CN115175919A - 转换结合剂、其制备方法、和各自使用该转换结合剂的药物组合物、测定试剂盒、以及抗原和抗体测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与抗体的抗原结合部位结合的转换结合剂,其制备方法,和各自使用该转换结合剂的药物组合物、测定试剂盒、以及抗原和抗体测定方法。根据本发明的实施方案的转换结合剂包括选自构成抗体的抗原结合部位的重链或轻链的框架区的氨基酸序列,其中除了重链或轻链之外,氨基酸序列还包括与构成抗原结合部位的重链或轻链的框架区结合的第一抗体结合部分或第二抗体结合部分,该氨基酸序列能够与抗体的抗原结合部位特异性结合,然后在提供目标抗原时从框架区分离。
Description
技术领域
本公开涉及免疫测定(immunoassay)技术,更具体地,本公开涉及转换结合剂、其制备方法和各自使用该转换结合剂的药物组合物、测定试剂盒以及抗原和抗体测定方法。
背景技术
免疫测定(或免疫学试验)已被用于生物测定,例如生物技术领域中的各种免疫诊断试验或环境监测。免疫测定是利用抗原-抗体反应的高特异性来检测或定量抗原或抗体的方法。通过各种方法标记抗原和抗体中的一种或两种,然后将它们与样本反应。此后,如果样本中存在抗体或抗原,则产生抗原-抗体反应,因此可以测量标记产物以定性或定量测量抗体或抗原。与其它分析方法相比,这种方法具有高灵敏度的优点。
免疫测定可用于各种诊断,例如癌症标记、传染病、甲状腺功能、贫血、过敏、妊娠、药物滥用或痛风诊断。为了将免疫测定用于诊断或分析各种类型的抗原,有必要制备对每种抗原具有特异性反应性的抗体。然而,近年来,这种方法在检测快速多样化的现代疾病或具有多个突变物种的病毒方面具有局限性。特别是在病毒的情况下,存在许多不可能获得对病毒具有特异性结合的抗体的情况。
此外,当使用抗原-抗体反应时,可能需要将抗体与标记材料结合的额外步骤。如果标记材料和抗体之间的结合特性低,免疫测定的准确性或可靠性可能会降低。如上所述,传统的免疫测定还存在另外一个问题,即需要开发能够与多种抗体结合的各种类型的标记材料。
公开
技术问题
本公开的一个方面是提供具有改进的适用性的转换结合剂,其不限于抗体的类型,因为其可以检测各种类型的疾病或引起疾病的抗原。
本公开的另一方面是提供制备具有上述优点的转换结合剂的方法。
本公开的另一方面是提供测试试剂盒,通过使用具有上述优点的转换结合剂,该测试试剂盒具有提高的分析可靠性和准确性。此外,提供了能够测量抗原与抗体结合强度的测试试剂盒。
本公开的又一方面是提供具有上述优点的测定方法,此方法提高了分析的可靠性和准确性,并简化了分析的处理步骤,从而提高了速度和易用性。
技术方案
为此,根据本公开实施方案的转换结合剂可以与抗体的框架区(FR)的至少一部分可逆地结合,并在与抗体特异性反应的目标抗原与抗体结合时从框架区分离。根据其它实施方案,转换结合剂可以通过抗体的三维结构与框架区结合。根据另一实施方案,转换结合剂可以包括能够与至少一个框架区结合的部分和能够与至少一个互补决定区(CDR)结合的部分。
根据实施方案,转换结合剂可以包括选自构成抗体的抗原结合位点的重链框架区的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列可以包括与轻链框架区可逆结合的第一抗体结合部分,所述轻链框架区与重链一起构成抗原结合位点。根据其它实施方案,转换结合剂可以包括选自构成抗体抗原结合位点的轻链框架区的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列可以包括与重链框架区可逆结合的第二抗体结合部分,所述重链框架区与轻链一起构成抗原结合位点。根据另一实施方案,转换结合剂的氨基酸序列也可以与和重链或轻链的框架区相邻的互补决定区可逆地结合。
根据实施方案,转换结合剂可以选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。根据其它实施方案,转换结合剂的一部分氨基酸可以被无机材料取代。
根据实施方案,第一抗体结合部分可以包括-Y-、-I-、-W-和-Q-的至少一个氨基酸残基。根据其它实施方案,第二抗体结合部分可以包括-Y-、-Q-、-P-、-L-和-F-的至少一个氨基酸残基。根据另一实施方案,转换结合剂可以包括SEQ ID NO.1:S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E、SEQ ID NO.2:V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-G-I-Y-F-D-V-W-G-K、SEQ ID NO.3:T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K和SEQ ID NO.4:V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K中的任何一种氨基酸序列。
根据实施方案,第一抗体结合部分可以包括通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种与轻链框架区结合的氨基酸残基。根据其它实施方案,第二抗体结合部分可以包括通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种与重链框架区结合的氨基酸残基。
根据实施方案,转换结合剂可能能够通过第一抗体结合部分的氨基酸调控来调节抗体结合位点的结合强度。根据其它实施方案,转换结合剂可能能够通过第二抗体结合部分的氨基酸调控来调节抗体结合位点的结合强度。根据另一实施方案,转换结合剂可以通过氢键与转换结合剂和框架区之间的侧链官能团键或肽键的极性区域结合。
根据实施方案,当转换结合剂与抗体的抗原结合部分结合时,可通过将与抗体特异性反应的目标抗原与抗体结合而将转换结合剂与抗体分离。根据其它实施方案,转换结合剂的抗体结合部分可以在至范围内与重链或轻链的抗原结合部分结合。
根据实施方案,可使用天然或人工标记材料对转换结合剂进行标记。根据实施方案,转换结合剂与人抗体、非人抗体、人源化非人抗体或其组合结合,并且在转换结合剂与抗体结合的状态下,抗体和目标抗原的结合是可能的。
根据实施方案,转换结合剂可以包括与抗体的至少一些框架区(FR)可逆且特异性地结合的第一抗体结合部分或第二抗体结合部分;以及结合强度调节部分,用于调节第一抗体结合部分或第二抗体结合部分与构架区的结合强度,使得当与抗体特异性反应的目标抗原与抗体结合时,抗体结合部分与构架区分离。在其它实施方案中,结合强度调节部分可以调控第一抗体结合部分或第二抗体结合部分在转换结合剂中的位置或转换结合剂的三维形状,以调节抗体结合部分与抗体的结合强度。
根据实施方案,结合强度调节部分可以包括选自-S-Y-W-I-H-W-V-K-、-R-P-G-Q-G-L-E-、-I-G-E-、-V-Y-、-C-A-R-E-P-T-G-T-G-、-Y-F-D-V-、-G-K-、-T-Y-L-E-W-Y-、-K-P-G-Q-S-、-K-、L-I-Y-K-、-C-F-Q-G-S-H-V-P-和-T-K-的至少一种氨基酸序列。根据其它实施方案,在包含第一抗体结合部分或第二抗体结合部分和结合强度调节部分作为单元结构的情况下,抗体结合部分和结合强度调节部分可以交替地连续彼此偶联。
根据本公开的实施方案用于解决上述问题的用于疾病筛查、诊断、预防或治疗整合的药物组合物可以包括转换结合剂。根据实施方案,药物组合物中的转换结合剂可以选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。根据其它实施方案,药物组合物中的转换结合剂可以包括SEQ ID NO.1:S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E、SEQ ID NO.2:V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K、SEQ ID NO.3:T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K和SEQ ID NO.4:V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K中的任何一种氨基酸序列。
用于解决上述问题的根据本公开的实施方案的测试试剂盒包括转换结合剂,其中转换结合剂用天然或人工标记材料标记,并且抗原与抗体的结合强度可通过测量与框架区结合和从框架区解离的转换结合剂的量来测量。根据实施方案,转换结合剂可以选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。根据其它实施方案,结合强度可以通过计算抗体的抗原结合系数(Kd)来测量。根据另一实施方案,抗原结合系数(Kd)可以包括0.7×10-6M至3.4×10-6M的范围。
根据实施方案,测试试剂盒包括转换结合剂,其中转换结合剂用天然或人工标记材料进行标记,并且可通过测量与框架区结合和从框架区解离的转换结合剂的量来识别或定量抗体和目标抗原。根据其它实施方案,测试试剂盒是免疫测定试剂盒,其中免疫测定试剂盒包括luminex测定法、蛋白质微阵列测定法、ELISA测定法、免疫-PCR测定法、捕获-ELISA测定法、ELISPOT测定法、放射免疫测定法(RIA)、侧流免疫测定法(LFIA)、流通免疫测定法(FTIA)、蛋白质微流控免疫测定法、蛋白质毛细管电泳(CE)测定法、电化学生物传感器、放射免疫沉淀测定法、免疫沉淀测定法、免疫组织化学染色测定法、Ouchterlony免疫扩散测定法、抑制或竞争测定法,夹心测定法、流式细胞术、免疫电泳测定法、组织免疫染色测定法、补体结合测定法、FACS测定法、蛋白质芯片测定法、免疫荧光染色测定法和免疫亲和纯化测定试剂盒。根据实施方案,当抗体与溶液中的未固定有抗体的抗原结合时,测试试剂盒可以测量抗原结合系数(Kd)。
用于解决上述问题的根据本公开的实施方案的使用转换结合剂的测定方法可以包括以下步骤:从构成抗体的抗原结合位点的框架区(FR)中选择转换结合剂的氨基酸序列;预处理,通过向特异性结合目标抗原的抗体提供转换结合剂,以与抗体框架区的至少一部分可逆结合;提供需要确定预处理步骤的结果中是否包含目标抗原的分析物;和通过定量与框架区结合的转换结合剂的残留量或从框架区分离的转换结合剂的残留量中的至少一种来分析,以识别或定量分析物中的目标抗原。根据其它实施方案,转换结合剂可以选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。根据另一实施方案,抗体可以固定在支持物上,例如基质、珠子、纤维、聚合物结构或其组合。根据又一实施方案,抗体不是固定的,而是可以溶解在溶液中。
根据实施方案,预处理步骤可以包括以下步骤:向抗体提供转换结合剂,以获得包含抗体和转换结合剂的第一缀合物以及未与抗体结合的转换结合剂的混合溶液;以及移除未与抗体结合的转换结合剂。根据实施方案,转换结合剂可以用天然或人工标记材料标记,并且在分析步骤中,可以通过测量标记反应来进行目标抗原的分析。分析步骤可以进一步包括:分离与抗体分离的转换结合剂,和抗体与目标抗原的第二缀合物;以及识别或定量分离的转换结合剂的步骤。
用于解决上述问题的用于制备根据本公开的实施方案的转换结合剂的方法可包括以下步骤:识别其中抗体的重链和轻链的框架区彼此自结合的氨基酸序列;获得氨基酸序列的疏水性指数;和比较疏水性指数,从而选择包含在构成重链和轻链的抗原结合位点的框架区的氨基酸序列之间具有相同特性的部分的氨基酸序列的转换结合剂。根据实施方案,氨基酸序列可以包括与框架区相邻的互补性决定区。根据实施方案,转换结合剂可以选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。根据其它实施方案,氨基酸序列可以通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种结合。
有益效果
根据本公开的实施方案的转换结合剂可以选自抗体的抗原结合部分,具体地,每种抗体的框架区具有相同或基本相似的氨基酸序列。因此,优点在于转换结合剂可以与各种类型的抗体结合,可以用于分析以识别或定量抗体和与抗体结合的抗原,而不管抗体的类型,并且可以通过调控选择的氨基酸序列来调控与抗体结合的结合强度。此外,优点在于转换结合剂可以与各种类型的抗体结合,并且可以用于分析以识别或定量抗体和与抗体结合的抗原,而不管抗体的类型,并且调控与抗体的结合强度。
根据本公开的实施方案的制备转换结合剂的方法具有能够制备可以与各种抗体结合的转换结合剂的优点,因为其可以从抗体的抗原结合部分(特别是框架区)提取。
根据本公开的实施方案的用于病毒或疾病筛查、诊断、预防或治疗的药物组合物具有能够使用具有上述优点的转换结合剂的优点,并被开发成用于诊断、预防或治疗包括各种病毒在内的抗原的药物。
根据本公开的实施方案的测试试剂盒可使用具有上述优点的转换试剂,并可识别和定量抗原和抗体,以及测量抗原与抗体的结合能力。
根据本公开的实施方案的使用转换结合剂的测定方法可通过使用具有上述优点的转换结合剂,省略洗涤分析物(例如抗体或抗原)或添加试剂处理的步骤,从而快速分析抗原结合和结合剂的量,并易于提供免疫测定的改进用途。
附图说明
图1a为示出根据本公开的实施方案的从框架区提取的转换结合剂和框架区的组合的图,图1b是示出根据本公开的实施方案的转换结合剂的配置的图。
图2为示出根据本公开的其它实施方案的转换结合剂与框架区的连接的图。
图3为根据本公开的实施方案的转换结合剂的示意图。
图4a为根据本公开的实施方案的使用转换结合剂的测定方法的流程图,图4b为根据本公开的其它实施方案的使用转换结合剂的测定方法的流程图,图4c为根据本公开的又一实施方案的使用转换结合剂的测定方法的流程图。
图5a和5b为示出SEQ ID NO.2转换结合剂和SEQ ID NO.3转换结合剂之间的结合的示意图;图5c是示出SEQ ID NO.2转换结合剂和SEQ ID NO.3转换结合剂的每个位点之间的相互作用的曲线图;图5d是示出SEQ ID NO.2转换结合剂和SEQ ID NO.3转换结合剂之间的疏水性指数的图;图5e是SEQ ID NO.2(H2)转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)转换结合剂之间的FRET分析图。
图6a和图6b为示出SEQ ID NO.1转换结合剂和SEQ ID NO.4转换结合剂之间的结合的示意图;图6c是示出SEQ ID NO.1转换结合剂和SEQ ID NO.4转换结合剂的每个位点之间的相互作用的曲线图;图6d是示出SEQ ID NO.1转换结合剂和SEQ ID NO.4转换结合剂之间的疏水性指数的图;图6e是SEQ ID NO.1(H1)转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)转换结合剂之间的FRET测定图。
图7a是示出每个转换结合剂的抗体结合强度的测量结果的图;图7b是示出与抗体结合的每个转换结合剂的结合强度的SPR分析结果的图;图7c和7d是示出与抗体结合的肽与抗体Fab位点结合的结果的图。
图8a至8d为根据本公开的实施方案的转换结合剂的测定方法的分析结果图。
图9a和9b为根据本公开的其它实施方案的转换结合剂的测定方法的测定结果图。
图10a至图10d为根据本公开的又一实施方案的转换结合剂的测定方法的测定结果图。
具体实施方式
现将参照附图对示例性实施方案进行更全面的描述。
提供本公开的实施方案是为了向本领域普通技术人员更完整地解释本公开,以下实施方案可以各种其它形式进行修改,本公开的范围不限于这些实施方案。相反,提供这些实施方案是为了使本公开更加全面和完整,并将本公开的精神完全传达给本领域普通技术人员。
在附图中,相同的附图标记表示相同的元件。如本文所用,术语“和/或”包括一个或多个所列项目的任何一个和所有组合。
本文使用的术语用于描述实施方案,并不旨在限制本公开的范围。尽管本文使用了单数形式,但是也可以包括复数形式,除非上下文清楚地指明了复数形式。如本文所用,术语“包括(comprise)”和/或“包括(comprising)”指定了所列举的形状、数字、步骤、动作、构件、元件和/或其组合的存在,但是不排除其它形状、数字、运动、构件、元件和/或组合的存在或添加。
本文提及的在基质或其它层“上”形成的层是指直接在基质或其它层上形成的层,或在基质或其它层上形成的一个或多个中间层上形成的层。对于本领域技术人员来说,与另一个形状“相邻”设置的结构或形状可以具有设置在相邻形状之上或之下的部分。
如本文所用,相关术语如“下方”、“上方”、“上部”、“下部”、“水平”或“垂直”可用于描述如图所示的一个组成构件、层或区域与另一组成构件、层或区域的关系。应当理解,这些术语不仅包括附图中所示的方向,还包括设备的其它方向。
下文中,将参考示意性说明本公开的理想实施方案(和中间结构)的截面图,描述本公开的实施方案。例如,在这些附图中,为了描述的方便和清楚,构件的尺寸和形状可能被放大,并且在实际实施中可以预期所示形状的变化。因此,本公开的实施方案不应被解释为限于本文所示区域的特定形状。附图中构件的附图标记在所有附图中指代相同的构件。
如本文所用,术语“肽”是氨基酸聚合物链,并且是酰胺,其中第一个氨基酸的氨基基团和与第一个氨基酸相邻的第二个氨基酸的羧基基团缩合,同时失去水分子。按照惯例,本文描述的所有肽序列都是以N末端在左边、C末端在右边的顺序书写的。如本文所用,术语“肽”可指天然或合成的蛋白质、蛋白质片段或蛋白质序列的肽类似物。类似物被定义为在适当的空间方向上表现出与相应的碱性氨基酸或肽相似的物理性质例如尺寸、电荷或疏水性的物质。例如,肽类似物可以是其中一个或多个氨基酸之间的酰胺键被碳-碳键或本领域已知的其它键取代的化合物。如本文所用,术语“肽”可以与术语“蛋白质”或“多肽”互换使用,其是其中几个氨基酸通过肽键连接的化合物,并且可以指其中氨基酸残基的数量在10和50(包括10和50)之间的分子结构。
如本文所用,术语“氨基酸”是广义的概念,不仅包括天然存在的氨基酸及其残基,还包括化学修饰的氨基酸,即氨基酸模拟物和类似物,且模拟物和类似物可包括本公开中的功能等同物。
如本文所用,术语“适体”是指DNA核酸分子,其自身具有稳定的三级结构,并能以高亲和力和特异性结合特定的物质。适体可以通过本领域公知的方法制备,并且该方法可以根据需要进行适当的修改。
如本文所用,术语“抗原-抗体反应”是在免疫反应过程中白细胞B细胞中产生的抗体与抗原之间的特定化学相互作用。在不同类型的抗体和抗原中,每种抗体只能结合特定的抗原。结合的特异性是由于每种所述抗体的特定化学结构。抗原通过弱非共价键例如静电相互作用、氢键、范德华键和疏水相互作用与抗体结合。
如本文所用,术语“抗体”是指由两条重链和两条轻链组成的基本4-多肽链,它们通过二硫键相互稳定,并包括包含抗原结合部分的任何分子构建体,所述抗原结合部分为具有特异性结合抗原的能力的糖蛋白。
抗体可以是血清的基本成分,抗体、免疫球蛋白分子或其片段的聚集体,或抗体或免疫球蛋白的单个分子。当抗体分子与抗原或特定抗原决定簇例如抗原的表位结合时,或抗体通过与抗原决定簇反应与抗原结合时,有可能诱导免疫效应机制例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC),其中抗体被自然杀伤(NK)细胞识别和清除。抗体可以是单特异性的。抗体的组成可以是由相同抗体组成的单克隆,或者是包含与相同抗原的不同表位或不同抗原的表位反应的不同类型抗体的多克隆。每种抗体可以具有独特的结构,该结构允许抗体与其相应的抗原特异性结合。
抗体可包括抗体、抗体衍生物或其片段,并且抗体的详细描述也适用于本公开的抗体筛查方法。在抗体片段中,抗体等同物或抗体同源物(例如多肽)包括Fc区、免疫球蛋白结合结构域、模拟结合结构域的肽、与Fc区同源的区域或其至少一部分。抗体还可以包括嵌合分子或其等价物,其包含融合至另一种多肽的免疫球蛋白结合域。具体地,抗体可以是完整的免疫球蛋白分子,并且包括抗体的组成部分,例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、VHH、Fv、N-聚糖结构和抗原决定簇,以及至少一些组成部分。
抗原结合片段(Fab)是包含抗原结合部分的抗原结合片段,是指包含轻链可变区(VL)和恒定区(CL)的轻链片段,以及包含可变区(VH)和第一恒定区(CH1)的重链片段的抗体片段。
可结晶区片段(Fc区)对应于不结合抗原但形成晶体的部分,通常指包含免疫球蛋白重链的C末端多肽序列的二聚体复合物。Fc区可以包含天然的或突变的Rc序列。尽管免疫球蛋白重链中的Fc序列可能具有多个边界,但IgG重链Fc序列通常被定义为从Cys226位或约Pro230位的氨基酸残基延伸至Fc的羧基末端。免疫球蛋白的Fc序列通常包含重链的两个恒定区,CH2结构域和CH3结构域,以及可选的CH4结构域。例如,在天然抗体中,Fc结构域由来源于IgG、IgA和IgD同种型中抗体的两条重链的CH2和CH3的两个相同的蛋白质片段组成,IgM和IgE的Fc结构域在每个多肽链中包含三个重链恒定域,CH2至CH4。当蛋白质聚集时,Fc区可以形成晶体,这意味着即使IgG抗体的抗原特异性不同,构成Fc结构区的蛋白质的氨基酸序列是相同的,因此它不参与抗原结合。此外,Fc区以一定数量的氨基酸残基为一个分区,通过-S-S-环(loop)形成更高级的结构,每个分区通过肽键连接。
可变区片段(Fv)是直接与抗原结合的抗体的可变区,其由重链可变域(VH)和轻链可变域(LH)组成。
VHH是没有轻链的单域分子,并且是也称为纳米抗体的单可变域。天然存在的单域分子可以衍生自或获得自骆驼科动物,例如骆驼、单峰骆驼、羊驼和原驼,以及鲨鱼,并且可以通过抗体分子的重组获得。
在抗体中,重链或轻链可分别包括可变区和恒定区。可变区对抗原具有特异性,并且对于每种抗体是不同的。可变区可以包括高变区(HVR),即互补决定区(CDR)和支持互补决定区的框架区(FR)。对于每种抗体,互补决定区(CDR)具有不同的氨基酸序列,因此它们可以特异性结合每种抗原。
框架区(FR)是指除高变区残基之外的恒定域残基。恒定域的框架区(FR)通常包括四个FR结构域:FR1、FR2、FR3和FR4,它们是可变区中存在的CDR以外的区域,充当连接三个CDR的支架,并有助于CDR的结构稳定性。此外,即使抗体的类型,即抗体的表达种类不同,框架区(FR)的氨基酸序列也具有与互补决定区(CDR)相比变化很小的特征。因此,CDR和FR序列通常可以下列顺序出现在重链可变区(VH)或轻链可变区(VL):FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。重链和轻链的两个可变区结合形成抗原结合部分。
抗体之间的恒定区基本相同。一般而言,恒定区能够介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括经典补体系统的成分和免疫系统的各种细胞,例如效应细胞,它们是选择性与蛋白质结合并调控生物活性的小分子。在下文中,将详细描述本公开的各种实施方案。
图1a显示了根据本公开的实施方案的转换结合剂100与抗体10的框架区(FR,FR’)结合。
参考图1a,转换结合剂100包括与构成抗体10的抗原结合部分15的轻链(VL)的框架区(FR’)可逆结合的第一转换结合剂(HA,HB),或与重链(VH)的框架区(FR)可逆结合的第二转换结合剂(LA,LB)。
第一转换结合剂(HA,HB)可以包含选自构成抗体10的抗原结合部分15的重链(VH)的框架区(FR)的氨基酸序列。类似地,第二转换结合剂(LA,LB)可以包含选自构成抗体10的抗原结合部分15的轻链(VL)的框架区(FR’)的氨基酸序列。
在另一实施方案中,转换结合剂100可以包含选自包含框架区(FR,FR’)和与框架区(FR,FR’)相邻的互补决定区(CDR,CDR’)的氨基酸序列的氨基酸。例如,如图1a所示,第一转换结合剂(HA,HB)的氨基酸序列可以选自包含重链(VH)的互补决定区(CDR)的CDR1区(CDR1)和框架区(FR)的FR2区(FR2)的部分或全部序列的氨基酸序列(以下称为HAR区(HAR)),或者包含重链(VH)的CDR3区(CDR3)和FR3区(FR3)的部分或全部的氨基酸序列(以下称为HBR区(HBR))。
类似地,第二转换结合剂(LA,LB)的氨基酸序列可选自包含与轻链(VL)彼此相邻的框架区(FR’)的FR2’区(FR2’)和与相邻互补决定区(CDR’)的CDR1’区(CDR1’)的部分或全部的氨基酸序列(以下称为LAR区(LAR)),或包含与轻链(VL)彼此相邻的框架区(FR’)的FR3’区(FR3’)和与相邻互补决定区(CDR’)的CDR3’区(CDR3’)的部分或全部的氨基酸序列(以下称为LBR区(LBR))。
抗体10的HAR区(HAR)和LBR区(LBR)以及HBR区(HBR)和LAR区(LAR)允许抗原结合部分15具有三维扭曲结构,因为相互自结合或几何交联是可能的。此外,由于区域(HAR、LAR、HBR、LBR)具有框架区(FR,FR’)作为基本成分,抗体10的结构通过上述相互结合特性得到支持。因为根据本公开的实施方案的转换结合剂100包括抗体10的上述区的氨基酸序列,所以与抗体10的抗原结合部分的自结合或交联是可能的。
本公开的转换结合剂100不限于图1a所示的选自HAR区(HAR)、HBR区(HBR)、LAR区(LAR)或LBR区(LBR)的那些。它可以从框架区(FR)的氨基酸序列中进行不同的选择。例如,转换结合剂100的氨基酸序列可以选自FR3区(FR3)或FR3’区(FR3’),也可以使用通过连接FR区(FR)而使用的序列。在实施方案中,清楚的是氨基酸序列选自重链(VH)例如FR1区(FR1)、FR1区(FR1)和CDR1区(CDR1)、FR2区(FR2)、FR1区(FR1)至FR2区(FR2)或FR2区(FR2)至FR3区(FR3),或轻链(VL)例如FR1’区(FR1’)、FR1’区(FR1’)和CDR1’区(CDR1’)、FR2’区(FR2’)、FR1’区(FR1’)至FR2’区(FR2’)或FR2’区(FR2’)至FR3’区(FR3’),作为必须包含至少一个FR区(FR,FR’)的位点。因此,设计转换结合剂100以包含框架区(FR,FR’)的氨基酸序列作为所需的构型,其特征在于尽管有各种抗体,但与互补决定区(CDR,CDR’)相比,具有相同或基本相似的序列,与抗体的抗原结合部分的结合是可能的,而与抗体或抗原的类型无关。将参照图2详细描述其各种实施方案。
由于上述抗体10的结构相互结合特性,第一转换结合剂(HA,HB)可以可逆地结合轻链(VL)的至少一个框架区(FR’)。例如,第一转换结合剂(HA)可以与LBR区域(LBR)相互结合,并且第一转换结合剂(HB)可以与LAR区域(LAR)相互结合。类似地,第二转换结合剂(LA,LB)能够与重链(VH)的至少一个框架区(FR)可逆结合。例如,第二转换结合剂(LA)可以与HAR区(HAR)相互结合,并且第二转换结合剂(LB)可以与HBR区域(HBR)相互结合。这允许转换结合剂100与构成抗体10的抗原结合部分15的框架区(FR,FR’)结合,以支持抗体10的抗原结合部分15的结构。
在实施方案中,第一转换结合剂(HA,HB)可以包括第一抗体结合部分(图5b中的AB1和图6b中的AB1’)。通过第一抗体结合部分(AB1,AB1’),第一转换结合剂(HA,HB)可以与抗体10的轻链(VL)的框架区(FR’)主要结合。根据实施方案,第一抗体结合部分(AB1,AB1’)可以包括-Y-、-I-、-W-和-Q-的至少一个氨基酸残基。第一抗体结合部分(AB1,AB1’)可以包括在选自抗体10的重链(VH)的氨基酸序列中特异性结合抗体10的轻链(VL)的氨基酸残基。
在实施方案中,优选地,包含第一抗体结合部分(AB1,AB1’)的序列可以具有SEQID NO.1和SEQ ID NO.2的氨基酸序列。氨基酸序列中带下划线的氨基酸残基可以是第一抗体结合部分(AB1,AB1’)。在氨基酸序列的N-末端至C-末端方向上的氨基酸序列可以如下。
SEQ ID NO.1(以下称为H1):S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E,
SEQ ID NO.2(以下称为H2):V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K。
在SEQ ID NO.1(H1)的情况下,氨基酸序列中的第9个氨基酸残基Q和第17个氨基酸残基W可以是第一抗体结合部分(AB1’)。在SEQ ID NO.2(H2)的情况下,氨基酸序列中的第3个氨基酸残基Y、第13个氨基酸残基I和第18个氨基酸残基W可以是第一抗体结合部分(AB1)。将参照图5a至6e详细描述其详细说明。
上面提及的SEQ ID NO.1和2仅为非限制性实施方案,且本公开的实施方案可以为包含选自能够彼此结合的重链(VH)框架区(FR)的氨基酸序列的任何材料。
在实施方案中,第二转换结合剂(LA,LB)可以包括第二抗体结合部分(图5b中的AB2和图6b中的AB2’)。第二抗体结合部分(AB2)允许转换结合剂(LA,LB)与抗体(10)的重链(VH)的框架区(FR)结合。根据实施方案,第二抗体结合部分(AB2,AB2’)可以包括-Y-、-Q-、-P-、-L-和-F-的至少一个氨基酸残基。第二抗体结合部分(AB2,AB2’)可以包括在选自抗体10的轻链(VL)的氨基酸序列中特异性结合抗体10的重链(VH)的氨基酸残基。
在实施方案中,优选地,转换结合剂10可以包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的氨基酸序列中的至少一种,作为包含第二抗体结合部分(AB2,AB2’)的氨基酸序列。氨基酸序列中带下划线的氨基酸残基可以是第二抗体结合部分(AB2,AB2’)。在氨基酸序列的N-末端到C-末端方向上的氨基酸序列可以如下。
SEQ ID NO.3(以下称为L1):T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K,
SEQ ID NO.4(以下称为L2):V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K。
在SEQ ID NO.3的情况下,氨基酸序列中的第6个氨基酸残基Y、第8个氨基酸残基Q、第14个氨基酸残基P和第16个氨基酸残基L可以是第二抗体结合部分(AB2)。在SEQ IDNO.4的情况下,氨基酸序列中的第3个氨基酸残基Y和第12个氨基酸残基F可以是第二抗体结合部分(AB2’)。
这是非限制性的,可以包括任何氨基酸序列,包括选自抗原结合部分15的氨基酸序列,所述抗原结合部分15包括能够彼此自结合的轻链(VL)的框架区(FR)。
在实施方案中,第一抗体结合部分(AB1,AB1’)或第二抗体结合部分(AB2,AB2’)可通过静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种与重链(VH)或轻链(VL)的框架区(FR,FR’)结合。例如,构成转换结合剂100的第一抗体结合部分(AB1,AB1’)和第二抗体结合部分(AB2,AB2’)可以通过氢键与框架区(FR,FR’)相互结合,该氢键具有肽键的侧链或极性区的官能团。然而,第一抗体结合部分(AB1,AB1’)和第二抗体结合部分(AB2,AB2’)不限于通过肽键的极性区域与侧链的官能团相互结合,并且可以包括能够与转换结合剂100结合和与抗体10的框架区域(FR,FR’)的结合的各种实例,如在极性和非极性结合的情况下。在另一实施方案中,转换结合剂100可以被设计成能够调节结合强度,稍后将参照图1b对其进行详细描述。
在实施方案中,当与抗体10特异性反应的目标抗原(图4a中的20)与抗体10结合时,与抗体10的框架区(FR,FR’)可逆结合的转换结合剂100可与框架区(FR,FR’)分离。当目标抗原20与抗体10结合时,处于未与目标抗原20或转换结合剂100结合的状态的抗体10的浓度会降低。随着浓度降低,与转换结合剂100结合的抗体10的浓度也可以降低,以维持抗体10和转换结合剂100之间的结合反应的平衡。在另一实施方案中,当其中转换结合剂100与框架区(FR,FR’)结合的抗体10与目标抗原20结合时,转换结合剂100可以通过目标抗原20的空间位阻效应与框架区(FR,FR’)分离。这是非限制性实施例,当目标抗原20结合抗体10时,转换结合剂100和框架区(FR,FR’)的结合可能被各种因素削弱或破坏。上述实施例不限制本公开。
在实施方案中,转换结合剂100可能不会影响目标抗原20与抗体10的结合过程。例如,转换结合剂100包括抗体的框架区(FR,FR’)的部分的氨基酸序列,并且与框架区(FR,FR’)的一部分或包含其的相邻区域(HAR,HBR)结合,并且由于目标抗原20通过识别抗体10的互补决定区(CDR,CDR’)与抗体10结合,所以目标抗原20可以与转换结合剂100所结合的抗体10结合。此后,目标抗原20和抗体10的结合可以在目标抗原20上引起空间位阻效应,从而引起结合的转换结合剂100的分离,以检测或分析目标抗原20。
通常,抗原-抗体反应难以控制,因为会发生许多非特异性反应,并且需要洗涤过程或额外的试剂处理。本公开的转换结合剂100具有转换特性,其执行与抗体10结合和解离的特定操作,但是能够在一个步骤中快速且准确地进行抗原定量和分析,同时省略了洗涤过程的步骤。
图1b为根据本公开的实施方案的转换结合剂100的基本配置图。
参考图1b,转换结合剂100可以控制结合强度。例如,可以通过抗体结合部分(AB)的氨基酸调控来控制转换结合剂100的结合强度。具体地,可以考虑构成用于相互结合的转换结合剂100和抗原结合部分15的框架区(FR,FR’)的氨基酸序列上的三维结构来选择,并且根据所选氨基酸序列的调控,可以控制转换结合剂100和框架区(FR,FR’)之间的抗体结合部分15的结合强度。由此,可以提供能够结合各种抗体10的转换结合剂100。
转换结合剂100可包括抗体结合部分(AB,在图1b中称为第一抗体结合部分(AB1,AB1’)或第二抗体结合部分(AB2,AB2’))和连接至抗体结合部分(AB)的结合强度调节部分(BR),作为基本单元配置。图1b示出了“抗体结合部分(AB)-结合强度调节部分(BR)”,其中抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR)作为基本配置的单个单元彼此连接,但这是示例性的。例如,抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR)被包括作为单元结构,使得抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR)被连续地连接以实现扩展的聚合物链,如-抗体结合部分(AB)-结合强度调节部分(BR)-抗体结合部分(AB)-,-抗体结合部分(AB)-结合强度调节部分(BR)-抗体结合部分(AB)-结合强度调节部分(BR)。
抗体结合部分(AB)可以包括能够识别并结合各种不同种类抗体的转换结合剂100的氨基酸序列。抗体结合部分(AB)可以被选择性地结合,然后针对抗体重链或轻链的抗原结合部分中包含的可变区的框架区(FR,FR’)的至少一部分被再次特异性地分离,所述抗体重链或轻链对于各种类型的抗体具有相同或相似的氨基酸序列。也即,它可以可逆地连接。例如,这些特征可能取决于稍后将描述的转换结合剂100的结构特征而出现,但是不限于此。这包括转换结合剂100的全部或部分与抗体的框架区的至少一部分可逆结合的情况,并且由于抗体结合部分101结合至抗体的框架区(FR),因此其适用于各种抗体。
此外,转换结合剂100以独特型为特征,通过该独特型,抗体选择性地与抗原结合,即,其选择性地与存在于这些互补决定区(CDR)之间的框架区(FR)结合,而不是与互补决定区(CDR)结合,因此,与用于干扰与特定抗原结合的抗独特型抗体不同,其具有与各种抗体,尤其是IgG抗体结合的性质,而与抗原结合特异性无关。
由于结合强度调节部分(BR)可干扰抗原与抗体的结合,因为转换结合剂100与抗体10之间的结合强度更强,为了不影响用于免疫测定的抗原-抗体结合系数,可调节转换结合剂100与抗体之间的结合强度。在实施方案中,结合强度调节部分(BR)可以具有根据它们所应用的抗体类型而彼此不同的氨基酸序列。与每个抗体结合的转换结合剂100的结合强度可以通过结合强度调节部分(BR)的氨基酸序列差异来调节。因此,与抗体结合的转换结合剂100的结合强度可以根据抗原-抗体反应中抗体的类型而变化。由于转换结合剂100的抗体结合部分(AB)和抗体之间的结合强度可以通过结合强度调节部分(BR)来控制,因此抗体结合部分(AB)可以被设计成在响应于各种类型的抗体10的某些条件下容易与抗体10的框架区(FR)分离,使得转换结合剂100可以与抗体10分离。例如,当抗体结合部分(AB)与抗体10的框架区(FR)结合,并且目标抗原识别并与抗体的抗原结合部分特异性结合时,这使得抗体结合部分(AB)能够容易地与抗体10的框架区(FR)分离,并且目标抗原能够容易地与抗体结合。因此,根据本公开的实施方案的具有抗体结合部分(AB)-结合强度调节部分(BR)的单元结构的转换结合剂100具有转换特性,该转换特性在抗体-抗原反应中执行结合和解离抗体的特定动作。
如上所述,本公开的转换结合剂100与预定的抗体10结合,然后当目标抗原20与抗体结合时,转换结合剂10与抗体10分离,并检测分离的转换结合剂,从而使抗原20的鉴定和定量成为可能。已知的方法可以用于抗原20的识别和定量。也即,转换结合剂100与抗体10的抗原结合部分结合,并且仅当抗原与抗体结合时才被分离。尽管根据本公开的实施方案的转换结合剂100的抗体结合部分(AB)与各种各样的抗体结合而不是非特异性地结合,但是当目标抗原20通过结合强度调节部分(BR)与抗体10结合时,它允许整个转换结合剂100容易地与抗体10分离,并且允许转换结合剂100引起对目标抗原20的特异性反应,也即,与抗体10的分离反应,从而可以使用分离的转换结合剂滴定和/或定量抗原。此外,与用于干扰与特定抗原结合的抗独特型抗体不同,它可能具有与抗体结合的非限制性特性,而与抗原结合特异性无关。此外,通过使用转换结合剂100的这些特性,不仅可以应用于诊断试剂,还可以应用于治疗试剂和生物传感器。如上所述,为了不影响特定抗原与抗体10的结合,转换结合剂100与抗体10的结合强度可以设计为小于抗体10与特定抗原之间的结合强度。然而,本公开不限于此。在另一实施方案中,转换结合剂100与抗体10的结合强度大于抗体10和目标抗原20的结合强度,可以控制抗原和抗体10之间的结合反应。当在诊断领域中需要控制抗原和抗体之间的反应强度时,可以应用这种方法。抗体结合部分(AB)是能够通过调控控制结合强度的部位,稍后将参照图5a至6e对其进行详细和具体的描述。
此外,结合强度调节部分(BR)可与各种抗体结合和分离,而不是与特定抗体结合和分离。即使当结合强度调节部分(BR)与未知抗原例如突变病毒的抗体结合时,也可以调节转换结合剂100的结合强度,以促进转换结合剂100与抗体10的分离,这可以提高稍后描述的抗体的鉴定和定量的快速性和准确性。本公开的实施方案具有能够快速和准确地一步定量和分析抗原的优点,同时通过在常规抗原-抗体反应中使用转换结合剂100的结合和解离的转换操作而省略了洗涤过程的步骤,而常规抗原-抗体反应需要洗涤过程,会由于许多非特异性反应而难以控制。
在实施方案中,抗体结合部分(AB)可以参考上文对图1a中的第一抗体结合部分(AB1,AB1’)和第二抗体结合部分(AB2,AB2’)的描述。在其它实施方案中,结合强度调节部分(BR)可以包含至少一种氨基酸残基或序列,例如氨基酸序列-S-Y-W-I-H-W-V-K-、-R-P-G-Q-G-L-E-、-I-G-E-、-V-Y-、-C-A-R-E-P-T-G-T-G-、-Y-F-D-V-、-G-K-、-T-Y-L-E-W-Y-、-K-P-G-Q-S-、-K-、L-I-Y-K-、-C-F-Q-G-S-H-V-P-和-T-K-(在下文中,结合强度调节部分氨基酸序列),但不限于此。如上所述,转换结合剂100包括作为一个或多个单元结构的抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR),使得其可以通过延伸序列的结合来表达,在延伸序列中,抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR)连续连接。因此,结合强度调节部分(BR)可以调控抗体结合部分(AB)在转换结合剂100中的位置,以控制抗体结合部分(AB)与抗体10的结合强度。在实施方案中,转换结合剂100可以包括氨基酸序列,其中选自抗体结合部分(AB)氨基酸序列中的任一者的抗体结合部分(AB)和选自结合强度调节部分(BR)氨基酸序列中的任一者的结合强度调节部分102交替重复至少一次或更多次。例如,它是物理和化学上可能的任何序列,例如-T-Y-L-E-W-Q-K-W-、-V-Y-Y-、-V-Y-Y-G-K-、-K-P-G-Q-S-I-、-G-K-W-K-L-、-Y-F-D-V-W-G-K-、-F-C-F-Q-G-S-H-V-P-Q-、-R-P-G-Q-G-L-E-F-V-Y-、-S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-T-K-F-和W-I-G-E-Y-V-Y-Q-Y-F-D-V-P-。它可以包括但不限于其中抗体结合部分氨基酸序列和结合强度调节部分氨基酸序列交替重复至少一次或多次的那些。在其它实施方案中,通过在转换结合剂100中包括抗体结合部分(AB)和结合强度调节部分(BR)作为一个单元结构而连续结合和延伸的氨基酸残基的数量可以与结合抗体的框架区(图2,FR中所示)的氨基酸残基的数量相同或更多,但不限于此,因此可以包括更少的情况。例如,延伸的氨基酸序列的数量是6至30,但不限于此。
图2是说明根据本公开的另一实施方案,转换结合剂100与框架区(FR)和与框架区(FR)相邻的互补决定区(CDR)的结合的图。
参照图2,根据本公开的实施方案,转换结合剂100a和100b可以与框架区(FR)中的全部或部分FR1区(FR1)、框架区(FR)中的全部或部分FR2区(FR2)、框架区(FR)中的全部或部分FR3区(FR3)或框架区(FR)中的全部或部分FR4区(FR4)的组合结合。例如,转换结合剂100a可以与框架区(FR)的FR1区域(FR1)结合,转换结合剂100b可以与FR2区(FR2)结合。当转换结合剂100与框架区的一部分结合时,其可以与框架区的约30%至70%以上结合。然而,图2中所示的转换结合剂100a和100b仅与框架区(FR)的FR1区(FR1)结合,和仅与框架区(FR)的FR2区(FR2)结合,但是不限于此。它们也可以与框架区的FR3区(FR3)或框架区的FR4区(FR4)结合。如上所述,它们也可以与通过将框架区(FR)(例如框架区(FR)的FR1区(FR1))连接至框架区(FR)的FR2区(FR2)或通过将框架区(FR)的FR2区(FR2)连接至框架区(FR)的FR4区(FR4)而使用的序列结合。
根据本公开的实施方案,转换结合剂100c可以同时结合至至少一个框架区(FR)和至少一个互补决定区(CDR)。例如,转换结合剂100c的完整氨基酸序列的一部分可以与框架区(FR)结合,另一部分可以与互补决定区(CDR)结合。在其它实施方案中,互补决定区(CDR)可以是从框架区(FR)延伸的区域,转换结合剂100c与该框架区结合。例如,当转换结合剂100c的氨基酸序列的一部分与FR2区(FR2)结合时,其它部分可以与互补性决定区(CDR)的CDR1区(CDR1)或互补性决定区(CDR)的CDR2区(CDR2)结合。然而,这是非限制性的,并且可以类似地与位于构架区(FR)之间的互补决定区(CDR)结合。例如,转换结合剂100可以与框架区(FR)中的FR3区(FR3)和框架区(FR)中的FR4区(FR4)之间的互补决定区(CDR)的CDR4区(CDR4)连续结合。
参考图2,尽管公开了与重链(VH)结合的转换结合剂,但根据本公开的实施方案的转换结合剂可类似地与轻链(VL)的框架区(FR’)结合。
在实施方案中,除非另有说明,否则抗体10可以包括任何抗体,包括同种型(isotype)、全型(hollotype)或独特型抗体。特别地,当抗体10是同种型抗体时,抗体10可以包括例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的抗体。根据另一实施方案,抗体10可以是人抗体、非人抗体、人源化非人抗体或其组合。如上所述,转换结合剂100包括构成抗原结合部分15的框架区(FR,FR’),其引起相互结合以形成抗体的三维结构,以及选自与框架区(FR,FR’)相邻的互补决定区(CDR,CDR’)的氨基酸序列。即使抗体10的类型改变,框架区(FR,FR’)的氨基酸序列也可以保持与互补决定区(CDR,CDR’)相似,几乎没有变化。因此,通过具有与抗体10的来源动物(例如,小鼠、兔、山羊或人)相同或基本相似的氨基酸序列,可以非特异性结合各种抗体10。因此,转换结合剂100可以应用于各种抗体,并且具有扩展的可用范围。
根据实施方案,转换结合剂100可以是肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示或另一种抗体。
肽可以通过化学合成、使用氨基酸前体的固相技术以及通过自动化肽合成仪的合成或重组手段来生产。上述合成肽的方法是非限制性实例,并且可以应用各种已知的合成肽的方法。
蛋白质是由氨基酸肽键形成的几个氨基酸组成的高分子化合物。在实施方案中,可以使用自动化有机合成方法合成蛋白质,并且可以表达基因工程重组蛋白质,使得编码大分子递送结构域的核酸序列被克隆至核酸表达载体中。
作为非限制性实例,可通过使用目标分子的结合的体外选择方法获得适体。通过从有机分子、核苷酸、氨基酸、肽、多肽、细胞表面上的标记分子、离子、金属、盐和多糖中分离能够特异性结合每个配体的适体,可以实现特异性结合目标分子的框架区(FR,FR’),特别是重链(VH)或轻链(VL)的适体的选择。此外,适体的选择可以使用体内或体外选择技术进行,该技术使用通过指数富集的配体系统进化(SELEX)方法。
纳米抗体是由单个抗体片段组成的单域抗体和单体可变抗体域,并且可以像抗体一样选择性地结合特定抗原。纳米抗体可以包括重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、衍生自常规四链抗体的单域抗体、工程化抗体和除了衍生自抗体的单域支架。
此外,噬菌体展示是在噬菌体的表面上展示部分或全部蛋白质,例如肽或抗体。它广泛用于通过噬菌体展示识别蛋白质-蛋白质相互作用,此外,它还可用于寻找用于治疗、诊断或实验的重要特异性抗体。酵母展示是蛋白质工程技术,它利用整合至酵母细胞壁中的重组蛋白质的表达来分离和工程化抗体。
作为转换结合剂100的抗体可以是人抗体、非人抗体或人源化非人抗体。人抗体可以是具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体,和/或已经使用用于制备本文公开的人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体可以通过噬菌体展示或人杂交瘤技术形成。非人抗体可以是从各种物种来源获得的抗体,例如,除人以外的非人哺乳动物或鸟类,如啮齿动物、兔、牛、羊、猪和狗。人源化非人抗体是嵌合抗体,其包含来自非人免疫球蛋白的最少序列。在实施方案中,人源化非人抗体还可以包含选自非人抗体的序列,而不是人序列。在另一实施方案中,人源化抗体可以包含保守氨基酸取代,即,来自相同物种或其它物种的非天然残基,其不会显著改变抗体结合和/或生物活性。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能,例如结合亲和力。上述转换结合剂100的实施例是非限制性实施例,并且可以包括各种实施例,包括能够可逆地与抗体的重链或轻链结合的上述氨基酸序列。
根据实施方案,即使转换结合剂100中的氨基酸序列的一部分被无机材料取代,其也可以与包括抗体10的重链或轻链的框架区(FR,FR’)的抗原结合部分15结合,并且转换结合剂100可以包括相应的物质。无机材料可以例如选自由二氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、氧化钙(CaO)、氧化镁(MgO)、氧化铁(Fe2O3)、氧化钛(TiO2)、氧化钾(K2O)、氧化钠(Na2O)、石灰石(CaCO3)、白云石(CaMg(CO3)2)、滑石(Mg3Si4O10(OH)2)、氧化银(Ag2O)、氧化铬(Cr2O3)、氧化钴(CoO2)、氧化铜(CuO)和氧化锌(ZnO)组成的组。
图3显示了根据本公开实施方案的转换结合剂100。
参考图3,根据实施方案,转换结合剂100可以由标记材料200标记,标记材料200显示化学、电、磁或光标记反应。在使用标记材料200的标记的抗原-抗体反应中,转换结合剂100具有能够通过结合和分离抗体10所显示的标记的量来识别和定量抗体和抗原,并测量抗原与抗体的结合强度的优点,这将在后面描述。
在化学标记反应的情况下,可以包括寡组氨酸序列标签、具有染料的化学标记等。在电标记反应的情况下,可以包括由表达基质的氧化还原反应产生的电子流信号反应。在磁标记反应的情况下,特定的放射性标记的结合构件,特别是抗体分子可以通过螯合基团装载多个顺磁性离子。螯合基团可以包括EDTA、卟啉、聚胺冠醚和聚肟。顺磁性离子的例子可以包括钆、铁、锰、铼、铕、镧、钬和铒。加载顺磁性离子,以允许通过放射性标记的特异性结合构件,特别是抗体和抗体片段,来识别和定位抗体。在光标记反应的情况下,可以包括发光、显色、荧光、混浊、磁力或电阻反应。
在实施方案中,标签材料200可以与转换结合剂100的至少任何部分结合。标记材料200可以是生色材料、发光材料、荧光材料、磁性材料、金属材料、有机合成材料或其组合。作为生色材料的实施方案,标记材料200可以是辣根过氧化物酶(HRP),基质可以是过氧化物,例如过氧化氢和/或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。或者,标记材料200可以是碱性磷酸酶(AP),基质可以是例如溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、萘酚-ASB1-磷酸盐和增强化学荧光(ECF)的材料。标记材料200可以作为分解基质的酶,以显示光学反应、化学反应或电反应。荧光材料的例子可以包括HEXTM、TAMRA(应用生物系统公司)、Cy5(艾美捷(Lumiprobe))或磺基罗丹明101酰氯(德克萨斯红(Texas Red)),优选FAM荧光或TAMRA荧光。金属材料的实例可以包括能够经历氧化还原反应的任何配位金属原子,例如,诸如铁、钴、钌、锌、铜、锂或银的材料。一些具体的实例可以选自由二茂铁、四苯并卟啉锌、钴酞菁、三-(2,2’-联嘧啶)钌、4-二茂铁基苯甲醇、5-(4-羟甲基苯基)-10,15,20-三甲苯基卟啉锌(II)和氧化还原活性杯芳烃。有机合成材料的实例可以包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白或荧光胺。这是非限制性示例,并且可以参考用于标记转换结合剂100的各种类型的已知技术。
再次参考图1a至图3,在实施方案中,制备转换结合剂100的方法可以包括以下步骤:识别抗原结合部分15处的氨基酸序列;获得氨基酸序列的疏水性指数;比较疏水性指数以提取转换结合剂100。转换结合剂100的描述与上述描述相同,没有矛盾。
在识别氨基酸序列的步骤中,可以在包括抗体10的重链和轻链的框架区的抗原结合部分15中识别具有抗原结合部分15之间的自结合特征的氨基酸序列。与互补决定区(CDR,CDR’)相比,框架区(FR,FR’)在不同类型的抗体之间具有相同或基本相似的氨基酸序列,并且适用于不同的抗体,从而可以识别框架区(FR,FR’)中待选择的氨基酸序列。
在获得氨基酸序列的疏水性指数的步骤中,可以获得抗体的每个氨基酸序列位点的疏水性指数。疏水性指数可分为负值和正值。可以确认的是,正值表示亲水性,负值表示具有疏水性的部分。稍后将参照图5c和5d以及图6c和6d对其进行详细描述。
其可包括通过比较疏水性指数,提取转换结合剂100的步骤,所述转换结合剂100包含在构成抗原结合部分15的重链(VH)和轻链(VL)的框架区(FR,FR’)的氨基酸序列之间具有相同特性的部分的氨基酸序列。在实施方案中,显示亲水特性的内部序列或显示疏水特性的序列可以相互结合。由此,由于亲水特性而能够相互结合的部分或具有能够相互结合的疏水特性的部分的氨基酸序列可以被选择作为转换结合剂100的全部或部分氨基酸序列。具体地,在选择转换结合剂100的步骤中,通过氨基酸序列的信息,提取对重链(VH)或轻链(VL)的框架区(FR,FR’)具有相互结合特性的氨基酸序列。通过包括抗体10的框架区(FR,FR’)的抗原结合部分15之间的结合特性,转换结合剂100与框架区(FR,FR’)的结合可以具有与框架区(FR,FR’)之间的相互作用相同的效果。转换结合剂100的详细描述与上述描述相同。
在另一实施方案中,作为用于疾病筛查、诊断、预防、治疗或诊断和治疗一体化的药物组合物,可以包括转换结合剂100。转换结合剂100具有通过其特异性结合和分离各种抗体10的框架区的特性来实现各种病毒的诊断、预防或治疗的优点。药物组合物可以在施用时以各种口服和肠胃外制剂施用。在制剂的情况下,可以使用稀释剂或赋形剂(例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂)来制备。
口服施用固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等,并且这种固体制剂通过将一种或多种化合物与至少一种赋形剂混合来制备,所述赋形剂是例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂外,还使用润滑剂,例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括悬浮液、内部溶液、乳液、糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡,各种赋形剂例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等可以包括在内。对于转换结合剂100的描述,可以参考前述内容。
肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液和乳液。作为非水溶剂和悬浮剂,可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的酯(例如油酸乙酯)。
图4a为根据本公开的实施方案的使用转换结合剂100的测定方法的流程图,图4b为根据本公开的另一实施方案的使用转换结合剂100的测定方法的流程图,图4c为根据本公开的又一实施方案的使用转换结合剂100的测定方法的流程图。
参考图4a,根据实施方案的测定方法可以包括从框架区(FR,FR’)(未显示)中选择氨基酸序列的步骤。转换结合剂100的氨基酸序列可选自框架区(FR,FR’),其中抗体的重链(VH)和轻链(VL)彼此相邻并且彼此自缔合。关于选择氨基酸序列的步骤,图1a至图2的公开内容和以下描述可以被称为可从构成抗体10的抗原结合部分15的构架区(FR,FR’)中选择的那些。因此,通过在抗体10的抗原结合部分15中提取包括每个抗体10的相同或基本相似的框架区(FR)的氨基酸序列,具有可应用于各种抗体10的优点。
在实施方案中,可以通过固定至支持物30来制备抗体10。支持物30可以是基质、珠字、纤维或聚合物结构。可以用作支持物30的基质不受限制,只要它可以用于生物芯片或生物传感器。优选地,它可以是金、陶瓷、玻璃、聚合物、硅、改性硅、纤维和其表面已经通过单独处理改性或未改性的金属。具体地,聚合物可以包括四氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯。纤维可以包括硝化纤维、再生纤维素或尼龙膜。可以在基质上处理以改变表面的材料可以是例如聚合物、塑料、树脂、碳水化合物、二氧化硅、二氧化硅衍生物、碳、金属无机玻璃和薄膜的材料。支持物30不仅用作支持物30,而且为固定的抗体和样本之间的反应提供场所。支持物的规格和固定在其上的抗体的位置、尺寸和形状可以根据分析的目的、点样机、点胶机和分析装置(例如扫描仪)而变化。
图4a示出了使用固体支持物30将抗体10固定在基质上,但不限于此,并且将抗体10固定在珠子上并置于溶液中(参见图4b);抗体10不是固定的,而是可以在溶液中以混合状态提供(参见图4c)。也即,它可以应用于免疫吸附型免疫测定和同质型免疫测定。
在实施方案中,可以在预处理步骤(S100)中量化转换结合剂110与抗体10结合。例如,抗体10被固定在基质上,并且转换结合剂100通过将标记材料200与转换结合剂100结合而显示标记反应。可以测量基质下表面上的转换结合剂100的标记反应的强度。根据本公开的实施方案,在目标抗原20与抗体10结合之前,可以通过量化转换结合剂110与抗体10结合并使用与抗体10结合的转换结合剂110的量作为初始值,来实现目标抗原20的高精度识别或量化。对于转换结合剂100、标记材料200和标记反应的详细描述,可以参考前述公开内容。此外,如本文所用,转换结合剂100的“量”可以与转换结合剂100的“浓度”互换使用。转换结合剂100的量“高”或“低”的描述可以理解为转换结合剂100的浓度“高”或“低”。
然后,可以包括向抗体10提供分析物的步骤。具体地,可以执行将目标抗原20与抗体10结合并将结合的转换结合剂110从框架区(FR,FR’)分离的抗原处理步骤(S200)。目标抗原20可以包含或不包含在分析物中。当目标抗原20包含在分析物中并且目标抗原20被提供给抗体10时,通过目标抗原(20)与抗体(10)的特异性反应,与抗体10结合的至少一些转换结合剂110可以从框架区(FR,FR’)分离并且释放至包含抗体10的溶液相中。随着目标抗原20的浓度增加,在与抗体10结合的转换结合剂110中,与抗体10分离的转换结合剂100的比例会增加。
在抗原处理步骤之后,可以进行定量与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120或从框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂130的剩余量中的至少一种以及分析目标抗原20的测定步骤。根据本公开的实施方案,可以通过转换结合剂100、120和130来分析分析物中的目标抗原20,而无需在将分析物提供给抗体10之后执行洗涤步骤。快速分析是可能的,并且不需要额外的洗涤设备。此外,由于不包括标记抗体本身的步骤,一步简化是可能的。即使使用少量,由于抗原结合的抗原-抗体反应也可以用用转换结合剂100标记的材料来识别,因此小型化是可能的。因此,本公开可以提供具有改进易用性的一步免疫测定。
在实施方案中,与框架区域(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量可以被量化。在这种情况下,如果在测定步骤中测量的与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量比在预处理步骤(S100)中与抗体10结合的转换结合剂110的量减少,则可以获取关于目标抗原20是否包含在分析物中的信息。这是因为只有当目标抗原20与抗体10结合时,转换结合剂110才被分离。
此外,在测定步骤中测量的与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量与在预处理步骤(S100)中与抗体10结合的转换结合剂110的量之间的差异越大,可以获得指示目标抗原20的量大的信息或指示浓度高的信息。因此,本公开可以识别或量化分析物中包含的目标抗原20的量或浓度(下文称为第一测定)。
在其它实施方案中,可量化与框架区(FR和FR’)分离的转换结合剂130。在这种情况下,当从框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂130的量等于或大于阈值时,目标抗原20可被包括在分析物中(下文称为第二测定)。
在另一实施方案中,与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120和从框架区域(FR,FR’)分离的转换结合剂130的残留量均可以被量化。对于定量结果测定(第一测定和第二测定)的详细描述,可以参考前述公开内容。因此,可以使用两种测定方法来定量目标抗原20,使用在预处理步骤(S100)中测量的与抗体10结合的转换结合剂110的量和在测定步骤(S300)中与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量之间的差异(第一测定),以及从框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂130的量的差异(第二测定)。通过第一测定和第二测定,可以提供一步免疫测定,其具有目标抗原20的定量分析的提高的准确性和可靠性。可以通过测量与残留量的转换结合剂120结合和/或分离的转换结合剂130的标记材料200的上述标记反应来确定量化。例如,可以使用荧光共振能量转移(FRET)方法测量标记反应中的荧光量。由此,当结合不同浓度的抗原20时,根据抗原20的浓度的定量关系,转换结合剂100从抗体10释放。因此,有可能实现能够量化分析物(例如,抗原(20))的一步免疫测定。将参照图8a至8d详细描述图4a中公开的测定方法的测定结果。
参考图4b,根据实施方案的测定方法可以包括从框架区(FR,FR’)(未显示)中选择氨基酸序列的步骤。将参照图1a至图2以及稍后描述的实施方案详细描述选择氨基酸的步骤的描述。
在实施方案中,抗体10可以在预处理步骤(S100’)中固定在珠子上。珠子是非限制性的实例,可以是玻璃珠、磁珠或聚合物珠。根据本公开的实施方案,作为用于固定抗体10的支持物30,使用可以被分配或分散在溶液中而不是基质中的珠子。因此,容易将抗体10均匀地固定到珠子上,并且之后,在抗原处理步骤(S200’)中,将抗体10和目标抗原20混合,使得抗体10和目标抗原20之间的结合程度增加。此外,与固定支持物例如基质不同,珠子可以分散或分配在溶液中,并且用于分析目标抗原20的液相过程是可能的。因此,可以省略固定抗体10的步骤,并且目标抗原20和抗体10以高概率结合,从而提高测定的准确性。
此后,如图4a所述,在提供分析物的步骤中,具体地,在抗原处理步骤(S200’)中,可以执行通过将作为分析物的目标抗原20与溶液中存在的抗体10结合而将转换结合剂100与框架区(FR,FR’)分离的步骤。对于转换结合剂100从框架区(FR,FR’)分离的详细描述,可以参考前面的描述。
然后,在测定步骤(S300’)中,在抗原处理步骤之后,可分离与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量和从框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂130。例如,与珠子结合的转换结合剂120的残留量转换结合剂、固定在珠子上的抗体10、以及从框架区(FR,FR’)分离的抗体10和转换结合剂130的框架区(FR,FR’)可以被分离。转换结合剂的密度可以大于分离的转换结合剂130的密度。在这种情况下,转换结合剂可以被分离,因为转换结合剂的密度大于分离的转换结合剂130的密度。为此,可以使用离心机,或者可以沉淀转换结合剂。将参照图9b和9c详细描述图4b的测定方法的测定结果。
参考图4c,根据实施方案的测定方法可以包括从框架区(FR,FR’)(未显示)中选择氨基酸序列的步骤。对于选择氨基酸的步骤的描述,可以参考图1a至图2中描述的细节。
预处理步骤(S100”)可以包括向抗体10提供转换结合剂100,以获得包含抗体10和转换结合剂100的第一缀合物(b1)以及未与抗体10结合的转换结合剂100的混合溶液(S110);以及从混合溶液中去除未与抗体10结合的转换结合剂100(S120)。例如,混合溶液穿过脱盐柱以去除首先穿过脱盐柱的未结合的转换结合剂,并且仅可以获得后来穿过脱盐柱的第一缀合物(b1)。上述方法是示例性的,并且可以参考用于分离第一缀合物和转换结合剂100的各种已知技术。
然后,作为提供分析物的步骤,在抗原处理步骤(S200”)中,可进行通过将目标抗原20与抗体10结合而将第一缀合物(b1)与框架区(FR,FR’)分离的步骤。当目标抗原20被提供给抗体10时,通过目标抗原20与抗体10的特异性反应,在第一缀合物(b1)中与抗体10结合的转换结合剂100被分离成框架区(FR,FR’)并释放至溶液相中。
然后,测定步骤(S300”)可以进一步包括以下步骤:分离从抗体10分离的转换结合剂130,以及抗体10与标抗原20结合的第二缀合物(b2)10(S310);以及量化分离的转换结合剂130(S320)。第二缀合物(b2)和分离的转换结合剂130可以使用例如蛋白质-A柱40分离。此后,只有分离的转换结合剂130可以通过标记反应被选择性地获得和量化。此时,随着目标抗原20的浓度增加,从第二缀合物(b2)分离的转换结合剂130的量增加,从而增加溶液的荧光量。
在实施方案中,在测定步骤(S300”)中,可以提供能够通过根据目标抗原20的浓度增加而分离的转换结合剂130的量来识别抗体和抗原的测试试剂盒。根据本公开的实施方案,使用转换结合剂100的测试试剂盒可以根据免疫测定方法来执行。例如,测试试剂盒可以包括luminex测定法、蛋白质微阵列测定法、ELISA测定法、捕获-ELISA测定法、ELISPOT测定法、放射免疫测定法(RIA)、侧向流动免疫测定法(LFIA)、流通免疫测定法(FTIA)、蛋白质微流体免疫测定法、蛋白质毛细管电泳(CE)、免疫-PCR测定法、电化学生物传感器、放射免疫沉淀测定法、免疫沉淀测定法、免疫组织化学染色测定法、Ouchterlony免疫扩散测定法、抑制或竞争测定法、夹心测定法、流式细胞仪、免疫电泳测定法、组织免疫染色测定法、补体结合测定法、FACS测定法、蛋白质芯片测定法、免疫荧光染色测定法和免疫亲和纯化测定法。上述测定方法仅仅是示例性的,并不限于此。关于免疫测定试剂盒,可以应用市售测定方法的描述。在另一实施方案中,测试试剂盒可以包括用天然或人工标记材料200标记的转换结合剂100。标记材料200的描述可以参考图3。
在实施方案中,在测定步骤(S300”)中,可提供测试试剂盒,其可测量根据目标抗原20的浓度增加而分离的转换结合剂130的量,并测量目标抗原20与抗体10的结合强度。为了测量结合强度,可以测量抗体10的抗原结合系数(Kd)。抗原结合系数(Kd)可以是平衡解离常数,表示抗原-抗体结合相互作用的强度。抗原结合系数(Kd)越高,目标抗原20和抗体10之间的结合亲和力越高。随着抗原浓度的增加,分离的转换结合剂130经历荧光标记反应,从而增加溶液的荧光量,因此,可以通过对每个浓度的测量来计算。因此,借助抗原-抗体结合释放的转换结合剂100的量,可以由抗原-抗体结合系数和通过常规方法测量的结合系数之间的差异得知结合强度。
在实施方案中,测试试剂盒可以提供能够测量溶液中抗原20与抗体10的结合强度的测试试剂盒,在所述溶液中抗体10未被固定。根据本公开的实施方案,使用当溶液中包含的抗体10结合目标抗原20而没有将抗体10固定在固体支持物30上时测量抗原结合系数(Kd)的方法,该方法省略了固定抗体10的步骤。因此,提高了测量的可靠性和准确性。因此,借助测量抗原结合系数(Kd)(与抗原的结合强度)的测定方法,也有可能开发能够使用与在溶液中的抗体的框架区(FR,FR’)可逆结合的转换结合剂100进行一步免疫测定的测试试剂盒。
在另一实施方案中,测试试剂盒可以包括用天然或人工标记材料200标记的转换结合剂100。转换结合剂100和标记材料200的描述可以参考图1a至图3。将参照图10a至10d详细描述图4c中公开的测定方法的测定结果。
图5a显示了SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的结合;图5b显示了SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的氨基酸序列之间的特异性结合;图5c是显出SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂每个位点之间的相互作用的曲线图;图5d是显出SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的疏水性指数的图;图5e是SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的FRET测定图。
参考图5a,在实施方案中,在SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间形成三维结构,以形成相互结合。也即,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂不在直线上相互作用。因此,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的下端和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的上端相互作用,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的上端和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的下端相互作用。在另一实施方案中,SEQ IDNO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的相邻区的结合可以在约至的短距离处起作用,优选约至类似地,在框架区(FR)中,该框架区自结合并通过转换结合剂(H2,L1)之间的连接距离与SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂或SEQ IDNO.3(L1)的转换结合剂相互作用,相邻位点的结构特征可在约至约的短距离处起作用,优选约至约
参考图5b,在实施方案中,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的氨基酸序列的一部分可以产生氢键。具体地,如图5b所示,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂包括序列V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K,SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂可以包括序列T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K。
在实施方案中,氨基酸序列可以包括主要结合的第一抗体结合部分(AB1)或第二抗体结合部分(AB2)。例如,作为第一抗体结合部分(AB1),SEQ ID NO.2(H2)的肽序列的氨基酸序列中的第3个氨基酸序列Y和第18个氨基酸序列W通过氨基酸侧链官能团相互作用。第13个氨基酸序列I可以引起与肽键的极性区域的相互作用。
在另一实施方案中,提取自轻链的氨基酸序列可以包括第二抗体结合部分(AB2),其与重链(VH)的框架区结合,重链与轻链一起构成抗原结合部分。例如,作为第二抗体结合部分(AB2),转换结合剂序列SEQ ID NO.3(L1)的氨基酸序列的第6个氨基酸序列Y和第8个氨基酸序列Q通过侧链官能团相互作用。第14个氨基酸序列P和第16个氨基酸L与肽键的极性区域相互作用。因此,如图所示,用红色下划线标出的氨基酸可以通过侧链官能团引起相互作用,用蓝色标出的氨基酸可以引起与肽键的极性位点的相互作用。然而,这是非限制性的,并且如在图1a中所述,不仅可以包括彼此交联的抗体的抗原结合部分的结构特征,还可以包括提取氨基酸序列以通过各种键(例如极性或非极性键)相互结合的情况。
参考图5c和5d,在实施方案中,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的第一抗体结合部分(AB1)和第二抗体结合部分(AB2)可以根据氨基酸侧链具有疏水性指数。在图5c中,如果疏水性指数为正,它位于蛋白质内部,而如果疏水性指数为负,它可以位于蛋白质外部,因为它是水溶性的。此外,疏水部分可以引起与疏水部分的相互作用以及亲水部分与亲水部分的相互作用。SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的上端是亲水性的,下端是疏水性的。
因此,亲水部分和疏水部分彼此相互作用,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的下端和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的上端、SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的上端和SEQ IDNO.3(L1)的转换结合剂的下端可以三维结构相互作用。因此,SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂可以与轻链(VL)的LAR区(LAR)相互作用,该轻链的LAR区包含与SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂相同的氨基酸序列。SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂可以与重链(VH)的HAR区(HAR)相互作用,该重链的HAR区包含与SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂相同的氨基酸序列。如果根据三维结构调控通过三维结构观察到的SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的四个氢键位置处的氨基酸,则可以调节抗体结合部分15的结合强度。
参考图5e,实施方案提供了FRET测试结果,示出了抗体结合转换结合剂(100)之间的相互结合。这表示SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂和SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂之间的相互结合。因此,可以确认SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂可以自结合并与轻链(VL)的LAR区相互作用,SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂可以自结合并与重链(VH)的HAR区相互作用。由此,具有从重链(VH)提取的氨基酸序列的转换结合剂100可以与包括轻链(VL)的框架区(FR)的抗原结合部分15结合,并且具有从轻链(VL)提取的氨基酸序列的转换结合剂100可以与包括重链(VH)的框架区(FR)的抗原结合部分15结合。通过这种相互结合特性,转换结合剂100与包括框架区(FR,FR’)的抗原结合部分15结合,因此可以获得与框架区(FR,FR’)之间的相互作用相同的效果。
图6a示出了SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的结合;图6b示出了SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的氨基酸序列之间的特异性结合;图6c是示出SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂每个位点之间的相互作用的曲线图;图6d是示出SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的疏水性指数的图;图6e是SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的FRET测定图。
参照图6a,在实施方案中,在SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间形成三维结构,以相互作用。也即,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQID NO.4(L2)的转换结合剂不在直线上相互作用。因此,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的下端和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的上端相互作用,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的上端和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的下端相互作用。在另一实施方案中,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的相邻区域的结合可以在约至的短距离处起作用,优选约至类似地,在框架区(FR,FR’)中,框架区自结合并通过转换结合剂(H1,L2)之间的连接距离与SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂或SEQ IDNO.4(L2)的转换结合剂相互作用,相邻位点的结构特征可在约至约的短距离处起作用,优选约至约
参考图6b,在实施方案中,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的氨基酸序列的一部分可以产生氢键。具体地,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂可以包括序列S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E,SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂可以包括序列V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K。
在实施方案中,类似于图5b,氨基酸序列可以包括主要结合的第一抗体结合部分(AB1’)或第二抗体结合部分(AB2’)。例如,作为第一抗体结合部分(AB1’),SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的氨基酸序列中的第9个氨基酸序列Q通过氨基酸侧链官能团相互作用。第17氨基酸序列W可以引起与肽键的极性区域的相互作用。在另一实施方案中,可以包括第二抗体结合部分(AB2’)。例如,作为第二抗体结合部分(AB2’),SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的氨基酸序列中的第3个氨基酸序列Y通过氨基酸侧链官能团相互作用。第12个氨基酸序列F可以引起与肽键极性区域的相互作用。因此,如图所示,用红色下划线标出的氨基酸可以通过侧链官能团引起相互作用,用蓝色标出的氨基酸可以引起与肽键的极性位点的相互作用。
参考图6c和6d,在实施方案中,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的第一抗体结合部分(AB1’)和第二抗体结合部分(AB2’)可以根据氨基酸侧链具有疏水性指数。在图6c中,如果疏水性指数为正,它位于蛋白质内部,而如果疏水性指数为负,它可以位于蛋白质外部,因为它是水溶性的。此外,疏水部分可以引起与疏水部分的相互作用以及亲水部分与亲水部分的相互作用。SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的上端是亲水性的,下端是疏水性的。
因此,亲水部分和疏水部分彼此相互作用,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的下端和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的上端、SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的上端和SEQ IDNO.4(L2)的转换结合剂的下端可以三维结构相互作用。因此,SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂可以与轻链(VL)的LBR区相互作用,而SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂可以与重链(VH)的HBR区相互作用。如果第一抗体结合部分(AB1’)或第二抗体结合部分(AB2’)的氨基酸残基根据通过三维结构观察到的SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的两个氢键位置处的氨基酸的三维结构进行调控,则可以控制抗体结合部分的结合强度。然而,本公开不限于此,并且可以包括具有从重链(VH)和轻链(VL)通过氢键结合并相互作用的位点提取的氨基酸序列的转换结合剂100和包含重链(VH)或轻链(VL)的框架区(FR)的抗原结合部分15之间的任何组合。
参考图6e,实施方案提供了FRET测试结果,示出了抗体结合转换结合剂之间的相互结合。这表示SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂之间的相互结合。由此,可以确认SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂可以与轻链(VL)的LBR区相互作用,SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂可以与重链(VH)的HBR区相互作用。通过这种特性,转换结合剂100与框架区(FR)结合,因此可以获得与框架区域(FR)之间的相互作用相同的效果。
图7a示出了每种转换结合剂100的抗体结合强度测量结果;图7b示出了根据浓度的抗体结合转换结合剂100的结合强度的SPR分析结果;图7c示出了与抗体结合的转换结合剂100与抗体10Fab位点结合的结果;图7d示出了与抗体10结合的转换结合剂100与其它抗原和蛋白质的抗体10Fab位点结合的比较分析图。
参考图7a,基于转换结合剂100的浓度,其示出了:示出SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的荧光量的图(A1);示出SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的荧光量的图(A2);示出SEQID NO.3(L1)的转换结合剂的荧光量的图(A3);和示出SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的荧光量的图(A4)。
在实施方案中,可以确认,随着本公开的转换结合剂100的浓度增加,荧光强度的强度增加。由此,本公开的转换结合剂100与抗体10结合,并且可以用于量化结合的转换结合剂100。在另一实施方案中,可以通过测量转换结合剂100的每个浓度的荧光量来测量抗原结合系数(Kd)。通过Kd(H1)=1.42×10-6M、Kd(H2)=1.94×10-5M、Kd(L1)=6.62×10-6M和Kd(L2)=6.68×10-6M,计算每个SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100的抗原结合系数。
由此,对于每种转换结合剂,计算和量化目标抗原20与抗体10的相对结合强度是有利的。荧光分析的具体实验方法将在后面的实施例3中描述。然而,图7a中所示的抗原结合系数(Kd)表示由支持物30固定的抗体10的值,但不限于此。当抗体10在溶液中结合目标抗原20时,也可以测量抗原结合系数(Kd),这将参照图10a至10d详细描述。
参考图7b,在实施方案中,可以确认表面等离子体共振(SPR)分析的结果。表面等离子体共振(SPR)利用当材料与金属薄膜(例如金)的表面结合时,金属表面的折射率改变的现象。当光被辐射时,与金属表面结合的材料的浓度可以通过检查反射光中发生SPR现象的共振角来测量。在该实验实施例中,每个浓度的转换结合剂100示出了用结合物中的肽处理的SPR信号的结果值。
具体地,为了确认SPR信号结果,在固定抗体10之前,用1mM巯基十一烷酸(MUA)处理金表面过夜并进行表面修饰。将碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS,0.4M/0.1M)以1:1的比例混合,并处理10分钟以活化官能团。通过用50μg/mL的抗体浓度处理抗HRP抗体1.5小时,来制备抗体固定化。此后,在用1M浓度的乙醇胺封闭10分钟后使用。分别使用10和20μM的两种浓度,通过孵育30分钟来处理所有的转换结合剂100。在1%吐温-20洗涤溶液流动1分钟三次后,溶液停止,通过重复常规的测量SPR信号3分钟,可以测量SPR信号的平均值。
然而,实施方案不限于本公开的实施方案,可以包括能够测量转换结合剂100的结合强度的任何方法。在图中,关于SEQ ID NO.1(H1)的肽的SPR信号、SEQ ID NO.2(H2)的肽的SPR信号、SEQ ID NO.3(L1)的肽的SPR信号、SEQ ID NO.4(L2)的肽的SPR信号,10μM的低浓度如左图(B1)所示,20μM的高浓度如右图(B2)所示。如左图(B1)所示,作为在10μM的低浓度下肽处理的结果,SPR信号被计算为:SEQ ID NO.1(H1)的肽=34.4±3.3(9.6%)RU,SEQID NO.2(H2)的肽=51.5±5.6(10.9%)RU,SEQ ID NO.3(L1)的肽=25.3±3.2(12.5%)RU,以及SEQ ID NO.4(L2)的肽=124.6±16.9(13.6%)RU。
如右图(B2)中所示,作为20μM的高浓度肽处理的结果,SPR信号可以确认:SEQ IDNO.1(H1)的肽=121.4±3.7(3.1%)RU、SEQ ID NO.2(H2)的肽=192.0±1.8(0.9%)RU、SEQ ID NO.3(L1)的肽=40.4±3.2(7.9%)RU和SEQ ID NO.4(L2)的肽=418.2±26.5(6.4%)RU。由此可以看出,通过分析抗体的抗原结合部分的氨基酸序列合成的SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4的肽与抗体结合,其中可以看出SEQ ID NO.4的肽结合最多。
参考图7c和7d,其示出了:示出SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的荧光量的图(D1,C1);示出SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的荧光量的图(C2,D2),示出SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的荧光量的图(C3,D3),以及示出SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂的荧光量的图(C4,D4)。在实施方案中,可以看出SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100仅结合抗体10的片段中包括抗原结合部分15的Fab位点。
再次参考图7c,在实施方案中,转换结合剂100可以与抗体10的抗原结合部分15结合。具体地,荧光标记的转换结合剂100与固定在固体支持物30上的抗体10结合。通过用10μg/mL的抗体浓度处理抗-HRP抗体10两小时来制备抗体固定,并在用8mg/mL的BSA浓度封闭1小时后使用。SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100在浓度为10μM的转换结合剂100的条件下孵育1小时。在用浓度为250μg/mL的木瓜蛋白酶在37℃下处理2小时以分解抗体10的Fab区和Fc区后,测量溶液中荧光量的变化,并分别测量残留在固体支持物30上的荧光量。
在实施方案中,可以确认底部(A)中的荧光量和溶液(B)中的荧光量。在用木瓜蛋白酶(分解抗体10的Fab位点和Fc区的蛋白水解酶)处理后,在转换结合剂100中测量荧光。当用木瓜蛋白酶处理荧光量时,可以确认在溶液(B)中游离的Fab位点的荧光量高于Fc区被固定的底部(A)处的荧光量。也即,在用木瓜蛋白酶(抗体降解酶)处理之前,对于SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100,与仅在固定有抗体的固体支持物30中观察到的大量荧光相比,在木瓜蛋白酶处理的情况下,在固定有抗体10的固体支持物中的荧光大大减少,并且在溶液中被大量观察到。由此可见,SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100与被木瓜蛋白酶分解并分布在溶液中的Fab区结合,而不与固定在固体支持物30上的Fc区结合。
再次参考图7d,在实施方案中,SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100可以选择性地仅结合抗体10。具体地,人IgG、兔IgG、山羊IgG和小鼠IgG在浓度为100μg/mL的抗体下处理过夜,用于将抗体10和蛋白质固定在固体支持物30上。通过分别用浓度为100μg/mL的HBsAg、CRP和蛋白A处理过夜来制备固定化蛋白。然后,以浓度为10mg/mL的BSA封闭1小时后使用。分别通过在浓度20μM下孵育1小时来处理SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100。
参考图7e,确认的是,与抗原HBsAg和CRP和蛋白A相比,SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.4的荧光标记肽在抗体例如人IgG、兔IgG、山羊IgG和小鼠IgG中显示出高荧光水平。这确认了SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100选择性结合抗体10。
图8a至8d是示出根据本公开的实施方案中的图4a的测定方法的目标抗原20的测定结果的图,其中图8a示出了当抗体10是抗HRP抗体10,且目标抗原20是HPR时;图8b示出了当抗体10是抗hCG抗体10,且目标抗原20是hCG时;图8c示出了当抗体10是抗CRP抗体10,且目标抗原20是CRP时;图8d示出了当抗体10是抗HBsAg抗体10,且目标抗原20是HBsAg时的情况。
参考图8a,抗HRP抗体以1μg/ml浓度处理并固定在固体支持物上过夜,SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100各自以10μM(100μl/孔)浓度处理2小时。此时,在测量底部的荧光后,将作为兔IgG抗体的分析物的抗原HRP以10μg/ml浓度处理1小时。参考图8b,抗-HCG抗体以1μg/ml浓度处理并固定在固体支持物上过夜,SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100各自以20μM(100μl/孔)浓度处理2小时。此时,在测量底部的荧光后,将作为小鼠IgG抗体的分析物的抗原HCG以100μg/ml浓度处理2小时。
参考图8c,抗CRP抗体以1μg/ml浓度处理并固定在固体支持物上过夜,SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂100各自以20μM(100μl/孔)浓度处理2小时。此时,在测量底部(A)的荧光后,将作为兔IgG抗体的分析物的抗原HRP以10μg/ml浓度处理1小时。参考图8d,抗-HBsAg抗体以1μg/ml浓度处理并固定在固体支持物上过夜,SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.4的转换结合剂100各自以20μM(100μl/孔)浓度处理2小时。此时,在测量底部(A)的荧光后,将作为山羊的IgG抗体的分析物的抗原HBsAg以10μg/ml的浓度处理1小时。
参考图8a至8d,使用SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的转换结合剂测试转换结合剂100,尤其是结合剂100中的肽。在图8a至8d中,图A可以是在预处理步骤(S100)中与抗体10结合的转换结合剂110的测量值;图B可以是在测定步骤S300中与框架区(FR)结合的转换结合剂120的残留量的测量值;图C可以是从框架区(FR)分离的转换结合剂130的测量值;例如,测量和量化由与转换结合剂100结合的标记材料200表现出的标记反应的强度。标记反应可以是荧光反应。上述材料是非限制性实例,本公开不限于此。
参考图8a至8d,可以看出,在所有SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂、SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂、SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂和SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂中,和与抗体10结合的转换结合剂110的量(A)相比,与框架区(FR)结合的转换结合剂120的残留量(B)降低。此外,可以看出,测量了从框架区(FR)分离的转换结合剂130的量(C)。结果,可以看出,与框架区(FR)结合的转换结合剂120的残留量(B)相对于与抗体10结合的转换结合剂110的量(A)的减少量大于从框架区(FR)分离的转换结合剂130的量(C)。
这是因为与抗体10结合的转换结合剂110的量(A)是在支持物30的表面上观察到的荧光强度,但从框架区(FR)分离的转换结合剂130的量(C)是在溶液相中观察到的荧光强度。因此,可以看出,当目标抗原20与抗体10结合时,与抗体10结合的转换结合剂110从框架区(FR)分离并释放至溶液相中。根据本公开的实施方案,如上所述,可以通过在预处理步骤(S100)中测量的与抗体10结合的转换结合剂110的量和在测定步骤(S300)中与构架区(FR)结合的残留量中的转换结合剂120的量之间的差异来量化目标抗原20。同时,可以使用从框架(FR)分离的转换结合剂130的量来量化目标抗原20,因此目标抗原20的测定可以在两个轨道中进行,并且可以提高测定的速度、准确性和可靠性。
此外,为了计算定量分析的测量间再现性,使用SEQ ID NO.3(L1)的结合剂在浓度为3.4μg/ml的HBsAg下重复该实验八次,然后将HBsAg浓度归一化为零(0)的基线值。此时,相应浓度下的测量值计算为3.1±9.3%(n=8)。上述结果表明,含有分析物抗原20HBsAg的样品用山羊IgG抗体处理,并且通过一步免疫测定法在不洗涤的情况下对分析物的测量显示出高再现性。
图9a和9b为示出根据图4b的测定方法的目标抗原20的测定结果的测定图。
参考图9a和9b,在实施方案中,图9a示出了使用SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的珠-基的抗体结合一步免疫测定结果,图9b示出了使用SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的珠-基的抗体结合一步免疫测定结果。
在实施方案中,在预处理步骤(S100’)中,将抗B型流感病毒抗体10固定至珠子上,并且在抗原处理子步骤(S200’)中,分析物可以含有浓度为10ng/mL的CRP或浓度为10ng/mL的B型流感病毒。左边的图(A)是量化从包括不同目标抗原200(即CRP和B型流感病毒)的分析物的框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂130的图,右边的图(B)是量化与框架区(FR,FR’)结合的转换结合剂120的残留量的图。上述材料是非限制性实例,本公开不限于此。
在实施方案中,可以看出,与当分析物包含B型流感病毒时相比,当分析物包含CRP时,分离的转换结合剂130的量较少,残留的转换结合剂120的量较多。这是因为当分析物是B型流感病毒时,B型流感病毒与抗B型流感病毒抗体10反应,并且转换结合剂100从抗体10的框架区(FR,FR’)分离。另一方面,当分析物包含CRP时,CRP不与抗B型流感病毒特异性结合,使得转换结合剂100不与框架区(FR,FR’)分离。
在实施方案中,分析物中的目标抗原20的浓度越高,分离的转换结合剂130的量越大。此外,分析物中的目标抗原20的浓度越高,转换结合剂120的残留量越少。参考图9a和9b,当分析物同样包含B型流感病毒作为目标抗原20时,B型流感病毒的浓度越高,分离的转换结合剂130的量越大。例如,当分析物中包含的B型流感病毒的浓度为100ng/mL时,分离的转换结合剂130的量可以大于10ng/mL的浓度。这是因为目标抗原20的浓度越高,与抗体10特异性反应的目标抗原20的量越大,并且从框架区(FR,FR’)分离的转换结合剂100的量越大。
根据本公开的实施方案,通过测量分离的转换结合剂130的量和/或转换结合剂120的残留量,可以识别包含在分析物中的目标抗原20,还可以提供能够定量或甚至能够进行浓度测量的测定方法。由此,在图9a中,可以确认使用SEQ ID NO.1(H1)的转换结合剂的珠-基的一步免疫测定是可能的,并且在图9b中,可以确认使用SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂的珠-基的一步免疫测定是可能的。因此,使用珠子以及固体支持物进行定量免疫测定是可能的。然而,这是非限制性的,并不限于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
图10a至10d为示出根据本公开的实施方案中图4c的测定方法的目标抗原20的测定结果的测定图。
参考图10a至10d,转换结合剂100使用具有SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4的氨基酸序列的转换结合剂,其中分别显示了使用SEQ ID NO.3(L1)(图10a)、SEQ ID NO.4(L2)(图10b)、SEQ ID NO.1(H1)(图10c)和SEQ ID NO.2(H2)(图10d)的转换结合剂测量溶液中的抗体的抗原结合系数的结果。在实施方案中,目标抗原20可以是HRP,抗体10可以是抗HRP抗体10。上述材料是示例性的,本公开不限于此。
在实施方案中,测量分离的转换结合剂130的量,同时增加分析物中目标抗原20的浓度,并使用分离的转换结合剂130的量计算抗体10的抗原结合系数(Kd)。至于抗原结合系数(Kd),随着作为目标抗原20的HRP的量增加,溶液的荧光量增加。在实施方案中,转换结合剂100的抗原结合系数(Kd)可以是1.2×10-6M至2.9×10-6M。优选地,图10a中的SEQ ID NO.3(L1)的转换结合剂、图10b中的SEQ ID NO.4(L2)的转换结合剂和图10d中的SEQ ID NO.2(H2)的转换结合剂的抗原结合系数(Kd)的值可以分别为8.9×10-7M、1.2×10-6M和2.9×10-6M。由此,与图4a的将抗体10与固体支持物结合后测量抗原结合系数(Kd)的方法不同,本公开中提供的试剂盒提供了当抗体与溶液中的抗原结合时用于测量抗原结合系数(Kd)的方法,因此可以使用与抗体的抗原结合部分可逆地结合的转换结合剂100来测量溶液中的抗体的抗原结合系数(Kd)。
上述的本公开不限于上述实施方案和实例以及附图,本发明所属领域的普通技术人员将会明白,在不脱离本公开技术精神的情况下,可在本公开范围内进行各种替代、修改和改变。
自由文本的序列表
Claims (45)
1.一种转换结合剂,其与抗体的框架区(FR)的至少一部分可逆地结合,并且在与抗体特异性反应的目标抗原与所述抗体结合时,其从框架区分离。
2.根据权利要求1所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂通过抗体的三维结构与框架区结合。
3.根据权利要求1所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂包含能够与至少一个框架区结合的部分和能够与至少一个互补决定区(CDR)结合的部分。
4.一种转换结合剂,其包含选自构成抗体的抗原结合部分的重链框架区的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列含有与轻链框架区可逆结合的第一抗体结合部分,所述轻链框架区与重链一起构成抗原结合部分。
5.一种转换结合剂,其包含选自构成抗体的抗原结合部分的轻链框架区的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列含有与重链框架区可逆结合的第二抗体结合部分,所述重链框架区与轻链一起构成抗原结合部分。
6.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述氨基酸序列还与和所述重链或轻链的框架区相邻的互补性决定区可逆地结合。
7.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。
8.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂的一部分氨基酸被无机材料取代。
9.根据权利要求4所述的转换结合剂,其中所述第一抗体结合部分包含-Y-、-I-、-W-和-Q-的至少一个氨基酸残基。
10.根据权利要求5所述的转换结合剂,其中所述第二抗体结合部分包含-Y-、-Q-、-P-、-L-和-F-的至少一个氨基酸残基。
11.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂包含以下氨基酸序列中的任一种:
SEQ ID NO.1:S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E,
SEQ ID NO.2:V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K,
SEQ ID NO.3:T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K,和
SEQ ID NO.4:V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K。
12.根据权利要求4所述的转换结合剂,其中所述第一抗体结合部分包含通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种与所述轻链框架区结合的氨基酸残基。
13.根据权利要求5所述的转换结合剂,其中所述第二抗体结合部分包含通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种与所述重链框架区结合的氨基酸残基。
14.根据权利要求12所述的转换结合剂,其中抗体结合位点的结合强度通过所述第一抗体结合部分的氨基酸调控来调节。
15.根据权利要求13所述的转换结合剂,其中抗体结合位点的结合强度通过所述第二抗体结合部分的氨基酸调控来调节。
16.根据权利要求12或13所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂与所述框架区之间的侧链官能团的结合或肽键的极性位点是通过氢键实现的。
17.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中当所述转换结合剂与所述抗体的抗原结合位点结合时,所述转换结合剂通过将与所述抗体特异性反应的目标抗原与所述抗体结合而与所述抗体分离。
19.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂用天然或人工标记材料标记。
20.根据权利要求4或5所述的转换结合剂,其中所述转换结合剂与人抗体、非人抗体、人源化非人抗体或其组合结合,并且所述抗体能够在所述转换结合剂与所述抗体结合的状态下与所述目标抗原结合。
21.一种转换结合剂,其包含:与抗体的至少一些框架区(FR)可逆地且特异性地结合的第一抗体结合部分或第二抗体结合部分;和
结合强度调节部分,用于调节第一抗体结合部分或第二抗体结合部分与构架区的结合强度,使得当与抗体特异性反应的目标抗原与抗体结合时,抗体结合部分与构架区分离。
22.根据权利要求21所述的转换结合剂,其中所述结合强度调节部分调控所述第一抗体结合部分或所述第二抗体结合部分在所述转换结合剂中的位置,或者所述转换结合剂的三维形状,以调节所述抗体结合部分与所述抗体的结合强度。
23.根据权利要求21所述的转换结合剂,其中所述结合强度调节部分包含选自以下项的至少一种氨基酸序列:-S-Y-W-I-H-W-V-K-、-R-P-G-Q-G-L-E-、-I-G-E-、-V-Y-、-C-A-R-E-P-T-G-T-G-、-Y-F-D-V-、-G-K-、-T-Y-L-E-W-Y-、-K-P-G-Q-S-、-K-、L-I-Y-K-、-C-F-Q-G-S-H-V-P-和-T-K-。
24.根据权利要求21所述的转换结合剂,其包含作为单元结构的所述第一抗体结合部分或所述第二抗体结合部分和所述结合强度调节部分,使得所述抗体结合部分和所述结合强度调节部分交替地连续彼此连接。
25.一种用于疾病筛查、诊断、预防或治疗整合的药物组合物,其包含权利要求4或5所述的转换结合剂。
26.根据权利要求25所述的药物组合物,其中所述转换结合剂选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。
27.根据权利要求25所述的药物组合物,其中所述转换结合剂包含以下氨基酸序列中的任一种:
SEQ ID NO.1:S-Y-W-I-H-W-V-K-Q-R-P-G-Q-G-L-E-W-I-G-E,
SEQ ID NO.2:V-Y-Y-C-A-R-E-P-T-G-T-G-I-Y-F-D-V-W-G-K,
SEQ ID NO.3:T-Y-L-E-W-Y-P-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-Y-K,和
SEQ ID NO.4:V-Y-Y-C-F-Q-G-S-H-V-P-F-T-K。
28.一种测试试剂盒,其包含权利要求4或5的转换结合剂,
其中所述转换结合剂用天然或人工标记材料标记,并且所述转换结合剂通过测量与框架区结合和从框架区分离的转换结合剂的量来测量抗原与抗体的结合强度。
29.根据权利要求28所述的测试试剂盒,其中所述转换结合剂选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。
30.根据权利要求28所述的测试试剂盒,其中通过计算抗体的抗原结合系数(Kd)来测量结合强度。
31.根据权利要求29所述的测试试剂盒,其中所述抗原结合系数(Kd)介于0.7×10-6M至3.4×10-6M的范围内。
32.根据权利要求29所述的测试试剂盒,其中所述测试试剂盒测量当抗体与未固定有抗体的溶液中的抗原结合时的抗原结合系数(Kd)。
33.一种测试试剂盒,其包含权利要求4或5所述的转换结合剂,
其中所述转换结合剂用天然或人工标记材料标记,并且所述转换结合剂通过测量与框架区结合和从框架区分离的转换结合剂的量来识别和定量抗体和目标抗原。
34.根据权利要求33所述的测试试剂盒,其中所述测试试剂盒是用于免疫测定的试剂盒,
其中用于免疫测定的试剂盒包括luminex测定法、蛋白质微阵列测定法、ELISA测定法、免疫-PCR测定法、捕获-ELISA测定法、ELISPOT测定法、放射免疫测定法(RIA)、侧向流动免疫测定法(LFIA)、流通免疫测定法(FTIA)、蛋白质微流体免疫测定法、蛋白质毛细管电泳(CE)测定法、电化学生物传感器、放射免疫沉淀测定法、免疫沉淀测定法、免疫组织化学染色测定法、Ouchterlony免疫扩散测定法、抑制或竞争测定法、夹心测定法、流式细胞仪、免疫电泳测定法、组织免疫染色测定法、补体结合测定法、FACS测定法、蛋白质芯片测定法、免疫荧光染色测定法和免疫亲和纯化测定试剂盒。
35.一种使用转换结合剂的测定方法,包括以下步骤:
从构成抗体的抗原结合位点的框架区中选择转换结合剂的氨基酸序列;
通过向特异性结合目标抗原的抗体提供转换结合剂,预处理以与抗体框架区的至少一部分可逆结合;
提供需要确定预处理步骤的结果中是否包含目标抗原的分析物;和
通过定量与框架区结合的转换结合剂或从框架区分离的转换结合剂的残留量中的至少一种,分析以识别或定量分析物中的目标抗原。
36.根据权利要求35所述的测定方法,其中所述转换结合剂选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。
37.根据权利要求35所述的测定方法,其中将所述抗体固定在支持物上,所述支持物选自基质、珠子、纤维、聚合物结构或其组合。
38.根据权利要求35所述的测定方法,其中所述抗体不是固定的,而是溶解在溶液中。
39.根据权利要求35所述的测定方法,其中所述预处理步骤包括:
向所述抗体提供所述转换结合剂,以获得含有所述抗体和所述转换结合剂的第一缀合物以及未与所述抗体结合的转换结合剂的混合溶液,以及
从所述混合溶液中去除未与所述抗体结合的转换结合剂。
40.根据权利要求35所述的测定方法,其中所述转换结合剂用天然或人工标记材料标记,并且在分析步骤中,通过测量所述标记反应来进行所述目标抗原的分析。
41.根据权利要求35所述的测定方法,还包括以下步骤:
分离与抗体分离的转换结合剂,以及抗体和目标抗原的第二缀合物;和
识别或量化分离的转换结合剂。
42.一种用于制备转换结合剂的方法,所述转换结合剂可逆地且特异性地与抗体的框架区(FR)结合,并且当与抗体特异性反应的目标抗原被结合时,所述转换结合剂从框架区分离,所述方法包括以下步骤:
识别其中抗体的重链和轻链的框架区彼此自结合的氨基酸序列;
获得氨基酸序列的疏水性指数;和
比较疏水性指数,从而选择包含在构成重链和轻链的抗原结合位点的框架区的氨基酸序列之间具有相同特性的部分的氨基酸序列的转换结合剂。
43.根据权利要求35所述的方法,其中所述氨基酸序列包含与框架区相邻的互补性决定区。
44.根据权利要求35所述的方法,其中所述转换结合剂选自由肽、蛋白质、适体、纳米抗体、噬菌体展示、酵母展示和抗体组成的组。
45.根据权利要求35所述的方法,其中所述氨基酸序列通过选自静电相互作用、氢键、范德华力、疏水相互作用及其组合中的至少一种结合。
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