CN106319069B - 一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。本发明提供了一种检测病源细胞的试剂盒，包括：检测病源细胞的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针。所述非特异性信号监测寡核苷酸探针可监测靶向性分子的寡核苷酸部分与细胞结合产生的非特异性信号。本发明的方法有效降低非特异性结合导致的干扰，提高了检测病源细胞的准确性。
Description
技术领域
本发明属于病源细胞诊断领域，更具体地，本发明涉及一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。
背景技术
对病源细胞的定量检测是准确判断患者病情并给予及时治疗的直接证据。例如，血液中循环肿瘤细胞的数量是决定病人预后的重要因素。同样，对血液中的疟原虫的检测也是判断疟疾病情的重要指标。
传统的检测方法基本是基于对病源细胞表面抗原的检测和定量。在这些方法中，抗体首先被附着在一个固体载体上，由于抗体-抗原的相互作用抗体和待检测细胞形成复合物。同样的原理，抗体可能先通过抗原-抗体反应和待检细胞形成复合物，然后再附着到一个固体载体上。其后，被抗体抓住的细胞被收集和标记以此来定量。比如免疫荧光技术检测循环肿瘤细胞。首先用附着于磁珠或微流体芯片的抗体将肿瘤细胞从血液中富集出来。然后用带有标记物、肿瘤细胞特异性的抗体标记肿瘤细胞并进行定量检测。一般来说，标记物包括放射性的同位素，染料，荧光素和酶(用于酶标反应)等。尽管基于抗原捕获的检测方法在临床上应用广泛，但是这些方法有许多不足之处，包括检测灵敏度低、通量低、操作麻烦且人为误差大等。
本发明人前期的专利《检测病源细胞的靶向性分子及其应用》(申请号201110315281.6)，提供了一种检测病源细胞的靶向性分子，其结构为X-Y，其中X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，Y代表寡核苷酸探针，通过对寡核苷酸探针进行荧光定量PCR扩增，实现信号放大，提高了病源细胞表面特定结合分子的检测灵敏度，达到对待检病源细胞进行定量的目的。但是，本发明人在研究中发现：(1)在对病源细胞进行富集后的产物中，除了包含病源细胞外，还包含其他无关细胞。比如在对血液样本中的循环肿瘤细胞(CTC)进行富集后，除了CTC外，还含有大量白细胞。此外，对于多数良性病患者，由于存在炎症反应，白细胞数量也会显著高于正常值。由于这些病源细胞和无关细胞表面可能存在DNA受体的表达，因此可与靶向性分子的寡核苷酸探针部分结合，产生非特异性的结合信号，影响检测的准确性。(2)由于样本质量问题，如血液样本保存时间超过24小时或保存温度不当，容易导致细胞结团，亦会增加对靶向性分子寡核苷酸部分的非特异性结合。
因此，有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种检测病源细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：检测病源细胞的靶向性分子，结构为X-Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“-”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；和
非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’，Y’的序列长度和序列信息与Y相似，但与Y在序列信息上存在部分碱基的不同。
在一个优选例中，Y’与Y的序列长度差异≤30％，Y’与Y的序列中GC％差异≤30％。
在另一优选例中，Y或Y’的序列长度为10-150bp(双链)或10-150nt(单链)。
在另一优选例中，Y’的序列长度为11-120bp(双链)或11-120nt(单链)；如12bp(双链)或12nt(单链)；14bp(双链)或14nt(单链)；16bp(双链)或16nt(单链)；18bp(双链)或18nt(单链)；20bp(双链)或20nt(单链)；30bp(双链)或30nt(单链)；40bp(双链)或40nt(单链)；50bp(双链)或50nt(单链)；60bp(双链)或60nt(单链)；80bp(双链)或80nt(单链)；100bp(双链)或100nt(单链)。
在另一优选例中，当Y或Y’的序列长度为10-50bp(双链)或10-50nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在2-6个，较佳地3-5个碱基的不同；当Y或Y’的序列长度为51-100bp(双链)或51-100nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在3-30个、较佳地5-20个碱基的不同；当Y或Y’的序列长度为101-150bp(双链)或101-150nt(单链)时，Y’与Y在序列信息上存在3-45个，较佳地5-35个碱基的不同。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，X选自：特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。
在另一优选例中，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物；更佳地，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：针对Y的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B；其中，A为随机序列，B序列与Y序列的其中一个末端(如3’端)的序列互补；和针对Y’的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B’；其中，A的定义如前，B’序列与Y’序列的其中一个末端(如3’端)的序列互补。
在另一优选例中，当靶向性分子的寡核苷酸部分较短，如<50bp，设置该延伸引物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂。
在另一优选例中，所述的特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂是荧光定量PCR检测试剂；较佳地，所述的荧光定量PCR检测试剂包括：特异性扩增所述包含Y和Y’序列的延伸序列的正向引物、反向引物和特异性荧光探针。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于体外非诊断性地检测病源细胞。
在本发明的另一方面，提供一种体外非诊断性地检测病源细胞的方法，所述方法包括：
(1)提供前面任一所述的试剂盒，将所述的靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’与待测样品共混，孵育；
(2)孵育结束后收集细胞，分别从细胞上分离(如洗脱)所述的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’；
(3)以步骤(2)分离的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果1；以步骤(2)分离的非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果2；
(4)将步骤(3)获得的定量分析结果1的定量值减去定量分析结果2的定量值，获得待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、3mL健康人血样，分别掺入20和0个KB细胞，连接或未连接叶酸的寡聚核苷酸标记后，检测值的变化。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种对病源细胞进行靶向定量检测过程中，监测非特异性信号的方法。本发明的方法包括选用了一种寡核苷酸片段作为非特异性信号监测寡核苷酸探针，其长度和GC％与检测病源细胞的靶向性分子的寡核苷酸探针部分相似(差异≤30％)，可监测靶向性分子的寡核苷酸部分与细胞结合产生的非特异性信号。本发明的方法有效降低非特异性结合导致的干扰，提高了检测病源细胞的准确性。
术语
如本文所用，所述的“病源细胞”是指来自于病灶组织的细胞(固定于病灶组织或由病灶组织释放并游离存在于体液中)，该细胞表面上存在有特定分子(例如表面抗原或受体)，该特定分子为该种病源细胞所特有的，且能够被特定的结合分子(如抗体、配体)结合，该特定的结合分子即为特异性靶向病源细胞的结合分子。例如，叶酸可以识别和结合癌细胞表面的叶酸受体(folate receptor)，抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的黄体生成素释放激素受体(LHRH receptor)等等。
如本文所用，所述的“结合分子”能够特异性地靶向病源细胞上特定分子(例如表面抗原或受体)，其具有高的亲和性，其平衡解离常数通常小于10-6。所述的“结合分子”例如但不限于抗体、配体、化学小分子或多肽等。
如本文所用，所述的“非特异性信号监测寡核苷酸探针”是指一种特别设计的探针，该探针的序列长度和GC％与靶向性分子上的寡核苷酸探针的序列长度和GC％相似(差异≤30％)。由于所述的“非特异性信号监测寡核苷酸探针”与靶向性分子上的寡核苷酸探针存在高度的相似性，两者在细胞上发生非特异性结合的性能是相似的，因此，可以通过考察该“非特异性信号监测寡核苷酸探针”在细胞上发生非特异性结合的情况，来了解靶向性分子上的寡核苷酸探针的非特异性结合情况，从而去除这种非特异性结合对于检测结果的干扰。
如本文所用，所述的“癌症”或“肿瘤”没有特别的限制，较佳地该“癌症”或“肿瘤”自发病起会向血液循环中散播癌症细胞或肿瘤细胞。例如选自(但不限于)：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。作为本发明的优选实施方式，所述的“癌症”或“肿瘤”选自：乳(腺)癌、肺癌。
如本文所用，所述的“平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，Kd)”指占据半数细胞上特定的受体或表面分子所需的配体、抗体、化学小分子或多肽的浓度。Kd值与受体亲和力呈反向关系，Kd值愈小，表明亲和力愈高；反之Kd值愈大，表明亲和力愈低。通常Kd小于10-6M表示受体或表面分子与的配体、抗体、化学小分子或多肽亲和力高。
如本文所用，所述的“特异性”是指是抗体、配体、多肽或化学小分子能识别和/或结合于循环肿瘤细胞表面的特定分子(如表面抗原、受体)上，但不识别和结合于其它非相关分子。
如本文所用，所述的“循环肿瘤细胞(CTC)”是指存在于血液(外周血)中的癌症(肿瘤)细胞，CTC的浓度可以诊断癌症、对癌症进行分期、预后等。
靶向性分子
本发明的方法主要基于结合分子-寡(聚)核苷酸探针，所述的结合分子特异性靶向病源细胞表面的特定分子。所述的寡核苷酸探针用于作为后续PCR定量分析的扩增模板。所述的结合分子通过与病源细胞表面的特定分子结合，对病源细胞进行标记。而寡聚核苷酸通过定量PCR技术用于对配体进行定量检测从而达到对待检细胞进行定量的目的。
本发明的靶向性分子主要是基于以下结构：X-Y；
其中，X代表一个特异性的针对病源细胞的高亲和性分子(通常Kd<10-6mol/L)，比如抗体、高亲和性的多肽片段、高亲和性化学小分子等，用于特异性地结合病源细胞上的特定分子；Y用于作为后续PCR定量分析的扩增模板，用于目标病源细胞的定量检测。
X是发挥导向作用的关键分子，其是用于识别和/或结合病源细胞的，因此，其通常根据所需检测的病源细胞的类型而设，例如叶酸可以识别和结合肺癌细胞表面的叶酸受体(folate receptor)；抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的黄体生成素释放激素受体(LHRHreceptor)。
目前，针对存在于各种病源细胞表面的特定分子，已经有深入的研究，也开发出了各种针对这些表面分子的结合分子，包括抗体、配体、多肽、化学小分子等。本发明对结合分子没有特别的限制，这些结合分子均可被应用于本发明的方法中，从而设计出各种针对病源细胞的靶向性分子。
Y是具有一定长度的寡核苷酸分子，基于该寡核苷酸分子可设计出特异性的引物从而实现PCR扩增，通过扩增效应降低检测限，提高检测的敏感性。所述的寡核苷酸分子可以是双链的或是单链的。所述的寡核苷酸的序列没有特别的限定，较佳地其不与人体或动物体的基因序列互补，本领域人员熟知其设计以及合成的方法。所述寡核苷酸的长度较佳地可以是10-150bp(双链)或10-150nt(单链)。
本发明还包括采用如基于核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的寡核苷酸分子，所述的修饰基本不改变寡核苷酸分子结合特性；优选那些能够提高寡核苷酸分子稳定性的修饰。例如，所述的修饰为硫代修饰，或在核糖的2’位置进行烷基修饰。应理解，任何能够保持所述寡核苷酸分子结合特性的修饰都包含在本发明中。
寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，该方法是将DNA骨架上磷酸键上的氧原子用硫原子替代，所述的硫代可以是全部磷酸键上的硫代或是部分磷酸键上的硫代。硫代的修饰能够大大增强所述寡核苷酸分子的稳定性，从而有利于获得准确的检测结果。
较佳地，X和Y之间以化学共价键的形式连接。
作为本发明的优选方式，本发明人在反复研究后，开发了检测循环肿瘤细胞(CTC)的靶向性分子。这是由于叶酸可以识别和结合肿瘤细胞表面的叶酸受体(folatereceptor)。该靶向性分子中，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。叶酸与半胱氨酸的偶联物与天然叶酸相比较，提高了与叶酸受体的亲和力；并且，将叶酸与半胱氨酸相连，可以显著地增加叶酸的溶解性，从而提高与循环肿瘤细胞接触的叶酸的量。叶酸-半胱氨酸偶联物的制备可以采用本领域已知的技术进行。与叶酸连接的半胱氨酸的个数可以是一个或多个的，例如1～3个，该范围内的半胱氨酸可为叶酸提供良好的亲水环境。该靶向性分子中，Y的序列是多种多样的，且是硫代的或非硫代的。
非特异性信号监测寡核苷酸探针
本发明人在研究中发现，利用上述靶向性分子进行检测的过程中，靶向性分子上的寡核苷酸探针还会与细胞上的一些DNA受体等发生非特异性结合，从而降低了检测的准确性。
因此，本发明人经过深入研究后，设计了一种寡核苷酸片段作为非特异性信号监测寡核苷酸探针，其长度和GC％与检测病源细胞的靶向性分子的寡核苷酸探针部分相似(差异≤30％)，可监测靶向性分子的寡核苷酸部分与细胞结合产生的非特异性信号。
本发明所述的“非特异性信号监测寡核苷酸探针”应与靶向性分子上的寡核苷酸探针存在相似性，两者在细胞上发生非特异性结合的性能应是相似的。从而，可以通过考察该“非特异性信号监测寡核苷酸探针”在细胞上发生非特异性结合的情况，来了解靶向性分子上的寡核苷酸探针的非特异性结合情况，以在检测结果中去除这种非特异性结合对于检测结果的干扰。
试剂盒
本发明提供了一种检测病原细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：检测病源细胞的靶向性分子；以及非特异性信号监测寡核苷酸探针。
与所述靶向性分子配套的引物包括：正向的和反向的与所述的靶向性分子的两端序列互补的序列，从而可以以所述的靶向性分子为模板，进行PCR扩增，实现检测结果的放大。
如果靶向性分子的寡核苷酸部分较短(如<50bp)，为了克服序列过短难以进行PCR扩增的缺陷，可以针对所述靶向性分子上的探针，设计延伸引物，该延伸引物的一端与靶向性分子上的寡核苷酸探针的一端的序列互补，在适于DNA互补结合以及延伸的条件下，使得DNA延伸得到包含有原寡聚核苷酸探针序列以及延伸引物互补序列的寡聚核苷酸。以该加长的寡聚核苷酸为模板，进行PCR扩增，获得该模板的PCR定性或定量结果，从而获得所述微寡聚核苷酸的PCR定性或定量结果。
扩增用正向和反向引物根据此延伸引物与微寡聚核苷酸发生延伸反应后获得的寡聚核苷酸两端的序列制备。
并且，该延伸引物覆盖靶向性分子上的寡核苷酸探针与非特异性信号监测寡核苷酸探针序列中存在碱基不同的区域。也即，应用所述延伸引物获得的延长的序列，能够体现寡核苷酸探针与非特异性信号监测寡核苷酸探针在序列上的不同。
较佳地，所述的试剂盒中还包括荧光PCR用的荧光探针，例如TaqMan探针，从而便于PCR产物的定量分析。
所述的试剂盒中，所述靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针及其配套的引物或荧光探针被独立地装于合适的容器中，更佳地所述靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针及其配套引物或荧光探针还被配制成合适的用量或浓度。
所述的试剂盒中还可包含其它试剂，例如用于PCR扩增的试剂(如DNA聚合酶，Realtime PCR Master Mix)、缓冲液(如PBS)、洗涤液等。
所述试剂盒还可包括：试剂盒使用说明书，以指导技术人员的操作。
应用
本发明还涉及利用所述的试剂盒来检测病源细胞的方法，所述的方法可以是以诊断疾病为目的的，例如对患者进行预后，或判断疑似人群是否罹患疾病；或以非诊断疾病为目的的，例如，纯粹的科学研究，或纯粹的细胞分型(如区分肿瘤细胞的类别)。
所述的检测病源细胞的方法包括：(1)将所述的靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针与待测样品共混，孵育；(2)孵育结束后收集细胞，分别从细胞上分离所述的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针；(3)以步骤(2)分离的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果1；以步骤(2)分离的非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果2；(4)将步骤(3)获得的定量分析结果1的定量值减去定量分析结果2的定量值，获得待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
所述的PCR优选荧光定量PCR技术，因此，较佳地，在PCR扩增系统中还加入荧光探针，从而可藉由特定的定量PCR仪方便地实现分析；更佳地，所述的荧光探针是TaqMan探针。
作为本发明的优选方式，还设置对照组和/或标准品组，即已知叶酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探针数量的组，通常设置一系列数量不同的标准品构成标准品组，籍此分析待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
生物材料及仪器
H-Cys(Trt)-2-Cl Trt树脂、HBTU和HOBT均购自Novabiochem(U.S.A.)。
PD-10柱(SephadexG 25M)购自GeneralElectricalHealthcare(美国)。
SMCC(琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯)购自ThermoScientific(U.S.A.)。
红细胞裂解液购自索莱宝生物(北京，中国)。
氨基修饰的单链寡聚核苷酸、PBS、白细胞去除磁珠、Taqman MGB探针购自LifeTechnologies公司。
PCR所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
定量PCR检测试剂Realtime PCR Master Mix购自日本TOYOBO公司。
定量PCR仪为Applied Biosystems的7300realtime PCR system。
KB细胞株购自中科院上海细胞库。
其余试剂均购自Sigma Aldrich。
实施例1、靶向性分子的制备
以下实施例中，检测的病源细胞为循环肿瘤细胞(CTC)，通过在健康人血样中掺入KB模式细胞(人口腔表皮样癌细胞)，模拟含有CTC的肿瘤病人血样。结构为X-Y的靶向性分子中，特异性靶向CTC的结合分子X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。
靶向性分子的制备方法如下：
首先制备叶酸-半胱氨酸偶联物。将270mg的H-Cys(Trt)-2-Cl Trt树脂(以树脂的表面分子数为1当量)浸于5mL二甲基甲酰胺中30分钟。加入4当量的Fmoc-Glu-OtBu(购自Novabiochem，美国)和4当量的N,N二异丙基乙胺，及加入2.5当量的HOBT和2.5当量HBTU反应1小时。之后，加入20％的吡啶15分钟去除保护基团Fmoc，后用5mL二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。此后，加入4当量的蝶酸和4当量的N,N二异丙基乙胺及2.5当量的HOBT和HBTU反应过夜。次日，分别用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和甲醇洗树脂3次。用氮气干燥树脂60分钟。此后，在树脂中加入10mL三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(体积比，95:2.5:2.5)的混合物反应2小时。收集液体反应物于圆底烧瓶，并在旋转蒸发仪上挥发液体至大约1mL。加入50mL的预冷的乙醚，然后4000g离心收集固体粗产物。收集的粗产物用HPLC纯化得到，纯度为91％的叶酸(为γ叶酸)-半胱氨酸的偶联物52mg。进行HPLC分析谱和质谱分析以确认获得具有一定纯度的偶联物。
将SMCC溶于500uL水和二甲基亚砜的混合物中(体积比1:1)，然后加入浓度为1mg/mL的单链或双链寡核苷酸(PO16或PO80，序列信息如表1中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中并在室温孵育4小时。此反应是将寡核苷酸上的氨基和SMCC以C-N共价键键合。反应后的产物用PD-10柱(SephadexG-25M)去除过量的SMCC。然后在反应体系中加入终浓度为1mg/mL的叶酸-半胱氨酸偶联物。此反应是以叶酸-半胱氨酸的硫基和SMCC上的马来酰亚胺以C-S共价键键合。终产物用HPLC纯化可以得到叶酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探针(F-PO16或F-PO80)。
实施例2、靶向性分子可产生非特异性的“背景”信号
取3mL健康人血样，分别掺入20和0个KB细胞。实验步骤如下：
(1)血样中加入红细胞裂解液和白细胞去除磁珠，去除红细胞和绝大多数白细胞。将样本分为两组，一组加入10nM靶向性分子(F-PO16或F-PO80探针)与上述剩余细胞富集物混合后孵育40min；另一组加入10nM未连接叶酸的寡聚核苷酸(PO16或PO80探针，SEQ IDNO:1或2)与剩余细胞富集物混合孵育40min；
(2)孵育结束后收集细胞，PBS洗涤去除未结合的游离探针分子，用特异性的洗脱液分别洗脱细胞表面结合的靶向性分子和未连接叶酸的寡聚核苷酸；
(3)分别以步骤(2)洗脱的靶向性分子和未连接叶酸的寡聚核苷酸为模板，应用表1(SEQ ID NO:3-9)中对应的引物及荧光探针，进行荧光定量PCR扩增，获得检测信号。
表1
注：PO代表靶向性分子的寡聚核苷酸部分，后面的数字代表寡聚核苷酸的长度；RT代表延伸引物、针对PO16加入到PCR体系中，FP代表扩增正向引物，RP代表扩增反向引物，Taqman代表Taqman MGB探针。
结果见图1，未掺入KB细胞的样本，用连接或未连接叶酸的寡聚核苷酸标记后，检测值无显著差异。相反，对于掺有KB细胞的样本，用叶酸-寡聚核苷酸标记的样本的检测值明显高于用未连接叶酸的寡聚核苷酸标记的样本。该结果提示，由于靶向性分子的寡聚核苷酸部分与富集样本中残余的血细胞结合，可产生非特异性的“背景”信号，影响检测的准确性。
实施例3、非特异性信号监测寡核苷酸探针长度的选择
取健康人血样，实验步骤如下：
(1)加入红细胞裂解液和白细胞去除磁珠，去除红细胞和绝大多数白细胞。分别加入10nM寡核苷酸探针(PO16或PO80)和不同长度的非特异性信号监测寡核苷酸探针(针对PO16的SEQ ID NO:10-13，或针对PO80的SEQ ID NO:14-17)，与剩余细胞富集物共混，孵育40min；
(2)孵育结束后收集细胞，PBS洗涤去除未结合的游离探针分子，用特异性的洗脱液分别洗脱细胞表面结合的寡核苷酸探针和非特异性信号监测寡核苷酸探针；
(3)以步骤(2)洗脱的寡核苷酸探针或非特异性信号监测寡核苷酸探针为模板，分别应用表2(针对PO16，SEQ ID NO:3-6)和表3(针对PO80，SEQ ID NO:7-9)中的对应的引物及荧光探针，进行荧光定量PCR扩增，获得检测信号。
结果见表4。
表2
注：QC代表非特异性信号监测寡核苷酸探针，后面的数字代表寡聚核苷酸的长度。
表3
表4
以上结果显示，当QC探针与PO探针的长度差异≤30％时，可满足两者检测值差异≤20％。
实施例4、非特异性信号监测寡核苷酸探针GC％的选择
取健康人血样，实验步骤如下：
(1)加入红细胞裂解液和白细胞去除磁珠，去除红细胞和绝大多数白细胞。分别加入10nM寡核苷酸探针(PO16或PO80)和不同GC％的非特异性信号监测寡核苷酸探针(针对PO16的SEQ ID NO:18-22，或针对PO80的SEQ ID NO:36-40)，与剩余细胞富集物共混，孵育40min；
(2)孵育结束后收集细胞，PBS洗涤去除未结合的游离探针分子，用特异性的洗脱液分别洗脱细胞表面结合的寡核苷酸探针和非特异性信号监测寡核苷酸探针；
(3)以步骤(2)洗脱的寡核苷酸探针或非特异性信号监测寡核苷酸探针为模板，分别应用表1(SEQ ID NO:3-9)、表5(SEQ ID NO:23-35)和表6(SEQ ID NO:41-48)中对应的引物和荧光探针，进行荧光定量PCR扩增，获得检测信号。
结果见表7。
表5
表6
表7
以上结果显示，当QC探针与PO探针的GC％差异≤30％时，可满足两者检测值差异≤20％。
实施例5、靶向性分子中寡核苷酸部分非特异性结合引起的背景值对信噪比的影响
取健康人血样，分别经过正常保存条件(对照，保存温度为2-8℃，保存时间24h内)或异常保存条件(如室温，或保存时间超过24h)处理。另取因存在炎症反应而白细胞数量显著升高(≥1.2×107/mL)的良性病患者血样。每份检测血样取3mL，分别掺入20和0个KB细胞。实验步骤如下：
(1)加入红细胞裂解液和白细胞去除磁珠，去除红细胞和绝大多数白细胞。将样本分为两组，一组只加入10nM靶向性分子(F-PO16探针)与上述剩余细胞富集物混合后孵育40min；另一组同时加入10nM靶向性分子(F-PO16探针)和10nM非特异性信号监测寡核苷酸探针(QC16-3探针)与剩余细胞富集物共混，孵育40min；
(2)孵育结束后收集细胞，PBS洗涤去除未结合的游离探针分子，用特异性的洗脱液分别洗脱细胞表面结合的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针；
(3)以步骤(2)洗脱的靶向性分子为模板，以特异性针对该靶向性分子中寡核苷酸探针的引物(SEQ ID NO:3-6)进行PCR扩增，获得总检测信号；
(4)以步骤(2)洗脱的非特异性信号监测寡核苷酸探针分子为模板，以特异性针对该分子的引物及荧光探针(SEQ ID NO:29，4-6)进行PCR扩增，获得背景检测信号。
将总检测值减去背景值，即得到样本的检测值。计算掺有20个细胞的样本和未掺细胞的样本的比值作为信号噪声比。
结果见表8。
表8
以上结果显示，血液样本保存时间超过24小时、保存温度不当或白细胞数量高于正常值，均会造成检测值偏高。扣除靶向性分子中寡核苷酸部分非特异性结合引起的背景值后，可显著提高信噪比。
实施例6、F-PO16探针和QC探针的定量检测准确性验证
分别将F-PO16探针和QC16-3探针，依次稀释成六个浓度梯度作为校准品，以稀释液作为阴性对照。分别用针对两种探针的引物、延伸引物及荧光探针(SEQ ID NO:3-6，29)，进行荧光定量PCR扩增，考察两种探针PCR定量体系的性能，包括线性、扩增效率和扩增特异性(阴性对照与PCR校准品1的Ct值的差值)，以及两种检测体系之间是否存在交叉反应。扩增反应体系见表9。
表9
| 组份 | 用量 |
| Realtime PCR Master Mix | 12.5μL |
| 扩增引物 | 300nM |
| 探针 | 100nM |
| 扩增模板 | 2.5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补至25μL |
反应程序见表10，在步骤6中35℃退火时检测荧光信号，检测荧光选择FAM，并用ROX进行校正。
表10
结果见表11。
表11
以上结果显示，F-PO16和QC16-3探针的PCR定量标准曲线的线性相关系数R≥0.98，扩增特异性和扩增效率高，且两种检测体系不存在交叉反应，保证了定量检测的准确性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种检测病源细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
检测病源细胞的靶向性分子，结构为X-Y；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；“-”代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；
非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’，Y’的序列长度和序列信息与Y相似，但与Y在序列信息上存在部分碱基的不同；其中，Y’与Y的序列长度差异≤30％，Y’与Y的序列中GC％差异≤30％，Y或Y’的序列长度为10-150bp或10-150nt。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，Y’的序列长度为11-120bp或11-120nt。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，X选自：特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：
针对Y的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B；其中，A为随机序列，B序列与Y序列的其中一个末端的序列互补；和
针对Y’的延伸引物，该延伸引物序列结构如下：A-B’；其中，A的定义如前，B’序列与Y’序列的其中一个末端的序列互补。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测包含Y和Y’序列的延伸序列的检测试剂是荧光定量PCR检测试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR检测试剂包括：特异性扩增所述包含Y和Y’序列的延伸序列的正向引物、反向引物和特异性荧光探针。
10.权利要求1-9任一所述的试剂盒的用途，用于体外非诊断性地检测病源细胞。
11.一种体外非诊断性地检测病源细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供权利要求1-9任一所述的试剂盒，将所述的靶向性分子、非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’与待测样品共混，孵育；
(2)孵育结束后收集细胞，分别从细胞上分离权利要求1所述的靶向性分子和非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’；
(3)以步骤(2)分离的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果1；以步骤(2)分离的非特异性信号监测寡核苷酸探针Y’为模板，进行PCR定量分析，获得定量分析结果2；
(4)将步骤(3)获得的定量分析结果1的定量值减去定量分析结果2的定量值，获得待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
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