KR101395919B1

KR101395919B1 - 벤조에이피렌 오염 검출을 위한 마커 및 키트

Info

Publication number: KR101395919B1
Application number: KR1020090097322A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 박슬기
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-13
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2014-05-15
Also published as: KR20110040159A

Abstract

벤조에이피렌 오염 마커, 상기 마커를 이용한 벤조에이피렌 오염 여부 진단용 키트, 항원-항체 복합체 형성을 통하여 벤조에이피렌 오염 마커를 검출하는 방법이 개시되며, 이를 이용하면, 효과적으로 벤조에이피렌 오염을 검출할 수 있다.

벤조에이피렌, 오염, 마커, 단백질, 검출, 키트, 항체

Description

벤조에이피렌 오염 검출을 위한 마커 및 키트{Marker and kit for detecting contamination of benzoapyrene}

본 발명은 벤조에이피렌에의 노출 내지는 오염을 검출하기 위한 마커에 관한 것이다. 또한 본 발명은 벤조에이피렌에의 노출 내지는 오염을 검출하는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 벤조에이피렌의 노출 내지는 오염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

벤조에이피렌(Benzo[a]pyrene)은 PAH (Polycyclic aromatic hydrocarbons)의 일종으로 화학식은 C₂₀H₁₂이며 황색의 결정성 물질로 돌연변이원이자 강력한 발암물질이다. 비중 1.24, 융점 179℃, 비점 495℃으로 300~600℃ 가열시 불완전 연소하는 경우 발생한다.

콜타르, 자동차 매연, 담배 연기, 대마초 연기, 나무 훈연, 숯불을 사용한 음식 등에서 발견된다. 공기를 통해 전이되는 특정 물질이 연기와 함께 건조되거나 연기가 나는 중에 식품에 흡수, 누적되어 식품을 오염시킨다. 2001년 미국국립암센터는 바베큐, 스테이크, 닭고기의 껍질 그리고 햄버거 등의 요리에서 높은 수 치의 벤조에이피렌을 발견하였다.

벤조에이피렌을 쥐에 경구투여한 결과 전위와 폐에서 종양이 연속적으로 발생하였고, 생쥐에게 주입했을 때는 식도와 전위, 유선에서 종양이 발견되었다. 또한 림프관 같은 다른 곳에서도 종양이 발견되었다. 임신 중인 쥐에게 경구투여시 자궁 내에 독성이 나타났고, 태아의 기능 장애가 나타났다. 돌연변이 발생이나 뼈가 물러지게 하는 독성도 나타났다.

많은 연구들이 암을 유발하는 대사산물로써 벤조에이피렌의 benzo[a]pyrene-ne-7,8-diol-9.10-oxide (BPDEI)을 연구하는데 이 대사산물이 DNA와 공유 결합하여 단기간 실험에서는 돌연변이나 형질 변환을 나타냈으며, 쥐의 피부에서는 강력한 발암 물질이 발견되었다. 그러나 벤조에이피렌을 쥐와 토끼에게 경구 투여했을 때 DNA와 공유 결합하는 BPDEI의 양이 실험 대상인 조직뿐 아니라 실험 대상에서 제외된 조직에서도 유사한 수치가 나타나는 것으로 보고되었다.

벤조에이피렌은 1933년 콜타르의 구성성분이자 최초의 직업성 암이라고 기록되었으며 이는 18세기 영국의 굴뚝 청소부들에게 음낭암이 발생하게 되면서 대두되었다. 19세기 연료 공장 노동자들의 피부암 발병률이 높았으며, 20세기 초 실험동물에 반복적으로 콜타르를 노출시키자 악성 피부종양이 발생하였고 이 연구 결과로 벤조에이피렌의 독성이 증명되었다.

지난 30년간 수많은 연구진들은 벤조에이피렌과 암의 상관관계에 대해 연구하였다. 하지만 흡입과 섭취 등의 다양한 경로를 통해 벤조에이피렌에 노출되므로 이 물질의 위험성을 예측하고 암과 특정 벤조에이피렌에 대해 원인을 규명하는 것 은 매우 어렵다. 인체 내 벤조에이피렌의 발암 특성에 대한 적합한 증거는 찾지 못했지만 실험동물에서 발암 특성이 나타나며 단기간 발암 실험에서도 나타났다는 점에 주목 할 수 있다. IARC는 벤조에이피렌을 인체 발암성이 있는 group 1로 분류하고 있다.

본 발명의 일실시예의 목적은, 벤조에이피렌 오염 여부를 검출하는 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 벤조에이피렌 오염 여부를 진단하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 벤조에이피렌 오염 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커는, 생체의 벤조에이피렌 오염 여부를 진단하기 위한 마커로서, 표 1에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법은, (a) 상기 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 진단 방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 상기한 벤조에이피렌 오염 마커의 양이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 벤조에이피렌 양성으로 판정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용하면 벤조에이피렌에의 오염 여부를 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커는, 생체의 벤조에이피렌(Benzo[a]pyrene)을 진단하기 위한 마커로서,

페닐알라닌 히드록실레이즈 (Phenylalanine hydroxylase);

체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형 (Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver);

글루타치온 S-트랜스퍼레이트, 미토콘드리아 (glutathione S-transferase, mitochondrial);

글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 알파-2 (글루타치온 S-트랜스퍼레이트 Ya-2) (GST Ya2) (GST 1b-1b) (GST A2-2) (Glutathione S-transferase alpha-2 (Glutathione S-transferase Ya-2) (GST Ya2) (GST 1b-1b) (GST A2-2)); 및

헤모글로빈 서브유닛 베타-2 (헤모글로빈 베타-2 체인) (베타-2-글로빈) (헤모글로빈 베타 체인, 마이너-폼) (Hemoglobin subunit beta-2 (Hemoglobin beta-2 chain) (Beta-2-globin) (Hemoglobin beta chain, minor-form))로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.

일실시예에 따른 벤조에이피렌 마커에 대하여 구체적으로 살펴보면, 다음과 같다.

페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase)는 생물학적 촉매제로 과량의 페닐알라닌을 다른 아미노산인 타이로신으로 전환시켜 페닐알라닌의 양을 미세하게 조절한다. 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)이라는 질병은, 페닐알라닌 가수분해효소의 활성이 선천적으로 저하되어 있기 때문에 페닐알라닌과 그 대사산물이 혈액에 축적되어 지능 장애, 담갈색 모발, 피부의 색소 결핍을 초래한다. 상기 페닐알라닌 히드록실레이즈는 벤조에이피렌 처리에 의해 발현량이 증가하며, 도 1에서는 스팟 1 번으로 표시하였다.

체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형 (Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver); 글루타치온 S-트랜스퍼레이트, 미토콘드리아 (glutathione S-transferase, mitochondrial); 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2)는, 세포질 이분자 단백질로 다양한 세포독성 물질과 결합하는 반응에서 촉매역할을 하고 거의 모든 생체 세포 속에 들어 있다. 생체 내의 산화환원 반응에 중요한 역할을 하며 산화적 손상을 방어하는 중요 기작 중의 하나이며 많은 돌연변이원, 발암물질 및 약리적 활성성분과 같은 외부 환경물질의 체내 해독과 배출에 중요한 역할을 한다. 또한 GSTs 효소는 벤조에이피렌의 활성화된 대사물질을 해독시키는데 중요한 역할을 하고 있으며, 이 효소의 결핍시 흡연과 관련된 각종 암에 걸릴 위험성이 큰 것으로 알려져 있다. 상기 체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형; 글루타치온 S- 트랜스퍼레이트, 미토콘드리아; 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 알파-2는, 도 1에서 각각 스팟 2, 3 및 4 번으로 표시하였다.

또한, 헤모글로빈 서브유닛 베타-2(Hemoglobin subunit beta-2)는 헤모글로빈 내의 heme을 지니며 낫 모양의 혈색소로 산소운반과 결합의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 헤모글로빈 서브유닛 베타-2는 도 1에서 스팟 5 번으로 표시하였다.

본 발명은 또 다른 일실시예에서, 상기 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 생체의 벤조에이피렌 오염 여부 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벤조에이피렌 오염 마커를 이용한 검출 방법을 제공하다. 구체적으로는, 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법은,

(a) 상기 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함한다.

일실시예에서, 상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군의 정상범위에 비해 증가 또는 감소된 경우 벤조에이피렌 오염의 양성 판정을 하게 된다.

일실시예에서, 본 발명은 벤조에이피렌 오염 마커를 이용한 오염 진단 방법을 제공한다. 구체적으로는, 생물학적 시료 내에 존재하는 상기 벤조에이피렌 오 염 마커의 양이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 벤조에이피렌 오염 양성으로 판정하게 된다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커는 벤조에이피렌 오염을 검출하는 데에 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 또한, 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법에 있어서, "항체"는 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 항체를 생산하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있으므로, 당업계에 널리 공지된 항체 생산 방법 중 어느 하나를 선택하여 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법은, 당업계에 널리 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA, 또는 면역침강기법과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다.

다클론 항체는 상기한 벤조에이피렌 오염 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology 6:511- 519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 벤조에이피렌 오염 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 벤조에이피렌 오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

단클론 항체는 벤조에이피렌 오염 마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 벤조에이피렌 오염 마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01;and the Stratagene SurβAPS Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예컨대 미국 특허 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619;WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; 및 90/02809; Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 2개의 항체 또는 "샌드위치" ELISA를 사용하여 환자 샘플에서의 벤조에이피렌 오염 마커의 과다 발현을 검출한다. 상기 "샌드위치" 또는 "두 부위" 면역분석은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Current Protocols in Immunology. Indirect Antibody Sandwich ELISA to Detect Soluble Antigens, John Wiley & Sons, 1991를 참조한다. 이러한 측면에서, 본 발명은 하나의 벤조에이피렌 오염 마커상에 서로 상이한 항원 형성 부위 2곳에 특이적인 항체 2개를 사용한다. "서로 상이한 항원 형성 부위"는 항체들은 목적한 벤조에이피렌 오염 마커 단백질상의 상이한 부위에 특이적이어서, 하나의 항체의 결합은 벤조에이피렌 오염 마커 단백질에 다른 항체의 결합을 현저하게 방해하지 않는 것을 의미한다. 제1 항체, 이른바 "포획 항체"는 고형 지지체에 고정 또는 결합된다. 예컨대, 목적한 벤조에이피렌 오염 마커에 대한 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰, 비드, 큐벳 또는 그외 반응 용기에 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 바람직한 예에서, 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰에 결합된다. 고형 지지체에 항체를 부착하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 신체 샘플, 특히 혈청 샘플을 고형 지지체와 접촉시켜, 결합된 포획 항체와 복합체를 이룰 수 있도록 한다. 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 이차 항체, 이른바 "검출 항체"를 고형 매트릭스에 첨가한 다. 검출 항체는 목적한 벤조에이피렌 오염 마커상의 개별적인 항원 형성 부위에 특이적이며, 검출가능한 신호를 제공하는 물질로 커플링되거나 또는 표지된다. 이러한 항체 표지물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 검출 항체와 인큐베이션한후, 결합되지 않은 항체는 제거하고, 고형 지지체에 결합된 표지된 검출 항체를 정량하여 벤조에이피렌 오염 마커의 발현 수준을 측정한다. 포획 및 검출 항체를 신체 샘플과 전술한 바와 같이 연속적으로 또는 동시에 접촉시킬 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 나아가, 고정된 포획 항체와 샘플을 접촉하기 전에 먼저 신체 샘플을 검출 항체와 인큐베이션할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o- 프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 진단용 키트에 대하여 설명하면 다음과 같다. "키트"는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 임의의 또는 모든 키트 시약을 외부 환경으로부터 이를 보호하는 밀폐된 용기 또는 파우치와 같은 용기에 포함시킬 수 있다.

특정 예로, 본 발명의 면역세포화학 키트는 적어도 2가지 이상의 개별 단백 질 마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 2가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 추가적으로 포함한다. 각 항체는 개별 시약으로써 또는 목적한 상이한 단백질 마커에 대한 모든 항체를 포함한 항체 칵테일로서 키트에 제공될 수 있다.

바람직한 예로, 면역화학적인 방법 특히 "샌드위치" ELISA 을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 수동 또는 자동화된 면역화학적인 기법과 함께 사용가능하다. 이러한 키트는 목적한 단백질 마커에 대한 하나 이상의 제1포획 항체, 단백질 마커의 다른 항원성 부위에 특이적인 표지된 제2 검출 항체, 및 단백질 마커에 항체 결합을 검출하기 위한 화합물을 포함한다. 제1 포획 항체는 이후 고형 지지체에 부착하기 위해 용액중으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 포획 항체는 고형 지지체, 예컨대 비드나 마이크로타이터 플레이트의 웰에 이미 결합된 키트로 제공될 수 있다. 항원-항체 복합체를 검출하는 임의의 화합물을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 제2 검출 항체는 기질의 비색 변환을 촉매하는 효소가 접합된다. 이러한 효소 및 항체 결합을 검출하기 위한 이의 이용 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 예로, 키트는 HRP가 접합된 제2 검출 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP-표지된 제2 검출 항체의 경우, 테트라메틸벤지딘)와 황산과 같이 효소 반응을 중지시키는 용도의 용액과 같이 사용할 수 있는 기질, 특히 발색단을 추가적으로 제공할 수 있다. 특정 예에서, 항체 결합을 검출하기 위한 화합물은 상업적으로 이용가능한 시약 및 키트를 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 "샌드위치" ELISA 키트는 목적한 2 이상의 상이한 바이오마커를 검출하기 위한 항체들을 포함한다. 이러한 키트는 2 이상의 제1 포획 항체와 각각의 바이오마커 에 대한 2차 검출 항체를 포함한다. 상기 포획 항체는 개별적인 시약으로서 또는 대안적으로는 목적한 여러가지 바이오마커에 대한 모든 항체들의 혼합물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 채택된 시약의 정확한 사용과 활성을 검증하기 위해, 키트내에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 목적한 바이오 마커가 있거나 없는 것으로 알려진 조직 단편, 글라스 슬라이드에 고정된 세포 등과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 특정 예로, 양성 대조군은 목적한 바이오마커 단백질을 포함하는 용액이다. 대조군의 제작 및 사용은 당업자의 일반적인 능력 내에서 표준적이며 자명하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 단백질 추출

프로테옴 분석을 위해서 옥수수 오일(corn oil)로 처리한 정상군과, 1/10 LD₅₀(20 mg/kg) 및 1/2 LD₅₀ (100 mg/kg)의 벤조에이피렌으로 처리한 실험군(실시예 1, 실시예 2)을 준비하였다. 각 처리군들은 옥수수 오일 또는 벤조에이피렌으로 각각 72 시간동안 처리한 랫트로부터 간 조직을 분리하여 균질기로 파쇄한 후, 7 M urea, 2 M thiourea, 4.5% CHAPS, 100 mM DTE가 포함되어 있는 40 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.8)에서 한 번 더 파쇄하였다. 파쇄된 시료를 15℃, 12,000xg에서 50 분 동안 원심분리한 뒤 얻어진 상등액을 사용하였다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

2. 등전점 전기영동

정상군과 실험군의 랫트 간 조직에서 분리한 총 단백질은 1 mg이 되게 하였고, 450 ul의 rehydration 용액 (7 M urea, 2 M thiourea, 4.5% CHAPS, 0.25% ampholytes, 100 mM DTE)을 사용하여 단백질을 녹였다. 450 ul의 rehydration 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG holder에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 24 cm immobilized dry strip (pH 3-10 NL, GE Healthcare Bio-Science)를 이용하여 18 시간동안 rehydration 시켰다. 200 V/ 200 Vhrs, 500 V/ 500 Vhrs, 1,000 V/ 1,000 Vhrs, 8,000 V/ 13,500 Vhrs, 8,000 V/ 100,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

3. 평형화

등전점 전기영동이 끝난 스트립(strip)은 1 차 평형화 완충용액 (6 M urea, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% glycerol, 2% SDS, 25% acrylamide, 2 mM TBP)에서 각각 20 분간 1 차 평형화를 실시한 후, 2 차 평형화 완충용액 (6 M urea, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% glycerol, 2% SDS, 25% acrylamide, 2 mM TBP)에서 20 분간 2 차 평형화를 실시하였다.

4. SDS - polyacrylamide gel 전기영동

9% - 16% 아크릴아미드(acrylamide) 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 0.5% 아가로즈 겔(agarose gel)로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 2 시간 동안 겔 당 5 mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 10 시간 동안 겔 당 18 mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

5. 겔 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 Coomassie Blue G-250 염색 용액 (34% methanol, 0.1% Coomassie G-250, 17% ammonium sulfate, 3% phosphoric acid)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12 시간 이상 염색한 후 1% 아세트산을 이용하여 탈색하였다.

6. 겔 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 ImageMaster 2D Platinum 6.0 (2D software, GE Healthcare Bio-Science)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3 장의 겔을 분석하였 다.

7. NanoLC - MS / MS 분석

NanoLC-MS/MS 분석을 위해 각 스팟을 트립신(trypsin)으로 인-젤 다이제스천(in-gel digestion)한 후, 스팟들의 펩타이드들을 agilent 110 Series nano-LC와 LTQ-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA)에 의해 분석하였다. LC-MS./MS 분석에 사용된 capillary 컬럼 (150 mm ㅧ 0.075 mm)은 Proxeon (Odense M, Denmark)에서 구입하였으며, 슬러리는 5 μm, 100 Å pore size Magic C18 stationary phase (Michrom Bioresources, Auburn, CA)로 패킹하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 0.1% 포믹에시드를 함우하는 증류수 (0.1% formic acid in deionized water)이었고, 이동상 B는 0.1% 포믹에시드를 함유하는 아세톤니트릴 (0.1% formic acid in acetonitrile)이었다. 크로마토그래피 경사는 50 분간 5% B에서 35% D 직선증가와 20 분간 40% B에서 60% B의 직선증가, 5 분간 60% B에서 80% B 직선증가 하는 것으로 셋업하였다. 유속은 분리 (splitting) 분당 300 mL를 유지하였다. 매스 스펙트럼 (Mass spectra)은 MS/MS 스캔 후 전체 매스 스캔으로 얻은 데이터 (data-dependent acquisition with full mass scan: 400-1800 m/z)로 얻었다. 얻어진 각각 MS/MS 스캔은 LTQ에서 1 마이크로스캔 (microscans)의 평균이었다. 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 200℃로 맞추어졌으며, 스프레이는 1.5.0-2.0 kV였다. 정상화된 콜리전 (collision) 에너지는 MS/MS에 대해 35%로 맞추어졌다. Sequest 소프트웨어가 펩타이드 서열을 동정하기 위해 사용되어졌다. 신뢰성 높은 결과를 얻기 위해, delatCn ≥ 0.1과 Rsp ≤ 4의 조건을 적용하였고, Xcorr의 경우, Charge state 1+에서는 Xcorr ≥ 1.5를 적용하였고, charge state 2+에서는 Xcorr ≥ 2.0, charge state 3+에서는 Xcorr ≥ 2.5를 적용하였으며, 펩티드 확률(peptide probability) > 0.1을 적용하여 단백질동정을 확정범위 (cutoff)로 사용하였다. 펩타이드들은 메티오닌 (methionine) 잔기에서 다양하게 산화 (oxidization) 되었으며, 시스테인 (cystein)에서는 다양하게 카르복시아미도메틸레이션 (carboxyamidomethylation)과 카르복시메틸레이션 (carboxymethylation) 되었다.

8. 결과

벤조에이피렌을 처리한 랫트의 간을 분리하여 이차원 전기영동을 한 결과 정상군에서는 총 1170 개의 스팟이 발현되었고, 1/10 LD₅₀ (20 mg/kg)의 벤조에이피렌을 처리했을 때는 총 1259 개, 1/2 LD₅₀ (100 mg/kg)의 벤조에이피렌을 처리한 경우 1471 개의 스팟을 확인할 수 있었다. 그 중 정상군과 벤조에이피렌 처리군의 발현 차이를 보이는 단백질 스팟은 총 5 개였다(도 2).

또한, 도 2에는, 도 1 및 표 1에 나타낸 단백질에 대하여, 각 스팟별 단백질의 발현량을 나타내었다. 도 2에서 실시예 1은 1/10 LD₅₀ (20 mg/kg) 벤조에이피렌 처리군, 실시예 2는 1/2 LD₅₀ (100 mg/kg) 벤조에이피렌 처리군을 의미한다.

도 2를 참조하면, 스팟 1 번인 페닐알라닌 히드록실레이즈 (Phenylalanine hydroxylase), 스팟 2 번인 체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형 (Chain A, new crystal forms of a mu class glutathione S-transferase from rat liver) 및 스팟 5번인 헤모글로빈 서브유닛 베타-2 (Hemoglobin subunit beta-2)는 벤조에이피렌 농도에 의존하여 단백질 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다(도 2 (A)).

또한, 스팟 3 번인 글루타치온 S-트랜스퍼레이트, 미토콘드리아 (glutathione S-transferase, mitochondrial)는 1/10 LD₅₀ (20 mg/kg)의 벤조에이피렌 처리군에서는 정상군에 비해 감소하였으나 1/2 LD₅₀ (100 mg/kg)의 벤조에이피렌 처리군에서 1.5 배 이상 증가하였고(도 2 (B)), 스팟 4 번인 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 알파-2 (Glutathione S-transferase alpha-2)는 벤조에이피렌 농도가 증가함에 따라 감소함을 알 수 있었다(도 2 (C)).

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 오염 마커들의 발현 양상을 나타내는 전기영동 사진이다;

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 벤조에이피렌 처리에 따른 각 스팟별 단백질의 발현량을 측정한 전기영동 사진이다.

Claims

생체의 벤조에이피렌(Benzo[a]pyrene)을 진단하기 위한 마커로서,

페닐알라닌 히드록실레이즈(Phenylalanine hydroxylase); 체인 A, 래트 간 유래 Mu 클래스 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈의 신규 결정형(Chain A, New Crystal Forms Of A Mu Class Glutathione S-Transferase From Rat Liver); 글루타치온 S-트랜스퍼레이트, 미토콘드리아; 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 알파-2; 및 헤모글로빈 서브유닛 베타-2;로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 벤조에이피렌 오염 마커.
제 1 항에 따른 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 생체의 벤조에이피렌 오염 여부 진단용 키트.
(a) 제 1 항에 따른 벤조에이피렌 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법.
제 3 항에 있어서,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 증가 또는 감소된 경우 벤조에이피렌 오염의 양성 판정을 하는 것을 특징으로 하는 벤조에이피렌 오염 마커 검출 방법.
생물학적 시료 내에 존재하는 제 1 항에 따른 벤조에이피렌 오염 마커의 양이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 벤조에이피렌 오염 양성으로 판정하는 것을 포함하는 벤조에이피렌 오염 진단 방법.