WO2013105707A1 - 시트룰린화된 단백질에 특이적인 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 - Google Patents

시트룰린화된 단백질에 특이적인 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 Download PDF

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WO2013105707A1 PCT/KR2012/004074 KR2012004074W WO2013105707A1 WO 2013105707 A1 WO2013105707 A1 WO 2013105707A1 KR 2012004074 W KR2012004074 W KR 2012004074W WO 2013105707 A1 WO2013105707 A1 WO 2013105707A1
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antigen
antibody
monoclonal antibody
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김영균
이효주
김주련
정혜린
문수진
강귀영
김인제
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies capable of specifically detecting proteins containing citrine residues and hybridoma cell lines producing them.
  • the present invention relates to a composition and a detection kit for detecting citrulline-containing protein comprising the monoclonal antibody.
  • the present invention also relates to a composition and diagnostic kit for diagnosing a citlinylated protein-related disease comprising the monoclonal antibody.
  • Citrullination is the process by which arginine among the amino acid residues in a protein is de-iminized by the action of peptidylarginine deiminase (PAD) and converted to citrine during the post-translational modification of the protein. (Fig. 1). Since arginine is positively charged at thick pH, but citrine is not charged, the conversion of arginine to citrine has a significant effect on the structure and function of the protein. For example, the hydrophobicity of the protein may be increased to affect protein folding.
  • PAD peptidylarginine deiminase
  • Proteins containing citrine residues in the body include myelin basic protein (MBP), fi laggrin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), histone protein, fibrin, fibrinogen, collagen, alpha-enolase, and Non-mentin and the like are known. Citlination of these proteins is known to occur mainly in the process of cell death or tissue inflammation. Citlinylation is associated with a pathological condition, with reports of citlinylated proteins detected in patients with autoimmune diseases. It is recognized.
  • RA rheumatoid arthritis
  • ACPA anti-citrullinated protein antibody
  • Ishigami et al Reported that peptidyl alleles in the brain of Alzheimer's disease patients. It has been reported that nin deiminase 2 is increased and citrineylated proteins such as MBP, bimethine, GFAP and the like are accumulated (J Neurosci Res., 2005, 80 (1): 120-128).
  • Tatsuo et al. are known as a means of detecting citlinated proteins (Anal Biochem (1992) 203: 94-100).
  • the citlinylated site of the protein is chemically induced by using diacetyl monooxime and antipyrine, and the citlinylated protein is identified using an antibody that recognizes the derivatized site. It provides a detection technology.
  • it is necessary to perform derivatization of citrulline with respect to the cetlinized protein of a measurement object, and there exists a troublesome operation.
  • an antigen for antibody production was selected based on the most highly conserved conserved sequence in filaggrin, which is known as a cause of autoantibody production in rheumatoid arthritis, and the splenocytes obtained by administering the antigen to mice are myeloma cells. After hybridization with hybridoma cell lines, several screening processes were performed to finally select hybridomas that produce antibodies that recognize the citrine region of the protein with high specificity, thereby completing the present invention.
  • one object of the present invention is a monoclonal antibody that specifically binds to a citlinated protein, comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Or an antigen binding fragment thereof.
  • the monoclonal antibody is produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276.
  • Another object of the present invention is to provide a hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276, which produces a monoclonal antibody that specifically binds citlinated protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for detecting citrine-ized protein comprising the composition for detecting citrine-ized protein well.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing a sithrolation-related disease, including the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing citrinylation-related diseases, including the composition for diagnosing autoimmune diseases.
  • FIG. 1 shows a citrullination process in which L-arginine is converted to L-cythroline by the action of peptidylarginine deiminase (PAD).
  • PAD peptidylarginine deiminase
  • FIG. 3 is a time schedule illustrating a process for making a mouse monoclonal antibody that specifically binds to cyclic citrul 1 inated peptide (CCP) in the present invention.
  • Figure 4 shows the results of the anti-CCP and anti-CRPELISA of four mice injected with the antigen CCP twice each, and the absorbance at 450 nm wavelength (0.D).
  • Each mouse was named # 1, # 2, # 3, # 4, and the mouse serum was used by diluting step by step (1: 100, 1: 1000, 1: 5000, 1: 10000, 1: 50000, 1: 100000).
  • PBS stands for negative control, and 0 was serum obtained prior to injecting antigen into the mouse and used as another negative control to set initial values when no anti-CCP antibody was present in this serum.
  • Figure 5 shows the results of the anti-CCP and anti-CRP ELISA after the plasma cells isolated from the spleen of the mouse # 2 injected with the CCP into the antigen and fused with myeloma cells to form hybridoma cells (5 weeks, Fusion ELISA).
  • Each number represents the absorbance (0.D) value at 450 nm wavelength, and the binding strength when the anti-CCP antibody recognizes and binds to the target peptide, CCP, is converted to the value of emitted light.
  • Values marked with (+) and (-) mean positive and negative control values in each experiment.
  • Figure 6 shows the results of anti-CCP and anti-CRPELISA after two hybridoma screenings using CCP and CRP (10 weeks, 2 nd Cloning). Each number is absorbed at 450 nm wavelength (0. D) represents the value, and the values marked with (+) and (-) mean positive and negative control values in each experiment.
  • Figure 9 shows the results of immunohistochemical staining using the antibody 12G1 in the tissues of other rheumatoid arthritis patients, it can be seen that the sithrolated protein is detected.
  • Figure 10 shows the results of immunohistochemical staining using antibody 12G1 in the tissue of another rheumatoid arthritis patient, it can be seen that citlinylated protein is detected.
  • Figure 11 shows the results of immunohistochemical staining using antibody 12G1 in the tissues of patients with degenerative arthritis without inflammatory reaction, and it can be seen that citrine-ylated protein is not detected.
  • Figure 12 shows the results of immunohistochemical staining using antibody 12G1 in the amygdala tissue of the smoker, it can be seen that citlinylated protein is detected.
  • FIG. 13 shows Western blot results of detecting cetlinated antigen in samples using purified antibody 12G1 for blood samples of rheumatoid arthritis patients (RA) and healthy humans (HC). [Best form for implementation of the invention]
  • the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds a citlinylated protein, including a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Or antigen binding fragments thereof.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof which specifically binds to citlinated protein, produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276.
  • the hybridoma of the present invention may be prepared by using a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an antigen.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be one that does not bind to C-reactive protein (CRP).
  • CRP C-reactive protein
  • the present invention relates to a hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276, which produces a monoclonal antibody that specifically binds a citlinated protein.
  • the present invention relates to a citlinylated protein detection composition
  • a citlinylated protein detection composition comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276.
  • the present invention relates to a citrine-ized protein detection kit comprising the composition for detecting the citrine-ized protein.
  • the present invention provides a method for immunomodulating a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, and an antigen-antibody reaction of a sithrolated protein in a sample. It relates to a method of detection.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing citlinylation-related diseases, comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention relates to a kit for diagnosing a citrinylation related disease comprising the composition.
  • the citrinylation related disease may be rheumatoid arthritis', multiple sclerosis, psoriasis or Alzheimer's.
  • the present invention is a monoclonal that specifically binds to a citrated protein and that does not substantially react to a citrinylated protein such as a C-banung protein.
  • a citrinylated protein such as a C-banung protein.
  • citrulline residues As used herein, the term "citlinated protein", “protein containing citrulline residues” or “citlin containing protein” refers to a protein comprising citrulline residues in the amino acid residues constituting the protein, wherein In the post-translational modification of the protein, the citrulline residues are de-iminized by the action of a peptidyl arginine deiminase (PAD) to convert into citrine residues to form a protein.
  • PAD peptidyl arginine deiminase
  • Citrine residues are amino acids that are not introduced into the protein during the protein translation process, but can be generated by post-translational modification of arginine residues by PAD. That is, there is no tRNA for citrine and the presence of citrine residues in the protein is the result of only post-translational modifications.
  • Proteins containing citrine residues are known such as MBP, fillagrin, GFAP, histone protein, fibrin, fibrinogen, collagen, alpha-enolase, and bimentin. Citlination of these proteins is known to occur mainly in the process of cell death or tissue inflammation, and reports of citlinylated proteins detected in patients with autoimmune diseases have reported that citlination is associated with pathological conditions. It is recognized.
  • Antibodies provided in the present invention are monoclonal antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind citrate to lanthanated proteins and that do not substantially respond to uncitlinated proteins such as C-banung proteins, SEQ ID NO: It comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of 3 and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • antibody refers to an antibody that specifically binds to a citlinylation site of a citlinated protein, including complete antibody forms as well as antigen-binding fragments thereof.
  • a complete antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • Antigen-binding fragments of antibody molecules are those that possess antigen-binding function. Side, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain, and a first constant region of the heavy chain (CH1).
  • F (ab ') differs from Fab in that it has a hinge region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F (ab ') 2 is produced when the cysteine residues of the hinge region of Fab' form disulfide bonds.
  • Fv refers to the minimum antibody fragment having only the heavy chain variable region and the light chain variable region.
  • antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes, for example, Fab can be obtained by restriction cleavage of the entire antibody with papain, and F (ab ') 2 fragment can be obtained by cleavage with pepsin. Can be produced through genetic recombination techniques.
  • variable region refers to a portion of an antibody molecule that exhibits many variations in sequence while performing its function of specifically binding to an antigen, wherein the variable region is a complementarity determining region (CDR) .
  • CDR1, CDR2 and CDR3 are present.
  • a framework region (FR) portion exists between the CDRs to support the CDR rings.
  • complementarity determining region is a ring-shaped region that is involved in the recognition of an antigen and as the sequence of this region changes, the specificity of the antibody to the antigen is determined.
  • variable chain 1 refers to a variable region domain V H and three constant region domains C H 1, C H 2 and C H 3 comprising an amino acid sequence having a stratified variable region sequence for imparting specificity to an antigen. Means both the full length heavy chain and fragments thereof.
  • light chain herein also refers to a full length light chain and fragment thereof comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L comprising an amino acid sequence having a stratified variable region sequence for conferring specificity to an antigen. All means.
  • Antibodies of the present invention are referred to in the art known hybridoma method (See, eg, Kohler and Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6: 511-519).
  • hybridoma refers to a cell obtained by fusing B lymphocytes that produce antibodies to myeloma cancer cells (myeloma cells), which are transformed cells, which have been cultured for a long time in a culture dish.
  • myeloma cells myeloma cancer cells
  • the hybridoma of the present invention is a hybridoma cell line of Accession No. KCLRF-BP-00276.
  • the antibody produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276 was named 12G1.
  • sithrolated polypeptide antigen having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 used to prepare the antibody in the present invention is based on the most reactive conserved sequence among filaggrins known as a causative agent of autoantibody production in rheumatoid arthritis. It is manufactured by.
  • cells from an immunologically suitable host animal such as a mouse injected with an antigen are first prepared, and a cancer or myeloma cell line is prepared as the other population.
  • a cancer or myeloma cell line is prepared as the other population.
  • These two populations of cells are fused by methods well known in the art, such as polyethylene glycol, and then antibody-producing cells are propagated by standard tissue culture methods.
  • hybridomas capable of producing antibodies specific for the sithrolated protein can be produced in vitro or in accordance with standard techniques. Incubate in large quantities in vivo.
  • hybridomas can be performed by a known method.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody of the present invention is screened by binding a cytotrophin-containing polypeptide used as an immunogen to a solid support and performing a known immunoassay such as ELISA on the hybridoma culture supernatant. which Can be.
  • immunoassay was also performed using a solid support conjugated with a non-cyrrolinated protein, such as C-Sungwoong protein.
  • the monoclonal antibodies produced by the hybridomas may be used without purification, but in order to obtain the best results, it is preferable to use the purified in high purity according to methods well known in the art.
  • Antibodies prepared by the above method can be separated by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.
  • Monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof provided in the present invention can be used for various research purposes, e.g., citlinylation-related diseases, by specifically detecting citrinylated proteins present in the body or present in biological samples. This can be useful for research.
  • Citlinylation-related disorders are defined herein as diseases in which the cytolization of proteins plays a role in the development of the disorder.
  • antibodies of the present invention one skilled in the art can easily determine whether the production of citlinated proteins plays a role in the development of the disease.
  • citlinated-related diseases have abnormal levels of citrulline-containing protein in affected tissues or disease-associated tissues, and thus, from anti-citlinated protein antibodies of the present invention, The level of citrine production can be analyzed by immunological analysis such as Western blot or ELISA.
  • citlination-related diseases include, but are not limited to, inflammation-related diseases and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, psoriasis, and Alzheimer's. ⁇
  • the present invention comprises immunoassay of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and the antigen-antibody reaction of the sheeted protein in the sample, the method for detecting the sheeted protein in the sample To provide.
  • the method for detecting citrine-ized protein of the present invention can be found in the control and experimental groups.
  • the reaction level of the antigen-antibody reaction can be compared.
  • the antigen-antibody reaction level is the antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention that recognizes the antigen and the protein in the sample. It means the amount combined with, and means the amount of the antigen-antibody complex.
  • the reaction levels of these antigen-antibodies can be compared using any measurement method commonly used in the art without limitation, and can be quantitatively measured through, for example, the magnitude of a signal of a detection label.
  • the immunoassay may include any method capable of measuring the binding of the antigen to the antibody. These methods are well known in the art and, for example, Western blotting (western blotting), EL ISA (enzyme linked immunosorbent assay), a radiation side, inverse analysis (Radioimmunoassay, RIA), radial plane inverse diffusion method (Radioimmunodif fusion), immune Immunofluorescence assay (IFA), immunoblotting, Ouchter lony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation A complete fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS), or a protein chip may be used, but is not limited thereto.
  • the ELISA method can detect the citrine-ized protein in the sample.
  • ELISA reacts with a direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in a complex of antigen and an antibody attached to a solid support, or another antibody that recognizes an antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support.
  • Various ELISA methods such as indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody which recognizes the antibody after recognition, are preferred.
  • a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex may be enzymatically developed or labeled for an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. It can be detected by the sandwich ELISA method which attaches the secondary antibody thus enzymatically developing. As described above, the degree of complex formation of the antigen and the antibody is confirmed to detect citrine-ized protein in the sample. can do.
  • sample includes tissues, cells, whole blood, plasma, serum, blood, saliva, synovial fluid, urine, sputum, lymph, and cerebrospinal fluid in the subject, and cells capable of detecting citrated protein. If it is a sample containing is not limited.
  • the present invention also provides a composition and detection kit for detecting citlinated protein, comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds citlinated protein.
  • the present invention also provides a composition and diagnostic kit for diagnosing citlinylation-related diseases, including monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind citlinated proteins.
  • Kits of the present invention may further comprise tools or reagents known in the art for use in immunological assays in addition to antibodies to citlinated proteins.
  • Immunological analysis in the above may include any method that can measure the binding of the antigen and the antibody. These methods are well known in the art and include, for example, Western blots, ELISAs, radioimmunoassays, radioimmunoassays, immunofluorescence methods, immunoblots, ocreronid immunodiffusions, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation. Assays, complement fixation assays, FACS, protein chips, etc., but are not limited thereto.
  • Tools or reagents for use in immunological assays may include suitable carriers or supports, labels capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents, stabilizers, and the like.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, substrates capable of measuring enzymatic activity if the marker is an enzyme, a suitable buffer solution, secondary antibodies labeled with a chromogenic enzyme or fluorescent substance, chromogenic substrate, and reaction stop And the like.
  • Antibodies to citlinated proteins can preferably be immobilized to a suitable carrier or support using various methods as disclosed in the literature (Antibodies ' A Labotory Manual, Harlow &Lane; Cold Spring Harbor, 1988), examples of suitable carriers or supports include PBS, poly Polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluorine resin, agarose, cellulose, nitrosel, dextran, sefatex, sepharose, liposome, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide , Polyterin, gabbro, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube, polyamine-methyl vinyl ⁇ ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, metal, glass, glass Beads, magnetic particles, and the like.
  • Other solid substrates include cell culture plate ELISA plates, tubes and polymeric membranes.
  • the support may have any possible form, for example
  • Labels capable of generating a detectable signal enable qualitatively or quantitatively to measure the formation of antigen-antibody complexes, such as enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioactive materials. Isotopes and the like can be used. Enzymes include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -glucosidase, urease, peroxidase (such as horse radish peroxidase), alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glycosidase, nucleoki, nase, Maleate dihydrogenase, glucose-6-hydrophosphate dihydrogenase, invertase and the like can be used.
  • Enzymes include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -glucosidase, urease, peroxidase (such as horse radish peroxidase), alkaline phosphatase, acetylcho
  • Ligands include biotin derivatives, and light emitting materials include acridinium ester, luciferin, and luciferase.
  • Microparticles include colloidal gold, colored latex, and redox molecules such as ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ions, Cs silver, diimide, 1,4'benzoquinone, and hydroquinone.
  • Radioactive isotopes include 3 ⁇ 4, 14 C, 32 ?, 35 S, 36 C1, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 5 9 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, and the like. . However, any of those that can be used for immunological assays other than those exemplified above may be used.
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase when alkaline phosphatase is selected as an enzyme label, a solution containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, nitroblue tetrazolium, or P-nitrophenyl phosphate can be used as a substrate.
  • -D-galactosidase when -D-galactosidase is selected as the enzyme label, 0-nitrophenyl - ⁇ -D-galactosid as substrate; A solution containing 5-bromo-4-chloro-3—indole - ⁇ -D-galactopyranoside can be used.
  • various enzymes and enzyme coloring substrates known in the art may be used.
  • CCP citrullinated peptide
  • SEQ ID NO: 1 Arthritis Rheum 2000, 43 (1): 155-163
  • CRP C-reactive protein
  • Mice producing antibodies were subjected to anti-CCP and anti-CRP ELISAs from each mouse serum to select.
  • the prepared CCP peptide and CRP peptide were first diluted in PBS or carbonate buffer at a final concentration of 250ng / well.
  • FIG. 2 The basic procedure of preparing monoclonal antibodies through the hybridoma method in the present invention using the selected mouse # 2 is shown in FIG. 2.
  • the spleens of Uss # 2 were removed to separate lymphocytes and then fused with pre-cultured myeloma cells.
  • the fused cells were cultured in a medium (HAT medium) to which hypoxanthin, aminopterine, and thymidine were added, to selectively obtain cells in which only myeloma cells and B-impocytes were fused (hybridoma).
  • HAT medium hypoxanthin, aminopterine, and thymidine
  • the myeloma cells are selected if they do not fuse with B lymphocytes, and die of thymidine kinase (TK) and hypoxanthin.
  • TK thymidine kinase
  • HGPRT guanine phosphor ibosyl transferase
  • the prepared CCP peptides and CRP peptides were first diluted in PBS or carbonate buffer at a final concentration of 250 ng / well.
  • the diluted solution was incubated in a 96 well plate at 50 ul for 2 hours at room temperature and overnight at 4 ° C. Then, 200 ul of PBS was put into each well and washed. When washing, turn the plate upside down to allow all the solution inside to flow out, and then lower the plate on a paper towel to completely remove the solution.
  • the supernatant of the media on which hybridoma cells were grown was collected, diluted 1: 1000, and 100 ul was added to each well, followed by incubation at room temperature for 2 hours.
  • TMB 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • 0.16 M sulfuric acid was used as a stop solution.
  • two clones 11G1 and 12G1 were obtained in the final step through repeated screening with CCP and CRP from hybridoma cells (FIGS. 6 and 7).
  • 5 to 7 are measured values of the binding strength when the anti-CCP antibody recognizes and binds to the target peptide CCP in each screening step of the hybridoma, measured by absorbance at 450 nm wavelength. Values marked with (+) and (-) mean positive and negative control values in each experiment. Based on this, each hybridoma clone is measured to determine how effective anti-CCP is secreted.
  • Two clones 11G1 and 12G1 were selected in such a way as to induce clones that effectively secrete the anti-CCP-only clones to form a specialized cell line by repeatedly passage it, of which 12G1 cell lines were selected in November 2011.
  • 12G1 cell lines were selected in November 2011.
  • he was deposited with the Korea Cell Line Research Foundation (28 Cancer Research Institute, Seoul National University, Yeongun-dong, Jongno-gu, Seolle-si) and was assigned accession number KCLRF-BP—00276.
  • the monoclonal antibody produced in the 12G1 hybridoma cell line was named 12G1, and the variable region sequence of the heavy chain variable region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the amino acid of SEQ ID NO: 4 as a result of analysis by an automatic sequencer The light chain variable region having the sequence could be identified.
  • Example 2 Detection of Citrineylated Protein in Tissue of Rheumatoid Arthritis (Immunohistochemical Staining)
  • Paraffin-embedded tissue was cut into 4um for immunohistochemical staining To prepare. Deparaffinization by incubation in a 60 ° C. dry oven for 40 minutes, followed by dipping (100% to 70%) with decreasing ethanol at a sequential rate. This was washed with Tap water, soaked in 3% 3 ⁇ 40 2 , incubated for 13 minutes, and washed for 15 minutes. Since the 12G1 antibody to be used is a mouse-derived antibody, it was stained using the VECTASTAIN Elite ABC Kit ((Mouse IgG) Catalog # PK-6102).
  • the primary antibody was diluted 1: 100, dispensed on each slide, overnight at 4 ° C, and washed three times with tris buffer for 5 minutes. After incubation for 40 minutes using a biotin-attached secondary antibody, it was developed for 2 minutes with DAB peroxidase substrate kit (Vector Lab Catalog # SK-4100) and then dipping with tap water to stop ⁇ mayer for background staining. s stained with Hematoxylin (Wako Cat a log # 131-09665) for 2 minutes and washed thoroughly with tap water. After that, using xylene black, Mounting Medium (Vector Lab Catalog H # 5000) was mounted and observed under a microscope.
  • Figure 13 shows the result of detecting the sheet-linified antigen in the sample using the antibody 12G1 produced by hybridoma with accession number KCLRF-BP-00276 in a purified state.
  • RA rheumatoid arthritis
  • HC healthy human
  • the diagnostic utility of the antibody 12G1 according to the present invention can be used in diagnostic kits for diagnosing rheumatoid arthritis, a representative citlinylation-related disorder.
  • a diagnostic kit for rheumatoid arthritis a diagnostic kit for detecting rheumatoid factor (RF), a serological marker of rheumatoid arthritis, and a serum sample using a cyclic citrullinated peptide (CCP)
  • Anti-CCP (anti-CCP) diagnostic kits are used to detect internal anti-citlinated protein antibodies.
  • the principle of the anti-CCP diagnostic kit is to attach the CCP produced by the gene recombination technology to the microwells, dispense the sample sample to induce the antigen-antibody reaction, and detect the anti-CCP antibody present in the sample sample sample It is.
  • the kit provided in the present invention differs from the anti-CCP diagnosis kit in that it contains antibody 12G1 and detects a citrinated antigen in the sample sample sample.
  • the present inventors analyzed statistically in 48 patients with rheumatoid arthritis to confirm whether the 12 (1 ⁇ antibody diagnostic kit of the present invention is correlated with the RF diagnostic kit and anti-CCP diagnostic kit. Was carried out, and the results are shown in Table 2.
  • the existing anti-CCP diagnostic kit for the diagnosis of rheumatoid arthritis Unlike operating in a manner that detects antibodies present in a sample, the kit of the present invention is characterized by using 12G1 antibodies to detect citrineized antigen present in a sample, which has not been attempted yet. Diagnosis method The high correlation between the kit of the present invention and the anti-CCP diagnostic kit means that it is possible to introduce a diagnostic system in a manner similar to or better than that of the existing diagnosis using the antibody of the present invention. do .
  • the monoclonal antibody provided in the present invention can be used to detect citlinylated protein, and thus can be used in various fields such as cell death, tissue inflammation, and diagnosis and treatment of autoimmune diseases as an experimental material useful in laboratories.
  • the present invention may be used to study cellular processes of citrulline-related diseases, to study the effects of anti-sitlinin protein autoantibodies on pathological conditions, or to develop therapeutic agents for citlinin-related diseases.
  • Antibodies can be used.

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Abstract

본 발명은 시트룰린 잔기를 함유하는 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 시트룰린 함유 단백질 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 시트룰린화된 단백질 관련 질환의 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
시트를린화된 단백질에 특이적인 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이 브리도마 세포주
【기술분야】
본 발명은 시트를린 잔기를 함유하는 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 단클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 또 한， 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 시트를린 함유 단백질 검출용 조성물 및 검출 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단클론 항체를 포함하는 시트를린화된 단백질 관련 질환의 진단용 조성물 및 진단 키트에 관한 것이다.
【배경기술】
시트를린화 (citrullination) 란 단백질의 번역 후 변형 과정에서 단 백질 내 아미노산 잔기 중 아르기닌이 펩티딜아르기닌 탈이미노화효소 (peptidylarginine deiminase, PAD)의 작용에 의해 탈이미노화되어 시트를린 으로 변환되는 과정을 말한다 (도 1). 아르기닌은 증성 pH 에서 양성 전하를 띠지만 시트를린은 전하를 띠지 않기 때문에， 아르기닌에서 시트를린으로의 변환은 단백질의 구조 및 기능에 중요한 영향을 미친다. 예를 들어， 단백질 의 소수성이 증가하여 단백질 폴딩에 영향을 미칠 수 있다.
체내에 시트를린 잔기를 포함하는 단백질로는 MBP (myelin basic protein) , 필라그린 (fi laggrin), GFAP (glial fibrillary acidic protein) , 히스톤 단백질， 피브린， 피브리노겐， 콜라겐， 알파 -에놀라제， 및 비멘틴 등 이 알려져 있다. 이들 단백질의 시트를린화는 세포 사멸 또는 조직 염증의 과정에서 주로 일어나는 것으로 알려져 있으며., 자가면역질환 환자에서 시트 를린화된 단백질이 검출된 예들이 보고되면서， 시트를린화가 병리학적 상태 와 관련이 있는 것으로 인식되고 있다.
예를 들어, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA) 환자의 관절 내에서 시트를린화 과정이 촉진되어 단백질의 항원성이 증가되어 자가 항체 인 항-시트를린화된 단백질 항체 (anti-citrullinated protein antibody, ACPA)의 생성을 유도하는 것으로 알려져 있으며 , ACPA 는 류마티스 관절염 진단 마커로 활용되고 있다. Hoet 등은 필라그린이 ACPA 생성의 원인 물질이 라고 보고하였고 (Ann Rheum Dis. , 1991， 50： 611- 8), Masson-Bessiere 등은 류마티스 관절염 환자의 활막에 피브린의 알파- 및 베타-사슬의 시트를린화 가 존재한다고 보고하였으며 (J I醒 unol., 2001, 166:417그 84), Nogueira등 은 시트를린화된 피브리노겐이 혈청 내 ACPA 검출에 높은 특이도 및 민감도 를 가진다고 보고하였다 (Arthritis Res. , 2002 ;4: A30). 또한, Despres 등은 인간의 태반， 비장 및 류마티스 관절염 환자의 활액에서 50 kDa 의 Sa 항원 을 검출하였다고 보고하였으며 (J Rheumatol. , 1994, 21:1027- 33)， Vossenaar 등은 항 -Sa 항체가 류마티스 관절염 환자에 특이적으로 존재하며 시트를린화된 비멘틴을 인식한다고 보고하였고 (Arthritis Res. , Ther 2004, 6:R142- 50), Baeten 등은 류마티스 관절염 환자의 활막에 ACPA 와 함께 세 포내 시트를린화된 단백질 (intracellular citrullinated protein)이 존재한 다고 보고하였다 (Arthritis Rheum. , 2001， 44:2255- 62). 또한, Mamoru Yoshida 등은 류마티스 관절염에 시트를린화된 콜라겐이 자가면역성과 관련 이 있다고 보고하 고 (Mod Rheumatol , 16:276-281, 2006), Kinloch 등은 시 트를린화된 알파-에놀라제 (α-enolase)가 류마티스 관절염의 자가 항원 후 보 물질이라고 보고하였다 (Arthritis Research & Therapy, 7:R1421-29, 2005) .
다른 예로， Nicholas 등은 인간 중추 신경계에 MBP 및 GFAP 의 시트롤 린화가 존재한다고 보고하였으며 (Glia, 2002,37:328- 336), 여러 연구팀에 서 다발성 경화증 (multiple sclerosis, MS)환자의 뇌척수액에서 이들 단백 질이 증가하고 다발성 경화증의 병리학적 상태를 심화시키는 것으로 보고하 였다 (Moscarello et al . , J Neurosci Res. , 1986， 15:87- 99； Moscarello et al. , J Clin Invest . , 1994， 94:146- 154； Nicholas et al . , J Comp Neurol. , 2004, 473:128- 136).
다른 예로， Ishigami 등은 알츠하이머병 환자의 뇌에서 펩티딜아르기 닌 탈이미노화효소 2가 증가되고 시트를린화된 단백질， 예컨대 MBP, 비메틴， GFAP 등이 많이 축적된다고 보고하였다 (J Neurosci Res., 2005， 80 (1)： 120-128).
다른 예로， 건선에서， Ishida— Yamamoto등은 기작은 알려져 있지 않지 만 건선 표피에서 비정상적인 시트를린화가 PAI)1과 관련되어 있다고 보고하 였다 (J Invest Dermatol, 2000， 114:701-705).
아와 같이， 단백질의 시트를린화가 각종 자가면역질환 등에 미치는 병 리학적 영향에 대하여 많은 연구들이 수행되고 있으나， 체내에 사트를린화된 단백질의 절대적 존재량이 적고 이들을 검출하기 위한 실험적 도구가 마땅 치 않아 연구를 수행함에 있어서 일차적인 한계점이 있다.
예를 들어， 시트를린화된 단백질을 검출하는 수단으로서 Tatsuo 등의 문헌이 알려져 있다 (Anal Biochem (1992) 203:94-100). 상기 문헌에서는 단 백질의 시트를린화 부위를 디아세틸모노옥심 (monoxime) 및 안티피린 (antipyrine)을 이용하여 화학적으로 유도채화하고， 그 유도체화한 부위를 인식하는 항체를 사용하여 시트를린화된 단백질을 검출하는 기술을 제공하 고 있다. 그러나 상기에 의하여 시트를린화된 단백질을 검출하는 경우에는, 측정 대상의 시트를린화된 단백질에 관해서 시트를린의 유도체화를 행할 필 요가 있어 조작이 번잡한 문제가 있다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에, 본 발명자들은 체내 시트를린화된 단백질을 특이적으로 인식 및 검출할 수 있는 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 먼저 류마티스 관절염 에서 자가항체 생성의 원인 물질로 알려진 필라그린에서 가장 반웅성이 높 은 보존 서열을 토대로 하여 항체 제조를 위한 항원을 선정하고， 상기 항원 을 마우스에 투여하여 수득한 비장 세포를 미엘로마 세포와 융합하여 하이 브리도마 세포주들을 제조한 뒤， 수차례의 선별 과정을 통하여 단백질의 시 트를린 부위를 높은 특이성으로 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 최종 선별하여 본 발명을 완성하였다. 【기술적 해결방법】
본 발명은 시트롤린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편， 및 이의 시트를린화된 단백질 검출 용도를 제공 하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로， 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는， 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다. 바람직하게， 상기 단클론 항 체는 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마에 의해 생산되는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합 하는 단클론 항체를 생산하는， 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도 마에 의해 생산되는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편올 포함하는, 사 트를린화된 단백질 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 시트를린화된 단백잘 검출용 조성 물을 포함하는 시트를린화된 단백질 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 시료 내 시트를린화된 단백질의 항원 항체 반웅을 면역 측정하는 단계를 포함하는， 시료 내 시트를린화된 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트롤린화 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이 다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 자가면역질환 진단용 조성물을 포 함하는 시트를린화 관련 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 L-아르기닌이 펩티딜알기닌 탈이미노화효소 (peptidylarginine deiminase, PAD)의 작용에 의하여 L-시트롤린으로 전환되 는 시트를린화 (citrullination) 과정을 나타낸 것이다. - 도 2는 마우스에서 단클론 항체를 만드는 기본 과정을 나타낸 것이 다.
도 3은 본 발명에서 CCP(cyclic citrul 1 inated peptide)에 특이적으로 결합하는 마우스 단클론 항체를 만들기 위한 과정을 타임 스케즐로 나타낸 것이다.
도 4는 네 마리의 마우스에 각각 두 번에 걸쳐 항원인 CCP 를 주입한 뒤， 마우스 혈청으로부터 항 -CCP및 항 -CRPELISA를 시행한 결과를 450 nm파 장에서의 흡광도 (0.D)로 나타낸 것이다. 각 마우스는 #1， #2， #3, #4로 명명 하였으며， 마우스 혈청은 단계별로 희석하여 사용하였다 (1:100， 1:1000， 1:5000, 1:10000， 1:50000， 1:100000). PBS 는 음성대조군을 나타내며, 0차 는 마우스에게 항원을 주입하기 전에 얻어낸 혈청으로 이 혈청 내에는 항 -CCP항체가존재하지 않았을 때의 초기값을 설정하기 위해 다른 음성대조군 으로 사용되었다.
도 5는 항원으로 CCP 를 주입한 마우스 #2의 비장에서 분리한 플라즈 마 세포를 미엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만든 후 항 -CCP 및 항 -CRP ELISA를 수행한 결과를 나타낸다 (5 weeks, Fusion ELISA) . 각 숫 자는 450 nm파장에서의 흡광도 (0.D)값을 나타내는 것으로，항 CCP항체가 표 적 펩타이드인 CCP를 인지하여 결합하였을 때의 결합 강도를 발광되는 빛의 값으로 환산하여 나타낸 것이다. (+) 와 (-)로 표시된 값은 각 실험에서의 양성， 음성 대조군 값을 의미한다.
도 6은 CCP 및 CRP 를 이용하여 2회의 하이브리도마 스크리닝 후 항 -CCP및 항 -CRPELISA를 수행한 결과를 나타낸다 (10 weeks, 2nd Cloning).각 숫자는 450 nm파장에서의 흡광도 (0.D) 값을 나타내며， (+) 와 (-)로 표시된 값은 각 실험에서의 양성， 음성 대조군 값을 의미한다.
도 7은 CCP및 CRP를 이용하여 3회의 하이브리도마 스크리닝 후 선별 된 두 개의 클론 11G1 및 12G1 에 대하여 항 -CCP및 항 -CRP ELISA를 수행한 결과를 나타낸다 (13 weeks, 3nd Cloning). 각 슷자는 450 nm 파장에서의 흡 광도 (0.D) 값을 나타내며， (+)와 (-)로 표시된 값은 각실험에서의 양성, 음 성 대조군 값을 의미한다.
도 8은 류마티스 관절염 환자의 조'직에서 항체 12G1을 사용하여 면역 조직화학염색을 수행한 결과이며， Mock 는 기능성이 없이 구조만 동일한 마 우스 IgG 를 사용하여 음성대조군 (isotype control)을 설정한 것이다. 항체 12G1 에 반응할 경우 갈색으로 반응하게 되며 시트를린화된 단백질이 존재함 을 의미한다.
도 9는 다른 류마티스 관절염 환자의 조직에서 항체 12G1을 사용하여 면역조직화학염색을 수행한 결과를 나타내며， 시트롤린화된 단백질이 검출됨 을 알 수 있다.
도 10은 또 다른 류마티스 관절염 환자의 조직에서 항체 12G1을 사용 하여 면역조직화학염색을 수행한 결과를 나타내며， 시트를린화된 단백질이 검출됨을 알 수 있다.
도 11은 염증성 반웅이 존재하지 않는 퇴행성 관절염 환자의 조직에 서 항체 12G1을 사용하여 면역조직화학염색을 수행한 결과를 나타내며， 시트 를린화된 단백질이 검출되지 않음을 알 수 있다.
도 12는 흡연자의 편도 조직에서 항체 12G1을 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타내며， 시트를린화된 단백질이 검출됨을 알 수 있 다.
도 13은 류마티스 관절염 환자 (RA) 및 건강한 사람 (HC)의 혈액 시료 에 대하여 정제된 항체 12G1을 사용하여 시료 내 시트를린화된 항원을 검출 한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
하나의 양태로서， 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중 쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포 함하는， 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. ' - 바람직하게， 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마에 의해 생산되는， 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또 는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또한， 바람직하게， 본 발명의 하이브리도마는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 항원으로 하여 제조된 것일 수 있다.
또한, 바람직하게, 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 은 C—반응성 단백질 (Oreactive protein, CRP) 에는 결합하지 않는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결 합하는 단클론 항체를 생산하는， 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마 에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리 도마에 의해 생산되는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트를린화된 단백질 검출용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 시트를린화된 단백질 검출용 조 성물을 포함하는 시트를린화된 단백질 검출용 키트에.관한 것이다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 단클론 항체 또는 그의 항원 결 합 단편， 및 시료 내 시트롤린화된 단백질의 항원-항체 반웅을 면역 측정하 는 단계를 포함하는, 시료 내 시트를린화된 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 단클론 항체 또는 그의 항원 결 합 단편을 포함하는， 시트를린화 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다. 또 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 시트를린화 관련 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
바람직한 양태로서， 상기 시트를린화 관련 질환은 류마티스성 관절염'， 다발성 경화증， 건선 또는 알츠하이머일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 시트롤린화된 단백질에 특이적으로 결합하고, 비시트를린화 단백질， 예를 들어 C-반웅성 단백질에는 실질적으로 반응하지 않는 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본원에서 용어, "시트를린화된 단백질"， "시트를린 잔기를 함유하는 단백질" 또는 "시트를린 함유 단백질" 이란 단백질을 구성하는 아미노산 잔 기 중에 시트를린 잔기를 포함하는 단백질로, 상기 시트롤린 잔기는 단백질 의 번역 후 변형 과정에서 아르기닌 잔기가 펩티딜아르기닌 탈이미노화효소 (PAD)의 작용에 의해 탈이미노화되어 시트를린 잔기로 변환되어 단백질을 구성하게 된다.
시트를린 잔기는 단백질 번역 과정 동안 단백질 내로 도입되지 않는 아미노산이지만， PAD에 의해 아르기닌 잔기의 번역 후 변형에 의해 발생될 수 있다. 즉， 시트를린에 대한 tRNA는 존재하지 않고， 단백질에서 시트를린 잔기의 존재는 오로지 번역 후 변형의 결과이다.
시트를린 잔기를 함유하는 단백질로는 MBP, 필라그린 (fillagrin), GFAP, 히스톤 단백질， 피브린， 피브리노겐， 콜라겐， 알파 -에놀라제， 및 비멘 틴 등이 알려져 있다. 이들 단백질의 시트를린화는 세포 사멸 또는 조직 염 증의 과정에서 주로 일어나는 것으로 알려져 있으며， 자가면역질환 환자에서 시트를린화된 단백질이 검출된 예들이 보고되면서， 시트롤린화가 병리학적 상태와 관련이 있는 것으로 인식되고 있다.
본 발명에서 제공하는 항체는 시트를란화된 단백질에 특이적으로 결 합하고, 비시트를린화 단백질, 예를 들어 C-반웅성 단백질에는 실질적으로 반응하지 않는 단클론 항체 및 그의 항원 결합 단편으로， 서열번호 3의 아미 노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지 는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 용어， "항체" 는 시트를린화된 단백질의 시트를린화 부위에 특이적으로 결합하는 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 그의 항원 결 합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 디설파이드 결합으로 연결되어 있 다.
항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단 편을 의미하며， Fab, F (ab'), F (ab')2 및 Fv등을 포함한다. 항체 결합 단 편 중， Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. F (ab')는 중쇄 CH1도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차아가 있다 . F (ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각 을 말한다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고， 예를 들어， 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있 고 펩신으로 절단하면 F (ab')2단편을 얻을 수 있으며 , 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본원에서 용어， "가변 영역"이란 항원과특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고， 가 변 영역에는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)인. CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역 (framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한 다. '
본원에서 용어， "상보성 결정 영역' '은 항원의 인식에 관여하는 고리모 양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
본원에서 용어， "중쇄1 '는 항원에 특이성을 부여하기 위한 층분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
또한 본원에서 용어， "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 층분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불 변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한 다.
본 발명의 항체는 당업계 알려진 기술올 참고하여 하이브리도마 방법 에 의하여 제조되었다 (예， Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6 :511ᅳ 519 참조).
본원에서 용어， "하이브리도마" 는 항체를 생산하는 B 림프구와 골수 종 암세포 (미엘로마 세포)를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데， 미엘로마 세포는 형질전환된 세포로， 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어， 한 가지 항체만을 만들어 내는 미엘로마 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득할 수 있다. 바람직하게， 본 발명의 하 이브리도마는 수탁번호 KCLRF-BP-00276 의 하이브리도마 세포주이다. 본 발 명에서는 수탁번호 KCLRF-BP-00276인 하이브리도마에 의해 생산되는 항체를 12G1 으로 명명하였으며， 이의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 분석한 결과, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미 노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 것으로 분석되었다.
본 발명에서 상기 항체를 제조하기 위해 사용한 서열번호 1의 아미노 산서열을 가지는 시트롤린화 폴리펩타이드 항원은， 류마티스 관절염에서 자 가항체 생성의 원인 물질로 알려진 필라그린 중에 가장 반응성이 높은 보존 서열을 토대로 하여 제조한 것이다.
본 발명에서 적용한 하이브리도마 방법을 간략히 설명하면， 먼저 항원 을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 준비하고， 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 미엘로마 세포주를 준비한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시킨 후 항체 -생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의 해 증식시킨다. 한계 희석법 (limited dilution technique)에 의한 서브클로 닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후， 시트롤린화된 단백질에 대해 특이 적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에 서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다.
하이브리도마의 스크리닝은 주지의 방법에 의하여 행할 수 있다. 예를 들면, 면역원으로서 이용한 시트롤린 함유 폴리펩타이드를 고체 지지체에 결 합시키고， 하이브리도마 배양 상청액에 대하여 ELISA등의 주지의 면역 측정 을 수행하여 본 발명의 단클론 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 이 때， 시트롤린화 되어 있지 않은 단백질， 예컨대 C-반웅성ᅳ단백 질을 결합시킨 고체 지지체를 이용한 면역 측정도 함께 수행하고， 시트를린 화된 폴리펩타이드에 대한 반응성이 비시트를린화 단백질에 대한 반웅성보 다도 높은 것을 선별함으로써， 비시트를린화 단백질에의 교차 반웅성이 낮은 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택할 수 있다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용 할 수도 있으나， 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석， 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로 마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은， 체내 에 존재하는， 또는 생체 시료 내 존재하는 시트를린화된 단백질을 특이적으 로 검출함으로써 다양한 연구 목적， 예를 들어， 시트를린화 -관련 질환의 연 구에 유용하게 사용될 수 있다.
시트를린화 -관련 질환은 본원에서 단백질의 시트롤린화가 질환의 발 병에 있어서 일정한 역할을 수행하는 질환으로서 정의된다. 본 발명의 항체 를 사용하여， 시트를린화 단백질의 생성이 질환의 발병에 있어서 일정한 역 할을 수행하는지 여부를 당업자가 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어， 시 트를린화 -관련 질환은 영향 받은 조직 또는 질환 관련 조직에서 비정상적인 수준의 시트를린 함유 단백질이 존재하므로， 본 발명의 항 -시트를린화 단백 질 항체를 이용하여 목적 조직 시료로부터 웨스턴 블롯 또는 ELISA와 같은 면역학적 분석에 의하여 시트를린 생성의 수준을 분석할 수 있다.
이러한 시트를린화 -관련 질환은 염증 관련 질환 및 자가면역질환， 예 를 들어ᅳ 류마티스성 관절염， 다발성 경화증， 건선， 및 알츠하이머 등을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. ᅵ
따라서， 본 발명은 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편， 및 시료 내 시트를된화된 단백질의 항원 -항체 반웅을 면역 측정하는 단계를 포함하는， 시료 내 시트를린화된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 시트를린화된 단백질의 검출 방법은 대조군 및 실험군에 본 발명의 항체를 처리한 후 항원 -항체 반응의 반응 수준을 비교할 수 있는 데， 본 발명에서 항원 -항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백잘 항원과 이 를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하 며， 항원 -항체 복합체의 양을 의미한다. 이러한 항원-항체의 반웅 수준은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있으며， 예를 들어， 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
상기에서 면역 측정은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방 법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어， 웨스턴블랏 (western blotting), EL ISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선면'역분석법 (Radioimmunoassay, RIA) , 방사면 역 확산법 (Radioimmunodif fusion) , 면역형광분석법 (Immunofluorescence assay, IFA), 면역 블롯 (immunoblotting)， 오우크레로니 (Ouchter lony) 면 역 확산법， 로케트 (Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색， 면역 침전분석법 (immunoprecipi tat ion assay)， 보체 고정 분석법 (complete fixation assay), FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) 또는 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 ELISA법을 이용하여 시료 내 시트를린화된 단백질을 검 출할 수 있다.
ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인 지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 또는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체 와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌 드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법이 바람직하다. 예를 들어， 고체 지지체 에 항체를 부착시키고 시료를 반웅시킨 후 항원 _항체 복합체의 항원을 인지 하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원 -항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색 시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 이와 같이 항원 및 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여， 시료 내 시트를린화된 단백질을 검출 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료"란 개체의 조직, 세포， 전혈， 혈장， 혈청， 혈 액， 타액， 활액， 뇨， 객담, 림프액 및 뇌척수액 등을 포함하며, 시트를린화 된 단백질을 검출할 수 있는 세포를 포함하는 시료이면 제한되지 않는다. 또한， 본 발명은 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트를린화된 단백질 검출용 조 성물 및 검출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트를린화 관련 질환의 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 시트를린화된 단백질에 대한 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 또는 시약을 추가로 포함할 수 있 다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있 는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지뒤어 있으며 예를 들어, 웨스턴블랏， ELISA, 방사선면역분석법， 방사면역 확산법， 면역형광분석법, 면역 블롯， 오우크레로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영 동， 조직면역 염색, 면역 침전분석법， 보체 고정 분석 ¾， FACS, 단백질 칩 등 이 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체， 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지， 용해제， 세정제， 및 안정 화제 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체로는， 이에 한정되지는 않으나，또한， 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는기질, 적당한 완충 용액， 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체， 발색 기질 및 반웅 정지 제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는， 시트를린화된 단백질에 대한 항체는 바람 직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법 을 이용하여 고정될 수 있으며 (Antibodies'. A Labotory Manual, Harlow & Lane; Cold Spr ingHarbor , 1988) , 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 PBS, 폴 리스틸렌， 폴리에틸렌， 폴리프로필렌， 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴， 불 소 수지, 아가로스, 셀롤로즈， 니트로셀를로즈, 덱스트란， 세파텍스， 세파로 즈 , 리포솜 ,카복시메틸 셀를로즈，폴리아크릴아미드,폴리스테린， 반려암， 여 과지， 이온교환수지， 플라스틱 필름， 플라스틱 튜브， 폴리아민 -메틸 비닐ᅩ에 테르-말레산 공중합체,아미노산 공중합체， 에틸렌-말레산 공중합체， 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드， 또는 자성 입자 등이 포함된다. 그 외의 다른 고 체 기질로는 세포 배양 플레이트 ELISA플레이트，튜브 및 폴리머성 막이 있 다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태， 예를 들어 구형 (비드)， 원통형 (시 험관 또는 웰 내면)， 평면형 (시트， 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원 -항체 복합체의 형성 을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며， 이의 예로는 효소， 형광물질， 리간드， 발광물질， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위 원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제， βᅳ으글루코시다제， 우레아제， 퍼옥시다아제 (호스라디시 퍼옥시다제 등)， 알칼라인 포스파타아 제， 아세틸콜린에스테라아제， 글리코즈 옥시다아제， 핵소키、나제, 말레이트 디 하이드로게나아제, 글루코스 -6-인산디하이드로게나아제， 인버타아제 등을 사 용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트， 로다민， 피코 에리테린， 피코시아닌， 알로피코시아닌， 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아 크리디늄 에스테르， 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로 이드 금， 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센， 루테늄 착화합 물， 바이올로젠， 퀴논， Ti 이온， Cs 이은， 디이미드， 1，4ᅳ벤조퀴논， 하이드 로퀴논 등이 있다.방사성 동위원소로는 ¾， 14C, 32?, 35S, 36C1 , 51Cr , 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학 적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
효소 발색 기질로서， 예를 들어 효소 표지로서 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 를 선택한 경우쎄는 기질로 3-아미노 -9-에틸카르바졸， 5-아미노살리실 산, 4-클로로 -1-나프를， 0-페닐렌디아민， 2, 2'-아지노 -비스 (3-에틸벤즈티아 졸린 -6-술폰산)， 3，3-디아미노벤지딘， 3，3'，5，5'-테트라메틸벤지딘, o-디아 니시딘， 또는 3,3ᅳ디메록시벤지딘 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한， 효소 표지로서 알칼라인 포스파타아제를 선택한 경우에는 기질로 5-브로모 -4-클 로로 -3-인돌릴 포스페이트， 니트로블루 테트라졸륨， 또는 P-니트로페닐 포스 페이트 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한， 효소 표지로서 -D-갈락토시다 제를 선택한 경우에는 기질로 0-니트로페닐 -β-D-갈락토시드 또는; 5-브로모 -4-클로로 -3—인돌 -β-D-갈락토피라노시드 포함 용액을 사용할 수 있다. 이 외에도 당업계에 알려진 다양한효소 및 효소 발색 기질을사용할 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 항 -시트를린화 항체의 제조
1-1. 마우스의 선별
항원으로서 필라그린 (filaggrin)에서 유래한 고리형 시트를린 펩타이드 (cyclic citrullinated peptide, CCP)를 합성한 후 (서열번호 1； Arthritis Rheum 2000， 43 (1): 155-163참조)，네 마리의 마우스에 각각 두 번에 걸쳐 항 원을 주입한 뒤， 시트를린화된 단백질 (서열번호 1)에 결합하고 음성 대조군 인 C-반웅 단백질 (C-reactive protein, CRP; 서열번호 2) 에는 결합하지 않 는 항체를 생성하는 마우스는 선별하기 위하여 각 마우스 혈청으로부터 항 -CCP 및 항 -CRP ELISA를 수행하였다. 이를 위하여， 먼저 준비된 CCP 펩타이 드와 CRP 펩타이드를 최종 농도 250ng/well 이 되도톡 PBS 혹은 카보네이트 버퍼에 회석하였다. 이렇게 회석된 용액을 96 well plate에 50 ul씩 분주하 여 상온에서는 2시간， 4°C에서는 밤새도록 인큐베이션 하몄다. 그 뒤에 PBS 200 ul씩 각 웰에 넣어 세척하였다. 세척시에는 plate를 뒤집어 내부에 있 는 용액이 모두 밖으로 쏟아지게 한 뒤에 paper tower위에 plate를 내리쳐 내부의 용액을 완전히 제거하였다. 각 마우스 (#1~#4)의 혈청을 단계별로 희 석하여 (1:100， 1:1000， 1:5000， 1： 10000, 1:50000， 1:100000) 각 well에 100 ul씩 넣어준 뒤 상온에서 2시간 동안 인큐베이션을 하였다. 음성대조군으로 는 PBS와， 마우스에 항원을 주입하기 전에 얻어낸 혈청을 각각 사용하였다. 그 뒤에 PBS를 이용해서 앞에서 언급한 세척 과정을 4회 반복하여 진행한 뒤에 Mouse IgG를 인지 할 수 있는 항체 중 HRP가 연결되어 있는 항체를 2차 항체로 사용하여 각 웰에 100 ul씩 넣어주었다. 이 때 사용된 항체는 1;5000 으로 희석하여 사용하였다. 이렇게 2차 항체를 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에 서 인큐베이션 한 뒤에 4회 세척하였다. 세척이 끝난 뒤에 잔존하고 있는 용 액의 여분을 확실히 제거하고 HRP substrate를 각 well에 100 ul씩 넣어준 뒤에 빛을 차단한 채로 30분간 인큐베이션하여 발색 반웅을 유도하였다. 30 분 뒤에 stop solution을 넣어준 뒤에 바로 450nm파장에서 single point photo mode로 발색 정도를 측정하였다. 본 실험에서는 HRP 발생을 위한 substrate로 3,3' ,5,5'-tetraiiie1:hyU)enzidine (TMB)를 사용하였으며， 이데 따른 Stop Solution은 0.16 M sulfuric acid를 사용하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 희석시킬 때의 기을기가 급격할수록 항원 특이도 (specificity)가 떨어잔다고 볼 수 있으며， CCP에 대하여 높은 특이도를 나타내고 CRP 에는 특이도가 낮은 마우스 #2 를 선별하였다 (도 4). 1
【표 11
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1-2. 하이브리도마세포의 제조
상기 선별된 마우스 #2를 이용하여 본 발명에서 하이브리도마 방법을 통하여 단클론 항체를 제조하는 기본 과정을 도 2에 나타내었다.
우선， CCP에는 결합하고 CRP 에는 결합하지 않는 항체를 생성하는 마 우스 #2 의 비장을 떼어내어 림프구를 분리한 다음， 미리 배양한 미엘로마 세포와 융합시켰다. 융합된 세포를 hypoxanthin, aminopterine, 그리고 thymidine이 첨가되어 있는 배지 (HAT medium)에서 배양하여 미엘로마 세포 와 B 임프구만이 융합된 세포 (하이브리도마)를 선택적으로 수득하였다. 미 엘로마 세포와 B림프구를 융합하게 되면 원하는 하이브리도마 외에도, 융합 되지 않고 남아있는 미엘로마 세포나 B림프구들도 존재하게 되며， 심지어는 미엘로마 세포끼리 또는 B 림프구끼리 융합된 세포 #도 존재하게 된다. 따 라서， 이들 여러 세포로부터 미엘로마 세포와 B임프구만이 융합된 하이브리 도마 세포를 얻기 위하여， 미엘로마 세포의 경우 B 림프구와 융합되지 못하 면 선택되어 죽어버리도톡 thymidine kinase (TK)와 hypoxanthin guanine phosphor ibosyl transferase (HGPRT) 돌연변이가 유도되어 있는 세포주를 사 용하였다. 이렇게 해서 살아남은 하이브리도마 세포를 각각의 서로 다른 배 양접시에 배양하였다. 배양이 어느 정도 이루어지면， 배지를 이용하여 항원 과 반응시켜보아 원하는'항체가 만들어진 하이브리도마 클론을 ELISA 를 통 해 선별하였다 (도 5).
하이브리도마 선별을 위하여， 먼저 준비된 CCP펩타이드와 CRP펩타이 드를 최종 농도 250ng/well 이 되도톡 PBS혹은 카보네이트 버퍼에 회석하였 다. 이렇게 회석된 용액을 96 well plate에 50 ul씩 분주하여 상온에서는 2 시간， 4°C에서는 밤새도록 인큐베이션 하였다. 그 뒤에 PBS 200 ul씩 각 웰 에 넣어 세척하였다. 세척시에는 plate를 뒤집어 내부에 있는 용액이 모두 밖으로 쏟아지게 한 뒤에 paper towel 위에 plate를 내리쳐 내부의 용액을 완전히 제거하였다. 하이브리도마 세포를 키운 미디어의 상충액을 걷어서 이 를 1:1000으로 희석하여 각 well에 100 ul씩 넣어준 뒤 상온에서 2시간 동안 인큐베이션을 하였다. 그 뒤에 PBS를 이용해서 앞에서 언급한 세척 과정을 4 회 반복하여 진행한 뒤에 Mouse IgG를 인지 할 수 있는 항체 중 HRP가 연결 되어 있는 항체를 2차 항체로 사용하여 각 웰에 100 ul씩 넣어주었다. 이 때 사용된 항체는 1;5000으로 회석하여 사용하였다. 이렇게 2차 항체를 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 인큐베이션 한 뒤에 4회 세척하였다. 세척이 끝난 뒤에 잔존하고 있는 용액의 여분을 확실히 제거하고 HRP substrate를 각 well에 100 ul씩 넣어준 뒤에 빛을 차단한 채로 30분간 인큐베이션하여 발색 반응을 유도하였다. 30분 뒤에 stop so hit m을 넣어준 뒤에 바로 450nm파장 에서 single point photo mode로 발색 정도를 측정하였다. 본 실험에서는 HRP 발생을 위한 substrate로 3,3' ,5,5' -tetramethylbenzidine (TMB)를 사용하 였으며， 이데 따른 Stop Solution은 0.16 M sulfuric acid 를 사용하였다. 이후， 하이브리도마 세포들로부터 CCP 및 CRP 를 이용한 반복적인 스 크리닝을 통하여 최종 단계에서 두 개의 클론 11G1 및 12G1을 수득하였다 (도 6 및 도 7). 도 5 내지 도 7은 하이브리도마의 각 스크리낭단계에서 항 CCP 항체가 표적 펩타이드인 CCP 를 인지하여 결합하였을 때의 결합 강도를 450nm파장에서의 흡광도로 측정하여 나타낸 값이다. (+)와 (-)로 표시된 값 은 각 실험에서의 양성, 음성 대조군 값을 의미하는데， 이를 기준으로 각 하 이브리도마 클론들이 얼마나 효과적인 항 -CCP를 분비하고 있는지를 측정하 여 선별 후, 그것을 반복적으로 계대배양함으로 효과적인 항 -CCP만을 분비하 는 클론이 우점하도록 유도하여 특정화된 세포주를 형성하도록 유도하는 방 식으로 두 개의 클론 11G1및 12G1을 선별하였고， 이 중 12G1세포주는 2011 년 11월 15일자로 한국 세포주 연구재단 (서을시 종로구 연건동 28번지 서 울대학교 의과대학 암연구소)에 기탁하였으며， 수탁번호 KCLRF-BP— 00276을 부여받았다.
또한， 상기 12G1 하이브리도마 세포주에서 생산되는 단클론 항체를 12G1 으로 명명하였으며， 이의 가변영역 염기서열을 자동서열분석가로 분석 한 결과， 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 확인할 수 있었다. 실시예 2. 류마티스 관절염의 조직 내 시트를린화된 단백질의 검출 (면역조직화학염색)
본 발명에 따른 항체 12G1 이 류마티스 관절염 환자의 조직 내에 존재 하는 시트를린화 펩타이드를 특이적으로 검출할 수 있는지 면역조직화학염 색법으로 확인하였다.
파라핀 포매되어 있는 조직을 4um로 절단 하여 면역조직화학염색을 위해 준비하였다. 60°C dry oven에서 40분간 인큐베이션하여 탈파라핀한 뒤 에 에탄올을 순차적 비율로 낮추어 가며， dipping하였다 (100%~70%). 이를 Tap water로 세척하여 3%¾02에 담가서 13분간 인큐베이션한 뒤에 15분간 세 척하였다. 사용하고자 하는 12G1항체가 마우스 유래 항체이기에 VECTASTAIN Elite ABC Kit ((Mouse IgG) Catalog# PK-6102)을 사용하여 염색하였다. 간 략히 설명하자면， normal serum으로 60분간 blocking을 수행한 뒤에 1차 항 체를 1:100으로 희석하여 각 슬라이드에 분주 후 4°C에서 overnight한 뒤에 tris buffer로 5분간 3회 세척하였다. 바이오틴이 부착된 2차 항체를 사용하 여 40분간 인큐베이션한 후 DAB peroxidase substrate kit (Vector Lab Catalog# SK—4100)으로 2분간 발색한 뒤에 tap water로 dipping하여 stop하 였다ᅳ 이후 배경염색을 위해 mayer ' s Hematoxylin (Wako Cat a log# 131-09665) 을 이용 2분 염색한 뒤에 tap water로 완전히 세척해 주었다. 그 뒤에 xylene흑 이용， Mounting Medium (Vector Lab Catalog Hᅳ 5000)으로 mount한 뒤에 현미경으로 관찰하였다.
그 결과， 류마티스 관절염 환자 3명 모두의 조직에서 항체 12G1에 반 응하여 갈색 염색이 나타났으므로 시트롤린화된 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다 (도 8내지 도 10). 한편， 염증성 반응이 존재하지 않는 퇴행성 관 절염 환자의 조직에서는 시트를린화된 단백질이 검출되지 않았다 (도 11). 실시예 3. 흡연자의 편도 조직 내 시트를린화된 단백질의 검출 (면역 조직화학염색)
흡연이 편도 조직에서 시트를린화를 촉진시킨다는 보고가 있다 (Arthritis & Rheumatism, 54(1)： 38-46, 2006). 상기 보고에 의하면， 흡연자 의 경우 시트롤린을 발현하는 기관지폐포세척 세포 (bronchoalveolar lavage cell)의 비율이 비흡연자에 비하여 높았으며 폐 염증을 가진 흡연자의 경우 그 비율이 가장 높았다.
이에， 본 발명에 따른 항체 12G1 이 흡연자의 편도 조직 내에 존재하 는 시트를린화 펩타이드를 특이적으로 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여， 상기 실시예 3과 같은 방법으로 면역조직화학염색을 수행하였다ᅳ 그 결과, 흡연자의 편도 조직에서 항체 12G1에 반웅하여 갈색 염색이 나타났으므로 시트를린화된 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다 (도 12). 실시예 4. 류마티스 관절염 환자의 혈액 내 시트를린화된 단백질의 검 출 (웨스턴 블랏)
본 발명에 따른 항체 12G1 이 류마티스 관절염 환자의 혈액 시료 내에 존재하는 시트를린화 펩타이드를 특이적으로 검출할 수 있는지 웨스턴 블랏 을 통해 실험하였다.
우선， 류마티스 관절염 (RA) 환자 14명의 혈액 시료와， 건강한 사람 (HC) 3명의 혈액 시료를 준비하였다. 각 시료에서 전체 단백질을 분리하고 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으 로 이동시켜 시트를린화를 검출하는 항체와 반응시켰다. 상기 검출을 위한 항체로는 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 12G1을 사용하였다. 웨스턴 블랏 실험 조건은 다음과 같다.
12% SDS-PAGE gel, 40ug loading
Transfer 2h
Blocking (5% skim milk) 30분
1차 항체 ： 정제된 항체 12G1, 또는 하이브리도마 (KCLRF-BP-00276) 배 양 배지 상층액
2차 항체 ： 항-마우스
Develop ： exposure time 20m in
도 13은 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 12G1 을 정제된 상태로 사용하여 시료 내 시트를린화된 항원을 검출한 결과를 나타낸다. 웨스턴 블랏에 의해 검출된 밴드를 보면， 류마티스 관절염 (RA)을 가진 4명의 환자의 시료 중 특이적으로 3명에게서 약 17 kDa 에 해당 하는 밴드가 나타났으며， 건강한 사람 (HC)의 시료에는 해당 밴드가 나타나 지 않았다. 즉， 류마티스 관절염 환자의 시료에서만 특이적으로 시트를린화 된 항원이 검출되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를통하여, 본 발 명의 항체가 류마티스 관절염 환자의 혈액 시료 내에 존재하는 시트를린화 단백질을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다. 실시예 5. 류마티스 관절염의 진단유용성 검증
본 발명에 따른 항체 12G1 이 대표적인 시트를린화 -관련 질환인 류마 티스 관절염을 진단하기 위한 진단 키트에 사용될 수 있는지 그 진단 유용 성을 검증하였다.
현재 류마티스 관절염의 진단 키트로서, 류마티스 관절염의 혈청학적 표지자인 류마티스 유사인자 (Rheumatoid factor, RF)를 검출하는 진단 키트 와, 필라그린 펩타이드의 고리형 변이체 (cyclic citrullinated peptide, CCP) 를 이용하여 혈청시료 내 항—시트를린화 단백질 항체를 검출하는 항 -CCP (anti-CCP) 진단 키트가사용되고 있다. 상기 항 -CCP진단 키트의 원리는 유 전자 재조합 기술에 의해 생산된 CCP를 마이크로 웰에 부착하고， 검체 시료 를 분주하여 항원 -항체 반응을 유도하여， 검체 시료 내 존재하는 항ᅳ CCP 항 체를 검출하는 것이다. 반면， 본 발명에서 제공하는 키트는 항체 12G1을 포 함하며 검체 시료 내에 존재하는 시트를린화된 항원올 검출한다는 점에서 항- CCP진단 키트와 차이가 있다.
본 발명자들은， 본 발명의 12(1^항체를 이용한 진단 키트가 기존에 사 용되던 RF 진단 키트 및 항 -CCP 진단 키트와 상관관계가 있는지를 확인하기 위하여 48명의 류마티스 관절염 환자를 대상으로 통계적 분석을 수행하였으 며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
통계적 분석 결과 ΡΟ.05일 경우 유의한 상관관계가 있음을 나타내는 데，표 2에 나타난 바와 같이 ,본 발명에서 12G1항체를 이용하여 시료 내 시 트를린화된 항원을 검출하는 진단 키트의 경우 RF 키트와 상관관계가 다소 떨어지는 것으로 나타났으나， 기존의 항 -CCP 진단 키트와는 매우 유의한 상 관관계를 나타내었다. RF진단 키트의 경우 그 진단 특이성이 항 -CCP키트에 비해 떨어지는 것으로 보고되어 있으며， 본 발명의 키트는 기존의 항 -CCP진 단 키트와 동등한 성능을 나타내었으므로， 류마티스 관절염 진단에 유용성을 가짐을 확인할 수 있다.
또한， 류마티스 관절염 진단을 위한 기존의 항 -CCP 진단 키트의 경우 시료 내 존재하는 항체를 검출하는 방식으로 작동하는 것과는 달리， 본 발명 의 키트는 12G1 항체를 사용하여 시료 내 존재하는 시트를린화된 항원을 검 출한다는 점에 특징 이 있으며， 이는 아직 시도되지 않은 새로운 진단 방식 아 다. 본 발명의 키트가 항 -CCP 진단 키트와 높은 상관관계를 나타내었다는 것 은， 본 발명의 항체를 사용하여 기존의 진단 결과와 유사하거나 흑은 더 나 은 방식의 진단 시스템의 도입 이 가능하다는 것올 의미 한다 .
【표 2】
Figure imgf000024_0001
【산업상 이용가능성】
본 발명에서 제공하는 단클론 항체는 시트를린화된 단백질을 검출하 는데 이용될 수 있어 연구실 등에서 유용한 실험 재료로써 세포 사멸， 조직 염증， 및 자가면역 질환의 진단 및 치료 등 다양한 분야에서 응용할 수 있다 . 구체적으로， 시트를린 관련 질환의 세포적 프로세스를 연구하거나， 항 -시트 를린화 단백질 자가 항체가 병리학적 상태에 미치는 영향을 연구하거나 , 시 트를린화 관련 질환의 치료제를 개발하는 연구 등에 본 발명의 항체를 이용 할 수 있다 .
(번 역 문) 특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제양식
국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따 발행된
원기탁에 의한 수탁증
Figure imgf000025_0001
위 번역문 원본과 상위 없음

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4 의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는， 시트를린화된 단백질 에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마에 의해 생 산되는 것인 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 C-반웅성 단백질 (C-reactive protein, CRP) 에 는 결합하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
【청구항 4】
시트를린화된 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는， 수탁번호 KCLRF-BP-00276 인 하이브리도마.
【청구항 5】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트를린화된 단백질 검출용 조성물.
【청구항 6】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 시트를린화된 단백질 검출용 키트.
【청구항 7】
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그와 항원 결합 단편， 및 시료 내 시트를린화된 단백질의 항원 -항체 반응을 면역 측정하는 단계를 포함하는， 시료 내 시트를린화된 단백질을 검출하는 방법 .
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 면역 측정은 웨스턴블랏 (western blotting), EL ISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선면역분석법 (Radioimmunoassay, RIA), 방사면역 확산법 (Radioimmunodi f fusion)， 면역형 광분석법 (Immunofluorescence assay, IFA) , 면역 블롯 (immunob lot ting) , 오 우크레로니 (Ouchterlony) 면역 확산법， 로케트 (Rocket) 면역전기영동， 조 직면역 염색， 면역 침전분석법 (immunoprecipitation assay) , 보체 고정 분 석법 (complete fixation assay), FACS, 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이 루어친 군에서 선택되는 면역학적 분석에 의한 것인 방법.
【청구항 9】
제 7항에 있어서, 상기 시료는 조직， 세포， 전혈， 혈장， 혈청， 혈액， 타 액， 활액， 뇨， 객담， 림프액 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 면 역학적 분석에 의한 것인 방법.
【청구항 10】 ?
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 류마티스성 관절염， 다발성 경화증， 건선 및 알츠하이머에 서 선택되는 시트를린화 관련 질환의 진단용 조성물.
【청구항 11】
제 1항 내지 계 3항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는， 류마티스성 관절염, 다발성 경화증， 건선 및 알츠하이머에 서 선택되는 시트를린화 관련 질환의 진단용 키트.
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