CN101275137A - 鼠源IgG核酸适配子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于它是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一；制备方法包括：(1)用PCR制备ssDNA文库、(2)反筛与筛选、(3)克隆及阳性克隆的序列测定；应用：其特征在于在实验室、临床及工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯化。本发明的优越性：本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感；因此，SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。

Description

鼠源IgG核酸适配子及其制备方法和应用

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----系统进化指数富集技术设计和制备一组与鼠源IgG高特异性和高亲和力结合的鼠源IgG核酸适配子及其应用。

(二)背景技术：

鼠源IgG是用于抗原检测的单抗的主要种类，广泛应用于实验室和临床诊断领域。其高特异性、高亲和性的配体，对于鼠IgG的分离纯化以及检测具有重要意义，可替代生物医学研究中广泛使用的二抗。

SELEX技术(系统进化指数富集技术)是90年代初研制的一种新的组合化学技术，其利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在20～40bp左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间，由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适配子具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d.稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的是提供一种鼠源IgG核酸适配子，它通过SELEX技术筛选鼠IgG的核酸适配子，与现有鼠IgG的特异性抗体相比，本发明中的核酸适配子具有更高的特异性、亲和力，因此可替代抗体，用于简洁快速、高灵敏度、高特异性的鼠IgG检测及分离纯化方法的建立。

本发明的第二个目的是提供一种鼠源IgG核酸适配子替代抗体在鼠源IgG检测上的应用或用于鼠源IgG的分离纯化。

本发明的第三个目的是提供第二种鼠源IgG核酸适配子。

本发明的第四个目的是提供第二种鼠源IgG核酸适配子在鼠源IgG检测上的应用或用于鼠源IgG的分离纯化。

本发明的技术方案：一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于，它是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一。

上述所述的SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列具有下述结构之一：

上述所述的核苷酸序列也可以是与SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一同源序列占60％以上，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列也可以是与SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一杂交的寡核苷酸序列，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列也可以是用SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一转录的RNA序列。

上述所述的核苷酸序列的不少于一个位置的A或G或C或T或U被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同功能。

一种鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于，它是由以下步骤构成：

(1)用PCR制备ssDNA文库；

文库扩增方案一：

采用对称PCR扩增得到5’端带有生物素的dsDNA文库，后者以链亲和素磁珠为基质进行分离并变性解链，磁分离后经乙醇沉淀得到后续筛选的ssDNA文库。

文库扩增方案二：

采用不对称PCR，获得ssDNA文库。

(2)反筛与筛选

以Protein A-琼脂糖为基质，反筛去掉ssDNA文库中的非特异结合部分，筛选得到与鼠源IgG特异结合的ssDNA；

(3)克隆及阳性克隆的序列测定

扩增数轮筛选后所得次级文库，回收目标片段，经连接、转化，挑取单克隆白斑，对PCR反应鉴定的阳性克隆进行序列测定。

一种鼠源IgG核酸适配子的应用，其特征在于在实验室、临床及工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯化。

上述所述的鼠源IgG核酸适配子的应用，其具有序列表中SEQ IDNo.19～SEQ ID No.36的核苷酸序列之一，用于实验室、临床及工业化，包括鼠源IgG的检测和/或鼠源IgG的分离纯化。

本发明的优越性在于：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感。因此，SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。

(四)附图说明：

图1为检测一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG特异性结合的点杂交实验结果。

图2为一种鼠源IgG核酸适配子检测鼠源IgG的Western Blot实验结果(其中图2-a为核酸适配子检测鼠源IgG的实验结果，图2-b为抗体检测鼠源IgG的实验结果)。

图3为一种鼠源IgG核酸适配子检测鼠源IgG的组织化学实验结果(其中图3-a为核酸适配子检测鼠源IgG的组织化学实验结果，图3-b为鼠源IgG组织化学检测的空白对照)。

(五)具体实施方式：

实施例1

一种鼠源IgG核酸适配子，其特征是具有序列表中SEQ ID No.1～SEQ ID No.18所述的核苷酸序列之一。

SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCAGTCACTC TGTGTTTAAG CCCAGTACCC 50TCTTCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGGG 3’81

SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTAACGC ACGCATGTCA ACAGACGTCC 50GCTGCACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3’80

SEQ ID No.3所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTAGCGACA GACGCAATCC CCACGCGCAT 50CGAGGCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.4所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCAAGA GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50CCCGCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.5所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGGCAGCG ATAGAGCCAT CATCCCCCCC 50CACCCACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3’80

SEQ ID No.6所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCCTCACAC CGTCATTGAT CCTCCGACAC 50AAGCTAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.7所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTCCCTCAGC ACCCAGACCC CGCTTCTCCC 50ACATTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.8所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TACCCGTTAC CCAACCGATT TCCTTACGCC 50GCAATTACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.9所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCGCCCCACA ACACACTGTC CCGCTGCCAT 50CCCGTCAACT TGAGCAAAAT CACCTGCAGG GG 3’82

SEQ ID No.10所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGTGGCCCCG CTCTCTCCTA CCTCTTTCAC 50CACGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.11所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGTATGCTG AGTGTACCAG CCCTTCTCTC 50ACCCTAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.12所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCGCCGAAC CATCTCGATC CCCAGCTGGG 50ACTACACTTG AGCAAAATCA CCTGCAGGGG 3’80

SEQ ID No.13所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCCAACATCC GGCTTCCCGC GTACGCGCGT 50TGTGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.14所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGACCCAAGA GCTGCCTGTG ATTACCCTTC 50CCCGCAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.15所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGCCAATCC CCCAAGGTTC CTCCATTACA 50TCCGACACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.16所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TCAAACGCCC CATACCGTCT TCACCCATCC 50GCCCTCACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

SEQ ID No.17所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TTGAGCCCAT CACCTGCAGG GGACCCCGGA 50TTCACTTGAG CAAAATCACC TGCGGGGG 3’78

SEQ ID No.18所述的核苷酸序列：

5’ATCCGCCTGA TTAGCGATAC TGCACCTGGA AAAGCATAGC TTGAAACATC 50GCACAAACTT GAGCAAAATC ACCTGCAGGG G 3’81

本发明中用于SELEX筛选的单链DNA随机库及引物由invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’CCCCTGCAGGTGATTTT GCTCAA GT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’，库容量为10¹⁴以上，引物1：5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’，引物2：5’-biotin-ATCCGCCTGA TTAGCGATACT 3’，引物3：5’biotin-CCCCTGCAGGT GATTTTGCTCAAGT3’，引物4：5’-ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3’。鼠源IgG购于天津华生生物技术有限公司，硝酸纤维素滤膜购于MilliPore公司，寡核苷酸的纯化试剂购于北京天为时代公司，PCR试剂盒和T载体购于Promega公司。

实施例2

一种鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于，它是由以下步骤构成：

(1)用PCR制备ssDNA文库

文库扩增方案一：

PCR反应体系为：

10×扩增缓冲液      10μl

4种dNTP混合物       各200μmol/L

引物1               100pmol(5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’)

引物2               100pmol(5’biotin-ATCCGCCTGATTAGCGAT ACT3’)

模板DNA             1μg(5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-

                    AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’)

Taq DNA聚合酶       2.5U

Mg²⁺                1.5mmol/L

加双或三蒸水至      100μl

PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性1min，65℃退火45sec，72℃延伸30sec，循环30次，最后72℃延伸5min。

将PCR扩增得到5’端带有生物素的dsDNA文库，dsDNA产物经分离纯化，与链亲和素磁珠结合；然后用0.15mol/L的NaOH使dsDNA变性解链，磁分离；液体经乙醇沉淀，溶于TE缓冲液中。98℃加热2min，冰上1min，室温5min，测定吸光度(A)值，作为筛选的ssDNA文库。

文库扩增方案二：

利用引物1、引物2扩增单链DNA文库：采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100∶1，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸7min。将获得的产物(主要为ssDNA)于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置10min，即为ssDNA文库。

(2)反筛与筛选

100pmol随机ssDNA文库和5nmol(tRNA+鲑鱼精DNA)加入10μlProtein A-琼脂糖反筛，在100μl结合缓冲液中室温孵育1hr；然后转移液体，与鼠源IgG-Protein A-琼脂糖25℃结合1hr，用冲洗缓冲液洗6次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与鼠源IgG结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中，用作扩增的模板，进行下一轮筛选，重复筛选20轮。

(3)克隆及阳性克隆的序列测定

以第20轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR，琼脂糖电泳后回收81bp处片断，与T载体4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂板(Amp⁺，IPTG诱导，X-gal为底物)，37℃培养16h后，挑取单克隆白斑，置Amp⁺液体培养基摇菌过夜，提取质粒，如图1所示质粒电泳图。以质粒为模板，以引物1，引物4扩增，如图2所示在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。

实施例3

点杂交实验检测一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG的结合

将不同量鼠源IgG(0，1，2，3，4ng；体积均为10μl)点在硝酸纤维素膜上，待吸收完全，将膜以3％BSA和100μl鲑鱼精DNA室温封闭1-1.5h，然后将获得的5’标记生物素的一种鼠源IgG核酸适配子100pmol以TBS稀释至适当体积，与膜杂交，室温1h，TBST洗后杂交辣根过氧化酶标记的链亲和素，发光显迹，结果阳性，并呈现梯度。表明筛选得到的一种鼠源IgG核酸适配子与鼠源IgG存在特异性结合。

实施例4

Western Blot法测定鼠源IgG

将Hs578T细胞裂解液与加样缓冲液混合，采用Bio-rad的mini-VE电泳系统进行蛋白质SDS-PAGE电泳，分离胶浓度12％，浓缩胶5％，将胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上。用鼠源抗GST_∏抗体与膜孵育，洗涤后用5’标记生物素的一种鼠源IgG核酸适配子与生物素标记的抗鼠IgG的特异性抗体分别杂交，继而与辣根过氧化酶标记的链亲和素孵育，洗涤后用发光显迹液发光，暗室内X光片曝光，X光片显影定影。结果均显示明显的条带，表明一种鼠源IgG核酸适配子可替代抗体用于鼠源IgG的检测。

实施例5

组织化学法检测鼠源IgG

以筛选的所测序列为ATCCGCCTGATTAGCGATACTCAGTCACTCTGTGTTTAAGCCCAGTACCCTCTTCAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG的阳性克隆质粒为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR，引物3(100pmol)/引物4浓度比200∶1，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸7min。反应产物主要为5’生物素标记的DNA适配子，将其于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置10min，作为检测试剂备用。人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，0.3％H₂O₂-甲醇溶液作用30min封闭内源性过氧化物酶，TBS洗5min，与鼠源抗GST_∏抗体孵育后再与制备好的DNA适配子室温孵育1h，设立空白对照组，TBS洗3×5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素(1∶1000稀释)孵育30min，DAB显色液(50mg溶于100ml TB液中，临用前加入10μl 30％H₂O₂)中显色5-10min，镜下观察控制显色程度。结果空白对照组无明显棕黄色沉淀，而与鼠源IgG核酸适配子孵育的乳腺癌组织显示明显的棕黄色沉淀，表明筛选得到的核酸适配子能与鼠源IgG特异结合，从而可用于鼠源IgG的检测和分离纯化。

实施例6

一种鼠源IgG核酸适配子，具有序列表中SEQ ID No.19～SEQ IDNo.36所述的核苷酸序列之一。

SEQ ID No.19所述的核苷酸序列

5’CAGTCACTCT GTGTTTAAGC CCAGTACCCT CTTCA 3’35

SEQ ID No.20所述的核苷酸序列

5’CCCTAACGCA CGCATGTCAA CAGACGTCCG CTGC 3’34

SEQ ID No.21所述的核苷酸序列

5’GTAGCGACAG ACGCAATCCC CACGCGCATC GAGGC 3’35

SEQ ID No.22所述的核苷酸序列

5’GACCCAAGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3’35

SEQ ID No.23所述的核苷酸序列

5’GCGGCAGCGA TAGAGCCATC ATCCCCCCCC ACCC 3’34

SEQ ID No.24所述的核苷酸序列

5’CCCTCACACC GTCATTGATC CTCCGACACA AGCTA 3’35

SEQ ID No.25所述的核苷酸序列

5’TCCCTCAGCA CCCAGACCCC GCTTCTCCCA CATTC 3’35

SEQ ID No.26所述的核苷酸序列

5’ACCCGTTACC CAACCGATTT CCTTACGCCG CAATT 3’35

SEQ ID No.27所述的核苷酸序列

5’CGCCCCACAA CACACTGTCC CGCTGCCATC CCGTCA 3’36

SEQ ID No.28所述的核苷酸序列

5’GTGGCCCCGC TCTCTCCTAC CTCTTTCACC ACGAC 3’35

SEQ ID No.29所述的核苷酸序列

5’TGTATGCTGA GTGTACCAGC CCTTCTCTCA CCCTA 3’35

SEQ ID No.30所述的核苷酸序列

5’GCGCCGAACC ATCTCGATCC CCAGCTGGGA CTAC 3’34

SEQ ID No.31所述的核苷酸序列

5’CCAACATCCG GCTTCCCGCG TACGCGCGTT GTGAC 3’35

SEQ ID No.32所述的核苷酸序列

5’GACCCAAGAG CTGCCTGTGA TTACCCTTCC CCGCA 3’35

SEQ ID No.33所述的核苷酸序列

5’TGCCAATCCC CCAAGGTTCC TCCATTACAT CCGAC 3’35

SEQ ID No.34所述的核苷酸序列

5’CAAACGCCCC ATACCGTCTT CACCCATCCG CCCTC 3’35

SEQ ID No.35所述的核苷酸序列

5’TGAGCCCATC ACCTGCAGGG GACCCCGGAT TC 3’32

SEQ ID No.36所述的核苷酸序列

5’GCACCTGGAA AAGCATAGCT TGAAACATCG CACAA 3’35

SEQ ID No.19所述的核苷酸序列与SEQ ID No.1所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.20所述的核苷酸序列与SEQ ID No.2所述的核苷酸序列第22至55的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.21所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.22所述的核苷酸序列与SEQ ID No.4所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.23所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5所述的核苷酸序列第22至55的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.24所述的核苷酸序列与SEQ ID No.6所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.25所述的核苷酸序列与SEQ ID No.7所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.26所述的核苷酸序列与SEQ ID No.8所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.27所述的核苷酸序列与SEQ ID No.9所述的核苷酸序列第22至57的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.28所述的核苷酸序列与SEQ ID No.10所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.29所述的核苷酸序列与SEQ ID No.11所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.30所述的核苷酸序列与SEQ ID No.12所述的核苷酸序列第22至55的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.31所述的核苷酸序列与SEQ ID No.13所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.32所述的核苷酸序列与SEQ ID No.14所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.33所述的核苷酸序列与SEQ ID No.15所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.34所述的核苷酸序列与SEQ ID No.16所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.35所述的核苷酸序列与SEQ ID No.17所述的核苷酸序列第22至53的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQ ID No.36所述的核苷酸序列与SEQ ID No.18所述的核苷酸序列第22至56的碱基顺序一致，这两个序列所示的一种鼠源IgG核酸适配子具有相同的功能。

SEQUENCE LISTING

<110>国家纳米技术与工程研究院

<120>鼠源IgG核酸适配子及其制备方法和应用

<130>2007101880615

<140>2007101880615

<141>2007-11-23

<150>200610130352.4

<151>2006-12-15

<160>36

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atccgcctga ttagcgatac tcagtcactc tgtgtttaag cccagtaccc tcttcaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>2

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atccgcctga ttagcgatac tccctaacgc acgcatgtca acagacgtcc gctgcacttg    60

agcaaaatca cctgcagggg                                                80

<210>3

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atccgcctga ttagcgatac tgtagcgaca gacgcaatcc ccacgcgcat cgaggcactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>4

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>5

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atccgcctga ttagcgatac tgcggcagcg atagagccat catccccccc cacccacttg    60

agcaaaatca cctgcagggg                                                80

<210>6

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atccgcctga ttagcgatac tccctcacac cgtcattgat cctccgacac aagctaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>7

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atccgcctga ttagcgatac ttccctcagc acccagaccc cgcttctccc acattcactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>8

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atccgcctga ttagcgatac tacccgttac ccaaccgatt tccttacgcc gcaattactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>9

<211>82

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atccgcctga ttagcgatac tcgccccaca acacactgtc ccgctgccat cccgtcaact    60

tgagcaaaat cacctgcagg gg                                             82

<210>10

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atccgcctga ttagcgatac tgtggccccg ctctctccta cctctttcac cacgacactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>11

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atccgcctga ttagcgatac ttgtatgctg agtgtaccag cccttctctc accctaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>12

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

atccgcctga ttagcgatac tgcgccgaac catctcgatc cccagctggg actacacttg    60

agcaaaatca cctgcagggg                                                80

<210>13

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

atccgcctga ttagcgatac tccaacatcc ggcttcccgc gtacgcgcgt tgtgacactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>14

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

atccgcctga ttagcgatac tgacccaaga gctgcctgtg attacccttc cccgcaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>15

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

atccgcctga ttagcgatac ttgccaatcc cccaaggttc ctccattaca tccgacactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>16

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

atccgcctga ttagcgatac tcaaacgccc cataccgtct tcacccatcc gccctcactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>17

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

atccgcctga ttagcgatac ttgagcccat cacctgcagg ggaccccgga ttcacttgag    60

caaaatcacc tgcggggg                                                  78

<210>18

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

atccgcctga ttagcgatac tgcacctgga aaagcatagc ttgaaacatc gcacaaactt    60

gagcaaaatc acctgcaggg g                                              81

<210>19

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cagtcactct gtgtttaagc ccagtaccct cttca                               35

<210>20

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

ccctaacgca cgcatgtcaa cagacgtccg ctgc                                34

<210>21

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gtagcgacag acgcaatccc cacgcgcatc gaggc    35

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca    35

<210>23

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gcggcagcga tagagccatc atcccccccc accc     34

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

ccctcacacc gtcattgatc ctccgacaca agcta    35

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

tccctcagca cccagacccc gcttctccca cattc    35

<210>26

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

acccgttacc caaccgattt ccttacgccg caatt     35

<210>27

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

cgccccacaa cacactgtcc cgctgccatc ccgtca    36

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gtggccccgc tctctcctac ctctttcacc acgac     35

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

tgtatgctga gtgtaccagc ccttctctca cccta     35

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gcgccgaacc atctcgatcc ccagctggga ctac      34

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

ccaacatccg gcttcccgcg tacgcgcgtt gtgac    35

<210>32

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

gacccaagag ctgcctgtga ttacccttcc ccgca    35

<210>33

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

tgccaatccc ccaaggttcc tccattacat ccgac    35

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

caaacgcccc ataccgtctt cacccatccg ccctc    35

<210>35

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

tgagcccatc acctgcaggg gaccccggat tc       32

<210>36

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gcacctggaa aagcatagct tgaaacatcg cacaa    35

Claims (10)

1. 一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于，它是具有序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列之一。

2. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的SEQ ID No.1～SEQ ID No.18的核苷酸序列具有下述结构之一：

3. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的核苷酸序列也可以与SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一同源序列占60％以上，使其具有相同功能。

4. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的核苷酸序列也可以与SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一杂交的寡核苷酸序列，使其具有相同功能。

5. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的核苷酸序列也可以用SEQ ID No.1～SEQ ID No.18中的一种鼠源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一转录的RNA序列。

6. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的核苷酸序列的不少于一个位置的A或G或C或T或U被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后，使其具有相同功能。

7. 根据权利要求1所说的一种鼠源IgG核酸适配子，其特征在于所说的核苷酸序列的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同功能。

8. 一种上述鼠源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于它是由以下步骤构成：

(1)用PCR制备ssDNA文库；

文库扩增方案一：

采用对称PCR扩增得到5’端带有生物素的dsDNA文库，后者以链亲和素磁珠为基质进行分离并变性解链，磁分离后经乙醇沉淀得到后续筛选的ssDNA文库。

文库扩增方案二：

采用不对称PCR，获得ssDNA文库。

(2)反筛与筛选

以Protein A-琼脂糖为基质，反筛去掉ssDNA文库中的非特异结合部分，筛选得到与鼠源IgG特异结合的ssDNA；

(3)克隆及阳性克隆的序列测定

扩增数轮筛选后所得次级文库，回收目标片段，经连接、转化，挑取单克隆白斑，对PCR反应鉴定的阳性克隆进行序列测定。

9. 一种上述鼠源IgG核酸适配子的应用，其特征在于在实验室、临床及工业化的应用，包括用于鼠源IgG的检测、鼠源IgG的分离纯化。

10. 根据权利要求9所说的一种鼠源IgG核酸适配子的应用，其特征在于所说的具有序列表中SEQ ID No.19～SEQ ID No.36的核苷酸序列之一，用于实验室、临床及工业化，包括鼠源IgG的检测和/或鼠源IgG的分离纯化。