CN108929875B - 一种基于dna适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞的方法 - Google Patents

一种基于dna适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于DNA适体的分离胚胎干细胞和表面固定胚胎干细胞的方法。所述DNA适体与胚胎干细胞具有很强的结合特性和稳定性。该适体的获得是应用SELEX技术和流式细胞法的结合，以胚胎干细胞为靶目标，从随机文库中筛选出能与其特异性结合的DNA适体。该适体通过体外合成，无批间差异、合成成本低，与胚胎干细胞的结合具有高亲和力和选择性，无免疫原性或毒性作用，具有极大的应用价值。

Description

一种基于DNA适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞 的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于DNA适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)中经分离、体外抑制分化培养得到的具有发育全能性(或多能性)的一类干细胞。与已经成熟分化的体细胞一样，胚胎干细胞细胞也是一分为二地分裂增殖，且胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，胚胎干细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现“永生”。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞都能被诱导分化为内、中、外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，胚胎干细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用。
治疗应用和组织工程应用迫切需要一种快速有效的方法从胚胎直接分离胚胎干细胞。且目前的传统胚胎干细胞分离方法分离对象主要是针对动物，如猪、小鼠、鸡等。因此，探索一种有效的从人胚胎直接分离胚胎干细胞的方法具有潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离胚胎干细胞的适体。
本发明的进一步目的在于提供一种特异性高的分离胚胎干细胞的适体。
本发明的进一步目的在于提供一种稳定性高的分离胚胎干细胞的适体。
本发明另一个目的在于提供一种基于DNA适体分离胚胎干细胞的方法。
本发明另一个目的在于提供一种基于DNA适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞的方法。
本发明另一个目的在于提供一种筛选适体的方法。
为解决以上技术问题，本发明设计了一种适体。
适体是单链DNA(ssDNA)或RNA分子，可折叠成三维结构以结合多种靶标，包括蛋白质，肽，酶，抗体和各种细胞表面受体。适体的长度可达100个碱基，可通过指数富集(SELEX)系统进化配体的体外选择过程从组合文库中产生。与其他靶向剂相比，适体具有显著的优势。它们以高亲和力和选择性与其靶标结合，没有免疫原性或毒性作用，并显示出快速的循环清除率。而且，它们可以在体外很容易合成。适体用于诊断和治疗领域，作为特异性抑制剂或作为生物传感器来检测预期目标。
适体可以筛选多种来源的间充质干细胞，以及造血干细胞，但是还没有关于分离人胚胎干细胞的报道。本领域公知，不同类型的细胞，其细胞性质不同，尤其是细胞表面受体不同，每种细胞均有其特异性的表面受体，因此，适用于一种类型细胞筛选的适体，一般情况下并不能用于另外一个细胞的筛选。胚胎干细胞能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型(全能性)，即可以分化成成体干细胞，如间充质干细胞或者造血干细胞。而成体没有胚胎干细胞的全能性。这也反应了胚胎干细胞区别于一般的成体干细胞，适用于成体干细胞的适体不一定能够适应本发明中的胚胎干细胞。
通过大量的研究，本发明找到了一种可以特异性筛选胚胎干细胞的适体。
一方面，本发明提供了一种特异性结合胚胎干细胞的适体片段序列。其中，所述适体片段序列为DNA适体片段序列SEQ ID NO：5TAGGAGGAGGTATTTAGTGCCAAGCCTTCTCAAACGACGT。
另一方面，本发明提供了一种适体，所述适体含有上述的适体片段序列。
作为一种优选的实施方式，所述的适体含有序列SEQ ID NO：3 5'-GAATTCAGTCGGACAGCGTAGGAGGAGGTATTTAGTGCCAAGCCTTCTCAAACGACGTGATGGACGAATATCGTCTCCC-3'。
作为一种可选的实施方式，所述的适体上连接有标记。
作为一种优选的实施方式，所述的标记选自荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶标记；优选地，所述的标记选自生物素。
另一方面，本发明提供了一种含有上述适体片段序列/适体的试剂盒。
另一方面，本发明提供了一种上述适体片段序列/适体/试剂盒在筛选/分离胚胎干细胞的应用。
另一方面，本发明提供了一种筛选上述适体片段序列或适体的方法，包括以下步骤：
(1)合成以下所示随机序列的ssDNA文库和引物：
随机文库：5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTCCC-3'
正向引物：5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-3'
反向引物：5'-Bio-GGGAGACGATATTCGTCCATC-3'；
(2)SELEX筛选胚胎干细胞特异适体：
随机ssDNA文库加入筛选缓冲液中，加热；
-4～4℃放置5～15分钟，加入酵母tRNA和牛血清白蛋白；
加入胚胎干细胞，35～40℃温育25～35分钟；
离心去上清，沉淀用缓冲溶液洗涤后，用去离子水重悬细胞，95～105℃加热1～10分钟；
离心后取上清液，上清中含有ssDNA，即为本轮筛选所得适体文库；
(3)PCR扩增文库：将步骤(2)中筛选得到的特异性适体文库，利用(1)中的所示引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
(4)下轮ssDNA筛选文库制备：将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过盐除柱后收集滴下的溶液，即为下轮ssDNA筛选文库；
(5)重复筛选：将步骤(4)中得到的ssDNA筛选文库重复上述步骤(2)～(4)的过程一次；
(6)流式细胞术监测文库：用荧光标记每轮筛选得到的ssDNA文库，用流式细胞术检测荧光标记，将荧光强度不再增强，荧光强度最强的那一轮ssDNA为产物，将所得筛选产物克隆测序分析，获得可以用于筛选胚胎干细胞的适体；所述的胚胎干细胞来源于已确立的胚胎干细胞系。
其中，指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)，即SELEX技术，其基本思想是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合，混合液中存在靶物质与核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被弃去，而适体(Aptamer)即与靶物质有高亲和力的DNA或RNA从非常大的随机文库中分离出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，从P摩尔到n摩尔，最后占据库的大多数(>90％左右)。
所述的适体也可以用于非直接胚胎来源的胚胎干细胞的纯化和分离。
本发明的有益效果：
1、首次获得了一种能够特异高效结合人胚胎干细胞的适体，该适体通过体外合成，无批间差异、合成成本低；与人胚胎干细胞的结合具有高亲和力和选择性。
2、以DNA适体为基础可以构建特异性筛选和富集人胚胎干细胞的方法。
3、本发明得到的适体在血浆中能稳定24小时不被核酸酶降解，即不需要额外的修饰来提高其稳定性，适用性好。
附图说明
图1为胚胎干细胞的DNA适体筛选过程中，ssDNA与胚胎干细胞特异性结合荧光强度：A为第2轮筛选结果，B为第5轮筛选结果，C为第8轮筛选结果，D为第10轮筛选结果，E为第11轮筛选结果；
图2为生物素-链亲和素固定G-8分离胚胎干细胞实验中细胞附着培养板的情况：A包被适体的培养板上(实验组)的细胞附着情况，B为未包被适体的培养板上(对照组)的细胞附着情况；
图3为用cy-5标记的G-8与胚胎干细胞结合后用流式细胞术检测的荧光结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1随机ssDNA文库的构建和引物合成
构建ssDNA文库，两端为固定系列，中间为40个碱基的中心随机序列：5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTCCC-3'。文库的大小约为1015。
在筛选过程中用于扩增和克隆的寡核苷酸引物分别是：
正向引物SEQ ID NO：1 5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-3'；
生物素标记的反向引物SEQ ID NO：2 5'-Bio-GGGAGACGATATTCGTCCATC-3'。
实施例2SELEX程序
1、胚胎干细胞的DNA适体的筛选
(1)文库预处理：ssDNA文库加入到含有50mM Tris-HCl(pH7.4)，5mM KCl，100mMNaCl，1mM MgCl2和0.1％NaN3的筛选缓冲液中，其中ssDNA文库终浓度为4nM。90℃加热10分钟，使所述ssDNA文库变性。然后在0℃下放置10分钟，加入过量的酵母tRNA和牛血清白蛋白((浓度均为ssDNA文库浓度的5倍以上)。
(2)孵育：向上述含有ssDNA库的筛选缓冲液中加入106个人胚胎干细胞(H9)，37℃温育30分钟。离心(1200rpm，5min)后，去上清，沉淀用1mL筛选缓冲液(含有0.2％BSA)洗涤三次。
(3)解离：用去离子水重悬细胞，100℃加热5分钟，离心(1200rpm，5min)后取上清液。即为本轮筛选所得的DNA适体文库。
(4)进行PCR扩增文库：扩增条件为(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分钟，然后72℃10分钟，进行25次循环)。扩增引物：正向引物SEQ ID NO：1 5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-3'；生物素标记的反向引物SEQ ID NO：2 5'-Bio-GGGAGACGATATTCGTCCATC-3'。
表1配液体系
Figure BDA0001734727910000051
(6)制备DNA单链文库：将100μL链霉亲和素修饰的琼脂糖微球5000rpm离心去上清，再用500μL PBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。将步骤(5)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂微球在常温下孵育半小时，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面；5000rpm离心去上清，用PBS离心洗涤两次。然后加入200mM NaOH溶液500μL至琼脂糖微球中用于双链DNA的变性处理，常温反应15min，5000rpm离心5min，收集上清。除盐柱用100mL无菌水洗涤后，加入碱变性后收集到的上清液，自然滴完。加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，此即为本轮筛选所得ssDNA文库。此轮文库分成两份，一份用于下轮筛选，一份荧光标记后与胚胎干细胞结合，流式细胞测定荧光。
(7)重复筛选：将步骤(6)得到的单链文库重复上述(2)～(6)所述的步骤(其中从第二轮开始人胚胎干细胞个数为105，其他步骤一样)。
(8)实验结果
在连续的筛选循环中，流式细胞检测荧光标记从第二轮开始向更高的荧光强度转变。以第2轮、第5轮、第8轮、第10轮的样品荧光检测结果为例，如图1所示，从第1轮到第10轮，荧光强度逐渐增加。而实验结果显示，人胚胎干细胞筛选的第11轮的荧光没有进一步增加。说明第10轮筛选得到了特异性最强的适体。
因此，将第10轮得到的含ssDNA的上清液作为扩增模板。
备注:上述人胚胎干细胞来源于现有的人类胚胎干细胞系(H9)。
2、PCR扩增DNA适体
将第10轮筛选出来的DNA适体用流式筛选出一条跟干细胞结合最优的(细胞荧光最强的)作为模板进行扩增，配液体系如表1所示。扩增条件为(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分钟，然后72℃10分钟，进行25次循环)。扩增引物：正向引物SEQ ID NO：1 5'-GAATTCAGTCGGACAGCG-3'；生物素标记的反向引物SEQ ID NO：2 5'-Bio-GGGAGACGATATTCGTCCATC-3'。
表2配液体系
Figure BDA0001734727910000061
使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增后的DNA克隆到大肠杆菌中，通过质粒提取试剂盒分离单个克隆的质粒，进行常规PCR扩增后，用ABI PRISM 377DNA测序仪测定序列。测得的序列为:SEQ ID NO：3
5'-
GAATTCAGTCGGACAGCGTAGGAGGAGGTATTTAGTGCCAAGCCTTCTCAAACGACGTGATGGACGAATATCGTCTCCC-3'，命名为G-8。
实施例3DNA适体分离胚胎干细胞
人胚胎浆的来源：4-8周自然流产的人胚胎，并已知情同意。
1、生物素-链亲和素固定G-8分离胚胎干细胞
用链霉亲和素包被12孔细胞培养板，在4℃温育过夜，然后用PBS-T(0.05％Tween-20)洗涤三次。分成两组：
(1)实验组：将1nmol生物素标记的适体加入包被过的培养板中，30℃温育4小时；
(2)阴性对照组：将1nmol生物素标记的随机文库(对照组)加入包被过的培养板中，30℃温育4小时。
接着，将两组培养板用PBS-T洗板，然后加入新鲜人胚胎浆，37℃温育30分钟，同时轻轻摇动。取出平板，洗涤平板以弃去未贴壁细胞。在倒置显微镜下观察细胞附着，如图2所示。
表3细胞附着数目
分组 附着细胞数目
实验组 216.7±13.3
对照组 34.3±5.1
结果：将生物素化的适体固定在链霉亲和素包被的平板上。将新鲜胚胎浆加入平板并温和振荡温育30分钟。由图2可知，在较短时间内附着在适体板上的细胞(实验组)明显多于对照组。说明本发明的适体可以捕获人胚胎干细胞，可用于分选胚胎干细胞。
2、流式细胞分选法
将20mL新鲜人胚胎浆在37℃与4nmol cy-5标记的适体G-8温育30分钟，然后洗涤三次。利用流式细胞术进行细胞筛选，由如图3可知，cy-5标记的适体G-8可与人胚胎干细胞结合从而显强烈荧光，说明本发明的适体可捕获人胚胎干细胞，可用于分选胚胎干细胞。
3、适体在血浆中的稳定性检测
用3000克全血离心20分钟制备新鲜人血浆。将8nmo1SEQ ID NO：3、随机ssDNA:SEQID NO：4
(GGGAGCTCAGCCTAAACGCTCAAGGATCGTTCGCAACGGTTCGACGCAGTTCGTTCGACATGAGGCCCGGATC)分别加入0.5mL新鲜人肝素化血浆中，37℃孵化。
在0.5、1、2、4、6、24h的时间点取50uL样品。通过加入5uL的负载缓冲液终止反应，然后将混合物储存在冰中。用2％琼脂糖凝胶电泳实验进行检测，结果如表4。
表4 ssDNA血浆稳定性
时间点(h) G-8ssDNA组 随机ssDNA组
0.5 未降解 降解
1 未降解 降解
2 未降解 降解
4 未降解 降解
6 未降解 降解
24 未降解 降解
结果：对于临床或治疗应用，适体应该抵抗外切核酸酶和内切核酸酶的快速降解。人血浆主要含有高3'核酸外切酶活性。在人血浆中，随机序列不能抵抗等离子体的降解。从实验结果可以看出，随机ssDNA在0.5h就开始出现降解，而未修饰的适体SEQ ID NO：3可以稳定24小时不被核酸酶降解，即不需要额外的修饰来提高其稳定性。
序列表
<110> 多能干细胞再生医学科技（广州）有限公司
<120> 一种基于DNA适体的胚胎干细胞分离和表面固定胚胎干细胞的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 1
gaattcagtc ggacagcg 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 2
gggagacgat attcgtccat c 21
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 3
gaattcagtc ggacagcgta ggaggaggta tttagtgcca agccttctca aacgacgtga 60
tggacgaata tcgtctccc 79
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 4
gggagctcag cctaaacgct caaggatcgt tcgcaacggt tcgacgcagt tcgttcgaca 60
tgaggcccgg atc 73
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 5
taggaggagg tatttagtgc caagccttct caaacgacgt 40

Claims (8)

1.一种适体，其特征在于，所述适体为如SEQ ID NO：3所示的片段序列。
2.根据权利要求1所述的适体，其特征在于，所述的适体上连接有标记。
3.根据权利要求2所述的适体，其特征在于，所述的标记选自荧光物质、放射性物质、治疗性物质、纳米发光材料和酶标记中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的适体，其特征在于，所述的标记选自生物素、地高辛中的一种或两种。
5.根据权利要求2所述的适体，其特征在于，所述的标记选自生物素。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1-5任一所述的适体。
7.权利要求1-5任一所述的适体在筛选/分离胚胎干细胞中的应用。
8.权利要求6所述的试剂盒在筛选/分离胚胎干细胞中的应用。
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Title
Characterization and target identification of a DNA aptamer that labels pluripotent stem cells;Zhonggang Hou等;《Cell research》;20150331;第25卷(第3期);第390页左栏第1段、右栏第2-3段及图1 *
Selection of RNA aptamers against mouse embryonic stem cells;ToshiroIwagawa等;《Biochimie》;20120131;第94卷(第1期);第250-257页 *
全细胞的核酸适配体筛选的研究进展;刘品多等;《色谱》;20160430;第34卷(第4期);第382-388页 *

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CN108929875A (zh) 2018-12-04

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