KR100963031B1

KR100963031B1 - 포름알데히드 오염 검출을 위한 마커 및 키트

Info

Publication number: KR100963031B1
Application number: KR1020070137766A
Authority: KR
Inventors: 이미영
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2010-06-10
Also published as: KR20090069937A

Abstract

포름알데히드 오염 마커, 그 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 포름알데히드 오염 여부 진단용 키트, 항원-항체 복합체 형성을 통하여 포름알데히드 오염 마커를 검출하는 방법이 개시되며, 이를 이용하면, 효과적으로 포름알데히드 오염을 검출할 수 있다.

포름알데히드, 오염, 마커, 단백질, 검출, 키트, 항체

Description

포름알데히드 오염 검출을 위한 마커 및 키트{Marker and kit for detecting contamination of formaldehyde}

본 발명은 포름알데히드에의 노출 내지는 오염을 검출하기 위한 마커에 관한 것이다. 또한 본 발명은 포름알데히드에의 노출 내지는 오염을 검출하는 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 포름알데히드에의 노출 내지는 오염을 검출하는 방법에 관한 것이다.

최근 급속한 산업화와 경제발전은 환경오염이라는 심각한 부작용을 야기시키게 되었다. 신축건물의 실내공기 질은 점점 더 악화되고 있을 뿐만 아니라 각종 건축자재로부터 발생하는 가스 및 유해물질들은 인체에 심각한 악영향을 주고 있다 이중 포름알데히드가 건물병 증후군 및 새집 증후군 등의 대표적인 원인물질로 알려져 있다.

포름알데히드는 전세계적으로 1200만 톤 (1992년도) 이상이 생산되고 있는 환경 유해 물질이다. 포름알데히드는 수지생산, 모울딩, 합판 뿐만 아니라 살균제, 보존제 등으로 광범위하게 사용되고 있다. 미국의 경우 150 만명 이상의 근로자가 포름알데히드에 노출되고 있다고 알려져 있다.

장기간 포름알데히드에 반복 노출된 경우, 정서불안, 기억력 상실 뿐만 아니라 천식과 간 신장 중앙신경시스템이 손상될 수 있다. 사람을 대상으로 한 포름알데히드의 유해성 데이터가 매우 미미하기는 하지만 코호드 연구결과를 바탕으로 최근 발암추정물질(class 2A)에서 발암물질(class 1)로 상향조정되었다.

포름알데히드 노출에 따른 독성과 암 발생에 대한 분자 세포 수준에서의 연구 결과를 살펴보면 포름알데히드는 반응성이 높은 수용성의 저분자이므로 공기중 흡입으로 인한 조직흡수와, 호흡률 및 호흡기관과의 관련성이 많이 연구되어 왔다. 포름알데히드의 사람배양세포에 대한 세포독성과 유전독성을 살펴보면 세포사멸과 세포 형질전환 뿐만 아니라 콜로니 형성효율의 변화, 세포성장 변화, 세포막 구조변화, 시토졸 칼슘농도변화 등이 보고되어 있다.

포름알데히드는, DNA 어덕트(adducts) 형성과 DNA 단일가닥 브레이크(single strand break), DNA-단백질 간 크로스-링크, 6-티오구아닌 저항성 돌연변이 등 DNA 상의 변화도 일으킨다. 또한 DNA 회복기작에 관련된 효소를 포함하여 다양한 효소활성에 영향을 주며 N-니트로소 화합물(nitroso compounds) 등의 다른 독성물질과 돌연변이 유발물질의 효과를 공동상승적으로 증가시킨다.

포름알데히드의 독성에 대한 세포내 주요 방어 기작은 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase) 3 (ADH3)을 통한 산화와 티올(thiols)과 자발적인 반응을 통해서 나타난다.

상기와 같이 포름알데히드의 독성연구는 주로 세포독성과 유전독성에 치우쳐 있어서 단백질 수준에서의 연구는 거의 진행되어 있지 않다. 따라서, 포름알데히드에 의한 단백질 발현양의 변화가 어떻게 질병을 유발하는지에 대하여 자세히 연구되어 있지 않다.

유전자는 세포 내에서 단백질 합성 후 변형(post translational modification) 여부에 따라 세포내에서의 기능이 좌우될 뿐만 아니라 유전자 전사에 의해 합성된 mRNA가 실제로 단백질을 만드는 양은 세포나 조직 및 기관내 생리적 조건에 따라서 매우 크게 변한다. 이러한 이유로, 최근에는 최종 산물인 단백질 수준에서의 분석이 유전자 수준에서의 분석보다 중요한 것으로 받아들여지고 있다.

본 발명의 일실시예의 목적은, 포름알데히드 오염 여부를 검출하는 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 포름알데히드 오염 여부를 진단하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 포름알데히드 오염 여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 생체의 포름알데히드 오염 여부를 진단하기 위한 마커로서, 표 1 및 표 2에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 여부 진단용 키트는 표 1 및 표 2에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 포름알데히드 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커 검출 방법은,

a) 제1항에 따른 포름알데히드 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

b) 상기 a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 진단 방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 상기한 포름알데히드 오염 마커의 양이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 포름알데히드 오염 양성으로 판정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명을 이용하면 포름알데히드에의 오염 여부를 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 포름알데히드에 의해서 변화되는 세포 내 단백질의 발현 양상의 변화를 프로테오믹스(Proteomics)기술을 이용하여 분석하였다. 이차원 전기영동과 펩타이드와 아미노산수준에서 정확한 질량분석이 가능한 MALDI-TOF를 사용하여 단백질의 발현양상을 정확하게 관측함으로써 포름알데히드 검출을 위한 마커로서의 이용을 확인하였다.

본 명세서에서 "생물학적 시료"는 포름알데히드 오염 마커를 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액 샘플을 의미한다. 예로써, 혈액, 뇨, 림프, 여성 체액, 생검, 땀, 대변 및 눈물 등을 들 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "대조군의 정상 범위"란, 포름알데히드에 오염되지 아니한 정상 대조군이 해당될 수 있는 최대 범위를 가리킨다.

본 명세서에서 "포름알데히드 오염 전기"는 포름알데히드의 오염 시기를 두 시기로 구분할 때 앞의 시기를 의미하는 것이다. 예컨대, 본 명세서에 기재된 실시예의 조건으로 HCHO를 처리하는 경우에는 "포름알데히드 오염 전기"란 포름알데히드에 노출된지 24 시간이 경과했음을 의미한다.

본 명세서에서 "포름알데히드 오염 후기"는 포름알데히드의 오염 시기를 두 시기로 구분할 때 뒤의 시기를 의미하는 것이다. 예컨대, 본 명세서에 기재된 실시예의 조건으로 HCHO를 처리하는 경우에는 "포름알데히드 오염 후기"란 포름알데히드에 노출된지 48 시간이 경과했음을 의미한다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는 스트레스 반응 단백질, 세포 골격 관련 단백질, 탄수화물 대사/수송 관련 단백질, 단백질 합성/대사/가공/분해 관련 단백질, 핵산 대사 및 수송 핵단백질, 항-염증 활성 단백질, 및 기타 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 스트레스 반응 단백질로서, 32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser), 열 쇼크 90kDa 단백질 1 베타(Heat shock 90KDa protein 1, beta), 열 쇼크 27kDa 단백질 1(Heat shock 27KDa protein 1), (+)-안티-Bpde의 Gsh 컨쥬게이트와 복합된 Hgstp1-1[v104]의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of Hgstp1-1[v104] complexed with the Gsh conjugate of (+)-Anti-Bpde), 퍼옥시레독신 3 이소폼 b(Peroxiredoxin 3 isoform b), 퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1) 및 Holo 타입 인간 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 구조 체인 A(Chain A, the structure of Holo type human Cu, Zn superoxide dismutase) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 세포 골격 관련 단백질로서, 빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL), 빈큘린(Vinculin), 코필린 1(Cofilin 1) 및 로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 대사/수송 관련 단백질로서, C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase), 메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase), CPS1 이소폼(CPS1 isoform), 알돌레이즈 A(Aldolase A), 카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1), 포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain) 및 2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 단백질 합성/대사/가 공/분해 관련 단백질로서, 유비퀴틴 카복실-터미널 에스터레이즈 L1(Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1), 프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit), PSMA 4 단백질(PSMA4 protein) 및 샤페로닌 10-관련 단백질(Chaperonin 10-related protein) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 핵산 대사 및 수송 핵 단백질로서, 카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I), 헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI), 체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 항-염증 활성 단백질로서, 애넥신 I 및 Annexin A4 중 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는, 기타 단백질로서, 베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs), 인간 Dj-1의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of human Dj-1), 이소폼 a에서 발현되는 단백질인 비-전이세포 1(Non-metastatic cells 1, NM23A) expressed in isoform a) 및 사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure)사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A (Nmr,22 structure)) 중 어느 하나 이상일 수 있다.

빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL) (스팟 8,10), 빈큘린 (Vinculin) (스팟 9) 모두 포름알데히드에 의해서 그 발현양이 증가되는 단백질 중 하나이다. 빈큘린 단백질은 세포의 모양과 고도의 내부 구조물의 유기적 관계를 유지시켜주며 또한 세포 운동과 분열에도 중요한 역할을 하는 세포골격과 관련 있으며 분자량이 116 kDa 으로 세포 부착과 이동 조절에 결정적 역할을 하는 세포내 단백질이다. 또한 세포-세포, 세포-기질, 부착성-결합력을 보충하는 역할을 하며 세포 부착성 분자 패밀리인 F-액틴, 캐드헤린(cadherin), 인테그린(integrin) 사이의 연결을 조절하는 다양한 단백질-단백질 상호작용을 연결하고 활성화한다. 빈큘린은 a-액티닌에 결합하여 액틴을 contractile bundles로 조합한다. 최근 연구결과에 따르면 빈큘린(vinculin)의 3차원 구조가 변함에 따라 질병이 촉발되거나 또는 건강 유지에 도움이 된다는 결과가 나왔다. 특히 관심을 끄는 내용은 빈큐린 단백질의 구조가 약간만 변하더라도 단백질 기능은 매우 큰 변화를 보일 수 있다는 것이다. 한 예로 빈큘린 단백질을 활성태에서 불활성태 상태로 번갈아 변화시키면 세포의 운동 상태를 세밀하게 조절하는 것도 가능하다는 설명이다. 빈큘린 단백질의 기능은 발달 중인 배아(embryo)의 세포조직이나 기관(organ) 내에서 세포에 운동성을 부여하고 상처 치료를 가속시키는 것이다. 또한 암 세포가 종양에서 이탈해 다른 세포 조직으로 이동하는 과정을 조절하는 기작에도 빈큐린 단백질이 관여한다고 알려졌다(Constantina Bakolitsa, Daniel M. et al., (2004) Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature, 430. 29).

애넥신 1(Annexin 1)(ANX-1) (스팟 14)은 포름알데히드에 의해서 그 발현양이 증가되는 단백질 중 하나이다. 애넥신 1(Annexin 1)은 항-염증과 관련된 단백질로서 분자량이 약 37 kDa이며 구조적으로 연관된 칼슘-의존적인 인지질 (phospholipid) 결합 단백질로 항-염증반응, 세포막 융합, 분화, 세포외방출(exocytosis), 칼슘 채널 및 세포골격(cytoskeletal) 단백질과의 상호작용 등 다양한 세포작용에 관여한다. 또한 글루코코르티코이드(glucocorticoid)의 항-염증 작용에 대한 매개체로 알려져 있는데 이러한 항-염증 성질은 ANX-1이 포스포리페이즈(phospholipase) A2 (PLA2-인지질분해효소)의 활성을 억제하는 능력과 연관이 되어 있다고 알려져 있다. 이 PLA2가 류코트리엔 생성의 중요한 반응단계를 담당하고 있으며 염증반응, 세포독성 및 세포분열 등에 필요한 신호전달에 관여하는 중요한 효소이기 때문이다(Egle Solito, Ahmad Kamal et al., (2003) A novel calcium-dependent proapoptotic effect of annexin 1 on human neutrophils. FASEB Journal, 17, 1544-6).

애넥신 Annexin A4 (스팟 15)은 포름알데히드에 의해서 그 발현양이 증가되는 단백질 중 하나이다. 유비퀴토스 패밀리(ubiquitouse family)이며, 칼슘/의존적 막-결합 단백질(calcium/dependent membrane-binding protein)으로 막의 운반과 관련있는 단백질이다(Warren G. Hill, Marcia A. et al.,(2003) Annexin A4 reduces water and proton permeability of model membranes but does not alter aquaporin 2-mediated water transport in isolated endosomes. Journal of General Physiology, 121, 413-425).

유비퀴틴 카복실-터미널 에스터레이즈(Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1) (스팟 17) 단백질은 포름알데히드에 의해 발현량이 증가되는 단백질이다. 이는 신경계에 특이적이며 신경내분비계 확산과 관련있다. 특히 알파-시누클레인(alpha-synuclein)의 축적으로 생기는 파킨슨 병에 민감성이 높은 것으로 알려졌다(Maraganore, D. M et al., (2004) UCHL1 is Parkinson's disease susceptibility gene. Ann. Neurol., 55, 512-521.).

열 쇼크 90 kDa 단백질(Heat shock protein 90 kDa) (스팟 11)과 27 kDa (스팟 18)는 포름알데히드에 의해 발현량이 증가되는 단백질이다. 이는 분자량 크기에 따라 다양한 그룹으로 분류되며, 중금속, 열자극, 저산소증 등의 다양한 산화 스트레스에 의해 발현된다고 알려진 단백질로 정상적인 단백질 접힘과 집합에서 분자 샤프론으로 작용할 뿐만 아니라, 스트레스 상태에서의 단백질 복구와 세포 보호 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Krzysztof Laudanski, Asit De, and Carol Millter-Graziano (2007) Exogenous heat shock protein 27 uniquely blocks differentiation of monocytes to dendritic cells. Eur. J. Immunol. 37, 2812-2824.)

23번 스팟인 Hgstp 1-1은 포름알데히드에 의해 발현량이 증가되는 단백질이다. 이는 인간 글루타티온-에스-트랜스퍼레이즈 GSTP1-1(human glutathione-S-transferase GSTP1-1) 동위효소로서 태반형 GST(GST-P)로 알려져 있다. 환원형 글루타티온(utathione)과 지노바이오틱스(xenobiotics)사이의 컨쥬게이션(conjugation)을 촉매할 뿐만 아니라 세포내 지질과 산화물을 제거하는 기능도 가지고 있는 대표적인 방어효소이다(Zimniak P et al., Naturally ossurring human glutathione S-transferase GSTP1-1 isoforms with isoleucine and valine in position 104 differ in enzymic properties. Eur J Biochem 1994, 224, 893-899).

퍼옥시레독신 3 이소폼 b(Peroxiredoxin 3 isoform b) (스팟 24)와 퍼옥시레독신 1 (스팟 29)는 퍼옥시레독신 패밀리로서 세포내 분포 위치에 따라 여러 그룹으로 분류된다. 퍼옥시레독신은 체내에서 세포신호전달을 조절하는 활성산소를 제거하는 기능을 가지며 호모다이머로 존재하고 세포 증식, 분열 그리고 세포 사멸과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 세포의 증식은 성장인자 (growth factor)의 자극에 의해 시작되고 성장인자가 세포막 수용체 (growth factor receptor)에 결합하면 과산화수소가 생성되면서 수용체가 인산화되고 이를 신호로 세포는 증식을 시작한다. 반대로 퍼옥시레독신이 수용체에 접근하면 성장신호가 약화되어 세포는 증식을 서서히 멈추게된다. 이는 퍼옥시레독신이 과산화수소를 물로 환원시켜 제거하기 때문이다. 이처럼 과산화수소는 세포의 성장을 촉진시키고 퍼옥시레독신은 과산화수소를 조절하여 세포의 성장을 둔화시키는 작용으로 알려져 있다(Ana P. D. Demasi, Daniela Ceratti et al., (2007) Expression of peroxiredoxin I in plasma cells of oral inflammatory diseases. Eur. J. Oral Sci., 115, 334-337). 퍼옥시레독신 3 이소폼 b (스팟 24)는 포름알데히드에 의해 발현량이 증가되는 단백질이다. 퍼옥시레독신 1 (스팟 26)은 포름알데히드의 오염 진행 시기에 따라 전기에는 그 발현량이 감소하지만 후기에는 증가되는 단백질이다

인간 Dj-1의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of human Dj-1) (스팟 25) 단백질은 포름알데히드에 의해 그 발현량이 증가되는 단백질 중 하나이다. 이 단백질은 파킨슨병과 신경계관련 질병에 대한 방어 기작 시 나타나는 인간 Dj-1 단백질과 관련 있다(Ying Wei et al., (2007) Identification of functional subclasses in the Dj-1 superfamily proteins. PLoS Computational Biology, 3, 120-126.).

이소폼 a에서 발현되는 단백질인 비-전이세포 1(Non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in isoform a) (스팟 27)은 포름알데히드에 의해 그 발현량이 증가되는 단백질 중 하나이다. NM23 유전자와 관련있는 단백질로 NM23 유전자는 몇 몇 암 종류에서 침입을 억제하며 정상적인 발달과 세포 분화 조절에 관련있는 것으로 알려졌다(Lombardi D. et al., (2000) NM23: unraveling its biological function in cell differentiation. J. Cell Physiol., 182, 144-149.).

Holo 타입 인간 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 구조 체인 A(Chain A, the sturcture of Holo type human Cu, Zn superoxide dismutase) (스팟 28)는 포름알데히드에 의해 그 발현량이 증가되는 단백질 중 하나이다. 이 단백질은 항산화 효소로서 세포는 다양한 스트레스, 중금속 등에 의해 생성된 활성산소 (reactive oxygen)를 제거하고 스스로 방어하는 항산화 효소를 생산해 낸다. Cu, Zn SOD (SOD 1)는 메탈로샤페론(metallochaperone) 단백질로 구리(copper) 보인자이며 단백질-단백질 수송에 직접적인 관련있는 효소이다(Tracey D. Rea, Andrew S. Torres et al.,(2001) Mechanism of Cu, Zn-superoxide dismutase activation by the human metallochaperone hCCS. The Journal of Biological Chemistry, 276, 5166-5176.).

코필린 1(스팟 29)은 포름알데히드 오염 전기에는 발현량이 감소하다가 오염 후기에는 증가하는 단백질이다. Cofilin 1 는 근육을 구성하고 근수축에 필요한 단백질의 일종인 actin의 해중합을 촉진 시키는 단백질로 조직의 세포골격과 관련이 있다. 또한 cofilin은 glucocorticoid 저하와 관련하여 새로운 요인으로 나타났다. (Joelle Fuegg, Florian Holsboer et al., (2004) Cofilin 1 is revealed as an inhibitor of glucocorticoid receptor by analysis of hormone-resistant cells. Molecular and Cellular Biology, 9371-9382.)

사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A (Nmr,22 structure)) (스팟 31,32)은 포름알데히드에 의해 발현량이 증가하는 단백질 중 하나이다. 이 단백질은 사이클로필린(Cyclophilin) (CyP)이 유비퀴토스(ubiquitious) 세포 내 단백질로서 면역억제약 사이클로스포린(cyclosporin) A (CsA) 와 결합하게 되며 T-세포 활성을 억제한다(Ke H, Mayrose D, et al., (1994) Crystal structures of cyclophilin A complexed with cyclosporin A and N-methyl-4[(E)-2-butenyl]-4,4-dimethylthreonine cyclosporin A. Structure, 2, 33-44.)

샤페로닌 10-관련 단백질(Chaperonin 10-related protein) (스팟 33)은 포름알데히드에 의해 그 발현량이 증가되는 단백질 중 하나이다. 샤페로닌(chaperonin) 10 과 연관된 단백질로 cpn 10은 현존하는 가장 진화적으로 안정한 단백질인, 열 충격 단백질 계통 중 하나이다. 이 단백질은 정상적인 세포에서 매우 중요한 작용 을 수행하며, 세포의 스트레스 상태, 즉 대사 방해, 감염, 염증, 형질 전환에서는 과다 생성된다(Anna M. Czarnecka, Claudia Campanella et al., (2006) Heat shock protein 10 and signal transduction: a "capsula eburnea" of carcinogenesis. Cell Stress & Chaperones , 11, 287-294.).

CPS 1 이소폼 (스팟 6)과 카바모일포스페이트 신테테이즈 1(carbamoylphosphate synthetase 1) (스팟 7)은 포름알데히드 오염 전기에는 발현량이 증가하지만 후기에는 전기보다 감소하는 단백질들이다. 상기 단백질들은 조절 효소로서 간의 요소 생성의 첫 번째 단계를 촉진한다. 즉 요소 생성에는 암모니아를 카바모일포스페이트(carbamoylphosphate)로 바꿔주는 효소를 필요로 하고 카바모일포스페이트(carbamoylphosphate)가 만들어지면 효소회로를 거쳐 효소가 만들어지는데 이때 카바모일포스페이트(carbamoylphosphate)의 생성을 촉진하는 효소가 CPS 1이다(Tsutomu Aoshima, Mitsuharu Kajita et al., (2001) Novel mutations (H337R and 238-362 del) in the CPS1 gene cause carbamoyl phosphate synthetase 1 deficiency. Human Heredity, 52, 99-101.)

알돌레이즈 A(Aldolase A) (스팟 13)는 포름알데히드의 오염 전기에는 그 발현량이 감소하다가 오염 후기에는 전기보다 발현량이 증가하는 단백질이다. 이 단백질은 당분을 에너지로 변환시키는 해당작용을 하는 효소 알돌레이즈(aldolase)의 한 종류로 많은 조직에 존재하며 특히나 골격근에서 많이 볼 수 있는 단백질이다. 또한 근육의 발달단계에 따라 발현량 차이가 있는 것으로 보고 되었으며 근육 분화 및 근육 수축의 조절작용에도 관여한다고 알려져 있다(Marjo Salminen, Pascal Maire et al., (1994) Fast-muscle-specific expression of human aldolase A transgenes. Molecular and Cellular Biology, 14, 6797-6808.)

2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈(Chain A, Triosephosphate isomerase (TIM) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid) (스팟 22)는 포름알데히드에 의해 발현량이 증가하는 단백질이다. 이 단백질은 트리오세포스페이트 이소머레이즈(triosephosphate isomerase)와 관련된 단백질로 해당과정과 촉매반응 동안 d-글리세르알데히드 3-포스페이트(d-glyceraldehyde 3-phosphate)에서 디히드록시아세톤 포스페이트(dihydroxyacetone phosphate)로의 가역적 상호전환과 관련있는 이성체 효소이다. 이 반응은 해당과정과 당 신생과정에서 중요한 역할을 한다(Irshad M. Sulaiman et al., (2003) Triosephosphate isomerase gene characterization and potential zoonotic transmission of Giardia duodenalis. Emerging Ingectious Dieases, 9, 1444-1452.)

프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit) (스팟 19)과 PSMA4 단백질 (스팟 21)은 포름알데히드에 의해 그 발현량이 증가하는 단백질들이다. 이 단백질들은 프로테아좀의 서브유닛의 타입에 따라 여러 그룹으로 나뉘며, 프로테아좀은 고도의 잘 배열된 링 모양의 20S 코어 구조로 다중효소 단백질분해효소(multicatalytic proteinase) 복합체이다. 이 코어 구조는 28 비-동일 서브유닛(non-identical subunits)의 4개 링으로 이루어졌다: 2개의 링은 7 알파 서브유닛(alpha subunits)으로 구성되었고 2개의 링은 7 베타 서브유닛(beta subunits)으 로 구성되었다. 프로테아좀(Proteasomes)은 진핵세포에 광범위하게 있으며 변형된 프로테아좀(modified proteasome)의 필수적 기능인 이뮤노프로테아좀(immunoproteasome)은 클래스 1 MCH 펩티드와 관련있다(Cui F, Wang Y et al.,(2006) The up-regulation of proteasome subunits and lysosomal proteases in hepatocellular carcinomas of the HBx gene knockin transgenic mice. Proteomics, 6, 498-504.).

프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit) 은 일반적으로 유전자의 단일 염기 변이시 심근경색증을 유발하다고 알려져 있고(Ozaki, K., Sato, H., Iida, A. et al., (2006) A functional SNP in PSMA6 confers risk of myocardial infarction in the Japanese population. Nature Genet. 38:921-925), PMSA 4는 파킨슨 병과 관련있는 것으로 알려졌다 (Dachsel, J.C., Lucking, C. B. et al., (2005) Parkin interacts with the proteasome subunit alpha 4. FEBS. Lett. 579(18):3913-9).

포스포글리세레이트 뮤테이즈(Phosphoglycerate mutase) 1 (brain, 스팟 20)은 발현량이 증가되는 단백질이다. 이 단백질은 해당과정의 8번째 단계를 촉매하는 효소로 C-3에서 C-2 인산그룹의 내부 트랜스퍼(internal transfer)를 촉매하여 그 결과 3-포스포글리세레이트를 2-포스포글리세레이트로 변환시키는 역할을 한다(Yanli Wang, Zhongjun Cheng et al., (2004) Cloning, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of human phosphoglycerate mutase. Acta Cryst., 60, 1893-1894.)

C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate syntase, cytoplasmin) (스팟 1)은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 증가하다가 오염 후기에는 감소하는 단백질이다. 이 단백질은 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate) (THF)로 전환되어 단일 탄소계를 전달하는 역할을 하며 THF 유도체는 다양한 생합성 반응에서 단일 탄소의 공여체로서 작용한다. 흡수된 포름알데히드는 생체내에서 테트라하이드로폴레이트-의존적 일탄소 생합성 경로에 의해서 formate와 이산화탄소로 산화되거나 다른 생체물질로 편입되게 된다(Jae M. Song, and Jesse C. Rabinowitz (1993) Function of yeast cytoplasmic C1-tetrahydrofolate synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 2636-2640.)

메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈 (Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase) (스팟 2)는 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 증가하다가 오염 후기에는 감소하는 단백질이다. 이 단백질은 메틸렌테트라하이드로폴레이트(methylenetetrahydrofolate)를 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트로의 산화를 촉진하며 이때 NAD+를 이용하게 된다(NR Mejia and RE Mackenzie (1985) NAD-dependent methylenetetrahydrofolate dehydrogenase is expressed by immortal cells. J. Biol. Chem., 260, 14616-14620.).

로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha) (스팟 3) 단백질은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 증가하다가 오염 후기에는 감소하는 단백질이다. 이 단백질은 Rho small G 단백질의 구성원이며 액틴 세포골 격 재구성(actin cytoskeletal reorganization)의 중요한 매개체로서 세포의 형태학적, 운동성, 부착성, 악성종양으로의 형질전환 및 세포사멸과 관련있는 것으로 알려져 있다. 또한 이 단백질은 천식 쥐의 폐의 호흡기 리모델링과 관련되어 있다고 알려져 있으며 이 단백질의 증가시 세포사멸이 억제되고 종양으로의 형질전환이 촉진된다고 알려져 있다(Atsushi Togawa, Jun Miyoshi et al., (1999) Progressive impairment of kidneys and reproductive organs in mice lacking Rho GDI a. Oncogene, 18, 5373-5380.).

베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precursor) (스팟 4)는 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 증가하다가 오염 후기에는 전기보다 감소하는 단백질이다. 이 단백질은 당의 특이적 결합과 관련있는 단백질이다(Di Lella S, Mati MA et al., (2007) Characterization of the galectin-1 carbohydrate recognition domain in terms of solvent occupancy. J. Phys. Chem. B., 111, 7360-7366.)

스팟 5은 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(human thioredoxine double mutant)이다. 이 단백질은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 증가하다가 오염 후기에는 전기보다 감소하는 단백질이다. 인간 티오레독신(Human thioredoxin)은 인비트로(in vitro)에서 단백질의 다이설파이드(disulfide) 결합을 환원시킬 수 있으며 세포 내에서는 NFkB같은 전사인자를 활성화시킬 뿐만 아니라 성장 인자(growth factor)로 작용할 수 있으며 몇종의 암세포에서 과발현되는 특성을 보인다(Weichsel, A, Gasdaska J.R., Powis G, Montfort WR, Crystal structure of reduced, oxidized, and mutated human thioredoxins: evidence for a regulatory homodimer, Structure, 15, 735-751, 1996). .

헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI)(스팟 12)은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 감소하다가 오염 후기에는 증가하는 단백질이다. 이 단백질은 RNAi 과정에서 두 가닥 RNA 잘림과 관련 있는 단백질이다(Matsuda S, et al., (2000) Molecular cloning and characterization of a novel human gene (HERNA) which encodes a putative RNA-helicase. Biochim. Biophys. Acta., 1490, 163-169.).

카보닐 리덕테이즈(Carbonyl reductase) 1 (스팟 16)은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 감소하다가 오염 후기에는 전기보다 증가하는 단백질이다. 이 단백질은 두 전자의 환원을 촉매시키는 모노머 사이토졸(monomeric cytosolic) 효소이며 보인자로서 NADPH를 사용하여 기질을 활성시킨다(Vanessa Gonzalez-Covarrubias, Debashis Ghosh et al.,(2007) A functional genetic polymorphism on human carbonyl reductase 1 (CBR1 V881) impacts an catalytic activity and NADPH binding affinity. Drug metabolism and Disposition, 35, 973-980.).

체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, nucleoside triphosphate, nucleoside diphosphate:Mol:1;molecule: nuceloside diphosphate kinase; chain: A,8,C,D,E,F;EC:2.7.4.6) (스팟 30) 단백질은 포름알데히드의 오염 전기에는 발현량이 감소하다가 오염 후기에는 증가하는 단백질이다. 이 단백질은 뉴클레오시드- 디포스페이트 카이네이즈(nucleoside-diphosphate kinase)와 관련있는 단백질로 뉴클레오시드-디포스페이트 카이네이즈는 서로 다른 뉴클레오시드 디포스페이트(nucleoside diphosphates) 사이의 인산 그룹의 상호교환을 촉매하는 효소로 알려져 있다(Rumjahn SM, et al., (2007) Purinergic regulation of angiogenesis by human breast carcinoma-secreted nucleoside diphosphate kinase. Br. J. Cancer. Epub ahead of print.)

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커는 포름알데히드 오염을 검출하는 데에 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 또한, 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커 검출 방법에 있어서, "항체"는 포름알데히드 오염 마커에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 항체를 생산하는 것은 당업계에 널리 공지되어 있으므로, 당업계에 널리 공지된 항체 생산 방법 중 어느 하나를 선택하여 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커 검출 방법은, 당업계에 널리 알려져 있는 방법 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯, ELISA, 또는 면역침강기법과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다.

다클론 항체는 상기한 포름알데히드 오염 마커 단백질 항원을 동물에 주사하 고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 포름알데히드 오염 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 포름알데히드 오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

단클론 항체는 포름알데히드 오염 마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 포름알데히드 오염 마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으 로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다(예, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01;and the Stratagene SurβAPS Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝에 특히 사용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예컨대 미국 특허 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619;WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; 및 90/02809; Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 2개의 항체 또는 "샌드위치" ELISA를 사용하여 환자 샘플에서의 포름알데히드 오염 마커의 과다 발현을 검출한다. 상기 "샌드위치" 또는 "두 부위" 면역분석은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Current Protocols in Immunology. Indirect Antibody Sandwich ELISA to Detect Soluble Antigens, John Wiley & Sons, 1991를 참조한다. 이러한 측면에서, 본 발명은 하나의 포름알데히드 오염 마커상에 서로 상이한 항원 형성 부위 2곳에 특이적인 항체 2개를 사용한다. "서로 상이한 항원 형성 부위"는 항체들은 목적한 포름알데히드 오염 마커 단백질상의 상이한 부위에 특이적이어서, 하나의 항체의 결합은 포름알데히드 오염 마커 단백질에 다른 항체의 결합을 현저하게 방해하지 않는 것을 의미한다. 제1 항체, 이른바 "포획 항체"는 고형 지지체에 고정 또는 결합된다. 예컨대, 목적한 포름알데히드 오염 마커에 대한 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰, 비드, 큐벳 또 는 그외 반응 용기에 공유 또는 비공유적으로 부착될 수 있다. 바람직한 예에서, 포획 항체는 마이크로타이터 플레이트 웰에 결합된다. 고형 지지체에 항체를 부착하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 신체 샘플, 특히 혈청 샘플을 고형 지지체와 접촉시켜, 결합된 포획 항체와 복합체를 이룰 수 있도록 한다. 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 이차 항체, 이른바 "검출 항체"를 고형 매트릭스에 첨가한다. 검출 항체는 목적한 포름알데히드 오염 마커상의 개별적인 항원 형성 부위에 특이적이며, 검출가능한 신호를 제공하는 물질로 커플링되거나 또는 표지된다. 이러한 항체 표지물은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 검출 항체와 인큐베이션한후, 결합되지 않은 항체는 제거하고, 고형 지지체에 결합된 표지된 검출 항체를 정량하여 포름알데히드 오염 마커의 발현 수준을 측정한다. 포획 및 검출 항체를 신체 샘플과 전술한 바와 같이 연속적으로 또는 동시에 접촉시킬 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 나아가, 고정된 포획 항체와 샘플을 접촉하기 전에 먼저 신체 샘플을 검출 항체와 인큐베이션할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥 시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.

항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 진단용 키트에 대하여 설명하면 다음과 같다. "키트"는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다. 부가적으로, 키트는 키트와 그의 사용 방법이 설명된 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 임의의 또는 모든 키트 시약을 외부 환경으로부터 이를 보호하는 밀폐된 용기 또는 파우치와 같은 용기에 포함시킬 수 있다.

특정 예로, 본 발명의 면역세포화학 키트는 적어도 2가지 이상의 개별 단백질 마커의 발현을 특이적으로 검출하기 위한 2가지 이상의 시약, 예컨대 항체를 추가적으로 포함한다. 각 항체는 개별 시약으로써 또는 목적한 상이한 단백질 마커에 대한 모든 항체를 포함한 항체 칵테일로서 키트에 제공될 수 있다.

바람직한 예로, 면역화학적인 방법 특히 "샌드위치" ELISA 을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 수동 또는 자동화된 면역화학적인 기법과 함께 사용가능하다. 이러한 키트는 목적한 단백질 마커에 대한 하나 이상의 제1포획 항체, 단백질 마커의 다른 항원성 부위에 특이적인 표지된 제2 검출 항체, 및 단백질 마커에 항체 결합을 검출하기 위한 화합물을 포함한다. 제1 포획 항체는 이후 고형 지지체에 부착하기 위해 용액중으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 포획 항체는 고형 지지체, 예컨대 비드나 마이크로타이터 플레이트의 웰에 이미 결합된 키트로 제공될 수 있다. 항원-항체 복합체를 검출하는 임의의 화합물을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일부 예에서, 제2 검출 항체는 기질의 비색 변환을 촉매하는 효소가 접합된다. 이러한 효소 및 항체 결합을 검출하기 위한 이의 이용 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 예로, 키트는 HRP가 접합된 제2 검출 항체를 포함한다. 접합된 효소(예, HRP-표지된 제2 검출 항체의 경우, 테트라메틸벤지딘)와 황산과 같이 효소 반응을 중지시키는 용도의 용액과 같이 사용할 수 있는 기질, 특히 발색단을 추가적으로 제공할 수 있다. 특정 예에서, 항체 결합을 검출하기 위한 화합물은 상업적으로 이용가능한 시약 및 키트를 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 "샌드위치" ELISA 키트는 목적한 2 이상의 상이한 바이오마커를 검출하기 위한 항체들을 포함한다. 이러한 키트는 2 이상의 제1 포획 항체와 각각의 바이오마커에 대한 2차 검출 항체를 포함한다. 상기 포획 항체는 개별적인 시약으로서 또는 대안적으로는 목적한 여러가지 바이오마커에 대한 모든 항체들의 혼합물로 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 채택된 시약의 정확한 사용과 활성을 검증하기 위해, 키트내에 양성 및/또는 음성 대조군이 함유될 수 있다. 대조군은 목적한 바이오마커가 있거나 없는 것으로 알려진 조직 단편, 글라스 슬라이드에 고정된 세포 등과 같은 샘플을 포함할 수 있다. 특정 예로, 양성 대조군은 목적한 바이오마커 단백질을 포함하는 용액이다. 대조군의 제작 및 사용은 당업자의 일반적인 능력 내에서 표준적이며 자명하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 세포주 배양 및 포름알데히드 처리

본 연구에서는 인간 폐 상피세포주(human lung epithelial cell line)인 NCI-H292 세포를 사용하였다. NCI-H292 세포는 10% 열불활성화된 태아 소 혈청(heat inactivated fetal bovine serum) (FBS) (Hyclone)과 1% 항생제 (페니실린-스트렙토마이신) (Hyclone)이 첨가된 RPMI-1640 (Rosewell Park Memorial Institue) (Hyclone)배지를 사용하여 5% CO₂, 95% air가 공급되는 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

NCI-H292 세포의 부착 특성으로 인해 배양액을 흡입 제거한 후 1X PBS 버퍼로 수세한 후, 2.5 ml의 트립신-EDTA 용액을 가하여 약 3 분간 반응시켜 세포를 떼어주고 새 배지 4 ml을 첨가하여 트립신-EDTA 용액에 의한 반응을 멈춘 뒤, 부유된 세포들을 원심분리용 튜브로 옮기고, 1,200 rpm에서 3 분간 원심분리한 후 상등액을 다시 제거 후 5 ml의 새로운 배지에 수확된 세포를 현탁하여 세포 배양 플라스크에 분주하고 5% CO₂, 95% air가 공급되는 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실험에 사용된 NCI-H292 세포들은 100φ 세포 배양 플라스크 (BD)에 1.5x10⁶ 세포를 배양하였다. 그리고 100μM의 HCHO 를 새 배지에 넣어준 후 24시간, 48시간동안 세포에 처리 및 배양하였고 대조군으로 사용된 세포는 HCHO가첨가되지 않은 배지를 넣어주고 배양하였다. 본 실험에서는 37% formaldehyde 용액인 포르말린을 사용하였다.

2. 세포수확 및 단백질 정량

100 φ 세포 배양 플라스크 (BD)에서 100 uM의 HCHO로 24 시간, 48 시간 동안 배양한 세포들을 차가운 1xPBS로 2 회 수세하였고, 1 mM PMSF와 0.1% Triton X-100을 포함한 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액 1 ml을 첨가하여 세포를 융해하였다. 융해된 세포 혼합액을 4, 12,000 rpm에서 15 분 동안 원심 분리하여 침전된 세포부산물을 제거한 후 상층액을 얻었다. 얻은 상층액에 대한 단백질의 정량은 표준 단백질로 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 Bio-rad사의 단백질 분석 시약 200㎕와 BSA를 0-60 mg/ml의 농도로 반응시킨 후 15 분 후에 595 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성 후 시료를 동일한 조건으로 측정하여 단백질 농도를 결정하였다.

3. 이차원 전기영동(2-dimensional gel electrophoresis)

이차원 전기영동을 위해서 100 uM의 HCHO가 처리된 NCI-H292 세포를 모은 뒤 총 단백질을 분리하였다, 그리고 차가운 10% TCA / 아세톤 용액을 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 남아 있는 TCA를 제거하기 위해서 차가운 아세톤으로 5 회 반복하여 세척하였고, 남아있는 아세톤을 상온에서 증발시켰다. 추출된 단백질은 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

3-1. 일차원 전기영동(Isoelectrofocusing:IEF;등전점 전기영동)

100 uM의 HCHO가 처리된 세포에서 분리한 총 단백질 양은 각각 700㎍ 이상이 되게 하였고, 250㎕의 재수화(rehydration) 용액 (7 M 유레아, 2 M 티오유레아, 4% CHAPS, 0.5% ampholytes, 100 mM DTT, 0.01% 브로모페놀 블루)을 사용하여 단백질을 녹였다. 250㎕의 재수화 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG holder에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 13 cm 고정된 드라이 스트립(immobilized dry strip) (pH 3-10 NL, Amer sham Bioscience)를 이용하여 12 시간 동안 재수화시켰다. 250 V/ 100 Vhrs, 500 V/ 500 Vhrs, 1,000 V/ 1,000 Vhrs, 8,000 V/ 38,000 Vhrs 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

3-2. 이차원전기영동

(SDS-PAGE : SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 1 차 평형화 완충용액 [6 M urea, 0.4 M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 2% DTT, 10% 글리세롤]에서 각각 15 분간 1 차 평형화를 실시한 후, 2 차 평형화 완충용액 [6 M 유레아, 0.4 M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 2.5% 요오도아세트아미드, 10% 글리세롤]에서 15분간 2 차 평형화를 실시하였다 12.5% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 1% 아가로스 젤로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 15 분 동안 겔 당 25 mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 5시간 동안 겔 당 50 mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

3-3. 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 Coomassie Blue G-250 염색 용액 (34% 메탄올, 0.1% Coomassie G-250, 17% 암모늄 설페이트, 3% 포스포릭산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12 시간 이상 염색한 후 5% 아세트산을 사용하여 탈색하였다.

3-4. 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLoook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 Image Master^TM(2D software, Amersham)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3 장의 겔을 분석하였다.

4. MALDI-TOF 분석

단백질 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Bioscience)을 사용하였다. Rockfeller 대학에서 제작한 ProFound (http://129.85.19.192/ profound-bin Webpro Found.exe)를 사용하여 분석된 펩타이드 질량값들을 데이터베이스를 통해 조사하였고 그 결과를 바탕으로 단백질을 동정하였다. 단백질의 질량분석과 단백질 동정은 (주)제노마인에 의뢰하였다. HCHO에 의해 변화된 스팟을 선택한 후 분석을 하기 위해 겔에서 스팟을 오려낸 다음 튜브에 담은 후 30 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide)와 100 mM 소디움 티오설페이트(sodium thiosulfate)를 1 : 1로 섞어 단백질 스팟이 들어있는 튜브에 첨가하였다. 염색시약이 사라질 때까지 방치하고 증류수를 이용하여 염색시약이 완전히 제거될 때까지 세척하였다. 200 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)에서 20 분 동안 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. 겔 조각이 불투명한 흰색이 될 때까지 아세토니트릴로 탈수시킨 후 진공 원심 분리기에 튜브를 넣고 30 분간 겔을 건조하였다. 5-10 ng/ml의 ㅌ트립신과 암모늄 바이카보네이트를 넣고 37℃에서 12 시간 이상 방치하였다. 이후 5% TCA가 들어있는 H₂O : 아세토니트릴 (50 : 50)용액을 10-20 ml 넣고 펩타이드 절편들을 3 회 반복하여 추출하였다. 추출액을 진공 원심분리기에 넣고 2 시간 동안 건조시킨 후 MALDI-TOF를 이용하여 분석하였다.

5. 웨스턴 블롯에 의한 분석

100 uM의 HCHO로 각각 24 hr, 48 hr 처리한 세포에 lysis buffer (0.05 M, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100Tris-HCl) 1 ml을 첨가하여 세포를 융해하였다. 융해된 액은 원심 분리하여 세포 부산물을 제거한 후 상등액을 취해 단백질 정량을 실시하였다. 그 후 동일양의 각 단백질 시료를 시료용 완충용액 [0.05 M Tris-HCl 완충용액 (pH 6.8), 2% SDS, 5% β-머캡토에탄올, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루]과 혼합한 후 100℃에서 5분간 가열하여 단백질을 완전히 변성시켰다. 시료와 표준단백질을 5% 아크릴아마이드로 된 스태킹 겔과 10% 아크릴아마이드로 된 러닝 겔에서 분리하였다. 분리된 단백질을 블롯팅 키트에 트랜스퍼 버퍼 (192 mM 글리세린, 25 mM Tris, 20% 메탄올)을 채운 상태에서 PVDF 멤브레인으로 1시간 30분 동안 250 mA로 이동시켰다. 5% 탈지용액에 넣어 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 TBST 완충용액으로 씻은 다음 항-빈큘린 항체 (1:400 / 5% non-fat milk blocking solution)로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10 분씩 수 회 세척 후 홀스라디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 항-마우스 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG) (1:5000 / 5% non-fat mild blocking solution)와 실온에서 30 분 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10 분씩 수회 세척후 멤브레인을 ECL 용액 (Amersham)에서 3 분간 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.

동일 멤브레인 상에 양성 대조군(positive control)의 검출을 위하여 위에서 실험했던 PVDF 멤브레인을 reprobing buffer [0.1 M Glycine (pH 2.5)]에 10 분 동안 반응 시킨 후 TBST 완충용액으로 수회 세척 하여 5% 탈지용액에 넣어 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. Anti-β-actin Ab (1:3000 / 5% non-fat milk blocking solution)로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10 분씩 수 회 세척 후 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG (1:5000 / 5% non-fat mild blocking solution)와 실온에서 30 분 동안 반응시켰다. TBST 완충용액으로 10 분씩 수회 세척후 membrane을 ECL solution (Amersham)에서 3 분간 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.

6. 결과

포름알데하이드에 의한 사람 폐 상피세포의 프로테옴 발현 변화

100 uM HCHO를 24 시간, 48 시간 동안 처리한 후 NCI-H292 세포에서 일어나는 단백질의 발현 변화를 프로테오믹스 기법을 사용하여 분석하였다. NCI-H292 세포에 100 uM HCHO를 24 시간, 48 시간 동안 처리한 후 총 단백질을 분리하고 단백질의 등전점 값에 따라 분리하는 nonlinear strip (pH 3-10)을 사용하여 1 차원으로 분리하였다. 그리고 다시 단백질의 크기에 따라 이차원 전기영동으로 분리하여 HCHO에 의해 차별적인 단백질의 발현 변화를 이미지로 나타내었다(도 1). 도 1에서 보여주듯이 총 단백질은 겔상에 고루 분포되었고, HCHO가 처리되지 않은 대조군에서 발현된 총 단백질 스팟은 약 359 개 이상이었다 (도 2). 그리고 이들 스팟 중에서 HCHO에 의해 증가된 20 개의 단백질과 24 시간 처리 시에는 증가하였지만 48 시간 처리에 감소되는 7개의 단백질, 그리고 24 시간 처리에서 감소하였지만 48 시간 처리 시 증가한 6개의 단백질을 발굴할 수 있었다. 이렇게 HCHO에 의하여 뚜렷한 차이를 보이는 총 33 개의 단백질 스팟을 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용하여 동정하여 표로 나타내었다(표 1 및 표 2).

프로테옴 분석방법에서 포름알데히드에 의해서 현저하게 증가하는 빈큘린 단백질을 택하여 웨스턴 블롯방법으로 재검증하였다. 그 결과 도 6에서 알 수 있듯이 포름알데히드에 의해서 빈큘린 발현양이 증가함을 알 수 있으며 이러한 결과는 프로테옴분석 결과와 잘 일치함을 보여준다.

스팟 넘버	동정된 단백질	기탁번호	Cov %	매칭 펩티드 번호	Tr/M.W/ pI	24hr	48hr
스트레스 반응(St r ess response) 단백질
5	32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser)	1ERW	44	4	11.86/4.8	↗	↘
11	열 쇼크 90kDa 단백질 1 베타(Heat shock 90KDa protein 1, beta)	NP_031381	21	12	83.59/5.0	↗	↗
18	열 쇼크 27kDa 단백질 1(Heat shock 27KDa protein 1)	NP_001531	37	8	22.82/6.0	↗	↗
23	(+)-안티-Bpde의 Gsh 컨쥬게이트와 복합된 Hgstp1-1[v104]의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of Hgstp1-1[v104] complexed with the Gsh conjugate of (+)-Anti-Bpde)	4PGTA	43	8	23.39/5.4	↗	↗
24	퍼옥시레독신 3 이소폼 b(Peroxiredoxin 3 isoform b)	NP_054817	30	5	26.11/7.1	↗	↗
26	퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1)	NP_002565	72	18	22.32/8.	↘	↗
28	Holo 타입 인간 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 구조 체인 A(Chain A, the structure of Holo type human Cu, Zn superoxide dismutase)	1HL5A	39	4	16.01/5.7	↗	↗
세포 골격(Cytoskelecton) 단백질
3	로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha)	NP_004300	10	40	23.25/5.0	↗	↘
8	빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL)	NP_003364	18	14	117.28/5.8	↗	↗
9	빈큘린(Vinculin)	AAH39174	21	17	117.29/5.8	↗	↗
10	빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL)	NP_003364	18	15	117.28/5.8	↗	↗
29	코필린 1(Cofilin 1)	NP_005498	36	7	18.71/8.5	↘	↗
대사/수송(Metabolism/transport) 단백질
1	C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase)	P11586	11	11	102.23/6.9	↗	↘
2	메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase)	AAH50420	15	11	102.26/6.9	↗	↘
6	CPS1 이소폼(CPS1 isoform)	AAP84318	10	10	117.10/5.7	↗	↘
13	알돌레이즈 A(Aldolase A)	1ALD	30	9	39.73/8.8	↘	↗
16	카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1)	NP_001748	57	13	30.64/8.9	↘	↗
20	포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain)	AAH62302	34	9	28.92/6.7	↗	↗
22	2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid)	1HTIA	66	17	26.81/6.5	↗	↗

단백질 합성/대사/가공/분해( Proteinsynthesis / metabolism / processing / degradation )
17	유비퀴틴 카복실-터미널 에스터레이즈 L1(Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1)	NP_004172	53	11	25.15/5.3	↗		↗
19	프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit)	NP_002782	40	8	27.84/6.3	↗		↗
21	PSMA 4 단백질(PSMA4 protein)	AAH22817	38	9	29.62/7.7	↗		↗
33	샤페로닌 10-관련 단백질(Chaperonin 10-related protein)	AAC96332	35	5	10.28/9.0	↗		↗
핵산 대사 및 수송, 핵 단백질( Nucleic acid metabolism and transport, nuclear protein)
7	카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I)	BAD74209	10	14	166.00/6.3	↗		↘
12	헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI)	BAA78691	9	13	221.53/5.5	↘		↗
30	체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6)	1NUEA	54	7	17.26/8.8	↘		↗
항 염증 활성(Anti-inflammatory activity) 단백질
14	애넥신 I(Annexin I)	NP_000691	44	14	38.92/6.6	↗		↗
15	애넥신 A4(Annexin A4)	P09525	49	16	36.09/5.8	↗		↗
기타 단백질
4	베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs)	NP_002296	47	6	15.04/5.3	↗		↘
25	인간 Dj-1의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of human Dj-1)	1J42A	31	6	20.06/6.3	↗		↗
27	이소폼 a에서 발현되는 단백질인 비-전이세포 1(Non-metastatic cells 1, NM23A) expressed in isoform a	NP_937818	53	11	19.86/5.4	↗		↗
31	사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure)	3CYSA	39	9	18.09/8.1	↗	↗
32	사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A (Nmr,22 structure))	3CYSA	33	6	18.09/8.1	↗	↗

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 포름알데히드 오염 마커들의 발현 양상을 나타내는 이차원 전기영동 사진이다.

도 2는 NCI-H292 세포의 표준 이차원 전기영동 사진이다.

도 3은 HCHO로 24시간 처리시와 48시간 처리시에 발현량이 모두 증가한 단백질의 전기영동 사진이다.

도 4는 HCHO로 24시간 처리시에는 발현량이 증가하지만 48시간 처리시에는 발현량이 감소한 단백질의 전기영동 사진이다.

도 5는 HCHO로 24시간 처리시에는 발현량이 감소하지만 48시간 처리시에는 발현량이 증가한 단백질의 전기영동 사진이다.

도 6는 NCI-H292 세포에 HCHO를 처리 한 후 웨스턴-블럿을 이용한 빈큘린 특수 단백질 검출 검사 사진이다.

Claims

생체의 포름알데히드 오염 여부를 진단하기 위한 마커인, 표 1 및 표 2에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 포름알데히드 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 생체의 포름알데히드 오염 여부 진단용 키트.

[표 1]

스팟 넘버 동정된 단백질 기탁번호 Cov % 매칭 펩티드 번호 Tr/M.W/
pI 24hr 48hr 스트레스 반응(Stress response) 단백질 5 32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser) 1ERW 44 4 11.86/4.8 ↗ ↘ 11 열 쇼크 90kDa 단백질 1 베타(Heat shock 90KDa protein 1, beta) NP_031381 21 12 83.59/5.0 ↗ ↗ 23
(+)-안티-Bpde의 Gsh 컨쥬게이트와 복합된 Hgstp1-1[v104]의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of Hgstp1-1[v104] complexed with the Gsh conjugate of (+)-Anti-Bpde) 4PGTA
43 8
23.39/5.4
↗ ↗ 24 퍼옥시레독신 3 이소폼 b(Peroxiredoxin 3 isoform b) NP_054817 30 5 26.11/7.1 ↗ ↗ 26 퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1) NP_002565 72 18 22.32/8. ↘ ↗ 28 Holo 타입 인간 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 구조 체인 A(Chain A, the structure of Holo type human Cu, Zn superoxide dismutase) 1HL5A 39 4 16.01/5.7 ↗ ↗ 세포 골격(Cytoskelecton) 단백질 3 로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha) NP_004300 10 40 23.25/5.0 ↗ ↘ 8 빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL) NP_003364 18 14 117.28/5.8 ↗ ↗ 9 빈큘린(Vinculin) AAH39174 21 17 117.29/5.8 ↗ ↗ 10 빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL) NP_003364 18 15 117.28/5.8 ↗ ↗ 29 코필린 1(Cofilin 1) NP_005498 36 7 18.71/8.5 ↘ ↗ 대사/수송(Metabolism/transport) 단백질 1 C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase) P11586 11 11 102.23/6.9 ↗ ↘ 2 메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase) AAH50420 15 11 102.26/6.9 ↗ ↘ 6 CPS1 이소폼(CPS1 isoform) AAP84318 10 10 117.10/5.7 ↗ ↘ 16 카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1) NP_001748 57 13 30.64/8.9 ↘ ↗ 20 포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain) AAH62302 34 9 28.92/6.7 ↗ ↗ 22 2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid) 1HTIA 66 17 26.81/6.5 ↗ ↗

[표 2]

단백질 합성/대사/가공/분해(Proteinsynthesis/metabolism /processing/degradation) 17 유비퀴틴 카복실-터미널 에스터레이즈 L1(Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1) NP_004172 53 11 25.15/5.3 ↗ ↗ 19 프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit) NP_002782 40 8 27.84/6.3 ↗ ↗ 21 PSMA 4 단백질(PSMA4 protein) AAH22817 38 9 29.62/7.7 ↗ ↗ 핵산 대사 및 수송, 핵 단백질( Nucleic acid metabolism and transport, nuclear protein) 7 카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I) BAD74209 10 14 166.00/6.3 ↗ ↘ 12 헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI) BAA78691 9 13 221.53/5.5 ↘ ↗ 30 체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6) 1NUEA 54 7 17.26/8.8 ↘ ↗ 기타 단백질 4 베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs) NP_002296 47 6 15.04/5.3 ↗ ↘ 25 인간 Dj-1의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of human Dj-1) 1J42A 31 6 20.06/6.3 ↗ ↗ 27 이소폼 a에서 발현되는 단백질인 비-전이세포 1(Non-metastatic cells 1, NM23A) expressed in isoform a NP_937818 53 11 19.86/5.4 ↗ ↗ 31 사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure) 3CYSA 39 9 18.09/8.1 ↗ ↗ 32 사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A (Nmr,22 structure)) 3CYSA 33 6 18.09/8.1 ↗ ↗

삭제
a) 제1항에 따른 포름알데히드 오염 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및

b) 상기 a) 단계의 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제3항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

빈큘린 이소폼 VCL(Vinculin isoform VCL);

빈큘린(Vinculin);

열 쇼크 90kDa 단백질 1 베타(Heat shock 90KDa protein 1, beta);

유비퀴틴 카복실-터미널 에스터레이즈 L1(Ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1);

프로테아좀 알파 6 서브유닛(Proteasome alpha 6 subunit);

PSMA 4 단백질(PSMA4 protein);

(+)-안티-Bpde의 Gsh 컨쥬게이트와 복합된 Hgstp1-1[v104]의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of Hgstp1-1[v104] complexed with the Gsh conjugate of (+)-Anti-Bpde);

퍼옥시레독신 3 이소폼 b(Peroxiredoxin 3 isoform b);

인간 Dj-1의 결정 구조 체인 A(Chain A, Crystal structure of human Dj-1);

이소폼 a에서 발현되는 단백질인 비-전이세포 1(Non-metastatic cells 1, NM23A) expressed in isoform a);

Holo 타입 인간 Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 구조 체인 A(Chain A, the structure of Holo type human Cu, Zn superoxide dismutase);

코필린 1(Cofilin 1);및

사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 증가된 경우 포름알데히드 오염의 양성 판정을 하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제3항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase);

메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase);

로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha);

베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs);

32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser);

CPS1 이소폼(CPS1 isoform);

카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I);

사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure);

퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1);

코필린 1(Cofilin 1);

카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1);

포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain);

2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid);

헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI); 및

체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 포름알데히드 오염의 양성 판정을 하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase);

메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase);

로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha);

베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs);

32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser);

CPS1 이소폼(CPS1 isoform);

코필린 1(Cofilin 1);

카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I); 및

사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b)단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 많은 경우 포름알데히드 오염이 양성이고 상기 포름알데히드 오염의 진행 상태가 전기임을 판정하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

C-1 테트라하이드로폴레이트 신테이즈, 사이토플라스민(C-1 tetrahydrofolate synthase, cytoplasmin) (C1-THF synthase);

메틸렌테트라하이드로폴레이트 디하이드로지네이즈(Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase);

로 GDP 해리 저해제 알파(Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha);

베타-갈락토시드-결합 렉틴 전구체(Beta-galactoside-binding lectin precurs);

32 위치 및 35 위치의 Cys이 Ser으로 치환된 인간 티오레독신 이중 돌연변이체(Human thioredoxin double mutant with Cys 32 replaced by Ser and Cys 35 replaced by Ser);

CPS1 이소폼(CPS1 isoform);

카바모일포스페이트 신테테이즈 I(Carbamoylphosphate synthetase I); 및

사이클로스포린 A와 복합된 사이클로필린 A 체인 A(Chain A, Cyclophilin A complexed with Cyclosporin A) (Nmr,22 structure)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 적은 경우 포름알데히드 오염이 양성이고 상기 포름알 데히드 오염의 진행 상태가 후기임을 판정하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1);

코필린 1(Cofilin 1);

카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1);

포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain);

2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid);

헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI); 및

체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질의 발현량이 대조군의 정상 범위에 비해 적은 경우 포름알데히드 오염이 양성이고 상기 포름알데히드 오염의 진행 상태가 전기임을 판정하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
제5항에 있어서,

상기 포름알데히드 오염 마커는,

퍼옥시레독신 1(Peroxiredoxin 1);

코필린 1(Cofilin 1);

카보닐 리덕테이즈 1(Carbonyl reductase 1);

포스포글리세레이트 뮤테이즈 1(Phosphoglycerate mutase 1) (brain);

2-포스포글리콜산과 복합된 트리오세포스페이트 이소머레이즈 (Tim) (E.C.5.3.1.1) 체인 A(Chain A, Triosephosphate isomerase (Tim) (E.C.5.3.1.1) complexed with 2-phosphoglycolic acid);

헬리케이즈-MOI(Helicase-MOI); 및

체인 A, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 뉴클레오시드 디포스페이트 Mol_id:1; 분자: 뉴클레오시드 디포스페이트 카이네이즈; 체인: A,B,C,D,E,F; Ec:2.7.4.6(Chain A, Nucleoside triphosphate, Nucleoside diphosphate Mol_id : 1 ; molecule : Nucleoside diphosphate kinase ; chain : A, B, C, D, E, F ; Ec : 2.7.4.6)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현량이며,

상기 (b) 단계는, 검출 대상인 생물학적 시료 내의 상기 단백질이 대조군의 정상 범위에 비해 많은 경우 포름알데히드 오염이 양성이고 상기 포름알데히드 오염의 진행 상태가 후기임을 판정하는 것을 특징으로 하는 포름알데히드 오염 마커 검출 방법.
생물학적 시료 내에 존재하는 제1항에 따른 포름알데히드 오염 마커의 양이 대조군의 정상 범위에 비해 많거나 적은 경우 포름알데히드 오염 양성으로 판정하는 것을 포함하는 포름알데히드 오염 진단 방법.