CN111676271B - 一种原位杂交探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种原位杂交探针，包括探针序列和信号基团序列。本发明的探针序列的设计，用茎环序列连接接头序列和检测序列，既增加探针的稳定性，也为两次配对识别提供了先决条件；应用探针和目标、探针和信号序列的两次配对识别，提高实验检测准确性，减少背景信号，降低假阳性的概率；信号序列的引入，使后续检测更加灵活，降低实验成本。同时后续可扩展性能更加优良。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种原位杂交探针。
背景技术
现有技术中的常规原位杂交探针的设计是根据碱基互补配对的原则，针对目标基因序列设计合成单一的线性寡核苷酸探针，其长度范围多为30-200bp。寡核苷酸探针的末端进行荧光基团的标记或其他检测基团标记，溶于杂交缓冲液后直接用于原位杂交的检测，探针通过碱基互补配对识别目的基因序列并结合，或使用检测二抗进行检测。其后通过普通或荧光显微镜观测荧光信号杂交信号。此检测过程，基本为“探针——目的序列”的单次识别配对，此配对的准确性，决定了此实验检测过程的特异性或准确性。
由于实验过程中探针与目的序列的单次识别配对，探针的非特异结合或引起假阳性，或者导致背景信号高；同时，检测基团直接与探针相连，缺少灵活性和升级空间，因此缺少特异性高，增幅效果好的信号放大系统。对于含量低的目标分子，较难得到优质的特异阳性信号；容易受不同样本的组织结构，物理环境的不同所影响，产生高背景或假阳性。因此，单条线性探针的稳定性有所欠缺。
发明内容
针对上述缺陷，本发明引入双探针系统，增加对目标序列的识别能力与特异性。引入了“探针-目的序列”和“探针-信号序列”的两次识别配对，以及双探针之间的配合识别，大大降低非特异结合或样本结构引起的假阳性或高背景信号；信号序列的加入，也可以扩展出一个高效的信号级联放大系统，使特异信号得到有效的放大，应对低表达量目的分子的检测。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种原位杂交探针，包括探针序列和信号序列。
进一步地，所述探针序列包括5’端接头序列、中部连接序列和3’端目的基因检测序列。本发明的5’端接头序列是根据一种线虫基因组设计的匹配序列，与人、大鼠、小鼠的基因序列没有同源性，无特异结合，可用于结合后续的级联放大系统。
进一步地，所述中部连接序列具有茎环结构。本发明的探针序列的中部连接序列在常温或非杂交缓冲液环境下形成茎环结构，可提高探针的稳定性，增加探针的特异性；同时提供合适的空间构象，连接5’端序列和3’检测序列。
进一步地，所述3’端目的基因检测序列不形成发夹结构，并且根据所要检测的目的基因设计碱基序列。本发明探针序列的3’端检测序列按碱基互补配对的原则，根据需要检测的目的序列进行设计，通常针对目的序列的3’端特异保守区，30-50bp长度，GC％为40％-60％，此段区域避免形成发夹结构。
根据上述对本发明的探针序列的描述，所述探针序列的具体序列如下：TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGAcaagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGA AGAACATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA(SEQ ID NO:1)是探针序列的5’端接头序列，caagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAGAACAT(SEQ ID NO:2)是探针序列的中部连接序列(茎环)，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN是探针序列的3’端检测序列，其根据需要检测的目的序列进行设计，本发明完整的探针包含此三个区域，其形成的二级结构见图1。
进一步地，所述信号序列包括两个可与所述探针序列的5’端接头序列特异结合的序列，以及连接两个所述标记序列的中部延长序列
本发明所述信号序列为左右两侧相同的序列，可与探针序列的5’端接头序列特异配对结合，用以同时结合两个探针序列的接头部分。中部为延长序列，可以根据需要自行设计。信号序列在合成的同时带上后续实验所需的信号检测基团，如各种荧光基团、地高辛标记基团、生物素标记基团等。标记方式可为末端标记，也可以为序列中的碱基随机标记多个相同的基团，以进一步增强信号。
根据上述对本发明的信号基团序列的描述，所述探针序列的具体序列如下：TCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGAnnnnnnnnnnnnnTCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGA，其中TCTACTCTTTCTAGGAGGTTGTGA(SEQ ID NO:3)是与所述探针序列的5’端接头序列特异结合的序列，nnnnnnnnnnnnn是中部延长序列，可根据实际需要进行设计。
本发明的原位杂交探针的使用过程如下：
杂交前，探针在杂交缓冲液中高温变性处理，环状结构被打开，便于3’端检测序列与目的基因序列配对杂交。在杂交过程中，检测序列根据碱基互补配对原则，识别目的基因的特异序列并与之结合。杂交后，通过调节缓冲体系，使探针二级结构重新形成，并形成侧放的“M”字形结构，如图2。
针对每个待检测的目的序列，均有两条探针，两条探针的检测序列分别结合目的序列相邻区域，结合过程如图3所示。
信号序列与探针序列的特异结合过程如图4所示，信号序列两端的结合区，分别与两个探针的5’接头序列配对，形成稳定的碱基互补配对结构。形成“目的序列——探针——信号序列+信号检测基团”的复合结构，使目的序列分子带上可供检测的信号基团。
本发明的探针通过“探针——目的序列”和“探针——信号序列”的两次识别配对，形成“目的序列-探针-信号基团序列复合物”，与常规原位杂交实验中的单次碱基识别配对相比，大大增加了检测的特异性，明显降低背景信号，降低假阳性的出现概率。而信号序列只要保持识别序列的不变，可以生产不同信号基团，不同标记模式的信号序列，便于客户定制。同时此检测系统也有较大的升级空间，可以通过继续对信号进行级联放大。
本发明还提供了一种检测目的序列的方法，通过以下方法实现：通过使用本发明的原位杂交探针与所述目的序列形成目的序列-探针-信号基团序列复合物，检测所述复合物生产的信号值。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下优点：
1、探针序列的设计，用茎环序列连接接头序列和检测序列，既增加探针的稳定性，也为两次配对识别提供了先决条件；
2、应用探针和目标、探针和信号序列的两次配对识别，提高实验检测准确性，减少背景信号，降低假阳性的概率；
3、信号序列的引入，使后续检测更加灵活，降低实验成本。同时后续可扩展性能更加优良。
附图说明
图1为探针序列二级结构示意图。
图2为目的序列与探针序列特异结合的示意图(probe表示探针，target表示目的序列)。
图3为两条探针序列的检测序列分别结合目的序列相邻区域的示意图(probe表示探针，target表示目的序列)。
图4为信号序列与探针序列的特异结合过程示意图(probe表示探针，target表示目的序列，singal sequence表示信号序列)。
图5为传统探针对目的序列检测的结果示意图。
图6为本发明探针对目的序列检测的结果示意图。
图7为本发明探针对目的序列检测的结果示意图。
图8人乳腺癌组织传统探针原位杂交检测10×10拍照图片。
图9人乳腺癌组织传统探针原位杂交检测40×10拍照图片。
图10人乳腺癌组织本发明的探针原位杂交检测10×10拍照图片。
图11人乳腺癌组织本发明的探针原位杂交检测40×10拍照图片。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
使用本发明的原位杂交探针与传统寡核苷酸探针检测人LEF1基因，具体操作如下：
目的序列：针对人LEF1基因(Gene ID:641518,updated on 11-Sep-2019)，的两个不同的转录本(NCBI Reference Sequence:NR_029373.1，transcript variant1；NCBIReference Sequence:NR_029374.1，antisense RNA 1，transcript variant 2)选择相同序列设计探针，探针具体序列如下：
传统探针：5'-CTCACTGGAAAATTCTTCAACTCCACGCTTCAC-3'，长度33bp，TM：74.5，GC：45.5％，位置：1011。
本发明的探针1：
5'-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGAcaagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAGAACATCTCCACGCTTCACTGTGCCT-3'，长度：95bp，TM：56.3，GC：44％，位置：1004。
本发明的探针2：
5'-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGAcaagCTCAACTGGATTGTCGTGGAGT CGGCAATTCAGTTGAGGAAGAACATCTCACTGGAAAATTCTTCAA-3'，长度：95bp，TM：56.3，GC：44％，位置：1024。
图5、6、7分别表示了传统探针和本发明的探针1、2的ΔG值。ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。因此，应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过10)，而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。由图5、6、7可见，本发明的探针1、2的中间ΔG值均高于3’端，表明本发明的探针与目标序列形成的双链结构内部碱基对更加稳定。
实施例2
使用传统LEF1探针与本发明的探针检测乳腺癌石蜡组织，具体操作如下：
一、使用LEF1探针(人LEF1基因地高辛标记的寡核苷酸探针，货号MSS-LEF1，公司：广州烨善生物科技有限公司)
步骤A具体操作：
1、石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3min×2；
2、0.1M甘氨酸(PBS)孵育5min×2；
3、0.3％Triton X-100(PBS)处理15min，PBS洗3min×3；
4、蛋白酶K(20μg/ml in PBS)37℃(先预热)20min，PBS洗3min×3；
5、4％多聚甲醛固定5min，PBS洗3min×3；
6、0.25％乙酸酐(0.1M三乙醇胺，pH8.0)处理10min，PBS洗3min×3；
7、在-20℃，分别用70％，85％和100％的酒精处理5min，进行脱水，最后风干；
8、滴加探针(LEF1探针，用杂交缓冲液稀释，按要求加至各切片，20μl/张，可根据组织切片大小做适当调整)，加盖玻片，置于组化盒，40-50℃杂交过夜(16-18h)；
9、杂交后洗涤，2×SSC洗脱盖片，37℃2×SSC 5min×3，1×SSC 15min×2；
10、切片置于buffer 1中室温孵育5min；
11、每个组织片加buffer 2，孵育15min；
12、用buffer 2按1：1000稀释抗体Anti-Digoxigenin-AP conjugate，滴加50μl抗体稀释液，37℃孵育1h；
13、用buffer 1洗10min×2；
14、用buffer 3平衡切片5min；
15、配制显色液，用buffer 3按1：50稀释NBT/BCIP原液，临用前配制，避光。切片滴加显色液后，避光显色2-3h后观察显色情况
16、用buffer 1洗涤终止显色，洗涤几次；
17、滴加核固红复染，37℃,染色5-10min，水洗几次；
18、快速脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察。观察传统探针检测的结果，如图8、9所示，背景信号比较高，特异性不强。
步骤B试剂配制：
检测试剂盒DIG Nucleic Acid Detection Kit(Cat.No.11 175 041 910，内含：Blocking reagent，Anti-Digoxigenin-AP conjugate，NBT/BCIP)
1、Buffer1[100mM Tris-HCl，150mM NaCl；pH 7.5(20℃)]：1M的Tris-HCl pH 7.5配制50ml；称取Tris 6.06g，加ddH2O 30～40ml，加浓HCl调pH值至7.5。定容至50ml，保存备用；1.5M NaCl：称取NaCl4.4g，加ddH2O 50ml溶解，保存备用。Buffer1配制500ml：称取Tris6.06g，NaCl 4.4g，加入400ml的ddH2O溶解，加浓HCl调pH到7.5(20℃)高压灭菌备用。
2、Buffer2：0.5％(w/v)blocking regent in Buffer 1。
3、Buffer3[100mM Tris-Hcl(pH 9.5)，100mM NaCl，50mM MgCl2]：1M Tris-HCl(pH 9.5)100ml：称取Tris 12.12g，加入ddH2O到80ml，用浓HCl调pH至9.5；5M的NaCl 50ml：称取NaCl 14.6g，加入ddH2O充分溶解，定容到50ml；1M的MgCl2 50ml：称取MgCl2·6H2O10.15g，加入ddH2O定容至50ml；Buffer3配制100ml：1M的Tris-HCl(pH 9.5)10ml，5M的NaCl2ml，1M的MgCl2 5ml，加ddH2O到100ml，混匀后再次测定pH是否在9.5。
4、Buffer4[10mM Tris-HCl，1mM EDTA]
5、杂交缓冲液配制：1ml配方(50％去离子甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、2XSSC、20ng/ul鲑鱼精DNA)：去离子甲酰胺，0.5ml；20×SSC，100ul；25％硫酸葡聚糖，400ul；鲑鱼精DNA，20ul；充分混匀，-20℃保存，若有沉淀，水浴溶解。
6、核固红染色液：核固红0.1g、0.02g；硫酸铝5g、1g；ddH2O 97ml、19.4(20ml)。
二、使用本发明的探针，具体操作如下：
步骤A：样本前处理
制备人乳腺癌组织FFPE组织切片约1小时→60℃烤片约1小时→FFPE切片脱蜡约20分钟(准备预处理所需材料和仪器约30分钟)→双氧水处理约10分钟→靶标修复试剂处理约10～15分钟→画疏水圈约15分钟→蛋白酶Plus处理约15～30分钟→立即进行ISH检测。
步骤B：探针变性杂交
1.用杂交缓冲液稀释探针，稀释比例为1：50～200，常用比例为1：100。稀释后的探针工作液，于85℃变性5分钟
2.探针工作液于37℃保温2min
3.去除载玻片夹中的载玻片上多余的液体，滴加4-6滴探针混合物(同时加入实施例1中的探针1和探针2)，完全覆盖样本。
4.将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在40℃下孵育2小时。
5.取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜1×清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片2分钟。
步骤C：信号序列与探针1、2杂交
1.去除载玻片上多余的液体，滴加4-6滴AP-信号序列(本实施例中信号序列所带的信号检测基团为碱性磷酸酶AP)，完全覆盖样本。
2.将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在40℃下孵育15分钟。
3.取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜1×清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片2分钟。用新鲜1×清洗缓冲液重复1次。
步骤D：信号序列的检测基团的显色
1.去除载玻片上多余的液体，滴加150-200μL稀释的NBT/BCIP，完全覆盖样本。将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在40℃下孵育30分钟。
2.用新鲜1×清洗缓冲液洗涤载玻片，在室温下洗涤2分钟。用新鲜1×清洗缓冲液重复此步骤。
3.去除载玻片上多余的液体，滴加4-6滴HRP阻断剂，完全覆盖样本。
4.将载玻片夹放入湿盒，盖上盖，放入杂交炉。在40℃下孵育15分钟。
5.取出载玻片夹，立即将其放入盛有新鲜1×清洗缓冲液的清洗槽中。不时地晃动清洗槽，在室温下清洗载玻片2分钟。用新鲜1×清洗缓冲液重复1次。
步骤E：复染细胞核
1.去除载玻片上多余的液体，滴加核固红复染，37℃,染色5-10min，水洗几次；
2.快速脱水透明：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min--无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
步骤F：显微镜镜检，图像采集分析。结果如图10、11所示：相对于传统探针，其背景信号减少，降低假阳性的概率，目的基因所在组织结构清晰可见。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州烨善生物科技有限公司
<120> 一种原位杂交探针
<130> 1.19
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
tcacaacctc ctagaaagag taga 24
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
caagctcaac tggattgtcg tggagtcggc aattcagttg aggaagaaca t 51
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
tctactcttt ctaggaggtt gtga 24
Claims (4)
1.一种原位杂交探针，其特征在于，所述探针包括探针序列和信号序列;所述探针序列包括5’端接头序列、中部连接序列和3’端目的基因检测序列, 所述中部连接序列具有茎环结构, 所述中部连接序列的核苷酸如SEQ ID NO:2所示；所述5’端接头序列的核苷酸如SEQID NO:1所示；所述信号序列包括两个可与所述探针序列的5’端接头序列特异结合的序列，以及连接两个所述特异结合的序列的中部延长序列；所述可与所述探针序列的5’端接头序列特异结合的序列的核苷酸如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的原位杂交探针，其特征在于，所述3’端目的基因检测序列不形成发夹结构，并且根据所要检测的目的序列设计碱基序列。
3.如权利要求1所述的原位杂交探针，其特征在于，所述信号序列还包括信号检测基团。
4.一种用于非疾病诊断的检测目的序列的方法，其特征在于，通过以下方法实现：通过使用如权利要求1~3任一项所述的原位杂交探针与所述目的序列形成目的序列-探针-信号基团序列复合物，检测所述复合物生产的信号值。
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-
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