CN117607463B - 一种循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，本发明涉及一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂，其包括能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段、聚酰胺‑胺树枝状大分子修饰的磁性微球和可检测标记物。本发明将EGFR特异性抗体与聚酰胺‑胺树枝状大分子修饰的磁性微球、可检测标记物结合起来用作循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂，其通过EGFR特异性抗体与CTC表面EGFR特异性结合，所述抗体通过聚酰胺‑胺树枝状大分子与磁性微球相连，所述磁性微球还通过聚酰胺‑胺树枝状大分子与可检测标记物相连，整个系统通过磁性微球的中转实现对细胞表面EGFR信号的倍数放大，从而实现对CTC表面EGFR的高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体而言，本发明涉及一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂。
背景技术
循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。
本发明人前期已设计了一系列用于对CTC进行分离（例如， CN202310581431.0，“基于微流控芯片的CTC细胞检测方法及其系统”；CN202310671592.9，“适用于循环肿瘤细胞捕捉的微流控芯片及其方法”；CN202310581433.X，“基于微流控芯片的CTC细胞分离控制方法及其系统”等）、检测（CN202211359933.0，“循环肿瘤细胞检测设备及其方法”；CN202310065947.X，“基于分光光谱的肿瘤细胞检测设备及其方法”等）、荧光成像（CN202310581410.9，“基于FISH的细胞检测系统及其方法”；CN202310671490.7，“荧光显微成像系统及其方法”等）的设备和方法。然而，对于如何高效分离与富集CTC细胞，仍有待研究。鉴于此，本发明人开发了一种上皮间质混合型及PD-L1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法（CN201910506524.0），该方法利用上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物、特异性免疫检查点抗体标志物与捕获增强液与染色增强液组合结合微流控技术，不仅可以简捷高效特异地富集检测上皮间质混合型CTC而且可以富集检测上皮型与间质型CTC。然而，该专利中使用了多种抗体的组合，成本较高，操作也相对复杂，仍需要开发改进的CTC检测方法。
表皮生长因子受体(vascular endothelial cell growth factor, EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，癌细胞中EGFR的异常激活可由多种机制诱导，包括基因扩增、点突变、缺失和自分泌配体受体刺激等，通过建立非炎性的肿瘤微环境，降低CD8+T细胞活性，增强Treg细胞的免疫抑制功能，从而促进肿瘤的发生和进展。
检测肿瘤患者中EGFR的异常表达对于诊断肿瘤、转移和患者预后具有重要意义。然而目前临床实践中，肿瘤患者EGFR检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此检测循环肿瘤细胞上的EGFR异常表达是一种有前景的诊断和预后方法。然后目前市面上仍缺少这样的检测试剂。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂，其包括能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段、聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球和可检测标记物。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。
进一步地，所述可检测标记物通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。
进一步地，所述可检测标记物选自荧光物质、酶、量子点中的一种或几种。优选地，所述可检测标记物为异硫氰酸荧光素。
进一步地，本发明提供了所述免疫显色检测试剂的制备方法，其包括以下步骤：
（1）制备聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球，
（2）将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球与链霉亲和素在戊二醛存在的条件下进行反应，得到链霉亲和素化的磁性微球，
（3）将链霉亲和素化的磁性微球与可检测标记物连接，得到可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球，
（4）将可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球与生物素化的能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段连接，得到所述循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂。
进一步地，步骤（1）包括：S1.将Fe3O4磁性微球分散在碱性缓冲液中，加入盐酸多巴胺于室温搅拌孵育6-12h，用磁铁从反应液分离出聚多巴胺包被的磁性微球并进行洗涤、干燥；S2.将聚多巴胺包被的磁性铁颗粒分散在碱性缓冲液中，加入聚酰胺-胺溶液于30℃搅拌孵育6-12h，用磁铁从反应液分离出聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球并进行洗涤、干燥。
进一步地，步骤（2）包括将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球经戊二醛活化后，分散在磷酸盐缓冲液中，然后加入链霉亲和素溶液，20-30℃振荡反应20-30h，用磁铁从反应液分离出链霉亲和素化的磁性微球并进行洗涤。
进一步地，步骤（3）包括将链霉亲和素化的磁性微球分散在磷酸盐缓冲液中，加入可检测标记物的DMSO溶液，在保护气体下避光反应12-16h，用磁铁从反应液分离出可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球并进行洗涤。
进一步地，步骤（4）包括将可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球分散在包含生物素化的能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段的磷酸盐缓冲液中，于4-8℃振荡孵育12-48h，然后加入含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液于4-8℃振荡孵育1-2h以封闭潜在的蛋白结合位点，用磁铁从反应液分离出附着所述抗体或其抗原结合片段的可检测标记物标记的磁性微球（即本文所述循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂）、洗涤并储存于磷酸盐缓冲液中。
进一步地，所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤。进一步地，所述干燥包括在50-70℃下真空干燥。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：5、6和7所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
进一步地，所述重链可变区具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或di-scFv。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为scFv。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头。
进一步地，所述接头具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
本发明还提供了如本文所述的免疫显色检测试剂用于分离和富集EGFR阳性循环肿瘤细胞的用途。这可以简单地通过以下步骤实现：使如本文所述的免疫显色检测试剂与来自受试者的包含CTC的外周血或血浆在适合抗原-抗体复合物形成的条件下孵育，然后利用磁铁从混合物分离出磁性微球，即得到富集的EGFR阳性循环肿瘤细胞。
本发明的有益效果
本发明提供的特定的与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段对EGFR具有极高的亲和力，并且对其他抗原具有较低的交叉反应性，具备优异的特异性和灵敏度。
本发明进一步将所述抗体与聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球、可检测标记物结合起来用作循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂，其通过所述抗体与CTC表面EGFR特异性结合，通过磁性微球的中转实现对细胞表面EGFR信号的倍数放大，从而实现对CTC表面EGFR的高灵敏度检测。
本发明的循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂解决了在CTC富集阶段常常需要依赖免疫抗体的技术问题，显著节省了成本，简化了操作。此外，本发明的循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂也可用于对CTC进行富集，同时实现对CTC的检测，具有双重功效。
附图说明
图1显示了实施例1制备的EGFR特异性抗体的ELISA检测检测结果。图A：抗体亲和力验证；图B：抗体与其它抗原识别验证。PC=阳性对照；NC=阴性对照。
图2显示了实施例1制备的EGFR特异性抗体的亲和力检测结果。
图3显示了实施例5中对照组对CTC细胞的染色图。
图4显示了实施例5中本发明制备的循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂对CTC细胞的染色图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：EGFR特异性抗体的制备
将编码EGFR特异性抗体（其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示）的核苷酸序列克隆至pCDNA3.1表达载体，瞬时转染至293T细胞5天后，收集细胞表达上清液，纯化EGFR特异性抗体。
可使用许多常用技术中的任一种来纯化抗体。例如，可将上清液便利地应用于已用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)。可洗涤柱以去除非特异性结合组分。结合的抗体可例如通过pH梯度(诸如20mM Tris缓冲液pH 7至10mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0，或磷酸盐缓冲盐水pH 7.4至100mM甘氨酸缓冲液pH 3.0)来洗脱。抗体级分可诸如通过SDS-PAGE检测，且然后可进行合并。根据意欲用途，进一步纯化是任选的。可使用常用技术将抗体浓缩和/或无菌过滤。可溶性聚集体和多聚体可通过常用技术有效地去除，所述技术包括尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、多模式色谱或羟磷灰石色谱。在这些色谱步骤之后抗体的纯度大于95%。可将产物立即在-70℃下冷冻或可冻干。
生物素化EGFR特异性抗体的制备：
(1)生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/mL，得到生物素溶液；
将EGFR特异性抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.5，终浓度1-10mg/ml，得到抗体溶液；
(2)按每mg抗体溶液加5μL生物素溶液的比例，将生物素溶液和EGFR特异性抗体溶液于室温避光搅拌2h；
(3)收集反应物使用PBS缓冲液透析过夜，中途更换PBS缓冲液3-4次；
(4)收集透析完毕的产物，即得到生物素化的EGFR特异性抗体。
实施例2：ELISA检测EGFR特异性抗体与EGFR重组蛋白的结合
（1）抗原包被：用1×碳酸盐包被缓冲液（Na2CO3（1.59g）+ NaHCO3（2.93g），调节pH值后定容至50mL）稀释抗原（EGFR重组蛋白，购自abcam）至10µg/mL，取50µL稀释后的抗原以0.5µg/200µL包被96孔板（设置阳性对照组、阴性对照组及实验组，每组3个复孔）；
（2）封闭：吸弃孔中液体，洗涤缓冲液（1×PBS中加入Tween-20配成0.05%溶液）洗涤3次，每孔加入100μL封闭液（脱脂奶粉（1g）+1×TBST（20mL）），37℃孵育1h；
（3）待测抗体孵育：96孔板置于洗板机中洗涤5次，按不同分组加入待测抗体，37℃放置1h，弃去孔中液体，使用洗涤缓冲液摇床洗涤3min，重复洗涤三次；
（6）酶标二抗孵育：96孔板每孔加入100μL稀释好的酶标二抗（1：5000稀释），37℃避光孵育30min；
（7）显色：96孔板置于洗板机中洗涤6-7次，每孔加入100 TMB显色液，此时孔中液体变为蓝色，37℃避光显色5-15min；
（8）检测吸光值：每孔加入50μL终止液（孔中液体变为黄色），酶标仪450nm检测吸光值。
结果如图1中的A所示（PC=阳性对照，NC=阴性对照，Ab=EGFR特异性抗体），结果显示实施例1制备的抗体具有较高的亲和力。还通过ELISA检测了抗体能否对非相关抗原进行识别，结果显示抗体不能识别其他的抗原，具有良好的特异性（如图1中的B所示）。
实施例3：EGFR特异性抗体与EGFR重组蛋白结合的亲和力检测
（1）仪器准备
启动Biacore T200 控制软件，将HBS-EP+缓冲液（BR100669, GE, 美国）及去离子水放置在相对应的托架上，并连接相应管路，待仪器运行稳定后，打开芯片舱门，安装CM5芯片，设置相关信息。样品流动池的检测温度设置为25℃。
（2）EGFR抗原偶联
将0.4M EDC和0.1M NHS以1:1的比例混合，以10ul/min的流速流经芯片表面Fc3，活化时间200s，使芯片表面的羧甲基葡聚糖基质活化；用Acetate 4.0（BR100349, GE, 美国）将EGFR抗原稀释至2.5ng/ul，以10ul/min的流速流经活化的芯片表面，将EGFR抗原共价偶联于芯片表面，目标偶联量设置为160RU；用乙醇胺将芯片表面未偶联蛋白的活化位点封闭，封闭时间为200s。
用相同的操作对芯片表面Fc1进行活化及封闭，作为参比通道。
（3）动力学分析
用HBS-EP+缓冲液将EGFR特异性抗体稀释成50nM，25nM，12.5nM，5.225nM，3.105nM，其中3.105nM作为重复浓度以检验实验的重复性，将不同浓度的EGFR特异性抗体以30ul/min的流速流经芯片表面，结合时间设置为160s，解离时间设置为600s，再生试剂选择Glycine 3.0 (BR100355, GE, 美国)，再生时间为10s；动力学程序运行结束后，用BiacoreT200分析软件对动力学结果进行拟合。结果如图2所示，其显示EGFR特异性抗体结合EGFR抗原的平衡解离常数(KD)为6.625x10-12M。
实施例4：一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂的制备
按照以下步骤制备如本文所述的循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂：
（1）在氮气保护下，将6g FeCl3·6H2O和2.46g FeCl2·4H2O在50mL蒸馏水中在60℃下搅拌30min，再加入20mL氨水(氨水浓度20％-30％)于80℃在搅拌下反应1h，冷却至室温，用磁铁分离，用无水乙醇和去离子水交替清洗至溶液呈中性，50℃真空干燥得到Fe3O4磁性纳米微球；
（2）取80mg Fe3O4磁性纳米微球添加到80mL的10mM Tris缓冲液中(pH＝8.5)，超声分散30min，在搅拌同时加入160mL无水乙醇再逐滴缓慢加入120mL盐酸多巴胺的水溶液(2.5mg/mL)，于室温搅拌孵育12h以得到聚多巴胺包被的磁性微球，用磁铁从反应液分离出聚多巴胺包被的磁性微球，以去离子水和无水乙醇交替洗涤去除杂质，随后于50℃真空干燥；
（3）取80mg聚多巴胺包被的磁性微球添加到800μL的10mM Tris缓冲液中(pH＝8.5)，超声分散30min，加入1.5mL的5％聚酰胺-胺甲醇溶液，于30℃搅拌孵育12h，用磁铁从反应液分离出聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球，并用磷酸盐缓冲液洗涤和真空干燥，
（4）取步骤（3）得到的20mg聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球，在4mL磷酸盐缓冲液中超声分散10min，再加入20mL 2.5％戊二醛溶液，在室温下通氮气水浴搅拌活化2h，然后用磁铁分离并用PBS洗涤，重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，再加入5mL 1.0mg/mL的链霉亲和素溶液，2℃振荡反应25h，用磁铁从反应液分离出链霉亲和素化的磁性微球并用磷酸盐缓冲液进行洗涤；
（5）取步骤（4）得到的20mg链霉亲和素化的磁性微球，超声分散于10mL磷酸盐缓冲液中，将4mg异硫氰酸荧光素溶解于4mL二甲基亚砜中，二者混合后在氮气保护、避光以及室温条件下反应12h，用磁铁从反应液分离出异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素化磁性微球并用磷酸盐缓冲液进行洗涤；
（6）取步骤（5）得到的20mg异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素化磁性微球超声分散于含有0.5mg/mL 生物素化的EGFR特异性抗体、5％海藻糖、5％甘露醇、0 .01％吐温-80的磷酸盐缓冲液中，将反应体系置于于4℃缓慢振摇孵育24小时，随后向体系中加入含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液以封闭潜在的蛋白结合位点，在4℃环境中继续缓慢振摇孵育1h完成封闭，用磁铁从反应液分离出附着EGFR特异性抗体的异硫氰酸荧光素标记的磁性微球并用磷酸盐缓冲液反复冲洗，最后以20mg/mL混悬液的形式保存于磷酸盐缓冲液中，并于4℃低温条件下储存备用。
实施例5：循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂
1）抽取肺腺癌患者静脉血6 mL于ACD抗凝管中，常规离心分离血浆备用；
2）对血浆中CTC细胞进行富集及分离，具体步骤为：通过向血浆中加入样本密度分离液（Cytelligen）提取血浆中单细胞层，之后加入免疫细胞去除磁珠对所提取单细胞层中的CD45+免疫细胞进行去除，通过差向富集对单细胞层中CTC进行浓缩及富集，最终得到的CTC单细胞悬液用于后续步骤；
3）将CTC单细胞悬液离心去上清，PBS-BSA(0.1％)封闭细胞1h，然后用PBS洗涤细胞，并重悬于磷酸盐缓冲液中；
4）以EGFR单克隆抗体(abcam，ab155639)作为对照组，实施例4制备的免疫显色检测试剂为实验组，分别取5μL对照组和实验组的溶液于洗涤后的CTC单细胞悬液中，PBS-BSA(0.1％)定容至100μL，室温染色2h，期间轻摇样本，300g离心5min，弃去上清，PBS洗涤3次，将染色后的细胞置于载玻片上，然后在荧光显微镜下观察，结果见图3和图4。
其中图3为对照组对CTC细胞的染色图，光密度：16.28；图4为本发明实施例4制备的免疫显色检测试剂对CTC细胞的染色图；光密度：39.59。此实验结果证实本发明的循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂可以实现对细胞表面EGFR信号的倍数放大，从而实现对CTC表面EGFR的高灵敏度检测。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂，其特征在于，包括能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段、聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球和可检测标记物；
所述抗体或其抗原结合片段分为重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为分别如SEQ ID NO：1、2 和 3 所示的 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3；所述轻链可变区为分别如 SEQ IDNO：5、6 和 7 所示的 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。
2.根据权利要求1所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。
3.根据权利要求1所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述可检测标记物通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。
4.根据权利要求1所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述可检测标记物选自荧光物质、酶、量子点中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述免疫显色检测试剂的制备方法包括以下步骤：
（1）制备聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球，
（2）将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球与链霉亲和素在戊二醛存在的条件下进行反应，得到链霉亲和素化的磁性微球，
（3）将链霉亲和素化的磁性微球与可检测标记物连接，得到可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球，
（4）将可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球与生物素化的能够与循环肿瘤细胞的表面EGFR特异性结合的抗体或其抗原结合片段连接，得到所述循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂。
6.根据权利要求5所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述重链可变区为如SEQ IDNO：4 所示的氨基酸序列，和
所述轻链可变区为如SEQ ID NO：8 所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体。
8.根据权利要求7所述的免疫显色检测试剂，其特征在于，还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头，
所述接头为如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，
所述抗体或其抗原结合片段为如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的免疫显色检测试剂用于分离和富集EGFR阳性循环肿瘤细胞的用途。
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