CN111171154B - 一种抗生物素抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗生物素抗体，并提供了编码所述抗体CDR的氨基酸序列。研究表明该抗体只与生物素标记物或衍生物反应，不与游离的生物素反应。本发明还提供了所述抗体的应用，包括但不限于：ELISA检测、细胞捕获、分选和富集、免疫印迹检测、流式检测、免疫细胞荧光染色、免疫组织化学检测。本发明所述抗生物素抗体结合磁珠获得的免疫磁珠微球可特异性地直接识别生物素标记物，且不与游离生物素结合，而游离生物素常存在于临床样本和培养基中；此外为抗生物素抗体偶联的磁珠微球或抗生物素抗体‑荧光素为特异性细胞的分离提供了一种理想的解决方案，甚至可以从富含碎屑的样品或其他低频生物原料中富集和分离目的细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物科技领域；更具体地本发明涉及了一种抗生物素抗体及其应用。
背景技术
生物素(Biotin)是水溶性维生素B群成员之一，又称维生素H、D-生物素、维生素B7、辅酶R(Coenzyme R)等，分子量为244.31。生物素为无色长针状结晶，具有尿素与噻吩相结合的骈环，并带有戊酸侧链；极微溶于水(22mg/100ml水，25℃)和乙醇(80mg/100ml，25℃)，较易溶于热水和稀碱液，不溶于其它常见的有机溶剂。遇强碱或氧化剂则分解。
在生物科学等科研领域，生物素常被用来作为标记物提供反应位点，用于固化或显色等用途。为了便于标记通常会用化学方法制成衍生物，如生物素-羟基琥珀亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)等，可方便地与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物，并可与亲和素结合而被检测。生物素－亲和素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。近年大量研究证实，生物素—亲和素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，可极大地提高检测、分析的灵敏度，使BAS很快被广泛应用于生物、诊断、医学等领域。虽然生物素-亲和素检测体系有上述优势，但是生物素和亲和素的结合是非特异地，亲和素可识别所有来源和形态的生物素，包括生物素衍生物及游离的生物素小分子。因此在实际应用中需要将衍生物、标记物进行纯化，否则会产生严重的非特异性信号，从而影响检测的灵敏度和准确性。
抗体是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。抗体的可变区基因分别由4个相对恒定的框架区(FR)和3个高度可变的抗原互补决定簇(CDR)构成，其中CDR区是抗体的特异性结合位点。不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于"Y"的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称可变区。可变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2-3个。可变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)。"Y"的柄部称结晶片段(crystalline fragment,Fc)，糖结合在Fc上。
抗体片段是抗体经蛋白酶水解所形成的片段。如木瓜蛋白酶水解IgG形成2个相同的Fab段和1个Fc段；胃蛋白酶水解IgG形成1个F(ab′)2段和若干多肽碎片(pFc′)。若F(ab′)2重链间二硫键断裂，可形成2个Fab片段，后者可进一步被酶解成Fv片段。其中抗原结合片段有全长的抗体(如IgG)、Fab、F(ab′)2、scFv等形式。
Kohen,F.等报道了抗生物素抗体的制备和特性(Methods Enzymol.279(1997)451-463)。Bagci,H.等(FEBS Lett.322(1993)47-50)报道了单克隆抗生物素抗体在识别生物素中的模拟亲和力。Cao,Y.等报道了发展双特异性单克隆抗体作为用于检测生物素化大分子的通用免疫探针(J.Immunol.Meth.220(1998)85-91)。Dakshinamurti等报道了抗生物素的单克隆抗体的产生和表征(Biochem.J.237(1986)477-482)。Vincent,P.等(J.Immunol.Meth.165(1993)177-182)报道了生物素和生物素化大分子配体与抗生物素单克隆抗体和链霉抗生物素蛋白的结合的比较。Berger,M.等(Biochem.14(1975)2338-2342)报道了结合生物素并抑制含有生物素的酶的抗体的产生。
目前市面上抗生物素抗体基本上为可竞争结合游离生物素小分子抗体，与生物素-亲和素系统相近。而不可竞争游离生物素小分子的抗生物素抗体则较少，竞争结合游离生物素的抗体可检测样本中的游离生物素，本发明的目的在于获得一种不与游离生物素反应、特异性识别标记物生物素的抗体，从而实现其在相关免疫学检测应用中不受游离生物素的干扰。
发明内容
本发明提供了一种抗生物素抗体或其抗体片段，并提供了编码所述抗体CDR区的氨基酸序列，该抗体只与生物素标记物或衍生物反应，不与游离的生物素反应。本发明还提供了所述抗体的应用，包括但不限于：ELISA检测、磁珠法B细胞克隆、免疫印迹检测、流式检测、免疫细胞荧光染色、免疫组织化学检测。
本发明提供如下技术方案：一种抗生物素抗体，所述抗体运用Kabat方法分析包含以下多肽序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：
(1)含有SEQ ID NO1：至少6个氨基酸序列的CDR-H1；序列为SSYWIC；
(2)含有SEQ ID NO2：至少18个氨基酸序列的CDR-H2；序列为CIDAGSSGSTYYARWVNG；
(3)含有SEQ ID NO3：至少14个氨基酸序列的CDR-H3；序列为EGDWGAPIYYGVDL；
(4)含有SEQ ID NO4：至少13个氨基酸序列的CDR-L1；序列为QSSQSVYNNNQLS；
(5)含有SEQ ID NO5：至少7个氨基酸序列的CDR-L2；序列为YASTLAS；
(6)含有SEQ ID NO6：至少12个氨基酸序列的CDR-L3；序列为LGGYYDYADTSA；
其中，所述的抗生物素抗体特异性结合非游离的生物素。
作为优选，所述抗体为兔源单克隆抗体。
本发明还提供了另一种技术方案：一种抗生物素抗体的应用，包括但不限于：ELISA检测、细胞捕获、分选和富集、免疫印迹检测、流式检测、免疫细胞荧光染色以及免疫组织化学检测。
本发明的优点和效果：
1、本发明所述抗生物素抗体结合磁珠获得的免疫磁珠微球可特异性地直接识别生物素标记物，且不与游离生物素结合，而游离生物素常存在于临床样本和培养基中。本实验所述抗生物素抗体偶联的磁珠微球具有不与游离生物素结合的优点，根据这一特征可提供最敏感的标记和细胞分离。抗生物素抗体偶联的磁珠微球或抗生物素抗体-荧光素为特异性细胞的分离提供了一种理想的解决方案，甚至可以从富含碎屑的样品或其他低频生物原料中富集和分离目的细胞。
2、本发明提供的抗生物素单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性。并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的相关免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。
3、本发明满足B细胞克隆应用之外，还可满足ELISA检测、免疫印迹检测、流式分选和检测、免疫细胞荧光染色、免疫组织化学检测、临床样本稀有细胞富集和检测等免疫学检测应用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：抗生物素抗体间接ELISA检测结果图片；
图2：抗生物素抗体间接竞争ELISA检测结果图片；
图3：抗生物素抗体偶联磁珠复合物间接ELISA检测结果图片；
图4：使用磁珠-抗生物素抗体偶联物进行细胞捕获、分选和富集后以NCI-H226阳性细胞裂解液与MCF-7阴性细胞裂解液获得的抗PD-L1单克隆抗体的Western blot检测结果图片；
图5：使用抗生物素抗体对免疫后兔PBMC的流式分选结果图片；
图6：抗生物素抗体Western blot检测结果图片；
图7：抗生物素抗体应用于流式细胞检测结果图；
图8：抗生物素抗体应用于免疫细胞化学检测结果图片；
图9：抗生物素抗体应用于免疫组织化学检测结果图片。
具体实施方式
实施例对本发明作进一步描述，但是本申请不限于这些实施例，这些实施例也不能解释为对本申请的限制。
实施例1：
在本技术方案中所涉及到的一种抗生物素抗体是兔源单克隆抗体，其中所述抗体运用Kabat方法分析包含以下多肽序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：
(1)含有SEQ ID NO1：至少6个氨基酸序列的CDR-H1；序列为SSYWIC。
(2)含有SEQ ID NO2：至少18个氨基酸序列的CDR-H2；序列为CIDAGSSGSTYYARWVNG。
(3)含有SEQ ID NO3：至少14个氨基酸序列的CDR-H3；序列为EGDWGAPIYYGVDL。
(4)含有SEQ ID NO4：至少13个氨基酸序列的CDR-L1；序列为QSSQSVYNNNQLS。
(5)含有SEQ ID NO5：至少7个氨基酸序列的CDR-L2；序列为YASTLAS。
(6)含有SEQ ID NO6：至少12个氨基酸序列的CDR-L3；序列为LGGYYDYADTSA。
其中，所述的抗生物素抗体特异性结合非游离的生物素。
以下实施例2-8为抗体的应用包括但不限于：ELISA检测、磁珠法B细胞克隆、免疫印迹检测、流式检测、免疫细胞荧光染色、免疫组织化学检测。
所述抗体可通过间接ELISA方法识别包被于酶标板上的蛋白与生物素偶联的生物素分子；所述抗体可通过间接竞争ELISA方法检测不识别生物素游离的小分子。
实施例2：直接识别生物素标记物
将生物素标记物biotin-X稀释至合适浓度，如1μg/mL，包被酶标板，用封膜封板，4℃过夜。
次日，将酶标板至于洗板机上，用PBST洗板3次后，每孔加入脱脂奶或BSA封闭液封闭酶标板，置于30℃，恒温摇床震荡封闭约1h。
将抗生物素抗体预稀释至合适浓度，如1μg/mL后，在稀释板板作纵向倍比梯度稀释，共8个梯度。待酶标板封闭结束后，洗板3次。每孔加入50μL稀释的抗生物素抗体，置于30℃、恒温摇床震荡孵育约1h。
洗板后，每孔加50μL HRP偶联的羊抗兔IgG二抗，置于30℃，恒温摇床震荡孵育约45min。
洗板后，每孔加50μLTMB底物显色液，置于30℃，恒温摇床震荡，避光显色约15min。
加50μL H2SO4终止液终止反应，约5～30min后于酶标仪上读取吸光值。
以浓度读数为横坐标，以OD值为纵坐标，作四参数拟合曲线(如图1)，确定所述抗体的EC50(即半数有效浓度)数值为2.52ng/mL。反应所述抗体针对biotin-X抗原的ELISA灵敏度为2.52ng/mL。
实施例3：不与游离生物素反应的生物素标记物特异性
将生物素标记物biotin-X稀释至合适浓度，如1μg/mL，包被酶标板，用封膜封板，4℃过夜。
次日，将酶标板至于洗板机上，用PBST洗板3次后，每孔加入脱脂奶或BSA封闭液封闭酶标板，置于30℃，恒温摇床震荡封闭约1h。
将抗生物素抗体预稀释至合适浓度待用。将生物素游离小分子预调整到合适起始浓度，随后在稀释板上作倍比稀释，共10个梯度。取50μL抗生物素抗体与50uL梯度稀释生物素游离小分子于另一洁净稀释板上混匀后，置于30℃、100rpm恒温摇床，孵育约30min。
洗酶标板后，每孔加入50μL步骤(3)中的混合物，置于30℃，恒温摇床震荡孵育约1h。
洗板后，每孔加50μL HRP偶联的羊抗兔IgG二抗，置于30℃，恒温摇床震荡孵育约45min。
洗板后，每孔加50μL TMB底物显色液，置于30℃，恒温摇床震荡避光显色约15min。
加50μL H2SO4终止液终止反应，约5～30min后于酶标仪上读取吸光值。
根据图2，在添加不同浓度的游离生物素小分子后吸光值基本无变化，可看出添加游离生物素后并不会影响所述抗体与生物素标记物biotin-X的结合，说明所述抗体只与标记的生物素结合，不与游离的生物素结合，特异性非常好。
实施例4：细胞捕获、分选和富集以及单克隆抗体制备
细胞捕获、分选包括但不限于磁珠法及流式法。
磁珠法细胞捕获、分选和富集以及单克隆抗体制备实施方案如下：
将所述抗生物素抗体交联至免疫磁珠上，得到生物素抗体-免疫磁珠，经ELISA检测后，结果见图3，偶联后的抗体活性较好。用0.45μm滤膜过滤后存于4℃保存备用。
将生物素以合适的形式交联至多肽或蛋白上，得到生物素-多肽/蛋白复合物(biotin-Y)，0.22μM滤膜过滤后存于-20℃保存待用。
取经抗原Y免疫的淋巴细胞，加入biotin-Y复合物，4～37℃孵育1-120min，或根据实际情况需要孵育更长时间。孵育结束后用DPBS或培养基洗细胞若干次，离心去除上清。
清洗完成的细胞用DPBS或培养基重悬，加入一定量的免疫磁珠置于4～37℃混匀约1～120min，或根据实际情况需要孵育更长时间。
孵育结束后将样品放置在磁力架上，在磁场的作用下磁珠-抗生物素抗体-生物素-细胞复合物富集在底部。吸弃上清液。移开磁力架，加入DPBS或培养基洗细胞若干次后，加入完全培养液重悬细胞。
细胞计数后调整至合适浓度接种至细胞培养板或培养皿，补充足够的培养基。
细胞继续培养若干天后取上清检测。
收集符合检测要求的B细胞克隆制备单克隆抗体。如根据此方法制备PD-L1单克隆抗体的WB检测结果见图4，使用PD-L1阳性细胞裂解液NCI-H226与阴性细胞裂解液进行制膜，其中2种裂解液蛋白上样量均为40μg/泳道。根据结果图PD-L1用NCI-H226阳性细胞株裂解液进行Western Blot检测后，分子量在40-60kD有明显的印迹条带，用MCF-7阴性细胞株裂解液进行Western Blot检测后，无明显印迹条带，表明使用抗生物素抗体进行磁珠法富集、分选制备的单克隆抗体具有极好的特异性。
游离生物素常存在于培养基中，本实验所述抗生物素抗体偶联的磁珠微球具有不与游离生物素结合的优点。这一特征提供了最敏感的标记和细胞分离。抗生物素抗体偶联的磁珠微球为特异性细胞的分离提供了一种理想的解决方案，甚至可以从富含碎屑的样品或其他低频生物原料中分离细胞。
流式法细胞捕获、分选和富集以及单克隆抗体制备实施方案如下：
将所述抗生物素抗体交联至荧光素上，得到生物素抗体-荧光素，用0.22μm滤膜过滤后存于4℃保存备用。
将生物素以合适的形式交联至多肽或蛋白上，得到生物素-多肽/蛋白复合物(biotin-Y)，0.22μM滤膜过滤后存于-20℃保存待用。
取经抗原Y免疫的淋巴细胞，加入biotin-Y复合物，4～37℃孵育1-120min，或根据实际情况需要孵育更长时间。孵育结束后用DPBS或培养基洗细胞若干次，离心去除上清。
清洗完成的细胞用DPBS或培养基重悬，加入一定量的生物素抗体-荧光素和/或其它抗体，比如anti-CD19抗体、anti-CD138抗体、anti-IgG抗体等置于4～37℃混匀约1～120min，或根据实际情况需要孵育更长时间。孵育结束后用DPBS或培养基洗细胞若干次，离心去除上清。加适量DPBS或培养基重悬待流式上机。
流式上机筛选以未加生物素抗体-荧光素的细胞作为阴性群设门，以此检测加生物素抗体-荧光素孵育过的细胞，再根据anti-CD19抗体、anti-CD138抗体、anti-IgG抗体阳性荧光信号圈定符合要求的的细胞群，收集至流式管中。
细胞计数后调整至合适浓度接种至细胞培养板或培养皿，补充足够的培养基。
细胞继续培养若干天后取上清检测。
收集符合检测要求的B细胞克隆制备单克隆抗体。如图5，使用所述抗生物素抗体进行流式分选，左图为对照组(未加抗生物素抗体-FITC)，右图为实验组(加抗生物素抗体-FITC)进行试验后，对照组有约0.18％的背景细胞，实验组有1.97％的特异性淋巴细胞可被分选出来制备单克隆抗体。通过所述抗生物素抗体采用流式分选的方法即可进行下一步单抗的制备，节省开发步骤。。
游离生物素常存在于培养基中，本实验所述抗生物素抗体偶联的荧光素样品具有不与游离生物素结合的优点。抗生物素抗体偶联的荧光素样品为特异性流式细胞的分离提供了一种理想的解决方案。
实施例5：免疫印迹检测
用生物素标记物biotin-X进行SDS-PAGE制胶，蛋白上样量为2ng/泳道。
将制得的胶转至PVDF膜上。
用甲醇活化PVDF膜后，用5％脱脂奶粉/PBS进行室温封闭1h左右。取游离小分子2μL 0.5mg/mL(的D-biotin小分子分别与1：2000、1：5000稀释的所述抗体(所述抗体原始浓度为0.500mg/mL)，在30℃孵育约40min。封闭完后，用TBST冲洗膜3次，再用TBST洗膜约10min。
加所述抗体：其中一个泳道加入75μL所述抗体与游离小分子D-biotin的复合物，另一泳道加入75μL所述抗体。室温摇床上孵育1h。孵育完后，用TBST洗膜2次，每次约10min。
每次加入1:4000稀释的羊抗兔IgG-HRP二抗，室温摇床上孵育1h。孵育完后，用TBST洗膜3次，每次约10min。
每张膜滴加1.5mL ECL底物显影液，室温条件下显影5min后置于凝胶成像仪上曝光，曝光时间60s。
通过凝胶成像仪拍摄的图片如图6，泳道1、2、3、4表明所述抗体可与结合的生物素反应，显示出有单一的45kD左右大小的免疫印迹条带，泳道2表明所述抗体与游离biotin无结合现象，只与PVDF膜上的X蛋白结合的生物素有反应，条带大小和位置与泳道1相比无明显变化。泳道4表明所述抗体与游离小分子biotin无结合现象，只与PVDF膜上的X蛋白结合的生物素有反应，条带大小和位置与泳道3相比无明显变化。
实施例6：流式细胞学检测
取人乳腺癌细胞(Hela)细胞，用PBS清洗细胞后，1500rpm。4℃离心5min后，调整细胞密度为3M/mL。
按照1M细胞加入100μL 4％多聚甲醛固定液，轻轻混匀。室温条件下固定细胞约10min。
加入PBS，1500rpm，离心5min后弃上清，离心管底细胞用1mLPBS重悬后，再加入10mLPBS清洗细胞后，1500rpm，离心5min。
按照1M细胞加入100μL 0.1％TritonX-100，轻轻混匀后室温条件下破膜约15min。
重复步骤(3)清洗细胞。
取3个洁净的1.5mL离心管，每管中加入100μL 3M/mL的Hela细胞，即每管含0.3M个Hela细胞。离心后弃上清，其中一管加入100μL PBS作为阴性对照，其中一管加入100μL 1:200偶联了生物素的抗细胞角蛋白8(Cytokeratin 8,CK8)兔单克隆抗体，另一管加入100μL5μg/mL兔同型IgG，室温条件下孵育约1h。
重复步骤(3)清洗细胞。
每管加入100μL 1:100稀释的FITC标记的所述抗生物素抗体，室温孵育40min后重复步骤(3)清洗细胞，每管加入200μL PBS上流式细胞仪检测各管细胞的荧光强度。
结果如图7，左侧未填满黑色的直方图表示加同型IgG-生物素偶联物与FITC标记抗生物素抗体偶联物的Hela细胞流式检测结果作为同型对照组；右侧填满黑色的直方图表示加抗细胞角蛋白8-生物素偶联物与FITC标记抗生物素抗体偶联物的Hela细胞流式检测结果为实验组，由图可得实验组比同型对照组峰形图向右偏移较多，即实验组有阳性流式检测结果。所述抗体可用于流式细胞检测实验。
实施例7：免疫荧光染色
取铺于12孔细胞培养板人乳腺癌细胞(Hela)细胞，细胞孔底密度为50％-60％，用PBS清洗细胞2次。
每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定液，室温静置固定细胞约30min。
倒掉固定液，每孔加入1mL 1％BSA/PBST，摇床上清洗细胞约5min后倒掉洗液。重复此步骤2次。
每孔加入1mL0.1％TritonX-100，室温静置破膜10min左右。重复步骤(3)清洗细胞。
每孔加入1mL10％山羊血清封闭细胞上非特异性抗原结合位点，室温孵育约30min后重复步骤(3)清洗细胞。
其中一孔加入1mL1％BSA/PBST作为阴性对照，其中一管加入1mL 1:200偶联了生物素的抗细胞角蛋白8兔单克隆抗体，另一管加入1mL 5μg/mL兔同型IgG抗体，室温条件下孵育约1h。
重复步骤(3)清洗细胞，每孔加入1mL 1:100稀释的FITC标记的所述抗生物素抗体，室温孵育约50min后重复步骤(3)清洗细胞。
在空白的载玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片剂(含DAPI)，用镊子小心的将细胞爬片从孔中夹出，然后将细胞爬片反向(长有细胞的一面)贴到封片剂上，室温静置，避光自然晾干。
打开荧光显微镜蓝光通道，先在20倍镜下进行视野观察，挑选细胞染色均匀，背景干净，细胞数量适中(有5-15个细胞的细胞团为最佳)的视野，在40倍镜下调焦拍照，照片保存格式为TIFF；在保持原有视野不变的前提下，调整激发光通道(绿光)，对靶标蛋白染色结果进行拍照。靶标蛋白曝光时间200ms。DAPI曝光时间一般为10ms，可以根据实际情况进行调整。拍照完成后在荧光显微镜拍照软件上将靶标蛋白图片和DAPI染色图片进行合并(Merge)；合并后图片格式保存为TIFF。
结果如图8，图中有4个小图，左上角图为抗细胞角蛋白8单抗稀释200倍，用绿色荧光通道拍摄图片，定位胞浆的细胞角蛋白8蛋白；右上角图为抗细胞角蛋白8单抗稀释200倍，用蓝色荧光通道拍摄图片，定位细胞核；左下角图为抗细胞角蛋白8单抗稀释200倍，同一显微镜视野下绿色荧光通道与蓝色荧光通道合并的图片(Merged)；右下角图为未加抗体，只加稀释液1％BSA/PBST的绿色荧光通道与蓝色荧光通道合并的图片(Merged)，此图为实验的阴性质控图片，从图中可知阴性质控图均无绿色荧光染色，故阴性质控结果正确。所述抗体可用于免疫荧光染色实验。
实施例8：免疫组织化学检
按照细胞角蛋白8靶点选择子宫内膜阳性组织切片进行免疫组化实验。
将子宫内膜阳性组织切片放入烤箱，温度设定为62℃，加热烤片约1h。
组织脱蜡水化后进行抗原修复。抗原修复条件为高温常压修复约15min，修复液为Tris-EDTA(pH9.0)，修复结束后自然冷却至室温。
使用3％过氧化氢水溶液封闭组织上内源性过氧化物酶，使用自来水冲洗切片后，将切片置于PBST内浸泡备用。
在切片上对应加入100μL1:50稀释的偶联了生物素的抗细胞角蛋白8兔单克隆抗体，室温条件下孵育约30min，孵育结束后清洗切片。
切片上滴加1:100稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的所述抗生物素抗体，室温孵育约30min，孵育结束后清洗切片。
每孔加入100μL DAB显色液，室温显色约2min，用自来水冲洗切片。
将切片放入苏木素染液中染核2min后用自来水进行充洗，随后将切片放入PBST中返蓝60s。
脱水透明后进行封片，置于通风柜中晾干，将切片置于显微镜下拍照。
结果如图9，图中细胞角蛋白8在子宫内膜的腺上皮有特异性的胞浆染色，染色结果定位正确，且无非特异性染色及背景染色。所述抗体可用于免疫组织化学检测实验。
序列表
<110> 杭州百凌生物科技有限公司
<120> 一种抗生物素抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> CDR-H1
<400> 1
Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> CDR-H2
<400> 2
Cys Ile Asp Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg Trp Val
1 5 10 15
Asn Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> CDR-H3
<400> 3
Glu Gly Asp Trp Gly Ala Pro Ile Tyr Tyr Gly Val Asp Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> CDR-L1
<400> 4
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> CDR-L2
<400> 5
Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> CDR-L3
<400> 6
Leu Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Ala Asp Thr Ser Ala
1 5 10
Claims (3)
1.一种抗生物素抗体，其特征在于，所述抗体运用Kabat方法分析包含以下CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3：
（1）CDR-H1，其序列为SSYWIC；
（2）CDR-H2，其序列为CIDAGSSGSTYYARWVNG；
（3）CDR-H3，其序列为：EGDWGAPIYYGVDL；
（4）CDR-L1，其序列为：QSSQSVYNNNQLS；
（5）CDR-L2，其序列为：YASTLAS；
和（6）CDR-L3，其序列为：LGGYYDYADTSA；其中，所述的抗生物素抗体特异性结合非游离的生物素。
2.根据权利要求1所述的一种抗生物素抗体，其特征在于，所述抗体为兔源单克隆抗体。
3.权利要求1所述的抗生物素抗体在ELISA检测，细胞捕获、分选和富集，免疫印迹检测，免疫细胞荧光染色或免疫组织化学检测中的应用。
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