CN107490698A - 一种检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测试剂盒及其应用，检测试剂盒包括包被有抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α‑烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中至少两种组合的固相载体，可用于制备类风湿关节炎的检测试剂和/或检测药物。本发明采用两种或两种以上瓜氨酸化蛋白组合检测RA，可显著提高敏感性和特异性，为RA临床诊断提供一种灵敏快速的检测工具，试剂盒组成简洁，使用方法简便，应用范围广泛，具有巨大的市场价值。

Description

一种检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医学免疫应用领域，涉及一种检测试剂盒及其应用，具体涉及一种瓜氨酸化抗体的检测试剂盒及其应用。

背景技术

类风湿性关节炎又称类风湿(RA)，是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病，病程长，易反复，给患者造成很大痛苦，该病在我国的发病率约为0.36％。由于病因至今尚未完全清楚，而且早期临床表现不典型，加之缺乏特异性的诊断方法，给疾病早期诊断及治疗带来一定困难。RA的治疗关键在于早期治疗，而早期治疗的前提是早期诊断。因此，寻求准确的早期诊断RA的方法成为各国学者研究的热点。

瓜氨酸化蛋白(fibrinogen、vimentin、collagen、enolase)是一类重要的RA抗原，目前尚无采用检测相关抗原来诊断RA的试剂盒。常用于RA诊断的类风湿因子RF特异性较差，而现有方法(文献和专利)检测单一抗原的敏感性不高。

CN1796997公开了一种用于类风湿性关节炎的诊断试剂盒及其制备及完成质量检测标准的方法。所述试剂盒是检测抗环瓜氨酸肽抗体的检测试剂盒。检测试剂盒的制备方法包括包被抗原、制备对照物和配制液体试剂。该发明仅检测单一抗原，敏感性不高。CN204882569U涉及一种用于类风湿关节炎的联合检测试剂盒。该实用新型的用于类风湿关节炎的联合检测试剂盒可以同时检测RF、CRP、ASO、C3和IgM五种标记物，但制备方法复杂，使用过程繁琐。CN204964515U涉及类风湿因子双抗体夹心ELISA试剂盒。该试剂盒包括设置有凹槽的盒体(1)，其特征在于，所述盒体内设置有酶联板(2)、封板膜(3)和放置于凹槽上的试剂瓶(4)；所述酶联板(2)包括基板和设置于基板上的包被有抗IgG型RF抗体的反应槽(21)；所述反应槽为腰鼓状结构，槽底和槽口的直径小于中间部分的直径。该实用新型所述ELISA试剂盒对滑膜液中IgG型RF进行检测，因此灵敏度低，特异性差。

因此，开发一种瓜氨酸化蛋白组合检测方法及相关试剂盒，以实现快速、准确、灵敏诊断RA的目的，具有巨大的应用价值和市场前景。

发明内容

针对现有技术中，用于RA诊断的类风湿因子特异性较差和敏感性不高的缺陷，本发明提供一种检测试剂盒及其应用，以实现快速、准确、灵敏诊断RA的目的。

第一方面，本发明的目的在于提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有复合抗体的固相载体，所述复合抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中任意一种或至少两种的组合。

所述组合例如可以是抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的组合，抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的组合，抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合，抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的组合，抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合，抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合，抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的组合，抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合，抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合或抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合，所述复合抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中至少两种的组合，优选为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合。

本发明中，发明人通过大量的实验发现你，特异的选择抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中的任意一种或至少两种的组合就能够准确的检测类风湿关节炎，尤其采用这四种瓜氨酸化抗体的组合能够进一步提高检测的准确度。

优选地，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、46μg/mL、48μg/mL或50μg/mL，优选为1-20μg/mL。

优选地，所述抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、46μg/mL、48μg/mL或50μg/mL，优选为1-20μg/mL。

优选地，所述抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、46μg/mL、48μg/mL或50μg/mL，优选为1-20μg/mL。

优选地，所述抗瓜氨酸化II型胶原抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL、20μg/mL、22μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、42μg/mL、46μg/mL、48μg/mL或50μg/mL，优选为1-20μg/mL。

优选地，所述包被包括直接包被和/或间接包被，例如可以是直接包被、间接包被或直接包被和间接包被，优选为直接包被；

优选地，所述间接包被为通过生物素与链霉亲和素的特异性反应将抗体间接固定于固相载体上。

优选地，所述固相载体为酶标板、磁珠、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述检测试剂盒还包括第一抗体；

优选地，所述第一抗体包括抗纤维蛋白原抗体、抗波形蛋白抗体、抗胶原抗体或α-烯醇化酶抗体中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是抗纤维蛋白原抗体和抗波形蛋白抗体的组合，抗波形蛋白抗体和抗胶原抗体的组合，抗胶原抗体和α-烯醇化酶抗体的组合或抗纤维蛋白原抗体、抗波形蛋白抗体、抗胶原抗体和α-烯醇化酶抗体的组合。

优选地，所述第一抗体的工作质量浓度为0.1-10μg/ml，例如可以是0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1μg/ml、1.2μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.2μg/ml、2.5μg/ml、2.8μg/ml、3μg/ml、3.2μg/ml、3.5μg/ml、3.8μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml或10μg/ml；

优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体、酶标链霉亲和素或酶标亲和素中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述酶标抗体的工作质量浓度为0.1-3μg/mL，例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.2μg/mL、1.5μg/mL、1.8μg/mL、2μg/mL、2.2μg/mL、2.5μg/mL、2.8μg/mL或3μg/mL。

优选地，所述酶标链霉亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL，例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL。

优选地，所述酶标亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL，例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液；

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将待测样品进行稀释；

(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(3)将第一抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤；

(4)将酶标抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值，为所述待测样品的结果。

优选地，步骤(1)所述的稀释的倍数为2-200倍；

优选地，步骤(4)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测；

优选地，步骤(4)所述待测样品的光吸收值减去所述阴性对照品的光吸收值。

优选地，所述待测样品的结果判定标准为：

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时，判为阳性；

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值＜1时，判为阴性。

第三方面，本发明提供一种第一方面所述的检测试剂盒在制备类风湿关节炎的检测试剂和/或检测药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所提供的检测试剂盒特异的选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体这四种抗体检测RA，可显著提高检测的敏感性和特异性，人血液样本中瓜氨酸化蛋白的检出率高达90％，为RA临床诊断提供一种灵敏准确的检测工具；

(2)本发明所提供的试剂盒的使用方法简便，快速高效；

(3)本发明所提供的检测试剂盒的应用范围广泛，具有巨大的市场价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中4种蛋白体外催化前后的检测结果示意图；

图2为本发明实施例3中类风湿关节炎、骨关节炎、健康对照人群中瓜氨酸化蛋白组合检测结果的散点图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的附图和实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：试剂盒的组装

1、主要试剂：

(1)包被缓冲液：0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH6.9-9.4；

(2)封闭液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH6.9-9.4；

(3)样本稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M Tri-HCL缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(4)阴阳性对照品稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(5)洗涤液：0.01％-0.5％Tween-20，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(6)酶标抗体稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(7)显色缓冲液：0.01M-1M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH 3.0-5.0；

(8)显色液：TMB；

(9)终止液：硫酸。

2、反应板工作液配制

采用两类翻译后修饰的蛋白抗体包被：选取抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中的任意一种或至少两种的组合，按等质量比混合，然后用包被液将组合抗体按照工作浓度0.5-50μg/mL进行稀释，配制成反应板工作液。将配制好的反应板工作液按100μl/孔加入96孔酶标板中，室温震荡15min，置4℃过夜(16-20h)后弃废液拍干反应板。将洗涤液按250μl/孔加入96孔反应板中，室温静置2min，弃废液拍干反应板，洗板3次，将配制好的封闭液按200μl/孔加入96孔反应板中，室温震荡孵育2-4h后倒掉拍干反应板。拍干后的反应板，放入37℃温箱干燥3h后将反应板放入带有干燥剂的用铝箔袋密封包装。

3、生物素标记的复合第一抗体的制备：

选取纯化过的第一抗体组合，分别进行生物素化标记，长链活化生物素按浓度1mg/ml溶解于二甲基亚砜中；将待偶联而已经纯化的抗体按浓度5μg/ml溶解于0.1mol/LpH9.0的碳酸氢纳溶液中；将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1：8混合，在室温下温育4h；在4℃下对0.05mol/L pH7.2的PBS透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离生物素，标记好的抗体按等质量比例混合好，形成复合一抗。

4、酶标抗体的制备

采用酶结合物稀释液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体进行稀释，稀释5000倍配制成酶标抗体，其工作质量浓度为0.1-3μg/mL；

或采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素按1：20000倍稀释配制，其工作质量浓度为0.1-1μg/mL。

5、阴阳性对照配制

采用从医院收集确诊为类风湿性关节炎患者的血清和正常人血清，经过处理后用阴阳性对照品稀释液按照适当比例进行稀释。

组建的试剂盒包括以下几个方面：96孔酶标板、阴性对照、阳性对照、临界对照，样本稀释液、洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、封板膜及说明书。

实施例2：4种蛋白的体外PAD催化和ELISA检测

1、体外PAD催化：

(1)预处理：将4种蛋白溶于磷酸盐缓冲液中,在层析冷柜中通过Protein G柱去除蛋白中含有的IgG。

(2)瓜氨酸化：采用肽酰脱亚氨基酶(PAD)在体外进行催化反应。每7U的PAD酶催化1mg蛋白，按此比例分别将二者加入到瓜氨酸化缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)，10mmol/L CaCl₂，5mmol/L DTT)中，37℃水浴孵育2h，然后加终浓度为20mmol/L的EDTA溶液终止反应。

2、ELISA检测：

(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将催化前后的四种蛋白进行稀释2-200倍；

(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(3)将第一抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤；

(4)将酶标抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，450nm和630nm双波长检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值，为所述待测样品的结果，如图1所示。

由图1分析可知，采用本发明所述的ELISA方法检测瓜氨酸化纤维蛋白原(1-500μg/mL)和纤维蛋白原(1-500μg/mL)。当待检物中含瓜氨酸化纤维蛋白原时，检测结果在450nm的OD值随瓜氨酸化纤维蛋白原浓度增加而增加，而纤维蛋白浓度增加不会引起OD值的变化，因此本发明所述的ELISA方法可以特异性检测样本中的瓜氨酸化纤维蛋白原，且不会受到纤维蛋白原的干扰。。

实施例3：4种瓜氨酸化蛋白的检测

(1)从医院收集确诊为类风湿性关节炎患者的血清、骨关节炎患者血清和健康对照人血清，每种血清100份，经过处理后用作待测样品。

(2)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将待测样品进行稀释2-200倍；

(3)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(4)将第一抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤；

(5)将酶标抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，450nm和630nm双波长检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值，为所述待测样品的结果，如图2所示。

由图2可知，采用本发明所述的ELISA方法检测136例类风湿性关节炎，147例健康对照和66例非风湿关节炎的血清样本，其中117例(86％)类风湿性关节炎检测为阳性，1例(0.7％)健康对照和4例(6％)非风湿关节炎检测为阳性。表明本发明所述的ELISA方法具有良好的临床诊断的敏感性和特异性。

实施例4：抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体的工作浓度为5μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例5：抗瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化波形蛋白抗体包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的工作浓度为50μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例6：抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作浓度为0.5μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例7：抗瓜氨酸化II型胶原抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化II型胶原抗体包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化II型胶原抗体的工作浓度为20μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例8：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的组合包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的工作浓度均为8μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例9：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的组合包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作浓度均为15μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例10：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的工作浓度均为12μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例11：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的组合包被载体进行检测，所述抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作浓度均为1μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例12：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合包被载体进行检测，所述三种抗体的工作浓度均为20μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例13：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合包被载体进行检测，所述三种抗体的工作浓度均为10μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

实施例14：抗瓜氨酸混合抗体检测试剂盒

与实施例1相比，所述试剂盒选用瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体包被载体进行检测，所述四种抗体的工作浓度均为5μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

对比例1

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化牛白蛋白抗体包被载体进行检测，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

对比例2

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化组胺受体抗体包被载体进行检测，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

对比例3

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化组胺受体抗体和抗瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶抗体包被载体进行检测，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

对比例4

与实施例1相比，所述试剂盒选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体包被载体进行检测，其中瓜氨酸化纤维蛋白抗体的工作浓度为0.1μg/mL，抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的工作浓度为0.1μg/mL，抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作浓度为60μg/mL，抗瓜氨酸化II型胶原抗体的工作浓度是60μg/mL，试剂盒的其他组件与实施例1相同，具体检测步骤如实施例3。

表3

由表3分析可知，从实施例4-14可以看出，特异选用这四种抗瓜氨酸化抗体可以实现对类风湿关节炎的检测，采用四种抗瓜氨酸化抗体的组合效果优于单一抗瓜氨酸化抗体，采用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合对RA人群中瓜氨酸化蛋白的检出率最高，为90％，说明本发明的检测试剂盒特异性较好。对比例1-3与实施例14相比，检出率较低，说明采用别的抗瓜氨酸化抗体的种类或其组合无法达到理想的实验效果，对比例4与实施例14相比，测试结果同样不理想，表明抗体的工作浓度超出本发明所提供的范围也无法灵敏准确的检测出RA。

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒特异的选用抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体这四种抗体检测RA，可显著提高检测的敏感性和特异性，人血液样本中瓜氨酸化蛋白的检出率高达90％，为RA临床诊断提供一种灵敏准确的检测工具。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体包被有复合抗体，所述复合抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述复合抗体为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体或抗瓜氨酸化II型胶原抗体中至少两种的组合，优选为抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体、抗瓜氨酸化波形蛋白抗体、抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体和抗瓜氨酸化II型胶原抗体的组合。

3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗瓜氨酸化纤维蛋白抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，优选为1-20μg/mL；

优选地，所述抗瓜氨酸化波形蛋白抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，优选为1-20μg/mL；

优选地，所述抗瓜氨酸化α-烯纯化酶抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，优选为1-20μg/mL；

优选地，所述抗瓜氨酸化II型胶原抗体的工作质量浓度为0.5-50μg/mL，优选为1-20μg/mL。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述包被包括直接包被和/或间接包被，优选为直接包被；

优选地，所述间接包被为通过生物素与链霉亲和素的特异性反应将抗体间接固定于固相载体上。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板、磁珠、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括第一抗体；

优选地，所述第一抗体包括抗纤维蛋白原抗体、抗波形蛋白抗体、抗胶原抗体或α-烯醇化酶抗体中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述第一抗体的工作质量浓度为0.1-10μg/ml；

优选地，所述第一抗体采用生物素标记；

优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体、酶标链霉亲和素或酶标亲和素中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述酶标抗体的工作质量浓度为0.1-3μg/mL；

优选地，所述酶标链霉亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL；

优选地，所述酶标亲和素的工作质量浓度为0.1-1μg/mL；

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将待测样品进行稀释；

(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(3)将第一抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤；

(4)将酶标抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值，为所述待测样品的结果。

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)所述的稀释的倍数为2-200；

优选地，步骤(4)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测；

优选地，步骤(4)所述待测样品的光吸收值减去所述阴性对照品的光吸收值。

9.根据权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于，所述待测样品的结果判定为：

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时，判为阳性；

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值＜1时，判为阴性。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的检测试剂盒在制备类风湿关节炎的检测试剂和/或检测药物中的应用。