CN111944820B - 一种膀胱癌核酸适体的组织样本快速筛选及其在检测制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性结合膀胱癌上皮细胞及早期临床膀胱癌组织的核酸适体及其在制备临床检测试剂上的应用。核酸适体的序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8中任一序列，并将序列优化或加以修饰。本发明相对于生物抗体具有更加优越的特性，主要体现在其对靶标组织的识别具有特异性和高亲和力。核酸适体在人体内具有低毒性、无免疫原性等优势，并且可以在体外合成且保存运输便利。采用本发明可以对临床膀胱癌组织样本进行检测，且该制剂成本低、周期短、重现性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于膀胱癌上皮细胞及早期临床膀胱癌组织样本检测的核酸适体及其在制备检测试剂中的应用。
背景技术
膀胱癌是人类泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，其发病人数位于全球癌症发病人数的第十位。膀胱癌是一种高致死性癌症，2018年全球约有54.9万膀胱癌新病例，当年就有20万人死亡膀胱癌。吸烟被认为是膀胱癌最主要的致病因素。所以膀胱癌的男性发病率和致死率远远高于女性，是全球第六大男性发病率癌症和第九大男性致死性癌症。在东亚，膀胱癌年龄标准化发病率男性为7.3/10万，约为女性年龄标准化发病率的4倍。除此之外，长期接触致癌物质、慢性细菌性感染、膀胱异物刺激等也是导致膀胱癌发病的原因。
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上皮的恶性肿瘤，其中膀胱尿路上皮癌是最常见的膀胱癌，约占90%以上。临床上，根据膀胱癌的发病位置可以分为两大类：一类是非肌层浸润性的肿瘤，恶性程度低，预后比较好，转移概率小。但是复发率高，并且有 10%～30% 日后会发展成浸润癌。另一类是基层浸润性的肿瘤，恶性程度高，容易出现转移。大部分膀胱癌患者最初的临床表现为血尿，通常为无痛性、间歇性、肉眼血尿，有时也可为镜下血尿。少数膀胱癌患者也可能首先出现膀胱刺激症状，表现为尿频、尿急、尿痛和排尿困难，而无明显的肉眼血尿。这多由于肿瘤坏死、溃疡、膀胱内肿瘤较大或数目较多或膀胱肿瘤弥漫浸润膀胱壁，使膀胱容量减少或并发感染所引起。
当前，膀胱癌的主要治疗手段仍是以手术切除为主，联合其他化疗、放射治疗等方式进行。膀胱癌的早期确诊对于手术切除的治疗效果尤为重要。但是膀胱镜检、尿液检查、核磁共振成像（MRI）等现在常见的膀胱癌诊断方式具有假阳性、灵敏度低等局限性，对于膀胱癌的临床早期筛查效果并不理想。因此，开发出一种能够特异性识别膀胱癌的分子探针，进而快速、准确的实现膀胱癌的早期诊断、病情检测以及预后治疗就是目前膀胱癌研究的关键。
核酸适体是一类很有前途的特异亲和的靶向分子探针，是采用 2009 年诺贝尔医学奖获得者Szostak等在上世纪九十年代所发展的SELEX技术筛选得到的一类具有特异识别功能的化学“抗体”。因为核酸适体是化学合成的，而且完全是在体外进行的，不依赖于体内的生物过程，因此可重复的合成，并且非常适合于高通量的筛选。除此之外，核酸适体还具备热稳定性，可逆折叠性，免疫原性低，易于合成修饰等特性，在化学生物传感分析、医学诊断与肿瘤靶向给药等方面显示出巨大的应用前景。基于核酸适体的肿瘤靶向识别与诊疗方法正逐渐成为一种新的、普遍适用的技术，为肿瘤等疾病的诊断和治疗相关领域的发展带来了新的契机。到目前为止，核酸适体结合小分子药物、功能纳米材料以及聚合物材料开发出的诊疗一体化探针，在肿瘤的治疗方面显示出极大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以快速、准确识别膀胱癌上皮细胞或早期临床膀胱癌组织样本的核酸适体及其在制备检测试剂中的应用。
本发明主要通过Tissue-SELEX技术获得一种检测膀胱癌上皮细胞的核酸适体，且不与人膀胱正常细胞结合。核酸适体选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8中任一标记序列，并将序列优化或加以修饰。该核酸适体，为39至42个碱基的短链核酸序列，主要通过对序列进行修饰，例如荧光标记、生物素等，进一步拓展该核酸适体在膀胱癌诊疗中的应用。其中荧光的强度反映了该核酸适体与膀胱癌上皮细胞结合的强弱。
所述的核酸适体最优选是下述序列：
5’-AAGCCCACTCCTCTGTGGGGGGCGAACAACAAGGCAGTCGTG-3’（SEQ ID NO.3），或5’-AACACGGACCGATGTTGGGCACAGAATGCGCATGTGGGC-3’（SEQ ID NO.6）。
同时，本发明还提供所述的核酸适体在制备检测人早期膀胱癌组织或膀胱癌上皮细胞的制剂中的用途。所述用途，是将所述核酸适体与待测细胞样品摇床孵育，孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗，再通过流式细胞仪进行检测，优选所述检测是荧光检测。
同时，本发明还提供一种检测早期膀胱癌组织膀或胱癌上皮细胞的试剂盒，其含有所述的核酸适体。
所述的试剂盒，还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液；所述结合缓冲液成分为：0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA；所述洗涤缓冲液含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁。
本发明是基于Tissue-SELEX 技术，以临床膀胱癌组织为正筛样本，膀胱癌癌旁组织为负筛样本，进行正筛和负筛两轮筛选。从6组筛选结果序列中，通过实验组和对照组的测序结果对比，选取丰度前100名的核酸序列，并从中选取排名前8的候选序列，满足处于不同的进化树家族中的条件。后续亲和力验证实验进一步证明了其功能和效果，最终才得到本发明。
本发明相对于生物抗体具有更加优越的特性，主要体现在其对靶标组织的识别具有特异性和高亲和力。核酸适体在人体内具有低毒性、无免疫原性等优势，并且可以在体外合成且保存运输便利。采用本发明可以对临床膀胱癌组织样本进行检测，且该制剂成本低、周期短、重现性好，本发明为膀胱癌的早期诊断及临床治疗提供了新的手段。
附图说明
图1 为8条候选序列与人膀胱癌细胞（5637、253J细胞）和人正常膀胱癌细胞（SV-HUC-1）的流式结合情况，其中（A）为8条候选序列、Library序列和人移行性膀胱癌细胞（253J细胞）流式结合图，（B）为8条候选序列、Library序列和人膀胱癌细胞（5637细胞）流式结合图，（C）为8条候选序列、Library序列和人正常膀胱癌细胞（SV-HUC-1）流式结合图。
图2 为LYY-3、LYY-6及Library序列与人膀胱癌细胞（5637、253J细胞）和人正常膀胱癌细胞（SV-HUC-1）的共聚焦结合情况，其中（A）为核酸适体LYY-3与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图，（B）为核酸适体LYY-6与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图，（C）为Library序列与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图。
图3 为核酸适体LYY-3、LYY-6与人膀胱癌细胞的解离平衡常数。其中（A）为核酸适体LYY-3与253J细胞的解离平衡常数，（B）为核酸适体LYY-6与5637细胞的解离平衡常数。
图4为核酸适体LYY-3、LYY-6的靶标类型的初步鉴定，其中（A）为核酸适体LYY-3的靶标类型的初步鉴定，（B）为核酸适体LYY-6的靶标类型的初步鉴定。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。
细胞来源：
本实验所用到的细胞系人膀胱移行细胞癌细胞（253J），人膀胱细胞癌细胞（5637），正常的人膀胱永生化细胞（SV-HUC-1)均购自于中科院上海细胞库。
实施例1：临床膀胱癌组织核酸适体筛选
基于Tissue-SELEX 技术，对临床膀胱癌组织进行正筛，对膀胱癌癌旁组织进行负筛，以获得预期目的序列。先合成具有亲和基团修饰的X-Aptamer 文库。第一轮筛选中，将初始文库与膀胱癌癌旁组织孵育，分离并保留的结合文库为负筛文库。将不结合的文库与膀胱癌癌组织孵育，分离并保留的结合文库为正筛文库。在第二轮筛选中，将第一轮筛选中的正筛文库和负筛文库分别和无菌去离子水（空白组）、膀胱癌组织（阳性组）、膀胱癌癌旁组织（阴性组）再次进行孵育，得到6组核酸序列。孵育后分离纯化阳性结合文库，得到ssDNA，将核酸序列进行PCR扩增，随后将6组序列进行二代测序以及对比分析。
本次筛选通过二代测序阳性实验组共测出2688632条序列，本发明人依据正筛文库和负筛文库中的阳性实验组中丰度排行前100的核酸序列，与阴性实验组进行对比分析，挑选出部分序列。通过MEGA7软件对序列进行同源性对比和构建进化树，将序列对比划分于不同的家族树中。最终挑选出8条候选核酸序列，这些序列满足只与临床膀胱癌组织结合、且结合丰度值高、分布于不同的家族树中的挑选条件（见表1）（LYY-1至LYY-8序列分别与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列相对应）。
表1 针对临床结肠癌组织核酸适体筛选所挑选的8条候选序列
| Clone ID | Sequence of random region(5’ to 3’) |
| LYY -1 | AACACGACGCTCGTTCGGGGGACCCGGTTGGCAAGGTGGGC |
| LYY -2 | AAGCCCACTGTGCTGTGTGTCTCGAACTATGATGGCGTCGTG |
| LYY -3 | AAGCCCACTCCTCTGTGGGGGGCGAACAACAAGGCAGTCGTG |
| LYY -4 | AAGCCCACCTAACTGTGGCCAACACAGAGCGGCATGGTGGGC |
| LYY -5 | AACACGACCCAGCTGTGTATCTCGAACGGCATTGCAGTCGTG |
| LYY -6 | AACACGGACCGATGTTGGGCACAGAATGCGCATGTGGGC |
| LYY -7 | AACACGATGAGACTGTGGCTCGCACAGGGTGTCATTGTCGTG |
| LYY -8 | AAGCCCACATCAGTTCGGCCACCGAACAGCGGTGGTGTCGTG |
实施例2 ：确定与膀胱癌细胞系（253J、5637）特异性结合能力最强的序列
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将贴壁细胞253J用DPBS清洗2次，加入0.2% EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/LtRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测。贴壁细胞5637、SV-HUC-1重复上述步骤，结果请参见图1，其中（A）为8条候选序列、Library序列和人移行性膀胱癌细胞（253J细胞）流式结合图，（B）为8条候选序列、Library序列和人膀胱癌细胞（5637细胞）流式结合图，（C）为8条候选序列、Library序列和人正常膀胱癌细胞（SV-HUC-1）流式结合图。
将待测核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将贴壁细胞253J用DPBS清洗2次，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库，再轻轻摇匀，置于4℃条件孵育1小时。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5mM氯化镁）清洗3次，通过激光共聚焦显微镜进行荧光检测。贴壁细胞5637、SV-HUC-1重复上述步骤，结果见图2，其中（A）为核酸适体LYY-3与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图，（B）为核酸适体LYY-6与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图，（C）为Library序列与人膀胱癌细胞和人正常膀胱癌细胞的共聚焦结合图。
根据图1（A） 的流式结果显示，膀胱癌细胞在核酸适体孵育后，呈现出荧光强度曲线的位移。通过对每组曲线偏移程度进行比较，得到结合较强的核酸适体序列LYY-1、LYY-3、LYY-6，而其他5条标记序列和文库序列与253J细胞结合较弱或不结合。图1（B）的流式结果显示，8条核酸适体序列均可与5637细胞结合，呈现出不同荧光强度的结合情况，通过曲线偏移程度可进行比较出LYY-3和LYY-6对5637细胞均有较强结合，而LYY-1对5637细胞则结合能力较弱。同时，LYY-3较LYY-6的偏移程度大，说明LYY-3的结合能力强于LYY-6。同时图2（A，B）的共聚焦结果表明，经过核酸适体序列LYY-3、LYY-6孵育后的膀胱癌细胞，在细胞膜表面或是内部均出现不同强度的绿色荧光现象。而文库序列处理后的膀胱癌细胞，没有出现荧光标记现象，也与流式结果基本一致。
以上流式与共聚焦验证结果说明，核酸适体LYY-3、LYY-6对膀胱癌细胞253J和5637细胞的结合能力最强。且LYY-3对253J和5637细胞均有很强的结合，而LYY-6对5637细胞的结合能力较强，对253J细胞结合能力较弱。同时，根据图1（C）的流式结果显示，核酸适体序列LYY-3、LYY-6和文库序列均不与人膀胱正常永生化细胞SV-HUC-1细胞结合，图2的SV-HUC-1细胞共聚焦结果也与该流式结合结果一致。综上所述，核酸适体序列LYY-3、LYY-6可以特异性结合膀胱癌细胞。
实施例3：核酸适体LYY-3、LYY-6与膀胱癌上皮细胞的结合亲和力强弱
进一步对核酸适体LYY-3、LYY-6与膀胱癌细胞的结合亲和力进行研究。首先，对LYY-3进行预处理，采用如下的浓度梯度设置：0nM、25nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600 nM。在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将253J贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测。核酸适体LYY-6用5637细胞重复上述步骤，结果请参见图3，其中（A）为核酸适体LYY-3与253J细胞的解离平衡常数，（B）为核酸适体LYY-6与5637细胞的解离平衡常数。
根据流式数据，圈出中心荧光范围，扣除背景荧光值，算出各浓度下的平均荧光强度，再根Y=Bmax X/（Kd+X）公式，通过 GraphPad Prism 8.0 计算出核酸适体 LYY-3与253J和LYY-6与5637细胞的解离平衡常数，并以X 轴为核酸适体不同梯度浓度，Y 轴为平均荧光强度构建解离曲线图。核酸适体LYY-3与253J细胞的解离平衡常数为154.8±7.822nmol/L，LYY-6 与 5637细胞的解离平衡常数分别为162.6±41.67nmol/L（请参见图4）。各解离平衡常数均在纳摩尔级别，说明该核酸适体与膀胱癌细胞系的结合亲和力较高，是识别膀胱癌的亲和分子。
实施例4：探究LYY-3、LYY-6是否结合在膀胱癌细胞系（253J、5637）表面的膜蛋白上
首先，将贴壁状态的253J细胞用0.2% EDTA从细胞培养皿上消化下来，用5个离心管收集。其中2管细胞分别加入胰酶和蛋白酶K，放置于37℃细胞培养箱中处理5min和10min。处理完毕之后用洗涤缓冲液（PBS，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心洗涤，然后各加入250nM LYY-3混匀。另外3管细胞直接用洗涤缓冲液离心洗涤后，取2管细胞分别加入250nM的LYY-3、随机文库混匀，剩下1管细胞不做任何处理。将5管细胞全部放置在4℃摇床中孵育1个小时。孵育完后用洗涤缓冲液离心洗涤两次，最后用流式细胞仪进行荧光信号检测。5637细胞用LYY-6重复上述步骤，结果请参见图4，其中（A）为核酸适体LYY-3的靶标类型的初步鉴定，（B）为核酸适体LYY-6的靶标类型的初步鉴定。
根据图4（A）流式细胞仪的结果显示，经过蛋白酶K以及胰酶处理之后，LYY-3与253J细胞的结合量下降到几乎与文库重叠，说明LYY-3是大部分结合在253J细胞表面的膜蛋白上。图4（B）结果显示，LYY-6与5637细胞的结合量会有所下降，说明LYY-6有一部分是结合在5637细胞膜表面的蛋白上。并且通过激光共聚焦显微镜的结果图2（A, B）也与该流式结果基本符合。
<110> 湖南大学
<120>一种快速筛选的膀胱癌核酸适体及其在制备检测膀胱癌制剂中的应用
<160> 8
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<400> 1
AACACGACGCTCGTTCGGGGGACCCGGTTGGCAAGGTGGGC 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<400> 2
AAGCCCACTGTGCTGTGTGTCTCGAACTATGATGGCGTCGTG 42
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<400> 3
AAGCCCACTCCTCTGTGGGGGGCGAACAACAAGGCAGTCGTG 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<400> 4
AAGCCCACCTAACTGTGGCCAACACAGAGCGGCATGGTGGGC 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<400> 5
AACACGACCCAGCTGTGTATCTCGAACGGCATTGCAGTCGTG 42
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<400> 6
AACACGGACCGATGTTGGGCACAGAATGCGCATGTGGGC 39
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<400> 7
AACACGATGAGACTGTGGCTCGCACAGGGTGTCATTGTCGTG 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<400> 8
AAGCCCACATCAGTTCGGCCACCGAACAGCGGTGGTGTCGTG 42
Claims (4)
1.一种检测人早期膀胱癌组织或膀胱癌上皮细胞的核酸适体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，将所述的核酸适体进行标记修饰，所述标记修饰是指在核酸适体连接上放射性物质、生物素、荧光物质、治疗性物质以及酶标记。
3.根据权利要求2所述的核酸适体，其特征在于，所述检测是荧光检测。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备检测人膀胱癌上皮细胞或人早期膀胱癌组织的制剂中的应用。
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