜스페린-당쇄 가지-렉틴-바이오틴-발색효소 또는 형광물질 순서로 결합되게 된다. 이들이 상호작용하게 되어 그 결과가 흡광도로 나타나게 된다.

이와 같은 원리를 이용한 구체적인 진단방법은,

i) 트랜스페린 항체에 검체 시료를 가하여 흡착시키는 단계;

ⅱ) 단계 i)에 표지된 렉틴을 가하여 결합시키는 단계;

ⅲ) 단계 ⅱ)에 발색효소 또는 형광물질을 가하는 단계;

ⅵ) 단계 ⅲ)에 발색기질을 가하여 발색 반응시키는 단계; 및

Ⅴ) 단계 ⅵ)의 반응액의 흡광도를 측정하여 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 단계 ⅱ)의 표지된 렉틴은 바람직하게는 바이오틴으로 표지된 렉틴이고 보다 바람직하게는 바이오틴으로 표지된 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemaggl utinin)일 수 있다.

렉틴은(lectin)은 식물 단백질군에 속하고, 당단백질이나 당지질의 당사슬과 결합하여 세포응집, 분열유발, 기능활성화 등의 효과를 미치는 물질이다. 렉틴의 종류에는 추출 부위 및 렉틴을 추출한 식물에 따라, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin, PHA), 미국자리공 마이토젠(pokeweed mitogen, PWM), 콘카나발린 A(Concanavalin A, Con A) 등이 있으며 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemagglutinin)는 피토헤마글루티닌의 일종으로 네 개의 렉틴이 결합되어 있는 형태이다.

한편, 단계 ⅲ)의 상기 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포 스파타아제(alkaline phosphatase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트는 트랜스페린 항체, 트랜스페린 항체를 접착시키는 기질,표지된 렉틴 및 발색효소 또는 형광물질을 포함한다.

진단키트 내에서 렉틴이 트랜스페린의 당쇄 변화를 탐지하는 원리는 다음과 같다. 진단키트의 기질에 접착된 트랜스페린 항체에 검체 시료를 가하면 검체 시료 내의 트랜스페린이 항체에 결합하고, β 1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지가 첨가되는 당쇄 변화가 일어난 트랜스페린에 렉틴이 결합하게 된다. 여기에 발색효소 또는 형광물질 및 발색기질이 순서대로 결합함으로써 그 결과가 흡광도로 나타나게 된다(도 8 참조).

본 발명의 진단키트의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있는데 기질에 항체를 접착시키기 위해서는 기질 표면이 L-리신 중합체(poly-L-lysine), 아크릴아미드 중합체(poly-arylamine) 또는 알데하이드(aldehyde)로 처리된 상태여야 한다. 본 발명의 진단키트는 표지된 렉틴을 포함하며 상기 렉틴은 바이오틴 (biotin)에 의하여 표지된 바이오틴-표지-렉틴이고 상기 렉틴은 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemagglutinin)임을 특징으로 한다.

진단키트에 포함되는 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 진단키트를 이용하여 사람과 마우스의 정상 혈청과 암 환자의 혈청에서 당쇄 변화된 트랜스페린의 양을 확인한 결과 정상과 암 환자 간에 뚜렷한 차이를 보였으므로, 이를 이용하여 효과적으로 암을 진단할 수 있음을 확인하였다(도 9 참조)

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 당단백질 정제와 2차원 전기영동

본 발명자들은 환자의 혈청으로부터 직접 암의 표지자(marker)를 글라이코믹스(glycomics)를 이용하여 찾아내고자, 정상인의 혈액과 위암환자의 혈액에 대하여 프로테오믹스를 시도하였다. 우선 정상인 혈청을 확보하여 약 3 ml의 혈청에 대하여 20 mM Tris-HCl(pH7.5) 완충용액에 희석한 후 N-연결형 당쇄에서 당쇄의 중심부(core)를 인식하는 렉틴 LCA(Lens Culinaris Agglutinin)가 붙어있는 LCA-아가로스 컬럼(column)(SIGMA사)에 로딩(loading)하였다. 완충용액으로 충분히 씻어주고 280 nm에서 흡광도가 0.03이하가 되었을 때(더 이상 단백질이 흘러나오지 않을때) 0.4 M의 메틸 만노사이드(mannoside)를 가하여 당단백질을 용출시켰다. 이 용액을 밤새 투석하여 메틸 만노사이드를 제거한 후, TCA(trichloroacetic acid)를 포함하는 아세톤을 최종 10%가 되도록 가하여 단백질만을 침전시켰다. 아세톤으로 3회 이상 씻어 잔류 TCA를 제거하고 말린 다음 겔 로딩 완충용액(8 M Urea, 2% Triton X-100, 20 mM DTT, 0.5% carrier ampholyte, Bromophenol Blue dye)을 가하여 녹인 후, 1차원 전기영동 장치(Multiphor-II, Pharmarcia사)를 이용하여 전기영동을 실시하였다(13 cm drystrip pH 3-10). 상기 전개된 1차원 전기영동 겔을 SDS와 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 평형 완충용액으로 평형화시킨 후 2차원 전기영동 장치(Protean Ⅱ, Bio-Rad사)를 이용하여 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 2차원 전기영동을 실시하였다. 전기 영동이 완료된 2장의 겔을 확보한 후 한 장은 바이오세이프(Biosafe, Bio-Rad사) 염색액을 이용하여 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) 염색하였다(도 3). 정상 혈청과의 직접적인 비교를 위하여 위암 환자의 혈청도 동일 조건에서 1차원(등전점 분리) 전기영동을 시도하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다(도 3). 3회 이상의 2차원 전기영동을 시도하고 단백질 양의 변화를 소프트웨어(PDQUEST, Bio-Rad사)를 이용하여 분석한 결 과, 단백질의 발현 양상에서 확연한(2배 이상) 차이를 보여주는 단백질은 나타나지 않았다.

<실험예 2> 혈청 유래의 당단백질에 대한 렉틴 블럿팅

앞선 2 차원 전기영동의 염색 결과에서는 당단백질의 발현량의 차이를 보이지 않는 것으로 나타났으므로, 상기 당단백질의 당쇄 변화를 확인하기 위하여 렉틴 블럿팅을 시도하였다. 동일한 조건으로 전개된 또 다른 한 장의 젤은 반-건조 이동장치(Semi-Dry transfer, Bio-Rad사)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. β 1,6 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine) 당쇄 가지를 인식하는 바이오틴(Biotin) 표지된 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemagglutinin) 렉틴을 가하여, 상기 당쇄 가지를 지닌 당단백질에 붙도록 한 후 HRP-표지된 스트렙토아비딘(streptoavidin)을 붙이고 ECL 형광 반응을 이용하여 필름에 감광시켰다(도 4). 도 5의 스팟 1은 위암 환자 혈청의 경우 L₄-PHA 블럿에서 더 진하고 염기성 쪽으로 치우쳐 나타났다. 이는 당전이 효소 GnT-V에 의하여 폴리-락토오스아민(poly-lactosamine)이 형성되면서 말단에 존재하는 전체 사이알릭산(sialic acid)의 함량이 줄어든 결과로 보인다(Handerson T. and Pawelek J. M., cancer research 63: 5363-5369, 2003). 한편 대조구인 도 6의 햅토글로빈(haptoglobin)의 경우 암 환자나 정상인이나 별다른 차이를 나타내지 않았다.

<실험예 3> ESI/Q-TOF 질량 분석기를 이용한 단백질의 서열분석

본 발명자들은 <실험예 2>에서 선별한 스팟의 단백질을 동정하기 위하여, <실험예 2>에서 렉틴 블럿을 실시한 PVDF 막을 다시 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하였다. 이를 <실험예 2>의 감광된 필름에 붙여 스팟의 정확한 위치를 확인한 후 처음부터 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색된 겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내었다. 30%의 메탄올과 100% 아세토나이트릴(acetonitrile) 을 이용하여 탈색한 후 10 U의 트립신(trypsin, Promega사)을 가하여 37℃에서 하룻밤 동안 절단하였다. 상기 절단된 펩타이드를 아세토나이트릴로 추출한 후 원심 동결 건조기로 건조하고 ESI/Q-TOF(Electrospray Ionization/Quadrupole Time of Flight) 질량 분석기(Micromass사)로 아미노산 서열을 결정하였다(도 7).

그 결과, ESI/Q-TOF에 의하여 서열번호 1로 표시되는 펩타이드 서열이 결정되었고, 단백질의 데이타베이스와 비교하여 상기 서열이 트랜스페린 임을 확인하였다.

<실시예 1> 본 발명의 진단키트 및 진단방법을 이용한 암 진단

우선 상용화된 트랜스페린의 항체(Santacruz사)를 구입한 후 ELISA 전용 플레이트에 15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, 0.2 g/ℓ NaN₃(pH9.6)으로 구성된 카보네이트(carbonate) 완충용액으로 4℃에서 밤새 붙이고, 최종 농도가 10 mg/ml가 되도록 소 혈청 알부민으로 블로킹한 후 정상인이나 환자의 혈청을 희석(1/100, 1/400, 전 체 100 μl)하여 37℃에서 트랜스페린 항체에 붙였다. 이어 0.15 M NaCl과 0.05% Tween-20을 포함하는 10 mM Tris-HCl, pH7.4 (이하 TBS-T)로 세 번 이상 세척하고, 바이오틴(biotin)이 표지된 L₄-PHA를 가하여 반응시켰다. 그 후 TBS-T로 세척하고 페록시다아제(peroxidase)가 연결되어 있는 아비딘(avidine)을 가한 후 기질인 OPD(o-phenylenediamine)와 과산화수소를 넣어 발색시켰다. 상기 발색 반응을 황산 용액을 가하여 종결시키고 492 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 8). 그 결과, 사람, 마우스 모두에서 정상 혈청과 암이 형성된 혈청의 흡광도 차이가 유의하게 나타남으로써(도 9 참조) 본 발명의 진탄키트를 이용하여 암을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질인 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단키트는 기존의 암 진단 방법에 비하여 정확하고 간편하므로 한국인에 많은 위암을 비롯하여 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암 등의 여러 가지 암을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

i) 트랜스페린의 항체에 검체 시료를 가하여 흡착시키는 단계;

ⅱ) 단계 i)에 바이오틴으로 표지된 렉틴을 가하여 결합시키는 단계;

ⅲ) 단계 ⅱ)에 스트렙타비딘-결합된 발색효소 또는 형광물질을 가하는 단계;

ⅳ) a) 단계 ⅲ)에서 스트렙타비딘-결합된 발색효소를 사용한 경우에는 발색 기질을 가하여 발색반응을 시킨 후 반응액의 흡광도를 측정하는 단계, 또는

b) 단계 ⅲ)에서 스트렙타비딘-결합된 형광물질을 사용한 경우에는 형광을 측정하는 단계; 및

ⅴ) 단계 ⅵ)의 흡광도 또는 형광을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스페린의 당쇄변화를 측정하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 당쇄 변화는 트랜스페린의 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine) 첨가인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 당쇄 변화의 측정 방법은 면역측정법인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
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제 4항에 있어서, 단계 ⅱ)의 바이오틴 표지된 렉틴은 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemagglutinin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 단계 ⅲ)의 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)로 구성된 군으로부터 선택되고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), TRITC(tetramethylrhodamine isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
트랜스페린에 대한 항체, 항체를 접착시키는 기질, 바이오틴 표지된 렉틴 및 스트렙타비딘-결합된 형광물질을 포함하는 암 진단키트.
트랜스페린에 대한 항체, 항체를 접착시키는 기질, 바이오틴 표지된 렉틴, 스트렙타비딘-결합된 발색효소 및 발색기질을 포함하는 암 진단키트.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 진단키트의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 표지된 렉틴은 바이오틴(biotin)에 의하여 표지된 바이오틴-표지-렉틴인 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 바이오틴 표지된 렉틴은 L₄-PHA(leukoagglutinating phytohemagglu tinin)인 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 8항에 있어서, 상기 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 TRITC(tetramethylrhodamine)인 것을 특징으로 하는 진단키트.
제 9항에 있어서, 상기 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase) 또는 알칼라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 진단키트.