CN110579600A - 通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法。该方法通过联合检测血清14‑3‑3η蛋白、anti‑CCP抗体和抗Carp抗体中至少2种的水平，并将检测结果与RA相关联，可以显著提高RA炎性关节病变患者的RA阳性的检测准确度。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的试剂盒及制备方法、使用方法。
背景技术
生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。
类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎为主要特征,临床表现以慢性多发性关节炎为主的最终可导致关节畸形的系统性自身免疫性疾病。利用生物标志物对RA患者的病程和病情、遗传学背景、表观遗传学等特性做出综合判断，可以实现RA的精准化诊治，提高RA患者的生存质量。因此，如何提高RA炎性关节病变患者的RA阳性的检测准确度是一个迫切的技术问题亟待解决。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法。该方法通过联合检测血清14-3-3η蛋白、anti-CCP抗体和抗Carp抗体中至少2种的水平，并将检测结果与RA相关联，可以显著提高RA炎性关节病变患者的RA阳性的检测准确度。
为此，本发明第一方面提供了一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
本发明第二方面提供了一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂中的用途，包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第三方面提供了一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的制剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第四方面提供了一种类风湿性关节炎(RA)生物标记物组用于制备在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RA。
根据本发明的一些实施方式，生物标记物组中各生物标记物的浓度采用非均相和/或均相化学发光免疫检测发进行检测。
在本发明的一些具体实施例中，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测。
在本发明的另一些具体实施例中，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用均相化学发光免疫检测法进行检测。
根据本发明的一些实施方式，采用非均相化学发光免疫检测法检测Anti-CCP抗体的浓度的步骤包括采用非均相化学发光免疫检测法测量Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量。
在本发明的一些实施例中，基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤还包括将所测得的Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量进行比较。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤包括将所述样品与包含能够与Anti-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合形成免疫复合物的第一抗原接触，并进一步与抗免疫复合物抗体接触，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
本发明中，所述第一抗原直接或间接与固相载体结合，所述抗免疫复合物抗体直接或间接与能够与底物反应或能够催化底物生成的可检测信号的标记物结合。
在本发明的一些实施例中，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述第一抗原为瓜氨酸化抗原。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白
根据本发明的一些实施方式，采用均相化学发光免疫检测法生物标记物组中14-3-3eta蛋白的浓度的步骤包括测量14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量。
在本发明的一些实施例中，基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤还包括将所测得的14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量进行比较。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤包括将所述样品与包含能够与14-3-3eta蛋白或其片段的至少一种特异表位特异性结合形成免疫复合物的抗体。
在本发明的一些实施例中，所述抗体包括能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合的第一抗体以及能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述第一抗体与受体结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施例中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明中，所述第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
在本发明的一些实施例中，所述14-3-3eta蛋白或其片段的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。
在本发明的一些进一步的实施例中，所述表位选自氨基酸片段为14-3-3eta蛋白的序列的相对特异性片段：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa。
本发明第五方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第六方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第七方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第八方面提供了基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其中利用非均相化学发光均相免疫检测法对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RA。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织。
根据本发明的一些优选的实施例方式，所述试剂套装包括采用非均相化学发光免疫检测法检测生物标记物组中Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白浓度的试剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于检测Anti-CCP抗体的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a1，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗原，所述第一原能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合；
组分b1，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的标记物以及与之直接结合或间接结合的抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
在本发明的一些实施例中，所述试剂还包括作为校准品的Anti-CCP抗体纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的另一些优选的实施例中，，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些优选的实施例中，还包括组分c1，底物溶液，所述底物溶液包括A1溶液和B1溶液，优选所述A1溶液为过氧化氢溶液，优选所述B1溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明的另一些具体优选的实施例中，用于检测14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a2，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合；
组分b2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号第一标记物以及与之直接结合或间接结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
在本发明的一些实施例中，所述试剂还包括作为校准品的14-3-3eta蛋白纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗体或其结合片段与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的一些另优选的实施例中，所述第二抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第一标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第二抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第一标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些优选的实施例中，还包括组分c2，底物溶液，所述底物溶液包括A2溶液和B2溶液，优选所述A2溶液为过氧化氢溶液，优选所述B2溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述试剂还包括组分d2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的第二标记物以及与之直接结合或间接结合的第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，直接结合或间接结合第二标记物的第三抗体与直接结合或间接结合第一标记物的第二抗体为结合14-3-3eta蛋白的相同表位的同株抗体。
在一些优选的实施例中，所述第三抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第二标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第三抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第二标记物与链霉亲和素结合。
本发明第九方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十一方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十二方面提供了基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十三方面提供了一种通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其包括使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些进一步的实施例中，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
本发明第十四方面提供了一种通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的方法，其包使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种。
本发明第十五方面提供了一种通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的方法，其包括使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种。
在本发明的一些进一步的实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第十六方面提供了一种使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒用于在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RF。
根据第十三至十六方面所述的方法，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-CCP抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
根据第十三至十六方面所述的方法，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量；
或包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述方法还包括在步骤R1或T1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，在步骤R3或T3中，检测步骤R2或T2中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
本发明第十七方面提供了一种如本发明第五-八方面所述的非均相化学发光免疫检测试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的非均相化学发光免疫检测试剂盒或如本发明第十三至十六方面所述的非均相化学发光免疫检测方法在化学发光免疫分析仪中的应用。
本发明第第十八方面提供了如本发明第十七方面所述的应用中的所述的化学发光免疫分析仪，其包括：
样本加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品；
试剂加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注各种试剂的移液；
孵育模块，其用于为待测样品及试剂发生免疫反应提供合适的温育反应环境；
磁分离模块，其用于清洗反应混合液中的磁微粒，并将温育反应后的反应液排出，留下清洗后的磁微粒；
检测模块，其用于检测化学发光信号，判断待测样本中目标分子的浓度
电气控制模块，用于协调控制所述孵育模块、样本加注模块，试剂加注模块，所述磁分离模块和所述检测模块按照设定的程序动作。
本发明第十九方面提供了一种用于检测Anti-CCP的均相免疫检测方法，其采用本发明第十八方面所述的检测系统和如本发明所述的用于检测Anti-CCP抗体的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-CCP抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
本发明第二十方面提供了一种用于检测14-3-3eta蛋白的均相免疫检测方法，其采用本发明第十八方面所述的检测系统和如本发明所述的用于检测14-3-3eta蛋白的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量；
或包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1或T1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R3或T3中，检测步骤R2或T2中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
本发明所提供的通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法通过联合检测血清14-3-3η蛋白、anti-CCP抗体和抗Carp抗体中至少2种的水平，并将检测结果与RA相关联，可以显著提高RA炎性关节病变患者的RA阳性的检测准确度。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
“待测主体”、“受治疗者”和“患者”可互换使用，在没有特别说明或限定的情况下，是指哺乳动物，诸如人和非人灵长类、以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其它哺动物物种。
本发明所述用语“非均相”所对应的英文定义为“heterogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待测样品”是指可能含有被分析物的一种混合物，被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样品包括体液和组织，如血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织等。
本发明中所述用语“瓜氨酸肽”是指能与RA血清有阳性反应的特异性抗原：丝集蛋白片段、前丝集蛋白前体、合成多肽及重组多肽、偶联有标示物的多肽等各种修饰后肽段，其特点是含有瓜氨酸，瓜氨酸残基是抗CCP抗体识别的底物必须成分。
本发明所述用语“瓜氨酸表位”是指抗原表面能够被抗环瓜氨酸肽抗体特异性结合的区域，包括瓜氨酸残基及其所处的周围氨基酸序列。
本发明所述用语“抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位识别位点”亦称为“识别抗原表位的位点”是指抗环瓜氨酸肽抗体所具有的识别和结合“瓜氨酸表位”区域，例如，抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第一识别位点和抗环瓜氨酸肽抗体的抗原表位第二识别位点不相重叠，也就是说二者属于具有相同结合特性的不同位置的抗原表位识别位点。
本发明所述用语“所述瓜氨酸肽段混合物”是指由至少2个单一含瓜氨酸的肽段混合后形成的混合物，其中所述含瓜氨酸的肽段可以是含瓜氨酸的环型肽段，也可以是含瓜氨酸的线型肽段。
本发明所述用语“14-3-3”和“14-3-3蛋白”可互换使用，是指在真核细胞中普遍表达的保守胞内调节分子的14-3-3家族的至少一个成员。14-3-3蛋白具有结合许多功能各异的信号转导蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体的能力。实际上，多于100种信号转导蛋白已被报道为14-3-3的配体。14-3-3蛋白可被认为是Tetratrico肽重复片段超家族的演化成员。它们通常具有9或10个α螺旋，通常沿着其氨基末端螺旋形成同二聚体和/或异二聚体相互作用。这些蛋白包含多个已知结构域，所述结构域包括用于二价阳离子相互作用、磷酸化&乙酰化和蛋白水解裂解的区域及其它。已知在哺乳动物中表达七种不同遗传编码的14-3-3蛋白同种型，每种同种型包含242-255个氨基酸。七种14-3-3蛋白同种型命名为14-3-3α/β(alpha/beta)、14-3-3δ/ξ(delta/zeta)、14-3-3ε(epsilon)、14-3-3γ(gamma)、14-3-3η(eta)、14-3-3τ/θ(tau/theta)和14-3-3σ(sigma/stratifin)。14-3-3蛋白具有高程度的序列相似性，已知经历翻译后处理如，磷酸化、瓜氨酸化、等等。参见如，Megidish等(1998)J.Biol.Chem.273：21834-45。因此，抗14-3-3自身抗体可特异性结合和/或识别多于一种14-3-3蛋白同种型，或可特异性结合和/或识别仅一种同种型(如，14-3-3η)。另外，抗14-3-3抗体可结合和/或识别已被如，天然(如，翻译后)或化学方法修饰的14-3-3-蛋白。
本发明中所述用语“相对特异性片段”是指针对14-3-3家族的7个同种型14-3-3蛋白，本发明人通过研究发现如SEQUENCE NO.1所示的14-3-3eta蛋白或其片段的氨基酸序列中片段1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa为仅属于14-3-3η(eta)蛋白的特异性表位，其与14-3-3家族的其他6个同种型14-3-3蛋白的氨基酸序列无任何交叉，由其产生的单克隆抗体，只识别或结合14-3-3η(eta)蛋白，不识别或结合14-3-3家族的其他6个同种型14-3-3蛋白。
本发明中所述“关节炎”与“关节炎疾患”和“关节痛”可互换使用，除了指明之处以外，通常是指人体关节的炎症性疾患。疼痛、肿胀、僵硬和难以移动通常与关节炎疾患有关。关节炎由多于100种不同情况组成。这些情况可以是任何情况，从相对轻微的形式到严重损害的系统形式。关节炎疾患可由多种原因的任何原因造成，包括感染、创伤、退行性疾病、代谢紊乱或干扰或其它未知病因。关节炎疾患可按照亚型更具体地描述，例如，类风湿性关节炎、混合性结缔组织病(MCTD)、晶体性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、骨关节炎、类肉瘤病、复发性风湿病、创伤后关节炎、恶性肿瘤相关的关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、骨关节炎、细菌传染性关节炎、等等。关节炎还可伴有其它鉴定的疾病，包括痛风、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病、等等。明确定义的关节炎疾患是指知晓关于关节炎的类型和其阶段，如，发作、缓解、复发、等等。
本发明所述用语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段；包括但不限于Fab、Fv、scFv、Fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双特异性抗体，以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“免疫复合物”(immune complex)即抗原-抗体复合物；而所述“人免疫复合物”是指人体内存在的免疫复合物，其既可以是存在于血液循环中的免疫复合物，也可以是沉积于组织中的免疫复合物。
本发明所述用语“抗免疫复合物抗体”指的是能特异性识别和结合抗原-抗体免疫复合物的物质，其不识别游离的、未结合抗原的抗体以及游离的人IgG抗体。具体地，样本中特异性抗体与相应抗原结合后形成抗原抗体-免疫复合物，该免疫复合物状态下的抗体构象或表位发生变化，表现出与其他游离的非特异性抗体构象或表位有差异，这种差异被本发明所述的抗免疫复合物抗体所特异性识别。应用这种抗免疫复合物抗体能够区分出免疫复合物状态下的抗体和非特异性抗体、未结合抗原的游离的特异性抗体。
本发明所述用语“单克隆抗体”是指由单克隆的B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“多克隆抗体”是指由一个以上的B淋巴细胞克隆产生的免疫球蛋白集合，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”或“特异结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员对的例子是生物素-链霉亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体，可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。例如，本发明所述第一抗原为能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合的抗原。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
本发明所述用语“非均相化学发光免疫检测试剂套装”是指非均相化学发光免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂的组合。
本发明中所述“检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度”是指“生物标记物联检”。
Ⅱ.实施方案
如前所述，由于RA表现多样，部分不典型的早期和(或)血清显阴性的患者常被误诊、漏诊。为了完善RA现有诊断策略，提高诊断水平，本发明人对Ra诊断方法进行了大量的研究。
本发明人研究发现，14-3-3η蛋白在RA血清和关节滑液中显著升高，并能上调多种与RA相关的炎症因子的表达，提示其可能参与RA疾病发生。本发明人进一步通过检测RA、非RA炎性关节病变患者及同期健康体检者血清14-3-3η蛋白、anti-CCP抗体和抗Carp抗体中至少2种的水平，并对其进行分析比较，并与RA相关联，发现联合检测血清14-3-3η蛋白、anti-CCP抗体和抗Carp抗体至少2种的水平，并将检测结果与RA相关联，可以显著提高RA炎性关节病变患者的RA阳性的检测准确度。本发明正是基于上述发现作出的。
因此，本发明第一方面涉及一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
本发明第二方面涉及一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂中的用途，包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第三方面涉及一种检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的制剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第四方面涉及一种类风湿性关节炎(RA)生物标记物组用于制备在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆、血清、滑膜液和组织，进一步优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，更进一步优选所述待测样品为血清。
本发明中，Anti-CCP抗体被一种或多种作为抗原的CCP捕获；和/或，抗Anti-carp抗体被一种或多种作为抗原的carp捕获；和/或，所述14-3-3eta蛋白被一种或多种14-3-3eta蛋白的抗体捕获。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述其他生物标记物为RA。
在本发明的一些具体的实施例中，生物标记物组中各生物标记物的浓度采用非均相和/或化学发光免疫检测发进行检测。
在本发明的一些具体实施例中，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测。
在本发明的另一些具体实施例中，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用均相化学发光免疫检测法进行检测。
根据本发明的一些实施方式，采用非均相化学发光免疫检测法检测Anti-CCP抗体的浓度的步骤包括采用非均相化学发光免疫检测法测量Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量。
在本发明的一些实施例中，基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤还包括将所测得的Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量进行比较。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤包括将所述样品与包含能够与Anti-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合形成免疫复合物的第一抗原接触，并进一步与抗免疫复合物抗体接触，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
本发明中，所述第一抗原直接或间接与固相载体结合，所述抗免疫复合物抗体直接或间接与能够与底物反应或能够催化底物生成的可检测信号的标记物结合。
在本发明的一些实施例中，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述第一抗原为瓜氨酸化抗原。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白
根据本发明的一些实施方式，采用均相化学发光免疫检测法生物标记物组中14-3-3eta蛋白的浓度的步骤包括测量14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量。
在本发明的一些实施例中，基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤还包括将所测得的14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量进行比较。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤包括将所述样品与包含能够与14-3-3eta蛋白或其片段的至少一种特异表位特异性结合形成免疫复合物的抗体。
在本发明的一些实施例中，所述抗体包括能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合的第一抗体以及能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述第一抗体与受体结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些实施例中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明中，所述第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
在本发明的一些实施例中，所述14-3-3eta蛋白或其片段的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。
在本发明的一些进一步的实施例中，所述表位选自氨基酸片段为14-3-3eta蛋白的序列的相对特异性片段：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa。
下文中第五到第二十方面进一步提供了实现本发明的具体实施方案。
本发明第五方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第六方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第七方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第八方面提供了基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其中利用非均相化学发光均相免疫检测法对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明中，Anti-CCP抗体被一种或多种作为抗原的CCP捕获；和/或，抗Anti-carp抗体被一种或多种作为抗原的carp捕获；和/或，所述14-3-3eta蛋白被一种或多种14-3-3eta蛋白的抗体捕获。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种和其他生物标记物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述其他生物标记物为RA。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆、血清、滑膜液和组织，进一步优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，更进一步优选所述待测样品为血清。
本发明第九方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十一方面提供了一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十二方面提供了基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含本发明第五-八方面所述的试剂套装。
本发明第十三方面提供了一种通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其包括使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些进一步的实施例中，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
本发明第十四方面提供了一种通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的方法，其包使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
本发明第十五方面提供了一种通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的方法，其包括使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病。
在本发明的一些实施例中，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些进一步的实施例中，所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
本发明第十六方面提供了一种使用如本发明第五-八方面所述的试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的试剂盒用于在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
在本发明的一些优选的实施例中，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种和其他生物标记物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述其他生物标记物为RA。
本发明中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、精液、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆、血清、滑膜液和组织，进一步优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，更进一步优选所述待测样品为血清。
根据本发明的一些优选的实施例方式，所述试剂套装包括采用非均相化学发光免疫检测法检测生物标记物组中Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白浓度的试剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于检测Anti-CCP抗体的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a1，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗原，所述第一原能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合；
组分b1，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的标记物以及与之直接结合或间接结合的抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
在本发明的一些实施例中，所述试剂还包括作为校准品的Anti-CCP抗体纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的另一些优选的实施例中，，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些优选的实施例中，还包括组分c1，底物溶液，所述底物溶液包括A1溶液和B1溶液，优选所述A1溶液为过氧化氢溶液，优选所述B1溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明中，所述抗免疫复合物抗体通过识别表位与第一免疫复合物中的抗-CCP抗体结合，所述识别表位是构象表位和/或线性表位。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的恒定区部分。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体不识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的轻链部分。
在本发明的另一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体特异性识别第一免疫复合物中抗-CCP抗体的Fc段。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为单克隆抗体。
在本发明中，所述多克隆抗体的制备方法包括：用人免疫复合物对动物进行免疫，获取含有所述多克隆抗体的动物血清；所述动物血清经亲和层析纯化得到特异性识别人免疫复合物的多克隆抗体。
在本发明中，所述单克隆抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行培养，对细胞培养上清液进行检测，保留阳性细胞株。
根据本发明，所述第一抗原为瓜氨酸化抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一抗原选自合成的含环瓜氨酸的环形肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物；优选所述第一抗原为由2-4个含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物。
在本发明的一些优选的实施例中，所述含瓜氨酸的肽段选自SEQ ID No.2-5。
表1
| 序列号 | 序列 |
| SEQ ID No.2 | 环-(HQCHQEST-Cit-GRSRGRCGRSGS) |
| SEQ ID No.3 | ARGGSRERARGRGRG-Cit-GEKR |
| SEQ ID No.4 | GGSKTSLYNLR-Cit-GTALAIPQ |
| SEQ ID No.5 | APPPISGGGY-cit-A-cit-PAKAAAT |
在一些优选的实施例中，所述第一抗原间接与固相载体相连接。
在本发明的一些实施例中，所述组分a1中固相载体以及与之结合的第一抗原的浓度为1-100mg/mL，优选10-50mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述组分b1中第一标记物以及与之结合的第二抗体或其结合片段的浓度为1-100mg/mL，优选10-50mg/mL。
在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-CCP抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于检测14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a2，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合；
组分b2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号第一标记物以及与之直接结合或间接结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述14-3-3eta蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。优选地，所述第二表位和所述第一表位分别独立地选自氨基酸片段为14-3-3eta蛋白的序列的相对特异性片段：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa。
本发明中，所述的第一抗体、第二抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
在本发明的一些优选的实施例中，所述试剂还包括作为校准品的14-3-3eta蛋白纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗体或其结合片段与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的另一些优选的实施例中，其特征在于，所述第二抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第一标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第二抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第一标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述组分a2中固相载体以及与之结合的第一抗体或其结合片段的浓度为1-100mg/mL，优选10-50mg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述组分b2中第一标记物以及与之结合的第二抗体或其结合片段的浓度为1-100mg/mL，优选10-50mg/mL。
本发明中，所述第一标记物为化学发光标记物，选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、金刚烷、稀土元素和联吡啶钌配合物。
本发明中，所述第一标记物为化学发光催化剂，选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
本发明中，所述固相载体选自微孔板、磁珠、塑胶微粒和塑料微球，优选所述固相载体为磁珠。
在本发明的一些优选的实施例中，所述试剂套装还包括组分c2，底物溶液。
本发明中，所述底物溶液包括A2溶液和B2溶液，在一些实施例中，例如，所述A2溶液为过氧化氢溶液，所述B2溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述试剂还包括组分d2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的第二标记物以及与之直接结合或间接结合的第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，直接结合或间接结合第二标记物的第三抗体与直接结合或间接结合第一标记物的第二抗体为结合14-3-3eta蛋白的相同表位的同株抗体。
在一些优选的例子中，所述第三抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第二标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第三抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第二标记物与链霉亲和素结合。
本发明中，所述第二标记物为化学发光标记物，选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、金刚烷、稀土元素和联吡啶钌配合物。
本发明中，所述第二标记物为化学发光催化剂，选自辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
在本发明的一些实施例中，所述组分d中第二标记物以及与之结合的第三抗体或其结合片段的浓度为1-100mg/mL，优选10-50mg/mL。
在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R3中，检测步骤R2中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的另一些进一步具体优选的实施例中，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤T1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤T4中，检测步骤T3中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
本发明第十七方面提供了一种如本发明第五-八方面所述的非均相化学发光免疫检测试剂套装或使用如本发明第九-十二方面所述的非均相化学发光免疫检测试剂盒或如本发明第十三至十六方面所述的非均相化学发光免疫检测方法在化学发光免疫分析仪中的应用。
本发明第第十八方面提供了如本发明第十七方面所述的应用中的所述的化学发光免疫分析仪，其包括：
样本加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品；
试剂加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注各种试剂的移液；
孵育模块，其用于为待测样品及试剂发生免疫反应提供合适的温育反应环境；
磁分离模块，其用于清洗反应混合液中的磁微粒，并将温育反应后的反应液排出，留下清洗后的磁微粒；
检测模块，其用于检测化学发光信号，判断待测样本中目标分子的浓度
电气控制模块，用于协调控制所述孵育模块、样本加注模块，试剂加注模块，所述磁分离模块和所述检测模块按照设定的程序动作。
本发明第十九方面提供了一种用于检测Anti-CCP的均相免疫检测方法，其采用本发明第十八方面所述的检测系统和如本发明所述的用于检测Anti-CCP抗体的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-CCP抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
本发明第二十方面提供了一种用于检测14-3-3eta蛋白的均相免疫检测方法，其采用本发明第十八方面所述的检测系统和如本发明所述的用于检测14-3-3eta蛋白的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量；
或包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1或T1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R3或T3中，检测步骤R2或T2中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
根据本发明的一些实施方式，本发明中所述试剂套装中还可以包含其他试剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于检测Anti-Carp抗体的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a3，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗原，所述第一原能够与抗-Carp抗体的抗原表位结合位点特异性结合；
组分b3，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的标记物以及与之直接结合或间接结合的抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-Carp抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-Carp抗体。
在本发明的一些实施例中，所述试剂还包括作为校准品的Anti-Carp抗体纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
在本发明的另一些优选的实施例中，，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
在本发明的一些优选的实施例中，还包括组分c3，底物溶液，所述底物溶液包括A3溶液和B3溶液，优选所述A3溶液为过氧化氢溶液，优选所述B3溶液为氢氧化钠溶液。
在本发明中，所述抗免疫复合物抗体通过识别表位与第一免疫复合物中的抗-Carp抗体结合，所述识别表位是构象表位和/或线性表位。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体识别第一免疫复合物中抗-Carp抗体的恒定区部分。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体不识别第一免疫复合物中抗-Carp抗体的轻链部分。
在本发明的另一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体特异性识别第一免疫复合物中抗-Carp抗体的Fc段。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述识别表位的氨基酸序列包含5-10个氨基酸。
在本发明的一些实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗免疫复合物抗体为单克隆抗体。
根据本发明，所述第一抗原为氨甲酰化抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述第一抗原选自合成的氨甲酰化肽段、由至少2个单一氨甲酰化肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物和氨甲酰化蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述第一抗原选自合成的氨甲酰化肽段、由至少2个单一氨甲酰化肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物；优选所述第一抗原为由2-4个氨甲酰化肽段合成在一条肽链上形成的多肽或含有2-4单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物。
在本发明的一些优选的实施例中，所述氨甲酰化肽段选自SEQ ID No.6-SEQ IDNo.9。
表2
| 序列号 | 序列 |
| SEQ ID No.6 | HQCHQEST-Hcit-GKSKGKCGKSGS |
| SEQ ID No.7 | CKAAATQ-Hcit-KVERCARRR |
| SEQ ID No.8 | NEAN-Hcit-YQISVN-Hcit-YRG |
| SEQ ID No.9 | NEEGFFSA-Hcit-GHRPLDKK |
在本发明的一些实施例中，对于由至少2个单一氨甲酰化肽段合成在一条肽链上形成的多肽，所述第一抗原中多个不同肽段相互之间的摩尔比相同。
在本发明的另一些实施例中，对于含有至少2个单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物，所述第一抗原中多个不同肽段相互之间的质量比相同。
本领域技术人员应该了解的是，对于选自合成的氨甲酰化肽段、由至少2个单一氨甲酰化肽段合成在一条肽链上形成的多肽和含有至少2个单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物的第一抗原，为减少空间位阻，所述第一抗原可以通过中间体与受体相结合，所述中间体为亲水性高分子物质。
在本发明的一些实施例中，所述中间体为蛋白质，优选选自血蓝蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。
在本发明的另一些实施例中，所述中间体选自树枝状大分子、聚羧酸酯、聚巯基和聚乙二醇。
本发明中对于含有至少2个单一氨甲酰化肽段的氨甲酰化肽段混合物的第一抗原偶联中间体的方式没有特别的限制，既可以是各单一氨甲酰化肽段分别先偶联中间体，然后混合形成偶联中间体的氨甲酰化肽段混合物；也可以是各单一甲酰化肽段混合后形成甲酰化肽段混合物，然后再偶联中间体形成偶联中间体的氨甲酰化肽段混合物；优选地，各单一甲酰化肽段混合后形成甲酰化肽段混合物，然后再偶联中间体形成偶联中间体的氨甲酰化肽段混合物。
在本发明的一些实施例中，所述受体及与之结合的抗免疫复合物抗体的浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选25-100μg/mL。
在本发明的另一些实施例中，所述第一抗原及与之结合的特异性结合配对成员中的一员的浓度为0.1-10μg/mL，优选0.5-5μg/mL，更优选1-3μg/mL。
在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，采用含有检测Anti-Carp抗体和Anti-Carp抗体的非均相化学发光免疫检测试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-Carp抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a3混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b3混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c3混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-Carp抗体的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-Carp抗体标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-Carp抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-Carp抗体的含量。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于检测14-3-3eta蛋白的均相免疫检测试剂包括：
组分a4，其包含能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合；
组分b4，其包含能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合的第二抗体或其结合片段，所述第二表位和所述第一表位不相重叠；
组分c4，其包括能够在激发状态产生单线态氧的供体。
在本发明的一些实施例中，所述14-3-3eta蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。优选地，所述第二表位和所述第一表位分别独立地选自氨基酸片段为14-3-3eta蛋白的序列的相对特异性片段：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa。
本发明中，所述的第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
在本发明的一些实施例中，所述试剂还包括作为校准品的14-3-3eta蛋白纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
在本发明的一些优选的实施例中，所述第二抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述供体与特异性结合配对成员中的另一员结合。优选地，所述第二抗体或其结合片段与生物素结合，而所述供体与链霉亲和素结合。
在本发明的一些实施例中，所述组分a中受体以及与之结合的第一抗体或其结合片段的浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选30-100μg/mL，最优选40-80μg/mL；和/或，所述组分b中第二抗体或其结合片段的浓度为0.1-8μg/mL，优选0.2-6μg/mL，更优选0.4-4μg/mL，最优选0.6-2μg/mL；和/或，组分c中所述供体的浓度为5-20μg/mL，优选8-15μg/mL，更优选10-12μg/mL。
本发明中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。
在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，采用含有检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白的均相免疫检测试剂套装通过均相免疫检测法来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a4和组合b4混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c4混合，得到第四混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第四混合物接触，激发所述供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
本发明中，步骤R1和R2之间以及步骤R2和R3之间没有分离和/或洗涤的步骤。
在一些实施例中，在步骤R3中，使用600-700nm波长的激发光照射第四混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光。
Ⅲ.实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
本发明所述方法中，所有试剂在组合或混合后，均可以根据实际需要进行混匀和/或温育。具体地，所述温育的温度可以是25-45℃温度范围内的任意温度，温育时间可以是过夜或者10-20min均可。
实施例1：
收集40例确诊类风湿关节炎样本，采用非均相免疫分析检测Anti-CCP抗体，采用均相免疫分析检测14-3-3eta蛋白)。
1、采用非均相磁微粒化学发光间接法检测Anti-ccp抗体的浓度。
1.1、试剂制备
试剂1：包被肽段抗原量1μg/mg的磁微粒；
试剂1的制备：0.1M pH7.2PBST稀释成0.4mg/mL磁微粒浓度。
试剂2：标记抗人IgG抗体摩尔比例1:20的吖啶酯；
试剂2的制备：用20％NBS稀释成0.6μg/mL蛋白浓度。
1.2、将上述组份组装成ANTI-CCP测定盒后，设置检测步骤：
反应步骤：(全自动分析仪)
(1)样本50μL+50μL试剂1，加入反应杯，37℃反应15min，磁分离，洗涤五次；
(2)加入100μL试剂2,37℃反应10min，磁分离，洗涤五次
(3)加入200μL底物液，立即测信号值。
(4)底物液为氢氧化钠和过氧化氢及表面活性剂的混合物。
(5)根据校准品的信号值，按照四参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与ANTI-CCP浓度之间的方程式；
(6)同样再按照步骤(1)-(4)检测待测样品，由(5)中的方程式计算得出待测样品中Anti-ccp蛋白浓度。
2、采用均相磁微粒化学发光法检测14-3-3的浓度。
2.1、试剂Ⅰ(抗体包被的受体)的制备：
(1)受体和供体的制备
用作本发明的受体和供体的制备方法、组成结构及其含量可以参见中国专利CN100429197C(该专利文献在此全文引为参考)中的实施例1。
(2)预处理
将待处理0.2mg抗体原料装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.05M pH9.6CB透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(3)包被过程
3.1取2mg受体加入离心管，加入0.05M pH9.6CB交联缓冲液，离心7500rpm，15min，弃上清，向离心管中加入400ul交联缓冲液，进行超声清洗微粒，再次离心。
3.2加入200ul交联缓冲液将微粒重悬，使微粒浓度为10mg/ml，再加入0.1mg抗体原料，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25-40rpm混匀过夜。
3.3将离心管放入2-8℃冷却10min，取4μL的8mg/ml NaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温，垂直旋转混合器上25-40rpm反应2小时。
3.4在离心管中加入32μL的75mg/mL Gly溶液混匀，垂直旋转混合器上25-40rpm反应1小时。
(4)清洗
离心管称重配平后，离心7500rpm，15min，弃上清，加入0.1M pH7.4PBST清洗缓冲液，进行超声清洗微粒。重复两次，再用微粒保存缓冲液清洗一次。
(5)配制
加入4ml工作稀释液，使其工作浓度为50μg/mL，完成试剂I的制备，备用。
2.2、试剂Ⅱ(抗体标记的生物素)的制备：
(1)预处理
取待处理0.2mg抗体原料装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH8.0NaHCO3透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(2)标记过程
取200μL0.1M pH8.0NaHCO3标记缓冲液加入离心管，加入0.1mg抗体原料，混匀。再加入配制好的5mg/mL生物素溶液8μL，迅速混匀。2-8℃垂直旋转混合器上25-40rpm反应过夜。
(3)透析
取待处理生物素标记溶液装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH7.4PBS透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。
(4)配制
加入20ml工作稀释液，使其工作浓度为1ug/ml，完成试剂2的制备，备用。2.3、14-3-3eta蛋白校准品的制备：
1.1校准品稀释液的配制：称取HEPES 4.77g、NaCl 1.7g，添加纯化水160g混匀30min，使用1M的浓盐酸和1M的NaOH溶液调pH值至7.4±0.2，继续添加Proclin300 0.1g、BSA 30g、1M MgCl2 0.5ml、0.1M MgCl2 0.1ml，搅拌30min后添加纯化水定重至200g，复测pH值后，2-8℃备用。
1.2校准品的配制：用校准品稀释液按照比例梯度稀释成工作校准品，再由由工作校准品标定出产品校准品抗体浓度，完成校准品的制备。
2.4、实验操作：
将上述组份组装成14-3-3eta蛋白测定盒后，装载在全自动光激化学发光免疫分析仪上，设置检测步骤：
1)加样Tip头吸取20μL校准品至反应微孔板中；
2)加样Tip头吸取25μL试剂Ⅰ至反应微孔板中；
3)加样Tip头吸取25μL试剂Ⅱ至反应微孔板中；
4)水平振荡混匀20秒后37℃孵育17min；
5)加样Tip头吸取175μL包含链霉亲和素修饰的供体的混合液(仪器配套)至反应微孔板中；
6)水平振荡混匀20秒后37℃孵育15min；
7)在仪器产生的680nm激发光照射下，供体被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子。该高能态的活性氧离子在近距离被发光微粒俘获，从而传递能量以激活发光微粒中的发光化合物。数微秒后，受体中的发光化合物将释放出612nm的高能级红光，用单光子计数器测定这些高能级光子；
8)根据校准品的信号值，按照五参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与14-3-3eta蛋白浓度之间的方程式；
9)同样再按照步骤1)-7)检测待测样品，由8)中的方程式计算得出待测样品中14-3-3eta蛋白浓度。
3、实验数据
实验数据见表3和表4。
表3
表4
结果表明：14-3-3eta蛋白单独阳性率52.2％，CCp单独阳性率67.5％，联合检测阳性率提高至75％。
收集40例确诊类风湿关节炎样本，采用非均相免疫分析检测Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白，实验结果表明：联合检测的阳性率明显高于Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白单独检测的阳性率。
实施例2：
收集40例确诊类风湿关节炎样本，采用非均相免疫分析分别检测Anti-CCP抗体、和14-3-3eta蛋白、Anti-carp抗体。
具体实施步骤
1、采用非均相磁微粒化学发光法检测Anti-ccp的浓度。
1.1、试剂
试剂1：包被肽段抗原量1μg/mg的磁微粒
试剂1的制备：0.1M PH7.2PBST稀释成0.4mg/mL磁微粒浓度
试剂2：标记抗人IgG抗体摩尔比例1:20的吖啶酯
试剂2的制备：用20％NBS稀释成0.6μg/mL蛋白浓度
1.2、将上述组份组装成ANTI-CCP测定盒后，设置检测步骤：
反应步骤：(全自动分析仪)
1)样本50μL+50μL试剂1，加入反应杯，37度反应15min，磁分离，洗涤五次；
2)加入100μL试剂2,37度反应10min，磁分离，洗涤五次
3)加入200μL底物液，立即测信号值。
4)底物液为氢氧化钠和过氧化氢及表面活性剂的混合物。
5)根据校准品的信号值，按照四参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与ANTI-CCP浓度之间的方程式；
6)同样再按照步骤1)-5)检测待测样品，由8)中的方程式计算得出待测样品中Anti-ccp蛋白浓度。
2、采用非均相磁微粒化学发光法检测14-3-3的浓度。
2.1、试剂
试剂1：包被抗体量10μg/mg的磁微粒
试剂1的制备：0.1M PH7.2PBST稀释成0.4mg/mL磁微粒浓度
试剂2：标记抗体摩尔比例1:20的吖啶酯
试剂2的制备：用20％NBS稀释成0.6μg/mL蛋白浓度
2.2、14-3-3eta蛋白校准品的制备：
(1)校准品稀释液的配制：称取HEPES 4.77g、NaCl 1.7g，添加纯化水160g混匀30min，使用1M的浓盐酸和1M的NaOH溶液调pH值至7.4±0.2，继续添加Proclin300 0.1g、BSA 30g、1M MgCl2 0.5mL、0.1M MgCl2 0.1mL，搅拌30min后添加纯化水定重至200g，复测pH值后，2-8℃备用。
(2)校准品的配制：用校准品稀释液按照比例梯度稀释成工作校准品，再由由工作校准品标定出产品校准品抗体浓度，完成校准品的制备。
2.3、将上述组份组装成14-3-3eta蛋白测定盒后设置检测步骤：
反应步骤：(全自动分析仪)
1)样本50μL+50μL试剂1，加入反应杯，37度反应15min，磁分离，洗涤五次；
2)加入100μL试剂2,37度反应10min，磁分离，洗涤五次
3)加入200μL底物液，立即测信号值。
4)底物液为氢氧化钠和过氧化氢及表面活性剂的混合物。
5)根据校准品的信号值，按照四参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与14-3-3eta蛋白浓度之间的方程式；
6)同样再按照步骤1)-5)检测待测样品，由8)中的方程式计算得出待测样品中14-3-3eta蛋白浓度。
3、采用非均相化学发给免疫检测法检测anti-carp抗体的浓度。
3.1、试剂
试剂1：包被肽段抗原量1μg/mg的磁微粒
试剂1的制备：0.1M PH7.2PBST稀释成0.4mg/mL磁微粒浓度
试剂2：标记抗人IgG抗体摩尔比例1:20的吖啶酯
试剂2的制备：用20％NBS稀释成0.6μg/mL蛋白浓度
3.2、将上述组份组装成ANTI-CarP测定盒后，设置检测步骤：
反应步骤：(全自动分析仪)
1)样本50μL+50μL试剂1，加入反应杯，37度反应15min，磁分离，洗涤五次；
2)加入100μL试剂2,37度反应10min，磁分离，洗涤五次
3)加入200μL底物液，立即测信号值。
4)底物液为氢氧化钠和过氧化氢及表面活性剂的混合物。
5)根据校准品的信号值，按照四参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与ANTI-CarP浓度之间的方程式；
6)同样再按照步骤1)-5)检测待测样品，由8)中的方程式计算得出待测样品中Anti-carp蛋白浓度。
4、实验数据
实验数据见表5和表6。
表5
表6
实验结果表明：14-3-3单独阳性率52.5％，anti-carp单独阳性率60％，anti-CCP单独阳性率67.5％，联合三项检测阳性率为82.5％。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京科美生物技术有限公司
<120> 通过生物标记物联检体外评估类风湿性关节炎是否存在的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> （14-3-3eta蛋白）
<400> 1
Met Thr Met Asp Lys Ser Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu
1 5 10 15
Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Ala Val Thr
20 25 30
Glu Gln Gly His Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val
35 40 45
Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile
50 55 60
Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Gln Gln Met
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys
85 90 95
Asn Asp Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Pro Asn Ala Thr
100 105 110
Gln Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe
115 120 125
Arg Tyr Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Asp Asn Lys Gln Thr Thr Val
130 135 140
Ser Asn Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe
165 170 175
Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser
180 185 190
Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu
195 200 205
Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg
210 215 220
Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ala Gly Glu Gly Glu Asn
245
Claims (69)
1.检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
3.检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂中的用途，包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
4.检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度在制备通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的制剂中的用途，其包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种；优选所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；进一步优选所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
5.类风湿性关节炎(RA)生物标记物组用于制备在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂中的用途，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的用途，其特征在于，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RA。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的用途，其特征在于，生物标记物组中各生物标记物的浓度采用非均相和/或均相化学发光免疫检测法进行检测。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，生物标记物组中Anti-CCP抗体的浓度采用非均相化学发光免疫检测法进行检测，14-3-3eta蛋白的浓度采用均相化学发光免疫检测法进行检测。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，采用非均相化学发光免疫检测法检测Anti-CCP抗体的浓度的步骤包括采用非均相化学发光免疫检测法测量Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其特征在于，所述步骤还包括将所测得的Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述Anti-CCP抗体与至少一种抗原形成的免疫复合物的含量进行比较。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的用途，其特征在于，所述步骤包括将所述样品与包含能够与Anti-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合形成免疫复合物的第一抗原接触，并进一步与抗免疫复合物抗体接触，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述第一抗原直接或间接与固相载体结合，所述抗免疫复合物抗体直接或间接与能够与底物反应或能够催化底物生成的可检测信号的标记物结合。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
17.根据权利要求13-16中任意一项所述的用途，其特征在于，所述第一抗原为瓜氨酸化抗原，优选地，所述第一抗原选自合成的含瓜氨酸的环型肽、含瓜氨酸的线型肽、由至少2个单一含瓜氨酸的肽段合成在一条肽链上形成的多肽、含有至少2个单一含瓜氨酸的肽段的瓜氨酸肽段混合物和瓜氨酸化蛋白。
18.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，采用均相化学发光免疫检测法生物标记物组中14-3-3eta蛋白的浓度的步骤包括测量14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
20.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述步骤还包括将所测得的14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量，与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品或来自同一受治疗者的治疗前样品中所述14-3-3eta蛋白或其片段或所述14-3-3eta蛋白或其片段与至少一种抗体形成的免疫复合物的含量进行比较。
21.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述步骤包括将所述样品与包含能够与14-3-3eta蛋白或其片段的至少一种特异表位特异性结合形成免疫复合物的抗体。
22.根据权利要求18-21中任意一项所述的用途，其特征在于，所述抗体包括能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合的第一抗体以及能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合的第二抗体，其中所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述第一抗体与受体结合，所述受体能够与单线态氧反应生成可检测的化学发光信号。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
25.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
26.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述14-3-3eta蛋白或其片段的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。
27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述表位选自氨基酸片段为14-3-3eta蛋白的序列的相对特异性片段：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa。
28.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
29.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
30.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂套装，其包括用于检测类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物浓度的试剂，其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种；优选所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；进一步优选所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
31.基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂套装，其中利用非均相化学发光免疫检测法对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
32.根据权利要求28-31所述的试剂套装，其特征在于，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RA。
33.根据权利要求28-32中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂套装包括采用非均相化学发光免疫检测法检测生物标记物组中Anti-CCP抗体和14-3-3eta蛋白浓度的试剂。
34.根据权利要求33所述的试剂套装，其特征在于，用于检测Anti-CCP抗体的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a1，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗原，所述第一原能够与抗-CCP抗体的抗原表位结合位点特异性结合；
组分b1，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的标记物以及与之直接结合或间接结合的抗免疫复合物抗体，所述抗免疫复合物抗体能够特异性识别和结合与第一抗原形成的第一免疫复合物中的抗-CCP抗体，不识别游离的、未结合抗原的抗-CCP抗体。
35.根据权利要求34所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂还包括作为校准品的Anti-CCP抗体纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
36.根据权利要求34或35中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗原与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗原与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
37.根据权利要求34-36中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述抗免疫复合物抗体与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述抗免疫复合物抗体与生物素结合，而所述标记物与链霉亲和素结合。
38.根据权利要求34-37所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂还包括组分c1，底物溶液，所述底物溶液包括A1溶液和B1溶液，优选所述A1溶液为过氧化氢溶液，优选所述B1溶液为氢氧化钠溶液。
39.根据权利要求33所述的试剂套装，其特征在于，用于检测14-3-3eta蛋白的非均相化学发光免疫检测试剂包括：
组分a2，其包含固相载体以及与之直接结合或间接结合的第一抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第一表位特异性结合；
组分b2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号第一标记物以及与之直接结合或间接结合的第二抗体或其结合片段，所述第二抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
40.根据权利要求39所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂还包括作为校准品的14-3-3eta蛋白纯品，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成不同浓度的工作校准品溶液。
41.根据权利要求39或40中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述第一抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述固相载体与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第一抗体或其结合片段与生物素结合，而所述固相载体与链霉亲和素结合。
42.根据权利要求39-41中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述第二抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第一标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第二抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第一标记物与链霉亲和素结合。
43.根据权利要求39-42所述的试剂套装，其特征在于，还包括组分c2，底物溶液，所述底物溶液包括A2溶液和B2溶液，优选所述A2溶液为过氧化氢溶液，优选所述B2溶液为氢氧化钠溶液。
44.根据权利要求39-43中任意一项所述的试剂套装，其特征在于，所述试剂还包括组分d2，其包含能够与底物反应或能够催化底物生成可检测信号的第二标记物以及与之直接结合或间接结合的第三抗体或其结合片段，所述第三抗体或其结合片段能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
45.根据权利要求44所述的试剂套装，其特征在于，直接结合或间接结合第二标记物的第三抗体与直接结合或间接结合第一标记物的第二抗体为结合14-3-3eta蛋白的相同表位的同株抗体。
46.根据权利要求44或45所述的试剂套装，其特征在于，所述第三抗体或其结合片段与特异性结合配对成员中的一员结合，而所述第二标记物与特异性结合配对成员中的另一员结合；优选所述第三抗体或其结合片段与生物素结合，而所述第二标记物与链霉亲和素结合。
47.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装。
48.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的试剂盒，其包含权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装。
49.一种用于基于风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度通过生物化学标记物体体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的试剂盒，其包含权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装。
50.基于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的试剂盒，其包含权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装。
51.一种通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其包括使用如权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装或使用如权利要求47-50中任意一项所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外评估类风湿性关节炎(RA)是否存在。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得生物标记物组中各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA是否存在相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中的各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种，优选为2种。
53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，将步骤b)的组合浓度值与衍生自除RA阳性患者之外的参考群体的截断值进行比较，所述参考群体包含明显健康者和选自骨关节炎(OA)患者和其他自身免疫性疾病患者的患者。
54.一种通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度的方法，其包括使用如权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装或使用如权利要求47-50中任意一项所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物外评估类风湿性关节炎(RA)的严重程度。
55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)将步骤b)中获得的组合浓度值与RA的严重程度相关联，其中与从参照群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示患者中RA的严重程度；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种。
56.一种通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病的方法，其包括使用如权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装或使用如权利要求47-50中任意一项所述的试剂盒来检测风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物的浓度并通过生物化学标记物体外区分类风湿性关节炎(RA)与其它自身免疫性疾病。
57.根据权利要求56所述的方法，其特征在于，该方法包括：
a)分别在待测样品中检测生物标记物组中各生物标记物的浓度；
b)组合a)所测量的各生物标记物的浓度值，获得各生物标记物的组合浓度值；和
c)从来自步骤b)中获得的组合浓度值区分RA与其它自身免疫性疾病，其中与从参照群体测量的对应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加的组合值指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种；优选所述其它自身免疫性疾病包括其他关节疾病；进一步优选所述其它关节疾病是骨关节炎(OA)。
58.使用如权利要求28-46中任意一项所述的试剂套装或使用如权利要求47-50中任意一项所述的试剂盒用于在体外评估待测样品中类风湿性关节炎(RA)是否存在的方法，其中对于类风湿性关节炎(RA)生物标记物组中各生物标记物测量的组合浓度值与对于来自参考群体测量的相应的生物标记物组中各标记物的截断组合浓度值相比增加指示RA的存在；
其中，所述生物标记物组含有Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种。
59.根据权利要求51-58中任意一项所述的方法，其特征在于，所述生物标记物组包含Anti-CCP抗体、14-3-3eta蛋白和Anti-carp抗体中的至少2种和其他生物标记物，优选为2种和其他生物标记物；优选所述其他生物标记物为RF。
60.根据权利要求41-59所述的方法，其特征在于，采用权利要求34-38中任意一项所述的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
61.根据权利要求60所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤R1之前的制作Anti-CCP抗体标准工作曲线的步骤。
62.根据权利要求61所述的方法，其特征在于，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于Anti-CCP抗体标准工作曲线来确定待测样品中Anti-CCP抗体的含量。
63.根据权利要求51-59所述的方法，其特征在于，采用权利要求39-46中任意一项所述的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量；
或包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
64.根据权利要求63所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤R1或T1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
65.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，在步骤R3或T3中，检测步骤R2或T2中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
66.一种如权利要求28-46中任意一项所述的非均相化学发光免疫检测试剂套装或如权利要求47-50中任意一项所述的非均相化学发光免疫检测试剂盒或如权利要求51-65中任意一项所述的非均相化学发光免疫检测方法在化学发光免疫分析仪中的应用。
67.如权利要求66所述的应用中的所述的化学发光免疫分析仪，其包括：
样本加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注怀疑患有类风湿性关节炎的受治疗者的待测样品；
试剂加注模块，其用于向化学发光分析仪的预设位置加注各种试剂的移液；
孵育模块，其用于为待测样品及试剂发生免疫反应提供合适的温育反应环境；
磁分离模块，其用于清洗反应混合液中的磁微粒，并将温育反应后的反应液排出，留下清洗后的磁微粒；
检测模块，其用于检测化学发光信号，判断待测样本中目标分子的浓度
电气控制模块，用于协调控制所述孵育模块、样本加注模块，试剂加注模块，所述磁分离模块和所述检测模块按照设定的程序动作。
68.一种用于检测Anti-CCP的均相免疫检测方法，其采用权利要求67所述的检测系统和如权利要求34-38中任意一项所述的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测Anti-CCP抗体的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a1混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与组分b1混合，得到第二混合物；
步骤R3，将第二混合物与组分c1混合，得到产生了可检测化学发光信号的第三混合物；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，从而确定Anti-CCP抗体的含量。
69.一种用于检测14-3-3eta蛋白的均相免疫检测方法，其采用权利要求67所述的检测系统和如权利要求39-46中任意一项所述的试剂套装来通过非均相化学发光免疫检测来检测14-3-3eta蛋白的浓度，其包括：
步骤R1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤R2，将第三混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第四混合物；
步骤R3，检测步骤R2中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量；
或包括：
步骤T1，将待测样品与组分a2和组合b2混合，得到第三混合物；
步骤T2，将第三混合物与组分d2混合，得到第五混合物；
步骤T3，将第五混合物与组分c2混合，得到产生了可检测信号的第六混合物；
检测步骤T3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白和/或确定14-3-3eta蛋白的含量。
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|---|
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