CN111944819B - 一种快速筛选的卵巢癌核酸适体及其在制备检测卵巢癌制剂中的应用 - Google Patents

一种快速筛选的卵巢癌核酸适体及其在制备检测卵巢癌制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能够用于检测早期卵巢癌组织的核酸适体及其在卵巢癌早期临床检测的应用。核酸适体的序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8中任一序列，或将序列优化或加以修饰。本发明中的核酸适体相较于传统的抗体，具有识别的靶标范围广且特异性强，亲和力强，毒性和免疫原性低，体外合成的成本低且省时，并可用适体载药或修饰，增强适体的功能性和达到预期的治疗目标。利用本发明的短链核酸适体并加以修饰标记，可以对卵巢癌上皮细胞及组织进行识别检测，且过程快速、简便，对卵巢癌的早期检测及临床治疗提供了新思路。

Description

一种快速筛选的卵巢癌核酸适体及其在制备检测卵巢癌制剂 中的应用
技术领域
本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于卵巢癌上皮细胞及早期临床卵巢癌组织样本检测的核酸适体及其在制备检测试剂中的应用。
背景技术
卵巢癌（ovarian cancer）是由卵巢内肿瘤引发的癌症。其也是预后最差的女性生殖系统恶性肿瘤，是发病率低、死亡率高的妇科恶性肿瘤。
根据2019年V3版NCCN卵巢癌临床实践指南可得，卵巢癌有高级别浆液性癌，低级别浆液性癌，粘液性癌，子宫内膜样癌，透明细胞癌等。I型卵巢癌包括子宫内膜样，透明细胞，低级别浆液和粘液性癌。II型卵巢癌主要由高级别浆液性癌，癌肉瘤和未分化癌组成。其中II型卵巢癌占75%，且前期发病隐匿，发现时已发展为晚期恶性肿瘤，化疗后易复发。I型卵巢癌肿瘤在临床上是惰性的，通常为低级的并通过临界肿瘤发展，且在良性囊性肿瘤和癌症之间表现出共同的谱系，有形态学连续性。其特点是KRAS，BRAF基因突变，卵巢表面上皮细胞癌变，由不典型增生性浆液性肿瘤过渡至低级别浆液性癌。II型肿瘤具有高度侵袭性，遗传不稳定并且具有非常高频率的TP53突变，大多数处于晚期阶段。关于II型肿瘤的起源尚未确定，主要的两种起源猜测是输卵管上皮细胞癌变和伞状细胞经由皮质包涵囊肿过渡至高级别浆液性癌。
根据美国癌症协会（American Cancer Society，ACS）在国际顶尖学术期刊CACancer J Clin发布的预测2018年美国癌症发病和死亡情况的报告——“2018年癌症统计”可知卵巢癌的全球发病人数为295414，占1.6%；死亡人数为184799，占1.9%；卵巢癌在女性恶性肿瘤中发病率和死亡率排名都为第8位；根据2015年中国恶性肿瘤流行情况分析可知卵巢癌发病率占女性所有癌症的2.38%，死亡率占女性所有癌症的3.27%。
卵巢癌发病机制有多种猜测，家族遗传性的与基因相关，或是与雌性激素分泌有影响，多数猜测是与输卵管损伤，产生细胞的癌变，致使的卵巢癌。
现目前卵巢癌的早期筛查主要是采用盆腔检查、肿瘤标志物的检测辅以影像学检测相结合，盆腔检查通常只在有明显的较大病灶时才能发现，妇科超声有时并不能区分卵巢癌与良性卵巢肿物、卵巢子宫内膜异位症等。而肿瘤标志物有CA125、CA724等都是广谱性的。影像学诊断有CT、MRI（核磁共振成像）、PET等，而且CT对于小于2cm的，MRI对于微小病灶的检测较差，PET则难以检测小于1cm的病理组织。
核酸适体是单链的DNA或RNA，经过指数富集的配体系统进化技术：在体外构建了随机核苷酸文库，筛选分离得到了对靶标具有特异性结合能力的 RNA 序列。其识别靶标的原理是通过核苷酸碱基互补配对、π-π 堆积、氢键、静电力等多种作用力发生自身适应性折叠后形成特定的三维结构。核酸适体经过化学修饰和折叠，达到与纳米材料联合载药等预期目标，进而在临床检测和诊断等方面发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高特异性、高稳定性且可用于人卵巢癌上皮细胞或早期临床卵巢癌组织样本检测的核酸适体及其在制备检测卵巢癌试剂的应用。
本发明主要通过Tissue-SELEX技术获得一种检测人卵巢癌上皮细胞的核酸适体，且不与人卵巢正常细胞结合。序列选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8任一所示序列，或将其进行标记修饰或改造。
该检测人卵巢癌上皮细胞的核酸适体，为35至42个碱基的短链核酸序列，主要通过对序列进行修饰，例如荧光标记、生物素、酶联基团等，进一步拓展该核酸适体在早期诊断和临床治疗中的应用。其中荧光的强度反映了核酸适体与人卵巢癌上皮细胞结合的强弱。
所述的核酸适体最优选是下述序列：
5’-AACACGACCGAGCTGTGGAGGACACAGTTCGGGCCGGTGGGC-3’（SEQ ID NO.7），
或AACACGACGGGGCTGTGGCCATCGAACGCCACGGGGGTGGGC-3’（SEQ ID NO.8）。
同时，本发明还提供所述的核酸适体在制备检测人早期卵巢癌组织或人卵巢癌上皮细胞的制剂中的用途。所述用途，是将所述核酸适体与待测细胞样品摇床孵育，孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗，再通过流式细胞仪进行检测，优选所述检测是荧光检测。
同时，本发明还提供一种检测人卵巢癌上皮细胞或早期临床卵巢癌的试剂盒，其含有所述的核酸适体。
所述的试剂盒，还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液；所述结合缓冲液成分为：0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/L tRNA,1g/L BSA;所述洗涤缓冲液含0.45%的葡萄糖，5mM氯化镁。
由于卵巢癌早期发病隐匿，症状不明显，至今对于其发病机制有多种猜测，大多数认为与输卵管相关。虽然I型卵巢癌治愈率较高，但是II型卵巢癌经过肿瘤消减术和铂类结合的标准治疗具有易复发的特性，因其对铂类敏感。所以早期的肿瘤标志物诊断十分重要，但目前的TPS（组织多肽抗原）、CA125、CA199、HE4（人附睾蛋白4）等都是广谱性诊断，其中PR（孕激素受体）是卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜样癌的良好预后标志物和诊断物。所以，目前尚未发现特异性针对卵巢癌的早期诊断物。本发明所述的核酸适体的特异性识别并结合卵巢癌上皮细胞具有稳定、成本低、细胞毒性低等特点，可进一步为卵巢癌的早期检测、靶向治疗和预后指标提供新的思路。本发明是基于Tissue-SELEX 技术，以临床肾癌组织为正筛样本，从933745条序列中，通过实验组和对照组的测序结果对比，选取丰都前100名中易形成G4链体的核酸序列，并从中选取排名前8的候选序列，且满足处于不同的进化树家族中的条件。后续实验进一步证明了其功能和效果，最终才得到本发明。
本发明中的核酸适体相较于传统的抗体，具有识别的靶标范围广且特异性强，亲和力强，毒性和免疫原性低，体外合成的成本低且省时，并可用适体载药或修饰，增强适体的功能性和达到预期的治疗目标。利用本发明的短链核酸适体并加以修饰标记，可以对卵巢癌上皮细胞及组织进行识别检测，且过程快速、简便，对卵巢癌的早期检测及临床治疗提供了新思路。
附图说明
图1 为8条候选序列与人卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞HO-8910细胞的结合情况，其中（A）为8条候选序列、文库序列和HO-8910细胞流式结合图，其偏移情况说明已经结合，（B）为8条候选序列、文库序列和HO-8910细胞共聚焦结合图，其说明情况和（A）图一样。
图2 为8条候选序列与人卵巢子宫内膜样腺癌上皮细胞A2780细胞的结合情况，其中（A）为8条候选序列、文库序列和A2780细胞流式结合图，其偏移情况说明已经结合，（B）为8条候选序列、文库序列和A2780细胞共聚焦结合图，其说明情况和（A）图一样。
图3 为8条候选序列与人卵巢正常上皮细胞IOSE-80细胞的结合情况，其中（A）为8条候选序列、文库序列和IOSE-80细胞流式结合图，其偏移情况说明不结合，（B）为8条候选序列、文库序列和IOSE-80细胞共聚焦结合图，其说明情况和（A）图一样。
图4 为核酸适体LNY-7与A2780细胞(A)、HO-8910细胞(B)的解离平衡常数和核酸适体LNY-8与A2780细胞(C)、HO-8910细胞(D)的解离平衡常数。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买所得到的。
细胞来源：
本实验所用到的细胞系人卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞（HO-8910）、人卵巢子宫内膜样腺癌上皮细胞（A2780）以及正常的人卵巢细胞（IOSE80）均来源于ATCC。卵巢癌组织以及卵巢癌癌旁组织来源于临床样本。
实施例1：临床卵巢癌组织核酸适体筛选
基于Tissue-SELEX 技术，对临床卵巢癌组织进行正筛，对卵巢癌癌旁组织进行负筛，以获得预期目的序列。先合成具有亲和基团修饰的X-Aptamer 文库。第一轮筛选中，将初始文库与卵巢癌癌旁组织孵育，分离并保留的结合文库为负筛文库。将不结合的文库与卵巢癌癌组织孵育，分离并保留的结合文库为正筛文库。在第二轮筛选中，将第一轮筛选中的正筛文库和负筛文库分别和无菌去离子水（空白组）、卵巢癌组织（阳性组）、卵巢癌癌旁组织（阴性组）再次进行孵育，得到6组核酸序列。孵育后分离纯化阳性结合文库，得到ssDNA，将核酸序列进行PCR扩增，随后将6组序列送往上海生工进行二代测序以及对比分析。
本次筛选通过二代测序阳性实验组共测出2028005条序列，本发明人依据正筛文库和负筛文库中的阳性实验组中丰度排行前200的核酸序列，与阴性实验组进行对比分析，挑选出部分序列。通过MEGA7软件对序列进行同源性对比和构建进化树，将序列对比划分于不同的家族树中。最终挑选出8条候选核酸序列，这些序列满足只与临床卵巢癌组织结合、且结合丰度值高、分布于不同的家族树中的挑选条件（见表1）（LNY-1至LNY-8序列分别与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示序列相对应）。
表1 针对临床卵巢癌组织核酸适体筛选所挑选的8条候选序列
Clone ID Sequence of random region(5’ to 3’)
LNY -1 AAGCCCACCTGACTGTGCACATCACAGCGCGGGATGTGCGC
LNY -2 AACACGACCAGAGGACGAACGCCATGGGCGTGGGC
LNY -3 AAGCCCACTCAACTGTGGCAGCCGAACACCATGGGCGTCGTG
LNY -4 AACACGACAGCACCGTGGGAGTCGAACGCCGAGCTTGTCGTG
LNY -5 AAGCCCACTAAGGTTCGAGCAACACAGCGCGGGCGGGTGGGC
LNY -6 AACACGACCAGGGTTCGTGGGGCACAGCCCATGGCGGTCGTG
LNY -7 AACACGACCGAGCTGTGGAGGACACAGTTCGGGCCGGTGGGC
LNY -8 AACACGACGGGGCTGTGGCCATCGAACGCCACGGGGGTGGGC
实施例2 ：确定与HO-8910细胞系特异性结合能力最强的序列
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将HO-8910贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图1（A））。
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将HO-8910贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库，再轻轻摇匀，置于4℃摇床孵育1小时。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）清洗3次，再通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图1（B））。
根据图1（A）的流式结果显示，8条核酸适体序列可与HO-8910细胞结合，呈现出不同荧光强度的结合情况，通过曲线偏移程度可进行比较。而文库序列不与HO-8910细胞结合。同时，图1（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符，各序列与HO-8910细胞出现结合现象，且在细胞膜表面或是内部均出现不同强度的绿色荧光现象，即说明与FITC标记的核酸适体的结合情况。结合流式与共聚焦验证结果，表明其中核酸适体LNY-7和LNY-8与HO-8910细胞的结合能力最强。
实施例3 ：确定与A2780细胞系特异性结合能力最强的序列
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将A2780贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/LtRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图2（A））。
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将A2780贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库，再轻轻摇匀，置于4℃摇床孵育1小时。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5mM氯化镁）清洗3次，再通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图2（B））。
根据图2（A）的流式结果显示，8条核酸适体序列可与A2780细胞结合，呈现出不同荧光强度的结合情况，通过曲线偏移程度可进行比较出LNY-7比LNY-8的偏移程度较大，LNY-7的结合能力强于LNY-8。而文库序列不与A2780细胞结合。同时，图2（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符。
实施例4：LNY-7和LNY-8不与卵巢正常上皮细胞IOSE80细胞结合
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将IOSE80贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/LtRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图3（A））。
将8条核酸适体序列及对照文库链的粉末进行离心，并用无菌的去离子水将其稀释至终浓度250nM，在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将IOSE80贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库，再轻轻摇匀，置于4℃摇床孵育1小时。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）清洗3次，再通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图3（B））。
根据图3（A）流式结果显示8条核酸适体序列和文库序列均不与IOSE80细胞结合。同时，图3（B）共聚焦结果也与流式结果基本相符。
实施例5：核酸适体LNY-7和LNY-8与卵巢癌上皮细胞的结合亲和力强弱
进一步对核酸适体LNY-7和LNY-8与卵巢癌上皮细胞的结合亲和力进行研究，对比二者的优异程度。首先，对LNY-7进行预处理，采用如下的浓度梯度设置：0nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM、150nM、180 nM、200nM、250nM、300nM、350nM。在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min,再将其置于常温。同时，将HO-8910和A2780贴壁细胞用DPBS清洗2次，加入0.2%EDTA于37℃消化细胞。用DPBS清洗2次后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45% 的葡萄糖，5 mM氯化镁）吹打收集细胞至离心管中。离心清洗后，加入结合缓冲液（Binding Buffer：DPBS，0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA）和处理后的核酸适体序列及文库。吸打混匀后置于4℃摇床孵育1小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液（Washing buffer，含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁）离心清洗3次。通过流式细胞仪进行荧光检测。LNY-8重复上述步骤。（结果见图3（A））。
根据流式数据，圈出中心荧光范围，扣除背景荧光值，算出各浓度下的平均荧光强度，再根Y=Bmax X/（Kd+X）公式，通过 GraphPad Prism 7.0 计算出核酸适体 LNY-7和LNY-8与HO-8910和A2780细胞的解离平衡常数，并以X 轴为核酸适体不同梯度浓度，Y 轴为平均荧光强度构建解离曲线图。如图4所示核酸适体 LNY-7和LNY-8 与 HO-8910细胞以及A2780细胞的解离平衡常数分别为60.21±36.31 nM和84.2±12.83 nM及42.24±6.542 nM和90.15±32.89nM。各解离平衡常数均在纳摩尔级别，说明该核酸适体与卵巢癌上皮细胞的结合亲和力较高，是识别卵巢癌的亲和分子。
<110> 湖南大学
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AACACGACGGGGCTGTGGCCATCGAACGCCACGGGGGTGGGC 42

Claims (8)

1.一种检测人早期卵巢癌组织或人卵巢癌上皮细胞的核酸适体，其序列如SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体进行了标记修饰，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。
3.根据权利要求2所述的核酸适体，其特征在于，所述标记修饰是指荧光标记。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备检测人卵巢癌上皮细胞的制剂中的用途。
5.权利要求1-3任一项所述的核酸适体在制备检测人早期卵巢癌的制剂中的用途。
6.一种检测或诊断人早期卵巢癌的试剂盒，其特征在于，其含有如权利要求1-3任一项所述的核酸适体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括结合缓冲液以及洗涤缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液的成分为：0.45%的葡萄糖，5 mM 氯化镁，100mg/L tRNA，1g/L BSA，所述洗涤缓冲液含0.45 % 的葡萄糖，5 mM氯化镁。
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