CN107632162A - 一种复合检测抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提供一种复合检测抗原及其应用，具体涉及一种复合检测类风湿关节炎抗原及其应用，所述检测抗原为瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的组合抗原，所述检测抗原组成的试剂盒能够一次检测多种类风湿关节炎自身抗体，克服了单一自身抗体检测灵敏和特异性不足以及多种自身抗体单次逐一检测在操作上的繁琐，大大提高了检测效率和结果判断的准确性，不仅如此，本发明试剂盒还可用于类风湿关节炎的临床检验以及治疗后的疗效考核，具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。

Description

一种复合检测抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物免疫检测技术领域，具体涉及一种复合检测抗原及其应用，尤其涉及一种复合检测抗原、检测试剂盒及其在类风湿关节炎检测上的应用。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的且难以治愈的疾病，引起关节不可逆的损伤，发病后期往往导致患者残疾，影响生活质量，丧失工作能力。其特征是持续的滑膜炎、全身性的炎症和存在自身抗体。目前RA的病因和发病机制仍知之甚少，及时诊断、及早治疗对于疾病的控制具有重要的意义。目前临床上用于诊断RA的方法很多，2010年美国风湿协会(ACR)诊断标准中规定了关节受累数量和病程，以及生物因子(RF、CCP、CRP等)与RA密切相关。然而目前临床上采用的CCP、RF、GPI、AKA等联合诊断，仍有部分的RA患者(特别是早期RA患者)未能及时检出。因此寻找RA相关的生物标志物得到持续的关注。

RA是一种自身免疫疾病，在其发病过程中许多功能蛋白发生了异常的翻译后修饰，如瓜氨酸化、氨甲酰化、糖基化等。这些异常修饰的蛋白能激发体内免疫系统反应从而产生自身抗体。

迄今的研究已经证实，对RA特异性最高的自身抗体是针对含瓜氨酸表位的自身抗体，这些抗体被称为含瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)。有研究显示，ACPA阳性和ACPA阴性的RA患者在遗传基因、环境危险因素、疾病进展和缓解等方面都有所不同。过去的研究主要聚焦于ACPA阳性RA患者的病因学、病情进展和治疗等方面，而对ACPA阴性的RA患者研究较少。

抗甲酰化蛋白抗体(CarP)是陈燚琼等报道在RA患者体内检测出的另一类新的自身抗体，不仅ACPA阳性的RA患者能检测到抗CarP抗体，约30％ACPA阴性RA患者也能检测到该抗体，而且有研究表明，抗CarP抗体可在RA确诊前数年出现。

上述方法都采用单一的抗体进行检测，检测灵敏度不够高，特异性不强，检测结果不够准确。

目前临床诊断中的通常检测自身抗体RF和CCP，RF在RA疾病中特异性比较低(低于80％)，而CCP2的特异性虽可达到90％以上，但其灵敏度却仅有70％左右，而在早期RA患者中，CCP灵敏度只有不到50％，因此，RA诊断需要开发新的更具诊断意义的方法，以提高诊断结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合检测抗原及其应用，所述检测抗原为瓜氨酸化蛋白与氨甲酰化蛋白的组合，能够一次检测多种RA自身抗体，克服了单一自身抗体检测灵敏和特异性不足、以及多种自身抗体单次逐一检测在操作上的繁琐，大大提高了检测效率和结果判断的准确性。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测抗原，所述检测抗原为瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的组合抗原。

本发明中，发明人发现通过采用瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白进行组合来检测，相比于采用单一的瓜氨酸化蛋白或单一的氨甲酰化蛋白检测的检测灵敏度明显提高，两种蛋白协同作用，共同检测多种自身免疫性抗体，相比于采用其中一种蛋白作为检测抗原，提高了检测的效率和结果的准确性。

优选地，所述瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的质量比为(5-8):(5-2)，例如可以是5:2、5:3、5:4、5:5、6:2、6:3、6:4、7:1、7:2、7:3、8:1、8:2、8:3、8:4、8:5，优选为8:2。

发明人发现，采用上述比例的瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白，可以最大限度的发挥瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的协同作用，提高了检测效率和结果的准确性。

优选地，所述组合抗原的工作浓度为1-20μg/mL，例如可以是1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL，优选为2-10μg/mL。

根据本发明，所述瓜氨酸化蛋白包括瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原、瓜氨酸化核周因子、瓜氨酸化丝聚蛋白、瓜氨酸化白蛋白、瓜氨酸化组胺受体、瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶、瓜氨酸化动力蛋白重链3、瓜氨酸化角蛋白、瓜氨酸化微管蛋白、瓜氨酸化纤维粘连蛋白、瓜氨酸化人白细胞抗原I、瓜氨酸化α-烯醇化酶烯醇化酶、瓜氨酸化无孢蛋白、瓜氨酸化组织蛋白酶D、瓜氨酸化β-肌动蛋白、瓜氨酸化CapZa-1、瓜氨酸化蛋白质二硫键异构酶ER60前体、瓜氨酸化线粒体乙醛脱氢酶或瓜氨酸化Spα(CD5抗原类蛋白)受体中的任意一种或至少两种的组合，优选为瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白，瓜氨酸化α-烯醇化酶烯醇化酶中的任意一种或两种及以上的组合。

根据本发明，所述瓜氨酸化(citrullination)是指在蛋白质精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminases,PADs)作用下蛋白质肽链中的精氨酸残基转化为瓜氨酸残基的过程，是一种重要的蛋白质翻译后修饰的过程。目前，已有5种PAD酶在人体组织中被发现，分别为PAD1～4和PAD6,PAD2和PAD4。瓜氨酸化蛋白可以用PAD2或PAD4酶修饰得到，优化地，可以使用兔肌肉纯化的PAD4进行修饰得到，更优地，可以用重组，表达，纯化的有活性的PAD4来修饰目标蛋白得到。除此之外，瓜氨酸化蛋白也可以由内风湿关节炎病人的血清来纯化制备。另外，瓜氨酸化蛋白还可以用瓜氨酸与相应蛋白进行化学偶联反应得到。

本发明中，所述氨甲酰化蛋白包括氨甲酰化牛白蛋白、氨甲酰化纤维蛋白原、氨甲酰化波形蛋白、氨甲酰化胶原蛋白或氨甲酰化烯醇酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为氨甲酰化纤维蛋白原、氨甲酰化波形蛋白、氨甲酰化α-烯醇化酶烯醇化酶中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述氨甲酰化蛋白可以用氰酸钾与相应的蛋白反应获得，透析后定量使用，氨甲酰化蛋白也可以由内风湿关节炎病人的血清来纯化制备。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测抗原在制备类风湿关节炎的检测试剂或检测工具中的应用。

根据本发明，所述检测工具为检测试剂盒。

第三方面，本发明提供一种检测类风湿关节炎的检测试剂盒，包括如第一方面所述的检测抗原和检测中可接受的试剂。

作为试剂盒，抗原和酶标检测抗体是其核心成分，只要有这两种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分，比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照，可以与上述三种成分配套组装在一个试剂盒中，也可以单独提供，因此本发明中试剂盒可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本发明优选包括这些辅助成分，以方便使用。

根据本发明，所述检测抗原固定于固相载体上，所述固定方法包括直接包被法和/或间接包被法。

优选地，所述间接包被法为通过生物素与链霉亲和素的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上。

优选地，所述固相载体为酶标板、磁珠、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述试剂盒还包括酶标抗人抗体、阴性对照品、阳性对照品、临界对照品，样品稀释液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液。

根据本发明，所述酶标抗人抗体的稀释倍数为1000-10000，所述酶标抗人抗体的质量浓度为0.1-1μg/mL，所述酶标抗体的浓度根据抗体的批次，浓度，纯度，亲合力高低而有所不同。

所述酶标抗人抗体的稀释倍数例如可以是1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1800、2000、2200、2500、2800、3000、3200、3500、3800、4000、4200、4500、4800、5000、5200、5500、5800、6000、6200、6500、6800、7000、7200、7500、7800、8000、8200、8500、8800、9000、9200、9500、9800或10000。

所述酶标抗人抗体的质量浓度例如可以是0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL。

在本发明的一个具体实施例中，所述试剂盒中的具体组分如下：

酶标板：96孔板，复合RA抗原包被于酶标板中；

阴阳性对照：血清、0.05％-0.5％ProClin300；

样品稀释液：10mM-100mM Tris-HCl缓冲液，150mM NaCl,0.05％-0.5％ProClin300；

酶标抗体：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；

封闭液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH6.9-9.4；

洗涤液：PBS,0.05％-0.2％Triton X-100,0.05％-5％ProClin300；

底物A：3，3，5，5，-四甲基联苯胺(TMB)；

底物B：过氧化脲；

终止液：2M硫酸。

第四方面，本发明提供如第三方面所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将待测样品进行稀释；

(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(3)将酶标抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，获得所述抗体的浓度。

在本发明的一个具体实施例中，所述检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)预处理：将试剂盒各组分置于室温平衡0.5-1h，用样本稀释液将样本进行1:30稀释；

(2)加样：在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴阳性对照各100μl/孔，用封板膜封板；

(3)孵育：将已加样的酶标板置200rpm-400rpm振荡器室温孵育30-60min；

(4)洗涤：将孵育好的酶标板，弃液拍干，用洗涤液洗涤4-6次；

(5)加酶标抗体：将酶标抗体按照100μl/孔加入酶标板中，用封板膜封板；

(6)孵育：将已加样的酶标板置200rpm-400rpm振荡器室温孵育30-60min；

(7)洗涤：将孵育好的酶标板，弃液拍干，用洗涤液洗涤4-6次；

(8)显色：底物A与底物B按照1:10进行稀释混合均匀，按照100μl/孔加入酶标板中，置400rpm振荡器室温孵育10-15min；

(9)测值：将终止液按照100μl/孔加入酶标板中，轻拍混匀，设定酶标仪波长450nm和630nm进行双波长测定各孔的OD值。

根据本发明，步骤(3)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测。

根据本发明，步骤(3)所述获得抗体值＝所述待测样品的光吸收值-所述阴性对照品的光吸收值。

根据本发明，所述检测后的结果判定为：

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时，判为阳性；

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值＜1时，判为阴性。

本发明试剂盒的检测分析原理：

本产品采用的是酶联免疫诊断技术，包被在酶标板上的两种抗原复合物：瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白，可以特异性结合血清中RA的自身抗体，没有结合的其他成分在洗涤后会被洗掉，结合的自身抗体在加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG后再次洗涤，经辣根过氧化物催化显色剂A、显色剂B，发生氧化还原反应产生特异波长的光波，经含450nm/630nm波长的酶标仪读数后即可进行定性判断。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本申请试剂盒的检测抗原为瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的组合，能够一次检测多种RA自身抗体，克服了单一自身抗体检测灵敏和特异性不足，以及多种自身抗体单次逐一检测在操作上的繁琐，大大提高了检测效率和结果判断的准确性；

(2)本申请试剂盒中的三种抗原：瓜氨酸化蛋白、氨甲酰化蛋白和糖基化蛋白能够协同作用，互相配合，使得本申请试剂盒的灵敏度为90.0％，特异性为96.7％，敏感性和特异性均高于现有的其他抗原的试剂盒；

(3)本发明试剂盒还可用于类风湿关节炎的临床检验以及治疗后的疗效考核，具有广阔的市场前景和巨大的经济效益。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：试剂盒的组装

1、主要试剂：

(1)包被缓冲液：0.01M-0.5M pH9.0-pH9.6碳酸缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(2)封闭液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，150mM NaCl，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(3)样本稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M Tri-HCL缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(4)阴阳性对照品稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(5)洗涤液：0.01％-0.2％Tween-20，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(6)酶标抗体稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(7)显色缓冲液：0.01M-1M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH 3.0-5.0；

(8)显色液：TMB；

(9)终止液：硫酸。

2、反应板工作液配制

采用两类翻译后修饰的蛋白：瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原作为抗原，按照最适比例8:2进行混合均匀，然后用包被液将混合抗原按照最佳工作浓度1-10μg/mL进行稀释，配制成反应板工作液。将配制好的反应板工作液按100μl/孔加入96孔酶标板中，室温震荡15min，置4℃过夜(16-20h)后弃废液拍干反应板。将洗涤液按250μl/孔加入96孔反应板中，室温静置2min,弃废液拍干反应板，洗板3次。将配制好的封闭液按200μl/孔加入96孔反应板中，室温震荡孵育2-4h后倒掉拍干反应板。拍干后的反应板，放入37℃温箱干燥3h后将反应板放入带有干燥剂的用铝箔袋密封包装。

3、酶标抗体的制备

采用酶结合物稀释液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG按照最佳稀释倍数5000进行稀释，配制成酶标抗体。

4、阴阳性对照配制

采用从医院收集确诊为类风湿性关节炎患者的血清和正常人血清，经过处理后用阴阳性对照品稀释液按照适当比例进行稀释。

组建的试剂盒包括以下几个方面：96孔酶标板、阴性对照、阳性对照、样本稀释液、洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、封板膜及说明书。

实施例2：试剂盒的组装

1、主要试剂：

(1)包被缓冲液：0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH6.9-9.4；

(2)封闭液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH6.9-9.4；

(3)样本稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-1M Tri-HCL缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(4)阴阳性对照品稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(5)洗涤液：0.01％-0.2％Tween-20，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(6)酶标抗体稀释液：0.5-10％BSA，0.01M-0.5M PBS缓冲液，0.01％-0.5％ProClin300，pH 6.9-9.4；

(7)显色缓冲液：0.01M-1M磷酸盐-柠檬酸缓冲液，pH 3.0-5.0；

(8)显色液：TMB；

(9)终止液：硫酸。

2、反应板工作液配制

采用两类翻译后修饰的蛋白：瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化烯醇蛋白按照最适比例4：4：2进行混合均匀，然后用包被液将混合抗原按照最佳工作浓度1-10μg/mL进行稀释，配制成反应板工作液。将配制好的反应板工作液按100μl/孔加入96孔酶标板中，室温震荡15min，置4℃过夜(16-20h)后弃废液拍干反应板。将洗涤液按250μl/孔加入96孔反应板中，室温静置2min，弃废液拍干反应板，洗板3次。将配制好的封闭液按200μl/孔加入96孔反应板中，室温震荡孵育2-4h后倒掉拍干反应板。拍干后的反应板，放入37℃温箱干燥3h后将反应板放入带有干燥剂的用铝箔袋密封包装。

3、酶标抗体的制备

采用酶结合物稀释液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG按照最佳稀释倍数5000进行稀释，配制成酶标抗体。

4、阴阳性对照配制

采用从医院收集确诊为类风湿性关节炎患者的血清和正常人血清，经过处理后用阴阳性对照品稀释液按照适当比例进行稀释。

组建的试剂盒包括以下几个方面：96孔酶标板、阴性对照、阳性对照、样本稀释液、洗涤液、酶标抗体、显色液、终止液、封板膜及说明书。

实施例3：试剂盒的使用方法

(1)预处理：将试剂盒各组分置于室温平衡0.5-1h，用样本稀释液将样本进行1:50稀释；

(2)加样：在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴阳性对照各100μl/孔，用封板膜封板；

(3)孵育：将已加样的酶标板置200rpm-400rpm振荡器室温孵育30-60min；

(4)洗涤：将孵育好的酶标板，弃液拍干，用洗涤液洗涤4-6次；

(5)加酶标抗体：将酶标抗体按照100μl/孔加入酶标板中，用封板膜封板；

(6)孵育：将已加样的酶标板置200rpm-400rpm振荡器室温孵育30-60min；

(7)洗涤：将孵育好的酶标板，弃液拍干，用洗涤液洗涤4-6次；

(8)显色：底物A与底物B按照1:10进行稀释混合均匀，按照100μl/孔加入酶标板中，置400rpm振荡器室温孵育10-15min；

(9)测值：将终止液按照100μl/孔加入酶标板中，轻拍混匀，设定酶标仪波长450nm和630nm进行双波长测定各孔的OD值。

对比例1：CCP诊断试剂盒

以人工合成的瓜氨酸化多肽包被酶标板，样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中，选取其余孔加入标准品或参考品，室温反应1h，经洗涤后加入HRP标记的兔抗人IgG抗体，室温反应30min，经洗涤后加入TMB底物，室温反应30min，加入终止液终止反应，用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值，与标准品或参考品比较计算结果。

对比例2：

以人工合成的氨甲酰化纤维蛋白原包被酶标板，样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中，选取其余孔加入标准品或参考品，室温反应1h，经洗涤后加入HRP标记的兔抗人IgG抗体，室温反应30min，经洗涤后加入TMB底物，室温反应30min，加入终止液终止反应，用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值，与标准品或参考品比较计算结果。

对比例3：

以瓜氨酸化的纤维连接蛋白包被酶标板，样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中，选取其余孔加入标准品或参考品，室温反应1h，经洗涤后加入HRP标记的兔抗人IgG抗体，室温反应30min，经洗涤后加入TMB底物，室温反应30min，加入终止液终止反应，用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值，与标准品或参考品比较计算结果。

对比例4：

以氨甲酰化的α-烯醇化酶烯醇化酶包被酶标板，样品血清经稀释后按每孔100μl加入反应板样品空中，选取其余孔加入标准品或参考品，室温反应1h，经洗涤后加入HRP标记的兔抗人IgG抗体，室温反应30min，经洗涤后加入TMB底物，室温反应30min，加入终止液终止反应，用分光光度计在450nm和630nm下检测光吸收值，与标准品或参考品比较计算结果。

试剂盒的灵敏度和特异性检测

通过用本发明试剂盒(实施例1-2)与对比例1-3中的试剂盒进行检测灵敏度和特异性：

样本数量及类型：共计210例临床血清，其中正常人110例，RA患者60例，系统性红斑性狼疮患者血清40例。实验结果如下表：

表1实施例1试剂盒临床诊断结果统计表

阳性符合率＝53/(53+7)×100％＝88.3％；

阴性符合率＝145/(145+5)×100％＝96.6％；

粗一致性＝(53+145)/210×100％＝94.3％；

约登指数＝53/(53+7)+145/(145+5)-1＝0.840；

表2实施例2试剂盒临床诊断结果统计表

阳性符合率＝54/(54+6)×100％＝90％；

阴性符合率＝145/(145+5)×100％＝96.6％；

粗一致性＝(54+145)/210×100％＝94.7％；

约登指数＝54/(54+6)+145/(145+5)-1＝0.866；

表3CCP试剂盒(对比例1)与临床诊断结果统计表

阳性符合率＝43/(43+17)×100％＝71.7％；

阴性符合率＝136/(136+14)×100％＝90.7％；

粗一致性＝(43+136)/210×100％＝85.2％；

约登指数＝43/(43+17)+136/(136+14)-1＝0.624；

表4与单一抗原比较(对比例2)中的试剂盒临床诊断结果统计表

阳性符合率＝45/(45+15)×100％＝75.0％；

阴性符合率＝140/(140+10)×100％＝93.3％；

粗一致性＝(45+140)/210×100％＝88.1％；

约登指数＝45/(45+15)+140/(140+10)-1＝0.683

表5对比例3中的试剂盒临床诊断结果统计表

阳性符合率＝27/(27+33)×100％＝45％；

阴性符合率＝144/(144+6)×100％＝96％；

粗一致性＝(27+144)/210×100％＝81.4％。

约登指数＝27/60+144/150-1＝0.41

表6与对比例4中的试剂盒临床诊断结果统计表

阳性符合率＝50/(50+10)×100％＝83.3％；

阴性符合率＝138/(138+12)×100％＝92％；

粗一致性＝(50+138)/210×100％＝89.5％；

从表1-表6的结果可以看出，本申请采用新型复合RA自身抗体检测法制备的试剂盒无论是灵敏度还是特异性均优于其他采用单一抗原的试剂盒。本申请试剂盒灵敏度为90.0％，特异性为96.7％。本实验结果表明，采用采用新型复合RA自身抗原检测法制备的试剂盒具有特异性强，灵敏度高等特点。

实施例4：

与实施例1相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为5:2之外，其它与实施例1相同。

实施例5：

与实施例1相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为5:0.1之外，其它与实施例1相同。

对比例5

与实施例1相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为1:5之外，其它与实施例1相同。

对比例6

与实施例1相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为9:1之外，其它与实施例1相同。

对比例7

与实施例2相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为4:8之外，其它与实施例2相同。

对比例8

与实施例2相比，除瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原的质量比为9:1之外，其它与实施例2相同。

试剂盒的灵敏度和特异性检测

将实施例4-5和对比例5-8按照实施例3的方法进行灵敏度和特异性的检测，结果如下表5所示：

表5

	阳性符合率	阴性符合率	粗一致性
				实施例4	85％	90％	87％
实施例5	83.3％	95％	85.2％
				对比例5	75％	91.3％	86.7％
对比例6	71.7％	90％	84.8％
				对比例7	88.3％	93.3％	91.9％
对比例8	70％	88％	82.9％

从表5可以看出，瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的质量比的改变使得检测精准度和特异性下降，尤其是瓜氨酸化波型蛋白和氨甲酰化纤维蛋白原白的质量比不在(5-8):(5-2)范围内，检测精准度和特异性与在(5-8):(5-2)范围内相差甚大，可见瓜氨酸化蛋白、氨甲酰化蛋白的组合抗原通过特定的质量比取得了精准度和特异性提高的效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种复合检测抗原，其特征在于，所述检测抗原为瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的组合抗原。

2.根据权利要求1所述的检测抗原，其特征在于，所述瓜氨酸化蛋白和氨甲酰化蛋白的质量比为(5-8):(2-5)，优选为8:2；

优选地，所述组合抗原的工作浓度为1-20μg/mL，优选为2-10μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的检测抗原，其特征在于，所述瓜氨酸化蛋白为瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化II型胶原、瓜氨酸化核周因子、瓜氨酸化丝聚蛋白、瓜氨酸化牛白蛋白、瓜氨酸化组胺受体、瓜氨酸化α-抗胰蛋白酶、瓜氨酸化动力蛋白重链3、瓜氨酸化纤维蛋白原β链、瓜氨酸化角蛋白、瓜氨酸化微管蛋白β链、瓜氨酸化纤维蛋白、瓜氨酸化纤维粘连蛋白、瓜氨酸化可溶性人白细胞抗原I、瓜氨酸化α-烯醇化酶烯醇化酶、瓜氨酸化无孢蛋白、瓜氨酸化组织蛋白酶D、瓜氨酸化β-肌动蛋白、瓜氨酸化CapZa-1、瓜氨酸化蛋白质二硫键异构酶ER60前体、瓜氨酸化线粒体乙醛脱氢酶或瓜氨酸化Spα受体中的任意一种或至少两种的组合，优选为瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白，瓜氨酸化α-烯醇化酶烯醇化酶，瓜氨酸化丝聚蛋白中的任意一种或两种的组合；

优选地，所述氨甲酰化蛋白为氨甲酰化牛白蛋白、氨甲酰化纤维蛋白原、氨甲酰化波形蛋白、氨甲酰化胶原蛋白或氨甲酰化烯醇酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为氨甲酰化牛白蛋白，氨甲酰化纤维蛋白原、氨甲酰化烯醇酶中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测抗原在制备类风湿关节炎的检测试剂或检测工具中的应用；

优选地，所述检测工具为检测试剂盒。

5.一种检测类风湿关节炎的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的检测抗原和检测中可接受的试剂。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗原固定于固相载体上；

优选地，所述固定方法包括直接包被法和/或间接包被法；

优选地，所述间接包被法为通过生物素与链霉亲和素的特异性反应将抗原间接固定于固相载体上；

优选地，所述固相载体为酶标板、磁珠、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标抗人抗体、阴性对照品、阳性对照品、临界对照品、样品稀释液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液；

优选地，所述酶标抗人抗体的稀释倍数为1000-10000，优选为5000；

优选地，所述酶标抗人抗体的工作质量浓度为0.1-1μg/mL。

8.根据权利要求6-8中任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)试剂盒在室温平衡0.5-1h，用样品稀释液将待测样品进行稀释；

(2)在酶标板相对应的孔中加入已稀释好的待测样品、阴性对照品和阳性对照品，封板，进行孵育、洗涤；

(3)将酶标抗人抗体加入酶标板中，封板，孵育、洗涤、显色，检测所述待测样品的光吸收值和所述阴性对照品的光吸收值，待测样品的光吸收值减去阴性对照的光吸收值，为所述待测样品的结果。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)所述检测的波长为450nm和630nm双波长检测；

优选地，步骤(3)所述待测样品的光吸收值减去所述阴性对照品的光吸收值。

10.根据权利要求8或9所述的使用方法，其特征在于，所述待测样品的结果判定为：

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值≥1时，判为阳性；

所述待测样品的光吸收值/所述临界对照品的光吸收值＜1时，判为阴性。