KR20110042694A

KR20110042694A - 염화메틸렌 독성 중독 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR20110042694A
Application number: KR1020090099484A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 박슬기; 류재천; 남석우
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2011-04-27
Also published as: KR101395918B1

Abstract

본 발명은 염화메틸렌 중독을 진단하는 바이오마커 단백질에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 정상세포와 비교할 때 염화메틸렌 노출 시험군에서 그 발현이 현저히 증가하거나 현저히 감소하는 단백질 바이오마커와 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.

염화메틸렌, 바이오마커, 독성, 중독

Description

염화메틸렌 독성 중독 진단용 바이오마커{Biomarkers for diagnosing the addiction of dichloromethylene}

염화메틸렌(Dichloromethylene)은 휘발성 유기화합물(Volatile organic compounds)의 일종으로서 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride), 메틸렌 다이클로라이드(Methylene dichloride), 이염화메틸렌이라고도 불리며, 화학식은 CH₂Cl₂이고 분자량은 84.93인 무색 휘발성 액체이다. 흡입시 유독하고 대부분의 유기용제에 용해되며 유기화합물의 화학공정에서 이용되는 용매이다. 불연성이고, 비중은 1.336(20℃), 융점은 -96℃, 비점은 40.2℃, 굴절률은 1.4216이며 벤젠, 에탄올, 에테르, 클로로포름, 이황화탄소와 혼화된다. 염화메틸렌을 염소화하거나 클로로포름을 아연과 아세트산으로 환원하면 얻어지는 화합물로 클로로포름과 비슷한 냄새 가 나며, 예전에는 에틸렌글리콜과 다황화물 고무를 만드는 원료와 용매로 중요하게 쓰였으나, 오늘날에는 주로 염화비닐 제조 및 가솔린의 노킹방지제인 시에틸납의 성분으로 사용된다.

염화메틸렌은 페인트의 논리제, 프린트 기판세정제, 금속탈지세척제, 우레탄발포조제, 에어졸분사제, 저비점용 유기용제(불연성필름, 유지, 알카로이드, 수지, 고무, 왁스, 셀룰로즈에스테르 및 에테르용 혼합제), 폴리카보네이트의 반응용매, 냉매, 래카용, 직물 및 피혁, 분석용, 리놀륨, 잉크, 소화제 등에 사용된다. 또 식품산업에도 이용되는데 커피에 카페인을 제거하고 홉 및 기타 식물에서 추출물을 얻어 조미료를 생산할 때 이용된다.

높은 휘발성을 갖는 염화메틸렌은 건강 위해요소가 포함되어 급성 흡입 위험이 있고 일산화탄소의 물질대사로 인해 일산화탄소 중독을 일으킨다. 장기간 피부에 접촉하게 되면 일부 피부 지방조직에 염화메틸렌이 용해되어 피부자극 또는 화학적 열상이 나타나게 된다. 실험동물의 간암, 폐암, 췌장암과 연계되어 있어 발암 물질로 예상되며, 임신 기간 동안 노출되었을 경우 염화메틸렌은 태반으로 흡수되어 태아에게 영향을 줄 것으로 예측하였지만 아직 이에 대해 입증되지 않았다. 동물실험에서 태아독성이 나타났지만 기형을 유발을 하지 않았다. IARC(International Agency for Research on Cancer)에서는 염화메틸렌을 사람에게 발암 가능성이 있는 그룹 2B로 구분하였다.

본 발명은 특이도가 높은 염화메틸렌 중독 진단용 바이오마커를 제공하려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 2차원 전기영동기술을 이용하여 정상 대조군 세포와 비교하여 염화메틸렌 처리 시험군에서 그 발현이 현저히 높아지거나 또는 현저히 낮아지는 단백질을 선별하여 이를 염화메틸렌 중독을 진단하는 용도로 이용할 수 있음을 밝혀내어 이를 이용한 진단용 키트를 발명하기에 이르렀다.

본 발명에 의한 염화메틸렌 중독 진단용 바이오마커는 7개의 단백질 중 1종 이상 단백질의 발현량 변화를 탐지함으로써 염화메틸렌 중독 여부를 민감하고 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명은 정상세포와 비교할 때 염화메틸렌 노출 시험군에서 그 발현이 현저히 증가하거나 현저히 감소하는 단백질 바이오마커 또는 그 면역원성 단편을 제공한다.

상기 단백질 바이오마커는 분자량 약 26kD, pI 8.6인 글루타치온 트랜스퍼라제 돌연변이 Y115f의 A 체인(Chain A, glutathione transferase mutant Y115f), 분 자량 약 25kD, pI 9.1인 미토콘드리아 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, mitochondrial), 분자량 약 26kD, pI 8.9인 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2), 분자량 약 16kD, pI 8인 베타 1-글로빈(beta 1 globin), 분자량 약 16kD, pI 9인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit) 및 분자량 약17kD, pI 5.4인 알파-2u 글로불린(alpha-2u globulin) 중 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

상기 면역원성 단편은 외부 숙주에 주입하였을 때 반응성 항체를 생산할 수 있는 상기 단백질 중 일부를 말하는 것이다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질 또는 그 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 본 발명의 항체는 종래 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명은 정상 대조군과 비교하여 상기 바이오마커 단백질 양의 증가 또는 감소로 염화메틸렌 중독을 진단하는 것을 특징으로 하는 진단 키트를 제공한다. 상기 키트에는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트가 포함된다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 바이오마커 검출을 통한 염화메틸렌 중독 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 마커 검출방법은

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 상기 1종 이상의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "마커"는 염화메틸렌 중독 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 상기 바이오마커 단백질에 대한 폴리펩타이드 마커일 수 있으며, 이들 마커들은 정상 세포에 비해 염화메틸렌 중독 세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 특징을 나타낸다.

본 발명에서 "진단"은 염화메틸렌 중독 상태의 중독 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

생물학적 시료 중의 바이오마커 단백질 발현량의 증대 또는 감소는 단백질 양을 확인함으로써 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"란 바이오마커 단백질 수준의 차이를 검출할 수 있는 조직, 세포 등으로 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "단백질 수준 측정"이란 생물학적 시료에서 염화메틸렌 중독 세포에서 발현 증가 또는 감소한 상기 바이오마커 단백질의 발현 정도를 확인하는 과 정으로서 바람직하게는 상기 바이오마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다.

"항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 항체는 상기 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하는 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오크털로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로켓 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석(Immunoprecipitation), 보체고정분석(Complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 기재된 방법으로 제한되는 것은 아니다.

위와 같은 분석방법을 통하여 정상 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 염화메틸렌 중독 의심환자의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 바이오마커 단백질의 유의한 발현량 증가 여부를 판단하여 의심환자의 실제 중독 여부를 진단할 수 있다.

"항원-항체 복합체"란 상기 바이오마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으며, 상기 기재된 범위로 제한되지 않는다. 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있고, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 발광물질로는 루시페린 등이 있고, 이에 제한되지는 않는다. 미소입자로는 콜로이드 금 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 방사선 동위원소에는 ³H,¹⁴C 등이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는 ELISA를 이용한다. ELISA로는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 좀더 바람직하게는 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나, 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 상기 바이오마커 단백질과 항체 의 복합체 형성 정도를 확인하여 염화메틸렌 중독 여부를 확인할 수 있는 것이다.

또 다른 방법으로 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜 항원-항체 복합체를 형성시키고 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 중독 여부를 확인할 수 있다.

또 다른 방법으로 바이오마커에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이것을 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인함으로써 중독 여부를 확인할 수 있다.

위와 같은 검출방법들은 정상 대조군의 바이오마커 단백질 발현량과 염화메틸렌 중독 세포에서의 마커 단백질의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. 단백질의 수준은 바이오마커 단백질의 절대적 또는 상대적 차이로 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 염화메틸렌 중독 진단 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 7종의 바이오마커 단백질이 염화메틸렌 중독 마커로 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 바에 따라, 폴리클론 항체는 상기 바이오마커 단백질 항원을 동물에 주사하여 동물로부 터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 얻는다. 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용하여 제조할 수 있다. 모노클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler & Milstein(1976) European J. Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법은 바이오마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 다른 하나는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 종류의 세포들을 폴리에틸렌글라이콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로 융합시킨 후 항체생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후 바이오마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양한다.

파지 항체 라이브러리 방법은 바이오마커 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 바이오마커 단백질과 결합하는 모노클론 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명의 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, F(ab)₂ 및 Fv 등이 있다.

바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 본 발명의 진단 키트는 바람직하게는 ELISA용 진단키트로서, 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있으며, 그 밖에도 항원-항체 복합체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

<단백질 추출>

프로테옴 분석을 위해서 옥수수 오일(corn oil)로 처리한 정상군, 1/10 LD₅₀(160mg/kg)과1/2 LD₅₀(800mg/kg)의 염화메틸렌으로 72시간 동안 처리한 랫트로부터 간 조직을 분리하여 균질기로 파쇄한 후, 7M 우레아, 2M 티오우레아, 4.5% CHAPS{3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonic acid}, 100mM DTE(dithioerythritol)가 포함되어 있는 40mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.8)에서 한 번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 15℃, 12,000xg에서 50분 동안 원심분리한 뒤 얻어진 상등액을 사용하였다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

<등전점 전기영동>

정상 대조군과 실험군의 랫트 간 조직에서 분리한 총 단백질은 1mg이 되게 하였고, 450㎕의 재수화(rehydration) 용액{7M 우레아, 2M 티오우레아, 4.5% CHAPS, 0.25% 양쪽성 물질(ampholytes), 100mM DTE}을 사용하여 단백질을 녹였다. 450㎕의 재수화 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG 홀더에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 24cm 고정 건조 스트립(pH 3-10 NL, GE Healthcare Bio-Science)를 이용하여 18시간 동안 재수화시켰다. 200V/200Vhrs, 500V/500Vhrs, 1,000V/1,000 Vhrs, 8,000V/13,500Vhrs, 8,000V/100,000Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

<평형화>

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1차 평형화 완충용액(6M 우레아, 0.375 M Tris-HCl(pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아마이드, 2mM TBP)에서 각각 20분간 1차 평형화를 실시한 후, 2차 평형화 완충용액(6M 우레아, 0.375M Tris-HCl(pH 8.8), 20% 글리세롤, 2% SDS, 25% 아크릴아마이드, 2mM TBP)에서 20분간 2 차 평형화를 실시하였다.

<SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동>

9% - 16% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 0.5% 아그로즈 겔로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 2시간 동안 겔당 5mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 10시간 동안 겔당 18mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

<겔 염색 및 탈색>

전개가 끝난 겔을 쿠마시 블루 G-250 염색 용액(34% 메탄올, 0.1% 쿠마시G-250, 17% 황산 암모늄, 3% 인산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12시간 이상 염색한 후 1% 아세트산을 이용하여 탈색하였다.

<겔 이미지 분석>

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 ImageMaster 2D Platinum 6.0 (2D 소프트웨어, GE Healthcare Bio-Science)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3장의 겔을 분석하였다.

<나노 LC-MS/MS 분석>

나노 LC-MS/MS 분석을 위해 각 스팟을 트립신으로 인-젤 다이제스천(in-gel digestion)한 후, 스팟들의 펩타이드들을 agilent 110 Series 나노 LC와 LTQ-mass spectrometer(Thermo Electron, San Jose, CA)로 분석하였다. LC-MS./MS 분석에 사용된 모세관 컬럼 (150mm×0.075mm)은 Proxeon(Odense M, Denmark)에서 구입하였으며, 슬러리는 5㎛, 100Å 포어 사이즈 Magic C18 정지상(Michrom Bioresources, Auburn, CA)으로 패킹하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유하는 증류수였고, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유하는 아세토나이트릴이었다. 크로마토그래피 경사는 50분간 5% B에서 35% B 직선증가와 20분간 40% B에서 60% B의 직선증가, 5분간 60% B에서 80% B 직선증가하는 것으로 셋업하였다. 유속은 분리(splitting) 분당 300㎖를 유지하였다. 매스 스펙트럼은 MS/MS 스캔 후 전체 매스 스캔으로 얻은 데이터(data-dependent acquisition with full mass scan: 400-1800m/z)로 얻었다. 얻어진 각각 MS/MS 스캔은 LTQ에서 1 마이크로스캔(microscans)의 평균이었다. 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 200℃로 맞추어졌으며, 스프레이는 1.5.0-2.0 kV였다. 정상화된 콜리전(collision) 에너지는 MS/MS에 대해 35%로 맞추어졌다. Sequest 소프트웨어가 펩타이드 서열을 동정하기 위해 사용되어졌다. 신뢰성 높은 결과를 얻기 위해 delatCn ≥ 0.1과 Rsp ≤ 4의 조건을 적용하였고, Xcorr의 경우, Charge state 1+에서는 Xcorr ≥ 1.5를 적용하였고, charge state 2+에서는 Xcorr ≥ 2.0, charge state 3+에서는 Xcorr ≥ 2.5를 적용하였으며, 펩티드 확률(peptide probability) > 0.1을 적용하여 단백질 동정을 확정범위(cutoff)로 사용하였다. 펩타이드들은 메티오닌 잔기에서 다양하게 산화되었 으며, 시스테인에서는 다양하게 카복시아미도메틸레이션(carboxyamidomethylation)과 카복시메틸레이션(carboxymethylation)되었다.

결과

염화메틸렌을 처리한 랫트의 간을 분리하여 프로테옴을 한 결과 정상 대조군에서는 총 1170개의 스팟이 발현되었고, 1/10 LD₅₀ (160mg/kg)의 염화메틸렌을 처리했을 때는 총 1309개, 1/2 LD₅₀ (800 mg/kg)의 염화메틸렌을 처리한 경우 1376개의 스팟을 확인할 수 있었다. 그 중 정상 대조군과 염화메틸렌 처리군의 발현 차이를 보이는 단백질 스팟은 총7개였다(그림 2).

Spot No.	Identified protein	Accession No.	Cov %	pI	M.W	Change
Spot No.	Identified protein	Accession No.	Cov %	pI	M.W	1/10 LD ₅₀	1/2 LD ₅₀
1	Chain A, glutathione transferase mutant Y115f	29726512	47	8.6	25920	↘	↘
2	glutathione S-transferase, mitochondrial	310077128	69	9.13	25493	↘	↘
3	Glutathion S-transferase alpha-2 (Glutathione S-transferase Ya-2) (GST Ya2) (GST 1b-1b) (GST A2-2)	121713	50	8.89	25559	↘	↘
4	beta 1 globin	546056	82	7.98	15834	↘	↘
5	similar to Hemoglobin beta-2 subunit (Hemoglobin beta-2 chain) (Beta-2-globin) (Hemoglobin beta chain, minor-form)	109459168	87	8.91	15982	↘	↘
6	Alpha-2u globulin	204264	46	5.4	17340	↘	↘

스팟 1번인 분자량 약 26kD, pI 8.6의 글루타치온 트랜스퍼라제 돌연변이 Y115f의 A 체인(Chain A, glutathione transferase mutant Y115f), 스팟 2번인 분자량 약 25kD, pI 9.1인 미토콘드리아 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, mitochondrial), 스팟 3번인 분자량 약 26kD, pI 8.9인 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2), 스팟 4번인 분자량 약 16kD, pI 8인 베타 1-글로빈(beta 1 globin), 스팟 5번인 분자량 약 16kD, pI 9인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit) 및 스팟 7번인 분자량 약17kD, pI 5.4인 알파-2u 글로불린(alpha-2u globulin)은 염화메틸렌 농도 의존적으로 단백질 발현이 감소함을 확인할 수 있었다(도 3A).

염화메틸렌 처리시 감소하는 스팟 1번 글루타치온 트랜스퍼라제 돌연변이 Y115f의 A 체인(Chain A, glutathione transferase mutant Y115f), 스팟 2번 미토콘드리아 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, mitochondrial), 스팟 3번 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2)는 환원된 글루타치온과 여러 전기 친화성 물질들 간의 결합을 촉매하여 산화성 세포독성물질이나 발암성 물질에 의해서 유발되는 손상으로부터 세포를 보호하는 기능을 한다. 또한 글루타치온 S 트랜스퍼라제들은 폭넓은 기질특이성을 가지고 있어서 발암 물질, 치료 약물, 환경 독소와 산화 스트레스 등 광범위한 유독성 화학물질들로부터 세포를 보호하기도 한다.

스팟 4번인 베타 1-글로빈(beta 1 globin), 스팟 5번인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit), 스팟 6번인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit)은 헤모글로빈 내의 헴(heme)을 지니며 낫 모양의 혈색소로 산소운반과 결합의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

스팟 7번 알파-2u 글로불린(alpha-2u globulin)은 20kDa의 작은 단백질로 랫트의 간, 하악선, 눈물샘, 포피, 유선에서 발견할 수 있다. 또한, 주요 비뇨기 단백질로 알려져 있으며 리포칼린(lipocalin) 단백질 그룹에 속한다. 호르몬과 복합적으로 조절되고 조직, 나이, 성별에 따라 특이적인 방법으로 발현된다. 이 단백질은 주로 간에서 발현되고 신장과 배설을 통해 혈장으로부터 제거된다. 사람보다 수컷 래트(male rat)가 방광암에 걸릴 확률이 더 높은 이유는 소변 속에 포함되어 있는 알파-2u 글로불린과 알부민의 높은 농도 때문이라는 보고가 있다.

상기 6종의 단백질들이 염화메틸렌 중독의 특이적이고 민감한 바이오마커로 유용하다는 사실은 본 발명에서 최초로 밝혀내었다.

도 1은 염화메틸렌에 의한 단백질 변화를 나타낸 그림이다.

(A): 정상군, (B):1/10 LD₅₀ (160 mg/kg) 염화메틸렌 처리군, (C): 1/2 LD₅₀(800 mg/kg) 염화메틸렌 처리군

도 2는 염화메틸렌에 의한 각 스팟별 단백질 발현 변화를 나타낸 도면이다.

실시예 1: 1/10 LD₅₀ (160 mg/kg) 염화메틸렌 처리군, 실시예 2: 1/2 LD₅₀(800 mg/kg) 염화메틸렌 처리군

Claims

분자량 약 26kD, pI 약 8.6인 글루타치온 트랜스퍼라제 돌연변이 Y115f의 A 체인(Chain A, glutathione transferase mutant Y115f);

분자량 약 25kD, pI 약 9.1인 미토콘드리아 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, mitochondrial);

분자량 약 26kD, pI 약 8.9인 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2);

분자량 약 16kD, pI 약 8인 베타 1-글로빈(beta 1 globin);

분자량 약 16kD, pI 약 9인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit);

및 분자량 약17kD, pI 약 5.4인 알파-2u 글로불린(alpha-2u globulin); 중 선택된 1종 이상의 바이오마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 염화메틸렌 중독 진단키트.
제1항에 있어서,

상기 키트는 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)용 키트인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
분자량 약 26kD, pI 약 8.6인 글루타치온 트랜스퍼라제 돌연변이 Y115f의 A 체인(Chain A, glutathione transferase mutant Y115f);

분자량 약 25kD, pI 약 9.1인 미토콘드리아 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, mitochondrial);

분자량 약 26kD, pI 약 8.9인 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2);

분자량 약 16kD, pI 약 8인 베타 1-글로빈(beta 1 globin);

분자량 약 16kD, pI 약 9인 헤모글로빈 베타-2 서브유닛 유사 단백질(similar to Hemoglobin beta-2 subunit);

및 분자량 약17kD, pI 약 5.4인 알파-2u 글로불린(alpha-2u globulin); 중 선택된 1종 이상의 바이오마커 단백질 또는 그의 면역원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 뇨, 혈액, 혈청 및 혈장 중에서 선택되는 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 염화메틸렌 중독 바이오마커 검출 방법.
제3항에 있어서,

a) 분석할 생물학적 시료를 제공하는 단계;

b) 상기 시료와 상기 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시키는 단계;

c) 항원-항체 복합체를 정량 검출하는 단계; 및

d) 상기 c) 단계 검출 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.