CN115144582A - 一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物，通过所述免疫试剂组合物实现对CTC表面蛋白的高灵敏度检测，组合物包含抗体、纳米微球、多官能团化合物、可检测标记物。免疫试剂组合物主要是通过抗体与CTC表面抗原特异性结合，所述抗体通过线状或者树枝状的多官能团化合物与纳米微球相连，所述纳米微球通过线性或者树枝状多官能团化合物与可检测标记物相连。整个系统通过纳米微球的中转实现对细胞表面蛋白信号的倍数放大，从而实现对CTC表面靶标抗原的高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)是通过从原发性肿瘤组织或转移性肿瘤组织释放到外周血中的癌细胞，与癌症转移和患者的预后密切相关。在晚期癌症中,患者每毫升血液中存在数百万的白细胞，而循环肿瘤细胞仅存在10至100个，即循环肿瘤细胞以非常低的浓度存在于外周血中。当前在许多与CTC有关的临床应用中,通常通过两种或者三种细胞肿瘤标记物抗原的存在和丰度来确定是否是肿瘤细胞并计数，然后基于CTC的数量来确定疾病的进展。因为抗体与其抗原之间存在一一对应的关系，从而允许通过抗体来准确测定抗原，所以目前CTC的计数主要是通过荧光抗体对细胞的肿瘤标记物进行染色和显微镜观察来实现的。当每个抗体与荧光物质连接时，可以通过作为取代物的各个细胞上的荧光的量和分布来确定抗原的存在。
目前对CTC膜蛋白的染色，常用的方法有两种，一种方法是一抗直接标记荧光物质显色，一般认为当将超过5个荧光分子掺入抗体时，由于荧光猝灭或降低的免疫反应性，只有3至5个荧光分子可以与单个抗体结合，因此对于低表达抗原的肿瘤细胞，荧光显色就会很弱以至于无法有效观察，这限制了CTC的检测灵敏度。另一种方法是用一抗加二抗的组合来检测肿瘤标记物的存在。荧光标记的多克隆二抗可以产生比荧光标记的一抗更强的信号，因为多个二抗可以结合到每个一抗分子上呈现的不同表位上。然而，这种方法通常限于只检测一个或两个靶标，因为大多数一抗仅在两种物种(小鼠和兔子)中产生，限制了二抗的选择；另外一抗加二抗的组合对靶标的特异性降低。
CTC非常稀少，所以对每个疑似细胞的鉴定就显得非常重要，染色效果差或非特异性的增加，对CTC的判读和计数的不可接受的。为了进一步优化CTC的计数，本发明认为新的技术需要满足如下要求：(1)更高的灵敏度和特异性(2)可在单个背景下同时分析多种抗原利并单独定量每个抗原(3)基于其染色模式识别目标物(细胞类型)的能力。
发明内容
本发明提供一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物，所述免疫试剂组合物实现对循环肿瘤细胞表面蛋白的高灵敏度检测，其组合物包含抗体、纳米微球、多官能团化合物、可检测标记物。所述免疫试剂组合物主要是通过抗体与CTC表面抗原特异性结合，所述抗体通过线状或者树枝状的多官能团化合物与纳米微球相连，所述纳米微球通过线性或者树枝状多官能团化合物与可检测标记物相连。整个系统通过纳米微球的中转实现对细胞表面蛋白信号的倍数放大，从而实现对CTC表面靶标抗原的高灵敏度检测。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物，包括能够与循环肿瘤细胞的表面抗原特异性结合的抗体或其片段、纳米微球、多官能团化合物和可检测标记物。
所多官能团化合物为线状或者树枝状的化合物，所述官能团包括氨基、羧基、磺酸基、巯基中的一种或几种。
所述抗体通过线状或者树枝状的多官能团化合物与纳米微球相连。
所述纳米微球通过线性或者树枝状多官能团化合物与可检测标记物相连。
所述可检测标记物选自荧光物质、酶、量子点中的一种或几种。
所述免疫组合物的制备方法包括如下步骤：
S1、将DSPE-PEG-NH2、胆固醇溶于二氯甲烷中，充分溶解，作为O相；配制pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入吐温，充分混合，作为W相；取O相溶液置于冰水中，超声处理，然后迅速加入W相溶液，继续超声处理，将超声混合形成的乳液蒸发除去溶液中的二氯甲烷，剩余溶液形成NPs-NH2纳米脂质体微球A；
S2、纳米脂质体微球A与多官能团连接，制得多官能团纳米微球B；
S3、多官能团纳米微球B和可检测标记物的连接，制得荧光纳米微球C；
S4、荧光纳米微球C和抗体的连接，制得所述免疫组合物。
进一步，步骤S2具体为：将纳米脂质体微球A和巯基化链霉亲和素溶于添加有EDTA的磷酸盐缓冲液中，最后加入SM(PEG)24的DMSO溶液，避光孵育3-5h，2-8℃离心，去除上清，清洗，制得多官能团纳米微球B。
进一步，步骤S3具体为：将多官能团纳米微球B溶于添加有EDTA的磷酸盐缓冲液中，并依次加入5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的DMSO溶液、荧光素聚乙二醇巯基的DMSO溶液，以及SM(PEG)24的DMSO溶液，混合均匀，2-8℃避光孵育3-5h，2-8℃离心，去除上清，清洗，制得荧光纳米微球C。
进一步，步骤S4具体为：荧光纳米微球C中加入生物素化的EpCAM抗体，避光孵育20-30min，2-8℃，离心，去上清，清洗，制得所述免疫组合物。
所述纳米微球的的粒径范围在10nm-1000nm之间。优选20nm-500nm之间，进一步优选为30nm-100nm之间。
所述抗体是能够与循环肿瘤细胞的表面抗原特异性结合的糖蛋白，或经替代或经修饰的免疫球蛋白家族的糖蛋白。
包含免疫组合物的检测试剂盒或检测试剂也属于本发明的保护范围。
所述表面蛋白为肿瘤标记物。
免疫组合物中线状或者树枝状的多官能团化合物将抗体与纳米微球串连，所述纳米微球通过线性或者树枝状多官能团化合物与可检测标记物相连，然后抗体通过与细胞表面抗原特异性结合来实现对目标蛋白的染色，进一步实现对其检测。整个染色系统只有一抗与抗原的特异性结合，避免了非特异性的产生，组合物适合循环肿瘤细胞的检测。
整个系统通过纳米微球的中转实现循环肿瘤细胞表面蛋白信号的倍数放大，从而实现对细胞表面靶标蛋白的高灵敏度检测。
所述纳米微球还可以是包括聚苯乙烯微球、编码微球中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将微球、线性化合物、抗体、可检测物质结合起来，作用于细胞膜表面的抗原检测，可明显增加实验过程中的细胞膜表面蛋白的检测灵敏度，解决了CTC临床应用中的假阴性问题；
2、同时本申请通过使用编码微球，理论可同时检测同一样本中的数个、数十个、甚至上百个目标抗原，突破了常规荧光染料的限制；
3、现有技术的荧光信号放大是通过线性化合物偶连，以减少位阻的方法增加抗体活性，同时放大信号，本发明专注于循环肿瘤细胞检测过程中荧光的放大，其中的核心创新点为通过微球作为中转去放大信号，比单纯的线性放大有着更高的放大效率，另外微球可以使用编码微球，理论上可测同一个样本的数个、数十个、甚至上百个目标抗原。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为对照组2对MCF-7细胞的染色图；
图2为本发明制备的免疫组合物对MCF-7细胞的染色图；
图3为对比例2制备FITC-PEG-NH2-NHS-PEG24-Maleimide-SH-Streptavidin-biotin-EpCAM对MCF-7细胞的染色图；
图4为本发明制备的化合物对循环肿瘤细胞的染色原理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1脂质体纳米微球的制备
步骤1、将10mg DSPE-PEG-NH2、2mg胆固醇溶于5mL二氯甲烷中，充分溶解，作为O相；
步骤2、配制0.1mol·L、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加0.1％的吐温20，充分混合，作为W相；
步骤3、取5mL O相溶液置于冰水中，于20％的超声功率下用超声波细胞粉碎仪超声1min，然后迅速加入10mL W相溶液，继续超声3min，将超声混合形成的乳液转移到梨形烧瓶中，于真空旋转蒸发仪上旋转蒸发除去溶液中的二氯甲烷，当二氯甲烷蒸发完成后，剩余溶液则形成了纳米脂质体微球A(NPs-NH2)，其表面含有羧基官能团，经检测，其平均粒径为280nm。
实施例2纳米脂质体微球A与巯基化链霉亲和素连接
缓冲液制备：
| 缓冲液1 | 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)加3mM的EDTA |
| 溶液1 | 取100mg SM(PEG)<sub>24</sub>溶于187μL DMSO |
将实施例1制备的浓度为20mg/mL的纳米脂质体微球A(NPs-NH2)和浓度为2mg/mL的巯基化链霉亲和素(Streptavidin-SH)溶于缓冲液1中，最后加入1mM终浓度的溶液1，2-8℃避光孵育5h，2-8℃，10000g离心15min,去除上清，PBS清洗三次，制得多官能团纳米微球B，储存在4℃，备用。
实施例3多官能团纳米微球B和可检测标记物的连接
缓冲液制备：
将实施例2制备的浓度为20mg/mL的多官能团纳米微球B溶于缓冲液2，加入10μL溶液2、4μL溶液4和1mM终浓度的溶液3，混合均匀，2-8℃避光孵育5h，2-8℃，10000g离心15min，去除上清，PBS清洗三次，制备得到荧光纳米微球C，储存在4℃，备用。
实施例4荧光纳米微球C和抗体的连接
将实施例3制备的浓度为20mg/mL的荧光纳米微球C取10mg，PBS清洗三次，然后加入400微克的生物素化的EpCAM抗体，室温避光孵育30min，10000g、2-8℃，离心15min，去上清，重复3次，将制备的微球置于20mM HEPES-0.09％叠氮钠-0.01％吐温20溶液中，以抗体含量计，调整溶液浓度为0.5mg/mL，制备得到免疫组合物，2-8℃保存备用。
实施例5
免疫组合物对MCF-7细胞的染色试验
取培养好的MCF-7细胞，PBS清洗，离心，弃去上清。PBS-BSA(0.1％)封闭细胞1h，再次清洗细胞；
以EpCAM Monoclonal Antibody(VU-1D9)，Biotin(Thermo，MA5-12150)作为对照组1、FITC(Thermo，A15755)作为对照组2，实施例3制备的免疫组合物为实验组，分别取2μL对照组1、对照组2和实验组的溶液于清洗后的细胞中，PBS-BSA(0.1％)定容至100μL，室温染色2h，期间轻摇样本，PBS清洗，300g，5min离心，弃去上清，洗3次。将染色后的细胞置于载玻片上，然后在荧光显微镜下观察，结果见图1和图2。
其中图1为对照组1对MCF-7细胞的染色图，光密度：10.67；图2为本发明实施例4制备的免疫组合物对MCF-7细胞的染色图；光密度：37.39。
对比例1
FITC-Streptavidin-biotin-EpCAM抗体的制备
取Streptavidin Protein,FITC(Thermo，21224)1mg，溶于0.1mL PBS溶液中，加入100微克的EpCAM Monoclonal Antibody(VU-1D9)，Biotin(Thermo，MA5-12150)，室温孵育30min，然后将反应液转入到蛋白浓缩管PES(Thermo，88504)中，再加200μL PBS，2-8℃12,000g离心15min，加300μL PBS，重复3次离心，将产品收集于PBS-0.1％BSA-0.09％叠氮钠-0.01％吐温20溶液中，以抗体含量计，调整溶液浓度为0.5mg/mL，2-8℃保存备用。
取培养好的MCF-7细胞，PBS清洗，离心，弃去上清。PBS-BSA(0.1％)封闭细胞1h，再次清洗细胞，将上述制备的FITC-Streptavidin-biotin-EpCAM溶液取2微升于清洗后的细胞中，PBS-BSA(0.1％)定容至100μL，室温染色2h，期间轻摇样本，PBS清洗，300g，5min离心，弃去上清，洗3次。将染色后的细胞置于载玻片上，然后在荧光显微镜下观察，结果显示染色后细胞的光密度为：17.71。
对比例2
FITC-PEG-NH2-NHS-PEG24-Maleimide-SH-Streptavidin-biotin-EpCAM
缓冲液制备：
将2mg/mL的巯基化链霉亲和素(Streptavidin-SH)溶于缓冲液1中，加入4μL的溶液21，最后加入1mM终浓度的溶液1，2-8℃避光孵育5h，2-8℃，10000g离心15min,去除上清，PBS清洗三次，制得FITC-PEG-NH2-NHS-PEG24-Maleimide-SH-Streptavidi，然后将反应液转入到蛋白浓缩管PES(Thermo，88512)中，再加200μL PBS，2-8℃12,000g离心15min，加300μLPBS，重复3次离心，将产品收集于PBS中，然后加入100微克的EpCAM Monoclonal Antibody(VU-1D9),Biotin(Thermo，MA5-12150)室温避光孵育30min，将反应液转入到蛋白浓缩管PES(Thermo，88504)中，再加200μL PBS，2-8℃12,000g离心15min，加300μL PBS，重复3次离心，将产品收集于PBS-0.1％BSA-0.09％叠氮钠-0.01％吐温20溶液中，以抗体含量计，调整溶液浓度为0.5mg/mL，制备获得
FITC-PEG-NH2-NHS-PEG24-Maleimide-SH-Streptavidin-biotin-EpCAM，2-8℃保存备用。
取培养好的MCF-7细胞，PBS清洗，离心，弃去上清。PBS-BSA(0.1％)封闭细胞1h，再次清洗细胞，将上述制备FITC-PEG-NH2-NHS-PEG24-Maleimide-SH-Streptavidin-biotin-EpCAM溶液取2微升于清洗后的细胞中，PBS-BSA(0.1％)定容至100μL，室温染色2h，期间轻摇样本，PBS清洗，300g，5min离心，弃去上清，洗3次。将染色后的细胞置于载玻片上，然后在荧光显微镜下观察，结果见图3，染色后细胞的光密度为：19.34。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种用于检测循环肿瘤细胞的免疫组合物，其特征在于，包括能够与循环肿瘤细胞的表面抗原特异性结合的抗体或其片段、纳米微球、多官能团化合物和可检测标记物。
2.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所多官能团化合物为线状或者树枝状的化合物，所述官能团包括氨基、羧基、磺酸基、巯基中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述抗体通过线状或者树枝状的多官能团化合物与纳米微球相连。
4.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述纳米微球通过线性或者树枝状多官能团化合物与可检测标记物相连。
5.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述可检测标记物选自荧光物质、酶、量子点中的一种或几种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫组合物，其特征在于，所述免疫组合物的制备方法包括如下步骤：
S1、将DSPE-PEG-NH2、胆固醇溶于二氯甲烷中，充分溶解，作为O相；配制pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，加入吐温，充分混合，作为W相；取O相溶液置于冰水中，超声处理，然后迅速加入W相溶液，继续超声处理，将超声混合形成的乳液蒸发除去溶液中的二氯甲烷，剩余溶液形成NPs-NH2纳米脂质体微球A；
S2、纳米脂质体微球A与多官能团连接，制得多官能团纳米微球B；
S3、多官能团纳米微球B和可检测标记物连接，制得荧光纳米微球C；
S4、荧光纳米微球C和抗体连接，制得所述免疫组合物。
7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，步骤S2具体为：将纳米脂质体微球A和巯基化链霉亲和素溶于添加有EDTA的磷酸盐缓冲液中，最后加入SM(PEG)24的DMSO溶液，避光孵育3-5h，2-8℃离心，去除上清，清洗，制得多官能团纳米微球B。
8.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，步骤S3具体为：将多官能团纳米微球B溶于添加有EDTA的磷酸盐缓冲液中，并依次加入5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯的DMSO溶液、荧光素聚乙二醇巯基的DMSO溶液，以及SM(PEG)24的DMSO溶液，混合均匀，2-8℃避光孵育3-5h，2-8℃离心，去除上清，清洗，制得荧光纳米微球C。
9.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，步骤S4具体为：荧光纳米微球C中加入生物素化的EpCAM抗体，避光孵育20-30min，2-8℃，离心，去上清，清洗，制得所述免疫组合物。
10.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述纳米微球的的粒径范围在10nm-1000nm之间；所述抗体是能够与循环肿瘤细胞的表面抗原特异性结合的糖蛋白，或经替代或经修饰的免疫球蛋白家族的糖蛋白。
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