CN101880313A

CN101880313A - 一种分离纯化抗体的方法

Info

Publication number: CN101880313A
Application number: CN2009102241529A
Authority: CN
Inventors: 吴淑庆; 弓景波; 杨在明; 张良
Original assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Current assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2010-11-10

Abstract

一种分离纯化抗体的方法，其特征在于它采用核酸适体即aptamer作为亲和分离配基进行抗体的分离纯化，包括以下步骤：(1)分离纯化抗体用核酸适体的筛选；(2)核酸适体与分离基质的偶联；(3)抗体的分离纯化。其优越性在于：纯化的成本低、质量稳定、效率高，而且能纯化任何来源的抗体，能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体。

Description

一种分离纯化抗体的方法

(一)技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种分离纯化抗体的方法。

(二)背景技术：

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，是能与相应抗原特异结合，产生各种免疫效应的球蛋白。随着生物技术的发展，抗体技术屡获突破，单克隆抗体、多克隆抗体和基因工程抗体现已广泛应用于生物学和医学研究领域。抗体的主要用途包括：1.作为研究工作中的探针或亲合层析的配体，用于生物学及医学的研究以及工业纯化；2.作为医学检验试剂或动植物病原、食品菌原等检验试剂，用于实验室、临床诊断产品及影象诊断试剂的开发，并发展动物疫苗；3.作为生物治疗的导向武器或免疫抑制剂，用于临床治疗。

然而，抗体的各种用途往往对抗体本身的纯度要求较高。尽管抗体纯化方法较多，如传统的DEAE离子交换色谱法、硫酸铵沉淀法等，但在很多情况下纯化效率均不理想，Protein A/Protein G纯化法以及用特异性抗原结合的亲和柱纯化法因具有较高的效率而最为常用，不过这两种方法除试剂成本较高外，特异性抗原纯品的获得也并非易事，而且抗原的品质直接影响抗体的纯度。

作为组合化学技术发展的最新成果，核酸适体(aptamer)与靶分子高特异性、高亲和力的结合已经得到确认。此外，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适体还具有许多优势：a.适体通过体外筛选制备，不依赖动物、细胞，筛选成本低；b.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约生产成本，且合成精确度高，重复性强，批间差异小；c.能区别靶标间的微小差异；d.其与靶标间的亲和性和特异性高于抗原抗体；e.稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感；f.适体的变性是可逆的，变性的适体可在数分钟内再生，因而可反复使用；g.化学修饰及标记非常容易实现。因此，寡核苷酸适体在生物分子分离、分析方面具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种分离纯化抗体的方法，它能够解决现有技术的不足，其不同于以抗原或protein A/G为分离试剂的纯化方法，无需纯化的抗原作偶联试剂，不易失活，可多次反复再生，具有成本低、质量稳定、效率高的特点。

本发明的技术方案：一种分离纯化抗体的方法，其特征在于它采用核酸适体即aptamer作为亲和分离配基进行抗体的分离纯化，包括以下步骤：

(1)分离纯化抗体用核酸适体的筛选；

(2)核酸适体与分离基质的偶联；

(3)抗体的分离纯化。

上述所说的核酸适体为以抗体通用型核酸适体或抗体亚型特异性核酸适体。

上述所说的核酸适体为通过体外筛选获得的与抗体或抗体不同亚型有特异结合能力的核酸序列。

上述所说的核酸适体为与抗体具有特异性结合能力的DNA序列或RNA序列。

上述所说的步骤(3)中的抗体的分离纯化是利用亲和色谱技术或磁分离技术纯化相应抗体。

上述所说的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

上述所说的抗体包括人源、鼠源、兔源、羊源、猪源或鸡源抗体。

本发明的技术效果：本发明所涉一种分离纯化抗体的方法，是以核酸适体为分离试剂的分离纯化抗体的方法，即以抗体通用型核酸适体或抗体亚型特异性核酸适体作为亲和配基，利用亲和色谱技术或磁分离技术纯化相应抗体；其不同于以抗原或protein A/G为分离试剂的纯化方法，无需纯化的抗原作偶联试剂，不易失活，可多次反复再生，具有成本低、质量稳定、效率高的特点，尤其适用于规模化生产，而且能纯化任何来源的抗体，能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体。

(四)具体实施方式：

实施例1：一种分离纯化抗体的方法，即基于抗体通用性核酸适体的人源化基因工程抗体的纯化

抗体通用性核酸适体的筛选：

本发明中用于SELEX筛选的单链DNA随机库及引物由invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT3’，库容量为10¹⁴以上，引物1：5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’，引物2：5’-biotin-ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3’，引物3：5’biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT3’，引物4：5’-ATCCGCCTGATTAGCGATACT3’。人Kappa轻链购于Southern Biotech公司，寡核苷酸的纯化试剂购于QIAGEN公司，PCR试剂盒和T载体购于Promega公司。

用PCR制备ssDNA文库：PCR反应体系为

10×扩增缓冲液 10μl

4种dNTP混合物各200umol/L

引物1 100pmol(5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’)

引物2 100pmol(5’-biotin-ATCCGCCTGATTAGCGATACT3’)

模板DNA 1μg(5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT 3’)

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg²⁺ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100μl

PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸2min，最后72℃延伸7min。

将PCR扩增得到3’端带有生物素的dsDNA文库，dsDNA产物经分离纯化，与链亲和素磁珠结合；然后用0.15mol/L的NaOH使dsDNA变性解链，磁分离；液体经乙醇沉淀，溶于TE缓冲液中。98℃加热2min，冰上1min，室温5min，测定吸光度(A)值，作为筛选的ssDNA文库。

100pmol随机ssDNA文库和5nmol(tRNA+鲑鱼精DNA)加入20μl对照磁珠(0.1mg)反筛去除与背景结合的ssDNA。在100μl结合buffer中25℃结合40min，磁分离；然后转移液体与Kappa轻链磁珠(0.1mg)37℃结合40min，用冲洗缓冲液洗6次，洗去未结合的ssDNA，再加洗脱缓冲液于80℃作用10min，洗脱下与Kappa链结合的ssDNA，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中，经PCR扩增成dsDNA。用生物素-链亲和素磁珠分离ssDNA，用作下一轮筛选的ssDNA文库，重复筛选20轮。

T载体连接、测序：以第20轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR，琼脂糖电泳后回收81bp处的片断，与T载体4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂板(Amp⁺，IPTG诱导，X-gal为底物)，37℃培养16h后，挑取单克隆白斑，置Amp⁺液体培养基摇菌过夜，提取质粒。以质粒为模板，以引物1、引物4扩增，在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。

采用SPR进行核酸适体的亲和力分析，得到理想序列5’cccctgcagg tgattttgct caagtccaat aaccaaacgt ataataggcataccctcgaa agtatcgcta atcaggcgga t 3’。

人源基因工程抗体的分离纯化：

具有活性氨基末端的层析柱与0.25％的PDITC溶液于37℃作用2h，清洗后以PBS平衡，加入适量氨基化的核酸适体5’cccctgcaggtgattttgct caagtccaat aaccaaacgt ataataggca taccctcgaaagtatcgcta atcaggcgga t 3’，37℃作用2h，用甘氨酸封闭未结合位点。待分离纯化的人源抗TNFα基因工程抗体scFV溶液进样后，缓冲液洗5个柱体积，然后，用含1M NaCl的0.5M乙酸钠缓冲液(pH5.2)洗脱，收集组分，即为纯化抗体。

实施例2：一种分离纯化抗体的方法，即基于抗体亚型特异性核酸适体的鼠源单克隆抗体的纯化

抗体亚型特异性核酸适体的筛选：

初级RNA文库通过体外转录的方法制备。首先采用组合化学法合成含30个随机序列的单链DNA文库：5’-GTCACTGTCTTCATAGGTTG-N30-GAATCAGT GAGACATCCC 3’，用于体外筛选；文库用8％的变性聚丙烯酰胺胶纯化后，通过引物1(5’-GTCACTGTCTTCATAGGTTG-3’)和引物2(5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTCACTGATTC-3’)扩增；引物2含T7 RNA聚合酶启动子的非转录区，用T7体外转录试剂盒转录合成RNA，DNA模板用无RNA酶的DNA酶消化，酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀RNA，溶解后用8％的变性聚丙烯酰胺胶纯化，即为初级RNA文库。

抗小鼠IgG1抗体购于Southern Biotech公司，筛选与其有特异结合能力的核酸适体。将抗小鼠IgG1抗体与抗小鼠IgG2a、2b、3抗体分别包被于96孔板，以抗小鼠IgG2a、2b、3抗体为反筛对象，将其与以上制备的初级RNA文库作用，吸取未结合部分再与抗小鼠IgG1抗体孵育，洗去未与抗小鼠IgG1抗体结合的部分，然后将已结合RNA洗脱下来，作为次级RNA文库参与下轮筛选。重复筛选15轮。

多克隆核酸适体经克隆测序及亲和力分析，得到可用于抗小鼠IgG1抗体纯化的核酸适体5’-GGGAUGUCUCACUGAUUCCCACCGUAACCCACCUUAGCUUUCCACGAACAACCUAUGAAGACAGUGAC-3’。

鼠源单克隆抗体的分离纯化：

合成上述核酸适体，并将其3’端用氨基修饰；用0.25％的PDITC溶液将其与具有活性氨基末端的磁珠偶联，37℃作用2h，用甘氨酸封闭未结合位点。向偶联有抗小鼠IgG1抗体之核酸适体的磁珠中加入待分离纯化的鼠源抗TNFα单克隆杂交瘤细胞上清液，用含1M NaCl的0.5M乙酸钠缓冲液(pH5.2)洗脱，磁分离即得纯化的鼠源抗TNFα单克隆抗体之IgG1亚型。

Claims

1.一种分离纯化抗体的方法，其特征在于它采用核酸适体即aptamer作为亲和分离配基进行抗体的分离纯化，包括以下步骤：

(1)分离纯化抗体用核酸适体的筛选；

(2)核酸适体与分离基质的偶联；

(3)抗体的分离纯化。

2.根据权利要求1所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的核酸适体为以抗体通用型核酸适体或抗体亚型特异性核酸适体。

3.根据权利要求1或2所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的核酸适体为通过体外筛选获得的与抗体或抗体不同亚型有特异结合能力的核酸序列。

4.根据权利要求3所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的核酸适体为与抗体具有特异性结合能力的DNA序列或RNA序列。

5.根据权利要求1所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的步骤(3)中的抗体的分离纯化是利用亲和色谱技术或磁分离技术纯化相应抗体。

6.根据权利要求1所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。

7.根据权利要求1或6所说的一种分离纯化抗体的方法，其特征在于所说的抗体包括人源、鼠源、兔源、羊源、猪源或鸡源抗体。