CN112067819B - 一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法 - Google Patents

一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫学检测领域。具体而言，本发明提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。该方法能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。

Description

一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测。具体而言，本发明提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。
背景技术
抗体药物是目前疾病治疗的重要产品，2018年全球药品销售额Top10中，抗体药物有8个，包括单抗药物6个，融合蛋白2个。抗体药物的研发方法目前有融合瘤、噬菌体展示和单B细胞测序三种，其中融合瘤是主流，目前已上市的单抗药物95％以上是通过融合瘤方法研究发现的。而通过融合瘤方法产生的上清抗体库小至数千，大至数万，需要合适的抗体筛选方法找出特异性结合目标抗原的抗体。经典的抗体筛选方法是通过酶联免疫吸附(ELISA)找到蛋白水平结合抗原的抗体，然后再通过流式细胞检测(FCM)进一步验证候选抗体在细胞水平的结合。ELISA中所使用的是抗原的蛋白形式，对于膜蛋白来说，重组表达的蛋白结构和其在细胞膜上的天然结构不可避免的存在差异，这就造成ELISA筛选对于后续FCM筛选的假阳性(ELISA水平结合但FCM水平不结合)/假阴性(FCM水平结合但因ELISA水平不结合没有被筛选出来)。为了避免ELISA筛选的假阳性/假阴性，以Mirrorball为代表的基于荧光微量分析的细胞水平结合筛选应运而生。然而无论是传统的ELISA，还是基于荧光微量分析均受到钩状效应(Hook效应)影响，给融合瘤上清的筛选带来极大问题。
钩状效应即Hook效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。以沉淀反应为例，若向一排试管中加入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线(图1)。曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内，抗原抗体充分结合，形成的沉淀物最多。在等价带前后分别为抗体、抗原过剩则影响沉淀物的形成，这种现象称为带现象。带现象在临床检验中经常出现，特别是ELISA反应中。出现在抗体过量时，称为前带，出现在抗原过剩时，称为后带。临床检测中尤其以前带效应明显，通常所采取的解决方式是进一步稀释样本。
以Mirrorball为代表的基于荧光微量分析的细胞水平结合检测中也出现了Hook效应。细胞和抗体均相混合的情况下，抗体和细胞结合的量与两者的浓度相关。以Mirrorball和类似的ABI 8200FMAT检测平台为例，其检测抗EGFT抗体和A431细胞结合的抗体浓度依赖的荧光强度曲线如图2所示，在一定量的细胞体系中加入不同量的抗体，当抗体浓度超过0.1μg/mL，信号值会发生一个较强的荧光减少。使用荧光微量分析对融合瘤上清的抗体进行筛选的时候，表达量高亲和力强的阳性克隆会因为“钩状效应”发生信号降低而被错过。解决方法也是进一步稀释上清，但这样做会大大增加工作量。
因此，本领域需要开发用于筛选抗体特别是结合膜蛋白抗体的改进方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了筛选针对膜蛋白抗体的改进方法，该方法能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。
筛选方法
在一个方面，本发明提供了用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：
(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；
(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；
(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；
(4)检测所述固相载体表面的可检测标记。
在某些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记。
在某些实施方案中，步骤(4)包括以下步骤：测定所述固相载体表面的带有可检测标记(例如荧光标记)的细胞的数量，以及测定所述固相载体表面的细胞总数，从而获得带有可检测标记(例如荧光标记)的细胞在所有细胞中所占的比例。在某些实施方案中，步骤(4)包括以下步骤：测定一个视场内所述固相载体表面的带有可检测标记(例如荧光标记)的细胞的数量，以及测定同一视场内所述固相载体表面的细胞总数，从而获得带有可检测标记(例如荧光标记)的细胞在所有细胞中所占的比例。
在某些实施方案中，步骤(4)包括以下步骤：获得所述固相载体表面的荧光图像从而获得所述荧光图像的细胞计数，并且获得所述固相载体表面的明场图像从而获得所述明场图像的细胞计数，从而获得荧光标记的细胞在所有细胞中所占的比例。
在某些实施方案中，所述方法还包括：(5)将获得的比例与参考值进行比较，或基于所述比例产生剂量-反应曲线(dose-response curve)并由此获得待测抗体的EC50，并将该EC50与参考值进行比较，从而确定待测抗体对目标膜蛋白的结合活性。
在某些实施方案中，所述参考值是对阳性对照样品实施上述步骤(1)-(4)之后所获得的比例或基于该比例获得的EC50。在某些实施方案中，所述阳性对照样品是已知能够特异性结合所述目标膜蛋白的抗体。在某些实施方案中，如果所述比例不低于参考值，则判断被检测抗体具有特异性结合所述目标膜蛋白的活性。
在某些实施方案中，所述待测抗体的EC50通过下述方法获得：利用包含不同量的待测抗体的系列待测样品重复步骤(1)-(4)，从而产生剂量-反应曲线并由此测定该抗体的EC50。
在某些实施方案中，所述固相载体是微量培养板，例如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板。在某些实施方案中，所述固相载体是96孔板。
在某些实施方案中，使用细胞成像微孔板检测仪实施步骤(4)。在某些实施方案中，所述细胞成像微孔板检测仪选自CQ1激光共聚焦成像细胞定量分析系统、BioTekCytation 5细胞成像微孔板检测系统、SpectraMax MiniMax300细胞成像系统、CeligoImage Cytometer全视野细胞扫描分析仪。
在某些实施方案中，所述固相载体表面的细胞密度(细胞汇合度)为20％-80％，例如30％-80％，40％-80％，50％-80％，60％-80％，或70％-80％。
在某些实施方案中，步骤(1)包括以下步骤：(1a)提供表达所述目标膜蛋白的细胞；(1b)将所述细胞固定于固相载体表面。
在本发明中，表达所述目标膜蛋白的细胞可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，将编码所述目标膜蛋白的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，从而获得表达所述目标膜蛋白的细胞。
在某些实施方案中，所述表达所述目标膜蛋白的细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如MDA-MB-231、HEK293、Hela、CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)等。
在某些实施方案中，所述表达所述目标膜蛋白的细胞是贴壁细胞或悬浮细胞。
在某些实施方案中，固定于所述固相载体表面的表达所述目标膜蛋白的细胞表达基本相同水平的目标膜蛋白。
在一些实施方案中，所述步骤(1b)包括：将细胞接种至固相载体，并使所述细胞沉降至固相载体表面；使用细胞固定剂对沉降至固相载体表面的细胞进行固定。
在某些实施方案中，所述细胞的接种密度为1.5×104/cm2至5×104cm2。
在某些实施方案中，通过离心将所述细胞沉降至固相载体表面。
在本文中，“细胞固定剂”意指通常用于对细胞进行固定(fixation)的溶液。细胞固定剂的实例包括基于乙醇、甲醇、甲醛、冰醋酸的固定剂，如4％多聚甲醛溶液、10％甲醛溶液、甲醛/NaCl溶液、甲醛/乙酸溶液、醇/甲醛/乙酸固定剂等等。
在某些实施方案中，所述固定剂选自95％酒精、4％多聚甲醛、冰醋酸、甲醇、乙醚酒精、及其任意组合。在某些实施方案中，术语“冰乙酸/冰醋酸”表示具有至少99.5w％(例如99.8w％)的纯度的乙酸。
在某些实施方案中，在步骤(1b)之后，还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。
在另一些实施方案中，所述步骤(1b)包括：将所述细胞接种至固体载体，在细胞培养基中，在促进细胞黏附于固体载体表面的条件下进行孵育。
在某些实施方案中，所述细胞的接种密度为1.5×104/cm2至5×104cm2。
在某些实施方案中，所述固相载体表面包含粘附基质，例如明胶或多聚鸟苷酸。
在某些实施方案中，所述细胞培养基中包含粘附基质，例如明胶或多聚鸟苷酸。
在某些实施方案中，所述细胞是悬浮细胞。在某些实施方案中，所述步骤(1b)包括：将所述细胞接种至表面包含粘附基质的固体载体，并在细胞培养基中进行孵育。在某些实施方案中，所述步骤(1b)包括：将所述细胞接种至固体载体，并在包含粘附基质的细胞培养基中进行孵育。
在某些实施方案中，在步骤(1b)之后，还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。
在某些实施方案中，所述待测样品是细胞培养上清。
在某些实施方案中，所述待测样品是融合瘤细胞培养上清或融合瘤亚克隆培养上清。
优选地，所述待测样品是产生重组抗体的宿主细胞(例如CHO细胞)培养上清。
在某些实施方案中，所述细胞培养上清未经稀释。在本文中，表述“细胞培养上清未经稀释”是指，所述细胞培养上清从细胞培养体系分离获得后未经过任何稀释处理。
在某些实施方案中，所述待测样品包含不低于0.001μg/mL(例如不低于0.1μg/mL)的待测抗体。
在某些实施方案中，所述待测样品包含不高于30μg/mL的待测抗体。在某些实施方案中，所述待测样品包含不高于10μg/mL的待测抗体。
在某些实施方案中，所述待测样品包含0.001μg/mL至30μg/mL的待测抗体。在某些实施方案中，所述待测样品包含0.001μg/mL至10μg/mL的待测抗体。
在某些实施方案中，所述待测样品包含0.1μg/mL至30μg/mL的待测抗体。在某些实施方案中，所述待测样品包含0.1μg/mL至10μg/mL的待测抗体。
在某些实施方案中，所述二级抗体对待测抗体所来自的物种(例如小鼠)的抗体是特异的。
在某些实施方案中，所述二级抗体选自抗免疫球蛋白抗体，例如抗IgG抗体、抗IgM抗体或抗IgA抗体。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白来自免疫动物，例如小鼠。
在某些实施方案中，在步骤(3)之前，还包括测定待测抗体的抗体亚型，以及根据所测定的抗体亚型，选择相应的二级抗体。在某些实施方案中，所述测定可以通过商业化试剂盒完成。
在某些实施方案中，在步骤(2)和/或(3)之后，所述方法还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。在某些实施方案中，在所述弃去液体步骤之后包含或不包含洗涤所述固相载体表面的步骤。
在某些实施方案中，在步骤(3)之后的弃去液体步骤之后，所述方法还包括向所述固相载体中加入缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液选自PBS、Hanks BSS、Earles盐、DPBS、HBSS、EBSS及其任意组合。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用KD值描述。KD值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(M)的kd/ka。KD值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。KD值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的，术语“可检测标记”可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，
Figure BDA0002350170220000081
)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞优选是哺乳动物细胞。
有益效果
本发明提供了筛选针对膜蛋白抗体的改进方法，该方法在保证检测准确率的同时，能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，极大地简化了操作步骤，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了抗原抗体免疫沉淀检测法中钩状效应的示意图。
图2显示了Mirrorball及ABI 8200FMAT检测平台检测抗EGFT抗体与A431细胞结合的抗体浓度依赖曲线。结果显示，抗体浓度超过0.1μg/mL时，信号值会发生一个较强的荧光减少，产生钩状效应。
图3显示了实施例1中阳性孔C3和阴性孔B1的成像结果。
图4显示了实施例1中检测版上的各融合瘤上清的荧光细胞比例，其中，H11为阴性对照孔，H12为阳性对照孔。
图5显示了实施例2中检测板上的荧光场成像。
图6显示了实施例2中检测板上的各融合瘤上清的荧光细胞比例，其中，G11为阳性对照孔，H11为阴性对照孔。
图7显示了实施例3-1中本发明方法检测抗PD-L1抗体的抗体浓度依赖曲线。结果显示，当抗体浓度达到10μg/mL的时候，本发明的方法的检测值依然不会发生降低，未产生钩状效应。
图8显示了实施例3-2中本发明方法检测抗CD20抗体的抗体浓度依赖曲线。结果显示，当抗体浓度达到30μg/mL的时候，本发明的方法的检测值依然不会发生降低，未产生钩状效应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：基于贴壁细胞的抗PD-L1单克隆抗体的筛选
1、表达人源PD-L1的细胞HEK293-PD-L1(in-house构建；使用吉凯基因制备的构建了人源PD-L1(Q9NZQ7)的慢病毒侵染ATCC来源的HEK293细胞，病毒转染48小时后加入抗性试剂杀死未表达蛋白细胞，之后再经过2周左右抗性筛选得到所要的抗原高表达细胞)，消化后DPBS清洗两遍计数，以每孔8000个细胞的细胞量将该细胞固定在平底96孔板底(96-Well CorningTM 3596Plate)，培养过夜使其贴壁。
2、取50μL抗PD-L1的小鼠融合瘤上清加入板孔中，相应阴性对照孔加入空白融合瘤培养基，阳性对照孔加入50μL浓度为0.5μg/mL的已知特异性结合该抗原的阳性对照抗体(Abcam,ab238697)，室温孵育45-60分钟。
3、孵育结束后拍板去掉上清，拍板强度以无肉眼可见液体残留为准。每孔加入50μL
Figure BDA0002350170220000111
488标记抗小鼠IgG(Abcam ab97003,Goat Anti-Human IgG Fc)作为第二抗体，第二抗体稀释于无血清培养基中，孵育浓度为2μg/mL，室温孵育30分钟。
4、二抗孵育完成后拍板去掉上清，拍板强度以无肉眼可见液体残留为准，每孔加入100μL DPBS，然后在Celigo Image Cytometer细胞成像微孔板检测仪上进行成像读数。成像时同时设置明场和荧光两个通道，对每孔中的细胞进行明场成像和荧光成像。条件设置：96％读取孔面积；1μm像素；荧光场，200增强,150000μms曝光；明场，0增强，3200μms曝光。
图3显示了阳性孔C3和阴性孔B1的成像结果。从图上可见，C3阳性孔中对于明场的细胞位置上有明显的荧光信号，而B1阴性孔里对应明场的细胞位置上没有荧光信号。
5、使用细胞成像微孔板检测仪对实验板读数进行分析。荧光通道得到的成像根据有荧光标记的细胞形态和荧光强度设定参数对抗体有结合的细胞进行计数，明场通道得到的成像根据细胞形态设定参数对贴壁细胞进行计数，然后两组数据相除得到和抗体有结合显示绿色荧光的细胞占贴壁细胞总数的百分比(％荧光细胞)，根据该比例判定融合瘤上清抗体与HEK293-PD-L1细胞的是否结合。明场细胞计数条件为：15强度基线，2精确度，10尺寸过滤，自动背景校正，自动细胞分离校正；荧光场细胞计数条件为：3强度基线，2精确度，10尺寸过滤自动背景校正，自动细胞分离校正。
图4显示了检测版上的各融合瘤上清的荧光细胞比例，其中，H11为阴性对照孔，H12为阳性对照孔。对于这个筛选，定义数值>20％为强阳性，2％<数值<20％为弱阳性，数值<2％为阴性。结果显示，A10，B3，C3，D5，D6，F7为强阳性孔，对应的融合瘤细胞被挑选出来，进入后续的亚克隆和亚克隆筛选。
实施例2：基于悬浮细胞的抗CD20单克隆抗体的筛选
1、构建的表达抗原CD20的CHO-CD20细胞(in-house构建；使用吉凯基因制备的构建了人源CD20(P11836)的慢病毒侵染Thermo Fisher来源的CHO细胞，病毒转染48小时后加入抗性试剂杀死未表达蛋白细胞，之后再经过2周左右抗性筛选得到所要的抗原高表达细胞)，DPBS清洗两遍计数，以每孔15000个细胞的细胞量将该细胞接种至平底96孔板(96-Well CorningTM3596Plate)，1000rpm离心5分钟后，使用4％多聚甲醛溶液室温孵育15分钟进行固定。
2、取50μL抗CD20的小鼠融合瘤上清加入板孔中，相应阴性对照孔加入空白融合瘤培养基，阳性对照孔加入50μL浓度为0.5μg/mL的阳性对照抗体(Abcam,ab78237)，室温孵育45-60分钟。
3、孵育结束后拍板去掉上清，拍板强度以无肉眼可见液体残留为准。每孔加入50μL
Figure BDA0002350170220000121
488标记抗小鼠IgG(Abcam ab97003,Goat Anti-Human IgG Fc)作为第二抗体，第二抗体稀释于无血清培养基中，孵育浓度为3μg/mL，室温孵育30分钟。
4、二抗孵育完成后拍板去掉上清，拍板强度以无肉眼可见液体残留为准，每孔加入100μL DPBS，然后在Celigo Image Cytometer细胞成像微孔板检测仪上进行成像读数。成像时同时设置明场和荧光两个通道，对每孔中的细胞进行明场成像和荧光成像。条件设置：96％读取孔面积；1μm像素；荧光场，200增强,150000μms曝光；明场，0增强，3200μms曝光。
图5显示了一块检测板上的荧光场成像。从图上可见，阳性孔如A1，C5，D7，G11等有明显的肉眼可见的荧光信号，而如A7，B2，C4，F1等阴性孔没有可观察到的荧光信号。
5、使用细胞成像微孔板检测仪对实验板读数进行分析。荧光通道得到的成像根据有荧光标记的细胞形态和荧光强度设定参数对抗体有结合的细胞进行计数，明场通道得到的成像根据细胞形态设定参数对贴壁细胞进行计数，然后两组数据相除得到和抗体有结合显示绿色荧光的细胞占贴壁细胞总数的百分比(％荧光细胞)，根据该比例判定融合瘤上清抗体与CHO-CD20细胞细胞的是否结合。明场细胞计数条件为：15强度基线，2精确度，10尺寸过滤，自动背景校正，自动细胞分离校正；荧光场细胞计数条件为：7强度基线，2精确度，10尺寸过滤自动背景校正，自动细胞分离校正。
图6显示了检测板上的各融合瘤上清的荧光细胞比例，其中，G11为阳性对照孔，H11为阴性对照孔。对于这个筛选，我们定义数值>30％为强阳性，2％<数值<30％为弱阳性，数值<2％为阴性。将读数值>30％的强阳性孔对应的融合瘤细胞被挑选出来，进入后续的亚克隆和亚克隆筛选。
实施例3：Hook效应评价
3-1.根据实施例1所述的方法，对起始浓度10μg/mL,3倍稀释，共11个浓度点的抗PD-L1抗体(该抗体由实施例1筛选所得。对实施例1中筛选获得的融合瘤细胞测序后得到重轻链可变区序列，随后进行抗体重组表达，本实施例所用为其鼠源IgG1抗体)进行检测，并以小鼠IgG1同型对照抗体作为对照，以通过细胞成像微孔板检测仪获得荧光细胞百分比为纵坐标，以抗体浓度为横坐标，绘制剂量-反应曲线。结果如图7所示，当抗体浓度达到10μg/mL的时候，本发明的方法的检测值依然不会发生降低。该结果表明，本发明的方法在高达10μg/mL的检测浓度时依然不会产生Hook效应。
3-2.根据实施例2所述的方法，对起始浓度30μg/mL,4倍稀释，共8个浓度点的抗CD20阳性抗体-01/02/03(该三株抗体由实施例2筛选所得。分别对实施例2中筛选获得的融合瘤细胞测序后得到重轻链可变区序列，分别进行嵌合抗体重组表达，本实施例所用为其人源IgG1嵌合抗体)进行检测，并以人源IgG1同型对照抗体作为对照，以通过细胞成像微孔板检测仪获得荧光细胞百分比为纵坐标，以抗体浓度为横坐标，绘制剂量-反应曲线。结果如图8所示，当抗体浓度达到30μg/mL的时候，本发明的方法的检测值依然不会发生降低。该结果表明，本发明的方法在高达30μg/mL的检测浓度时依然不会产生Hook效应。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (38)

1.用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：
(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；
(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；所述待测样品是细胞培养上清；
(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；
(4)检测所述固相载体表面的可检测标记，其包括以下步骤：测定所述固相载体表面的带有可检测标记的细胞的数量，以及测定所述固相载体表面的细胞总数，从而获得带有可检测标记的细胞在所有细胞中所占的比例；其中，所述可检测标记是荧光标记；
(5)基于所述比例产生剂量-反应曲线并由此获得待测抗体的EC50，并将该EC50与参考值进行比较，从而确定待测抗体对目标膜蛋白的结合活性。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)包括以下步骤：获得所述固相载体表面的荧光图像从而获得所述荧光图像的细胞计数，并且获得所述固相载体表面的明场图像从而获得所述明场图像的细胞计数，从而获得荧光标记的细胞在所有细胞中所占的比例。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述参考值是基于对阳性对照样品实施上述步骤(1)-(4)之后所获得的比例获得的EC50。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述阳性对照样品是已知能够特异性结合所述目标膜蛋白的抗体。
5.权利要求1所述的方法，其中，所述待测抗体的EC50通过下述方法获得：利用包含不同量的待测抗体的系列待测样品重复步骤(1)-(4)，从而产生剂量-反应曲线并由此测定该抗体的EC50。
6.权利要求1所述的方法，其中，所述固相载体是微量培养板。
7.权利要求1所述的方法，其中，所述固相载体是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板。
8.权利要求1所述的方法，其中，使用细胞成像微孔板检测仪实施步骤(4)。
9.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：(1a)提供表达所述目标膜蛋白的细胞；(1b)将所述细胞固定于固相载体表面。
10.权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1b)包括：将细胞接种至固相载体，并使所述细胞沉降至固相载体表面；使用细胞固定剂对沉降至固相载体表面的细胞进行固定。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述细胞的接种密度为1.5×104/cm2至5×104/cm2。
12.权利要求10所述的方法，其中，通过离心将所述细胞沉降至固相载体表面。
13.权利要求10所述的方法，其中，所述固定剂选自95％酒精、4％多聚甲醛、冰醋酸、甲醇、乙醚酒精、或其任意组合。
14.权利要求10所述的方法，其中，在步骤(1b)之后，还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。
15.权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1b)包括：将所述细胞接种至固相载体，在细胞培养基中，在促进细胞黏附于固相载体表面的条件下进行孵育。
16.权利要求15所述的方法，其中，所述细胞的接种密度为1.5×104/cm2至5×104cm2。
17.权利要求15所述的方法，其中，所述固相载体表面包含粘附基质。
18.权利要求17所述的方法，其中，所述粘附基质是明胶或多聚鸟苷酸。
19.权利要求15所述的方法，其中，所述细胞培养基中包含粘附基质。
20.权利要求19所述的方法，其中，所述粘附基质是明胶或多聚鸟苷酸。
21.权利要求15所述的方法，其中，在步骤(1b)之后，还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。
22.权利要求1所述的方法，其中，所述表达所述目标膜蛋白的细胞是贴壁细胞或悬浮细胞。
23.权利要求1所述的方法，其中，所述细胞选自MDA-MB-231、HEK293、Hela、CHO。
24.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品是融合瘤细胞培养上清或融合瘤亚克隆培养上清。
25.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品是产生重组抗体的宿主细胞培养上清。
26.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品包含不低于0.001μg/mL的待测抗体。
27.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品包含不低于0.1μg/mL的待测抗体。
28.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品包含不高于30μg/mL的待测抗体。
29.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品包含0.001μg/mL至30μg/mL的待测抗体。
30.权利要求1所述的方法，其中，所述待测样品包含0.1μg/mL至30μg/mL的待测抗体。
31.权利要求1所述的方法，其中，所述二级抗体对待测抗体所来自的物种的抗体是特异的。
32.权利要求31所述的方法，其中，所述二级抗体选自抗免疫球蛋白抗体。
33.权利要求32所述的方法，其中，所述二级抗体选自抗IgG抗体、抗IgM抗体或抗IgA抗体。
34.权利要求32所述的方法，其中，所述免疫球蛋白来自免疫动物。
35.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)和/或(3)之后，所述方法还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。
36.权利要求35所述的方法，其中，在所述弃去液体步骤之后包含或不包含洗涤所述固相载体表面的步骤。
37.权利要求35或36所述的方法，其中，在步骤(3)之后的弃去液体步骤之后，所述方法还包括向所述固相载体中加入缓冲液。
38.权利要求37所述的方法，其中，所述缓冲液选自PBS、Hanks BSS、Earles盐、DPBS、HBSS、EBSS或其任意组合。
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