TWI626315B - DNA 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine gene mapping method - Google Patents
DNA 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine gene mapping method Download PDFInfo
- Publication number
- TWI626315B TWI626315B TW106102252A TW106102252A TWI626315B TW I626315 B TWI626315 B TW I626315B TW 106102252 A TW106102252 A TW 106102252A TW 106102252 A TW106102252 A TW 106102252A TW I626315 B TWI626315 B TW I626315B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- dna
- hydroxymethylcytosine
- methylcytosine
- sequencing
- solid phase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
Abstract
本發明提供一種DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,包括(1)DNA的純化與片段化預處理:將標的DNA提取後將其打斷至平均50個核苷酸長度到10000個核苷酸長度的DNA片段;(2)微量DNA的修復與接頭引子連接:將預處理的DNA片段修復並與二代定序需要的定序接頭引子連接;(3)共價標記5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶;(4)固相收集濃化含有標記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段,在固相上用對應接頭引子的PCR擴增引子進行擴增。取得的PCR產物,經純化後即得到二代定序所需的基因組5位修飾胞嘧啶的分佈圖譜。本發明增強固相表面與DNA修飾鹼基結合的選擇性和效率。
Description
本發明涉及一種DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,屬於基因定序領域。
DNA不僅由胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤四種鹼基組合而成。5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶是DNA中的重要修飾,前述兩修飾鹼基是DNA上的第五種與第六種鹼基。他們是調控生物通路,細胞生命週期的重要標記,起到多重的生物功能,包括轉錄調控,轉座子沉默,基因印記和X染色體去活性等。在多種疾病特別是癌症等重大疾病中呈現特定的基因組分佈,在受精發育初期過程中呈現明顯的分佈變化,被認為可能參與及標記了這些過程。所以利用定序技術全面瞭解這一過程顯得尤為重要。
由於這類5位修飾的胞嘧啶(胞嘧啶第五個碳原子位置上的修飾)物理化學性質接近,不能直接利用現有的一代或二代定序技術進行檢測。一類常用的方法是將DNA打斷成片段,再將5位修飾的胞嘧啶特異性結合,從而特異性地收集濃化(enrichment,又稱富集)含有5位修飾的胞嘧啶的DNA片段。通過對收集濃化後的片段的定序,可以得到5位修飾的胞嘧啶在基因組上的分佈資訊,並藉由此資訊進行各類定性、半定量、定量生物資訊學分析。此類方法的優點是定序深度要求低,成本低,覆蓋性好。其中普遍使用的收集濃化手段有兩類,一類是特異性抗體捕捉,另一類是特異性的化學生物學標記捕捉。兩類手段均可給出重複性好的結果,其中抗體較為昂貴,捕捉的位點序列要求較高,對修飾鹼基分佈稀疏的序列結合性差,可能引入誤差。而特異性的化學生物學標記可能會因為化學生物反應的選擇性優化不完全導致未標記的副產物,從而引入背景。由於是收集濃化過程,大量的不含5位修飾胞嘧啶的DNA片段在過程中被棄去,導致在定序應用中,兩者均需要大量的DNA作為起始。這類傳統的定序方法一般只能就1微克以上的DNA作為起始樣品量進行定序。在實際的生物、醫療應用中,往往只能得到1微克以下,甚至1至10奈克(ng)的DNA樣品,對於此類樣品的檢測方法將直接獲取有生物與臨床價值的基因調控資訊,因而在生物臨床研發與檢測中有著重大意義。
根據上文分析,現有收集濃化手段未獲得重大突破的原因有三:一是收集濃化後的DNA過少,在定序基因庫建立過程中損失太大。傳統建立基因庫的流程中涉及到了多步反應純化,小量DNA的純化效率低下;二是收集濃化方法在低濃度的DNA上的效率下降,使用抗體收集濃化時,結合效率直接與抗原濃度相關,現報導的抗原-抗體的結合能力不能滿足極低的DNA濃度下的反應;三是收集濃化後的DNA不能有效地從固相沖提(elution),固相負載的DNA在收集濃化過程中只占原始DNA的5%以內。沖提的過程中涉及的純化或化學反應會極大的損失固相負載的DNA片段,造成後續反轉錄聚合酶連鎖反應(PCR)反應失敗或引入大量定序誤差。
本發明的目的在於提供一種DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,以提高含有5位修飾胞嘧啶的定序效率。
本發明採用了如下技術方案:
一種DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其特徵在於,包括以下步驟:
(1)DNA的純化與片段化預處理:
將標的DNA提取後使用機械力或消化酶將其打斷至平均50個核苷酸長度到10000個核苷酸長度的DNA片段;
(2)微量DNA的修復與接頭引子(adaptor)連接:
將預處理的DNA片段修復並與二代定序需要的定序接頭引子連接;
(3)共價標記(DNA甲基化)5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶:
將連接好接頭引子的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進行共價標記;
(4)固相收集濃化含有標記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段:
將標記的5位修飾的胞嘧啶的DNA片段在結合緩衝液中結合到固相上,對固相表面進行反復洗滌,去除未結合的DNA片段,
在固相上,用對應接頭引子的PCR擴增引子進行擴增。取得的PCR產物,經純化後即得到二代定序所需的基因組5位修飾胞嘧啶的分佈圖譜。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:其中,步驟(1)中,所述DNA片段來源於體液中游離的DNA片段;或純化於組織、細胞及胞器的完整的基因組DNA。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:步驟(1)中,DNA片段的體液來自於血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等人體體液。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:其中,上述步驟(2)中的DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:步驟(3)中,共價標記5-羥甲基胞嘧啶的方法包括步驟:i)利用轉糖酶將帶有疊氮基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,ii) 將直接或間接連有生物素的點擊化學受質(substrate)與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:所述轉糖酶包括但不限於T4噬菌體β-葡糖基轉移酶(T4 bacteriophage enzyme β-glucosyltransferase)、T4噬菌體α-葡糖基轉移酶(T4 bacteriophage enzyme α-glucosyltransferase)及其衍生物,類似物,或重組酶;疊氮基團修飾的糖包括但不限於6-N3-葡萄糖或其他疊氮修飾的糖類。
更佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:步驟(3)中,共價標記5-甲基胞嘧啶的步驟為i)利用鼠Tet氧化酶或其衍生物、類似物、重組酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶ii)將步驟i)中的5-羥甲基胞嘧啶進行生物素標記;該生物素標記的步驟包括:1)利用轉糖酶將帶有疊氮基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,2)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:其中,5-羥甲基胞嘧啶的標記步驟可以按順序進行也可以在一個反應中同時進行。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵:其中,步驟(4)中,固相材料包括直徑1 nm至100 mm的磁性小球、直徑1 nm至100 mm的瓊脂糖小球、直徑1 nm至100 mm的人工高分子小球、帶有表面修飾的矽片或其他生物晶片。
較佳的,本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,還可以具有這樣的特徵: 在步驟(5)中,在固相上擴增採用直接在固相上經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫,或經1個至40個PCR循環擴增後分離固液相再經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫。
上述步驟(1)中,DNA片段的體液來源指來自於又不限於血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁、胰腺液等人體體液。
上述步驟(1)中,組織、細胞及胞器指來自於又不限於活體組織、培養細胞、脫落細胞、血液循環細胞(circulating cell)、手術中沖洗下的細胞等。
上述步驟(1)中,提DNA片段或完整的基因組DNA的方法包括常用的純化方法或商業化的純化試劑盒。方法中包括但不受限於:使用氯仿-苯酚萃取,Proteinase K消解,矽膠膜離心柱法,磁珠法,乙醇、異丙醇沉澱等技術中的一項或多項組合。純化試劑盒包括但不受限於:QIAamp®
fast DNA tissue kit (Qiagen),ZR Genomic DNATM
-Tissue Kits (Zymo)。
上述步驟(1)中,機械力包括但不限於劇烈震盪、超聲等技術。消化酶包括但不限於NEBNext®
dsDNA Fragmentase®
(NEB)。
上述步驟(2)中的DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA雙鏈的5’端及3’端補齊成平末端。DNA的片段與定序接頭引子的連接方法包括但不限於:i)平末端連接;ii)在DNA片段的3’端末尾增加一至多個dA,利用接頭引子中相對應的dT進行連接。修復與連接中涉及的酶包括但不限於T4 polymerase,T4 Kinase,Klenow exo-中的一種或其組合。修復與連接也可以使用商業化的試劑盒,包括但不限於TruSeq Nano DNA Library Prep Kit (Illumina),Kapa Hyper Prep Kit (Kapa),NEBNext®
DNA Library Prep Master Mix Set (NEB)。
上述步驟(3)中,使用的化學生物學標記方法指:標記5-羥甲基胞嘧啶的步驟為i) 利用轉糖酶將帶有疊氮基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,見下面反應式,連接受質為UDP-6-N3-Glucose。5-羥甲基胞嘧啶共價標記反應
轉糖酶包括但不限於T4 bacteriophage enzyme β-glucosyltransferase、T4 bacteriophage enzyme α-glucosyltransferase及其衍生物,類似物,或重組酶。疊氮基團修飾的糖包括但不限於6-N3-葡萄糖或其他化學修飾包括但不限於羰基,巰基,羥基,羧基,碳-碳雙鍵,碳-碳三鍵,二硫鍵,胺基,醯胺基,雙烯)的糖類。ii)將直接或間接連有生物素(biotin)的點擊化學受質或相應的化學反應受質與疊氮糖修飾的或者其它化學修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應。
反應基團包括但不限於以下含三鍵的化合物:
間接連接生物素的化學基團及反應包括但不限於:羰基,巰基,羥基,羧基,碳-碳雙鍵,碳-碳三鍵,二硫鍵,胺基,醯胺基,雙烯。
標記甲基胞嘧啶的步驟為i)利用轉糖酶將不帶有下一步反應修飾基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,用於掩蔽相對於5-甲基胞嘧啶含量較低的5-羥甲基胞嘧啶ii)利用ten-eleven translocation (TET)氧化酶或其衍生物、類似物、重組酶將5-甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶(見5-甲基胞嘧啶氧化反應的反應式)同上文所述將5-羥甲基胞嘧啶進行生物素標記。5-甲基胞嘧啶氧化反應
上述5-羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的標記步驟可以按順序進行也可以在一個反應中同時進行。
上述步驟(4)中,所使用的固相為直接負載有親和素或利用化學生物學方法間接負載親和素的固相,收集濃化所用的固相材料包括但不限於直徑1 nm至100 mm的磁性小球、直徑1 nm至100 mm的瓊脂糖小球、直徑1 nm至100 mm的人工高分子小球、帶有表面修飾的矽片或其他生物晶片。
上述步驟(4)中,所使用的結合液及洗滌液是包含緩衝對如Tris-HCl,MOPS,HEPES (pH=6.0至10.0,濃度在1 mM到1 M之間);NaCl (0 M至2 M);表面活性劑如Tween20 (0.01%至5%)的緩衝液。
上述步驟(4)中,在固相上擴增,包括i)直接在固相上經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫,ii)經1個至40個PCR循環擴增後分離固液相再經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫,iii)將DNA片段從固相沖提後經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫。
上述步驟(1)至(5)中,各反應後的核酸純化步驟,可以使用常用的純化方法或商業化的純化試劑盒。方法中包括但不受限於:矽膠膜離心柱法,磁珠法,乙醇、異丙醇沉澱等技術中的一項或多項組合。純化試劑盒包括但不受限於:AmpureXP beads,Minelute PCR purification Kit (Qiagen),DNA Clean & ConcentratorTM
(Zymo)。
發明的有益效果
本發明的DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法與現有技術相比,由於採用了微量游離DNA二代定序建庫技術及高效的化學生物學正交反應(bioorthogonal chemistry),從而極大增強了固相表面與DNA修飾鹼基結合的選擇性和效率。在1 ng至100 ng DNA的量級,傳統的抗原抗體反應的結合效率不足以提供足夠的選擇性,使得相關應用只能停留在來源於培養細胞或組織的大量DNA樣品。
本發明在共價連接的基礎上,利用生物素與親和素的高結合能力,進一步使用高鹽及表面活性劑對未含有DNA修飾鹼基的DNA片段進行洗滌,從而大大提高了保護效率。
以下結合具體實施方式來說明本發明的具體實施方式。
實施例
1
血清游離
DNA
的
5-
甲基胞嘧啶定序基因庫建立
(1)DNA的純化與片段化預處理:
用EDTA抗凝管取人體血液4 mL,保存在4攝氏度(ºC)。在6小時內,離心10分鐘(min),離心速度2000g;再次離心10 min,離心速度13000g。取得血漿並提取游離DNA。
(2)微量DNA的修復與接頭引子連接,接頭引子序列如下:
5’-p-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACAAA CATCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’ (SEQ ID NO. 1);
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATGCCTAA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’ (SEQ ID NO. 2),*表示硫代。
將0.5 ng至10 ng游離DNA修復並與二代定序需要的定序接頭引子連接。DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。步驟如下: 1. 根據Kapa Hyper Perp Kit說明書將50 mL DNA在PCR管中進行末端修復與尾端加上腺嘌呤(End Repair & A-Tailing)反應, 表1、
2. 以下PCR程式加熱反應 表2、
3. 在1.5 mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物: 表3、
4. 加入以下反應物: 表4、
5. 按以下PCR程式加熱反應 表5、
6. 使用AmpureXP beads對反應進行純化,用20uL含Tris-HCl(10mM,pH=8.0)及EDTA(0.1 mM)的緩衝液進行沖提。
(3)共價標記5-甲基胞嘧啶:
將連接好接頭引子的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進行共價標記;使用不含標記反應修飾基團的糖掩蔽天然存在的5-羥甲基胞嘧啶,使用鼠TET氧化酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶,然後對5-羥甲基胞嘧啶進行生物素標記。 1. 接上步的純化DNA溶液配置標記反應: 表6、
加入DNA溶液中。在水浴上37ºC反應1小時。取出反應,用AmpureXP beads純化。 2. 進行Tet氧化與疊氮糖標記反應: 表7、
37ºC反應1小時。用AmpureXP beads純化。 3. 加入三鍵化合物 表7、
37ºC反應2小時,用AmpureXP beads純化。
(4)固相收集濃化含有標記的5-甲基胞嘧啶的DNA片段: 1 將0.5 mL C1 streptadvin beads (life technologyTM
)渦旋混合30秒。 2 用100 mL洗滌液(5 mM Tris,pH=7.5,1 M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。 3 加入DNA溶液等體積結合緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5,2 M NaCl,0.04% Tween20或其他表面活性劑)至磁珠用槍吹打均勻。磁珠混合液加入純化的標記hmC DNA溶液中,在旋轉混合器上混合15 min。 4 用100 mL洗滌液5 mM Tris,pH=7.5,1 M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。
(5) PCR 擴增純化 1. 按以下進行PCR反應, 表8、
2. 反應循環溫度如下: 表9、
用AmpureXP beads純化,得到最終定序基因庫(見圖1)。
實施例
2
血清游離
DNA
的羥甲基胞嘧啶定序基因庫建立
(1)DNA的純化與片段化預處理:
用EDTA抗凝管取人體血液4 mL,保存在4ºC。在6小時內,離心10 min,離心速度2000g;再次離心10 min,離心速度13000 g。取得血漿並提取游離DNA。
(2)微量DNA的修復與接頭引子連接:
將0.5 ng至10 ng游離DNA修復並並與二代定序需要的定序接頭引子連接。DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。步驟如下: 1. 根據Kapa Hyper Perp Kit說明書將50 mL DNA在PCR管中進行End Repair & A-Tailing反應, 表10、
2. 以下PCR程式加熱反應 表11、
3. 在1.5 mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物: 表12、
4. 加入以下反應物: 表13、
5. 按以下PCR程式加熱反應 表14、
6. 使用AmpureXP beads對反應進行純化,用20 mL含Tris-HCl (10 mM,pH=8.0)及EDTA (0.1 mM)的緩衝液進行沖提。
(3)共價標記5-羥甲基胞嘧啶: 表15、
加入三鍵化合物 表16、
37ºC反應2小時,用AmpureXP beads純化。
(4)固相收集濃化含有標記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段: 1. 將0.5 mL C1 streptadvin beads(life technologyTM
)渦旋混合30秒。 2. 用100 mL洗滌液(5 mM Tris,pH=7.5,1M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。 3. 加入DNA溶液等體積結合緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5,2M NaCl,0.04% Tween20或其他表面活性劑)至磁珠用槍吹打均勻。磁珠混合液加入純化的標記hmC DNA溶液中,在旋轉混合器上混合15 min。 4. 用100 mL洗滌液5 mM Tris,pH=7.5,1M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。
(5) PCR擴增純化 1. 按以下進行PCR反應, 表17、
2. 反應循環溫度如下: 表18、
用AmpureXP beads純化,得到定序基因庫,見圖1。
實施例
3
組織
DNA
的
5-
甲基胞嘧啶定序基因庫建立
(1)DNA的純化與片段化預處理:
用ZR Genomic DNA-Tissue Kits (Zymo)提取組織基因組DNA。按以下Kapa HyperPlus Library Preparation Kit對0.5 ng至100 ng基因組DNA進行反應打斷基因組DNA。 表19、
(2)微量DNA的修復與接頭引子連接:
將片段化DNA修復並並與二代定序需要的定序接頭引子連接。DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。步驟如下: 1. 根據Kapa HyperPLus Library Preparation Kit說明書將50 mL DNA在PCR管中進行End Repair & A-Tailing反應, 表20、
2. 以下PCR程式加熱反應 表21、
3. 在1.5 mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物: 表22、
4. 加入以下反應物: 表23、
5. 按以下PCR程式加熱反應 表24、
6. 使用AmpureXP beads對反應進行純化,用20 mL含Tris-HCl (10 mM,pH=8.0)及EDTA (0.1 mM)的緩衝液進行沖提。
(3)共價標記5-甲基胞嘧啶:
將連接好接頭引子的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進行共價標記;使用不含標記反應修飾基團的糖掩蔽天然存在的5-羥甲基胞嘧啶,使用鼠TET氧化酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶,然後對5-羥甲基胞嘧啶進行生物素標記。 1. 接上步的純化DNA溶液配置標記反應: 表25、
加入DNA溶液中。在水浴上37ºC反應1小時。取出反應,用Ampure XP beads純化。 2. 進行Tet氧化與疊氮糖標記反應: 表26、
37ºC反應1小時。用AmpureXP beads純化。 3. 加入三鍵化合物 表27、
37ºC反應2小時,用AmpureXP beads純化。
(4)固相收集濃化含有標記的5-甲基胞嘧啶的DNA片段: 1. 將0.5 mL C1 streptadvin beads(life technologyTM
)渦旋混合30秒。 2. 用100 mL洗滌液(5 mM Tris,pH=7.5,1 M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。 3. 加入DNA溶液等體積結合緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5,2 M NaCl,0.04% Tween20或其他表面活性劑)至磁珠用槍吹打均勻。磁珠混合液加入純化的標記hmC DNA溶液中,在旋轉混合器上混合15 min。 4. 用100 mL洗滌液5 mM Tris,pH=7.5,1 M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。
(5) PCR擴增純化 1. 按以下進行PCR反應, 表28、
2. 反應循環溫度如下: 表29、
用AmpureXP beads純化,得到最終定序基因庫,見圖1。
實施例
4
組織
DNA
的
5-
羥甲基胞嘧啶定序基因庫建立
(1)DNA的純化與片段化預處理:
用ZR Genomic DNA-Tissue Kits (Zymo)提取組織基因組DNA。按以下Kapa HyperPlus Library Preparation Kit對0.5 ng至100 ng基因組DNA進行反應打斷基因組DNA。 表30、
(2)微量DNA的修復與接頭引子連接:
將片段化DNA修復並並與二代定序需要的定序接頭引子連接。DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。步驟如下: 1. 根據Kapa Hyper Perp Kit說明書將50 mL DNA在PCR管中進行End Repair & A-Tailing反應, 表31、
2. 以下PCR程式加熱反應 表32、
3. 在1.5mL低吸附EP管中配置以下連接反應混合物: 表33、
4. 加入以下反應物: 表34、
5. 按以下PCR程式加熱反應 表35、
6. 使用AmpureXP beads對反應進行純化,用20 mL含Tris-HCl(10 mM,pH=8.0)及EDTA (0.1 mM)的緩衝液進行沖提。
(3)共價標記5-羥甲基胞嘧啶: 1. 對純化產物進行以下反應 表36、
37ºC反應1小時。用AmpureXP beads純化。 2. 加入三鍵化合物 表37、
37ºC反應2小時,用AmpureXP beads純化。
(4)固相收集濃化含有標記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段: 1. 將0.5 mL C1 streptadvin beads (life technologyTM
)渦旋混合30秒。 2. 用100 mL洗滌液(5mM Tris,pH=7.5,1 M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。 3. 加入DNA溶液等體積結合緩衝液(10 mM Tris,pH=7.5,2M NaCl,0.04% Tween20或其他表面活性劑)至磁珠用槍吹打均勻。磁珠混合液加入純化的標記hmC DNA溶液中,在旋轉混合器上混合15 min。 4. 用100 mL洗滌液5 mM Tris,pH=7.5,1M NaCl,0.02% Tween20)洗滌磁珠3次。
(5) PCR 擴增純化 1. 按以下進行PCR反應, 表38、
2. 反應循環溫度如下: 表39、
用AmpureXP beads純化,得到定序基因庫,見圖一。
無
圖1是實施例1至4中最終基因庫構建的電泳圖。
無
<110> 上海易華恩基因科技有限公司 <120> DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacaaacatc gatctcgtat gccgtcttct 60 gcttg 65 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgcctaaaca ctctttccct acacgacgct 60 cttccgatct 70
Claims (10)
- 一種DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其包括以下步驟:(1)DNA的純化與片段化預處理:將0.5ng至100ng標的DNA提取後使用機械力或消化酶將其打斷至平均50個核苷酸長度到10000個核苷酸長度的DNA片段;(2)微量DNA的修復與接頭引子連接:將預處理的DNA片段修復並與二代定序需要的定序接頭引子連接;(3)共價標記5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶:將連接好接頭引子的DNA片段中的5位修飾的胞嘧啶進行共價標記;以及(4)固相收集濃化含有標記的5位修飾胞嘧啶的DNA片段:將標記的5位修飾的胞嘧啶的DNA片段在結合緩衝液中結合到固相上,對固相表面進行反復洗滌,去除未結合的DNA片段,在固相上,用對應接頭引子的PCR擴增引子進行擴增,取得的PCR產物,經純化後即得到二代定序所需的基因組5位修飾胞嘧啶的分佈圖譜。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(1)中,所述DNA片段來源於體液中游離的DNA片段;或純化於組織、細胞及胞器的完整的基因組DNA。
- 如請求項2所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(1)中,DNA片段的體液來自於血液、尿液、汗液、痰液、糞便、腦脊液、腹水、胸水、膽汁或胰腺液。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(2)中的DNA片段修復是指修復DNA片段中的鹼基損壞,並將DNA的5’端及3’端補齊成平末端。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(3)中,共價標記5-羥甲基胞嘧啶的方法包括步驟:i)利用轉糖酶將帶有疊氮基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,ii)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應。
- 如請求項5所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,所述轉糖酶包括T4噬菌體β-葡糖基轉移酶(β-glucosyltransferase,β-GT)、T4噬菌體α-葡糖基轉移酶(α-glucosyltransferase,α-GT)或具有相同或相似活性的酶衍生物、類似物、或重组酶;疊氮基團修飾的糖包括6-N3-葡萄糖。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(3)中,共價標記5-甲基胞嘧啶的步驟為i)利用鼠Tet氧化酶或其衍生物、類似物、重組酶將甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶;ii)將步驟i)中的5-羥甲基胞嘧啶進行生物素標記;該生物素標記的步驟包括:1)利用轉糖酶將帶有疊氮基團修飾的糖共價連接到5-羥甲基胞嘧啶的羥甲基上,2)將直接或間接連有生物素的點擊化學受質與疊氮糖修飾的5-羥甲基胞嘧啶反應。
- 如請求項5所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法, 其中,5-羥甲基胞嘧啶的標記步驟可以按順序進行也可以在一個反應中同時進行。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,步驟(4)中,收集濃化所用的固相材料包括直徑1奈米(nm)至100微米(μm)的磁性小球、直徑1nm至100μm的瓊脂糖小球、直徑1nm至100μm的人工高分子小球、帶有表面修飾的矽片或其他生物晶片。
- 如請求項1所述之DNA 5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜定序方法,其中,在步驟(4)中,在固相上擴增採用直接在固相上經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫,或經1個至40個PCR循環擴增後分離固液相再經1個至40個PCR循環擴增得到合格的定序基因庫。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610119096.2A CN105648537B (zh) | 2016-03-02 | 2016-03-02 | Dna5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201732044A TW201732044A (zh) | 2017-09-16 |
TWI626315B true TWI626315B (zh) | 2018-06-11 |
Family
ID=56492951
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW106102252A TWI626315B (zh) | 2016-03-02 | 2017-01-20 | DNA 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine gene mapping method |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105648537B (zh) |
TW (1) | TWI626315B (zh) |
WO (1) | WO2017147945A1 (zh) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010037001A2 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Immune Disease Institute, Inc. | Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins |
AU2012291873B2 (en) | 2011-07-29 | 2016-03-10 | Cambridge Epigenetix Limited | Methods for detection of nucleotide modification |
CN104955960A (zh) | 2012-11-30 | 2015-09-30 | 剑桥表现遗传学有限公司 | 用于修饰的核苷酸的氧化剂 |
GB201403216D0 (en) | 2014-02-24 | 2014-04-09 | Cambridge Epigenetix Ltd | Nucleic acid sample preparation |
CN107779485B (zh) | 2016-08-24 | 2022-03-18 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | Cmd1酶催化的5-甲基胞嘧啶核酸的新修饰及其应用 |
CN107164508A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-09-15 | 上海易毕恩基因科技有限公司 | 用于检测肝癌的基因标志物及其用途 |
CN107385051A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 上海易毕恩生物技术有限公司 | 用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及检测方法 |
CN112646860B (zh) * | 2020-01-15 | 2022-10-11 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种dna甲基化靶向富集的方法及其应用 |
CN113430255A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 深圳泰莱生物科技有限公司 | 基于5hmC点击化学高通量测序技术的肺癌检测方法 |
CN113528616A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-10-22 | 深圳泰莱生物科技有限公司 | 一种捕获cfDNA5hmC片段的检测方法 |
CN114410813B (zh) * | 2021-11-12 | 2023-12-22 | 南京农业大学 | 一种在全基因组水平鉴定植物基因组dna胞嘧啶四联体位点的方法 |
CN114410762A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-04-29 | 武汉大学 | 磷酸激酶辅助的dna中5-羟甲基尿嘧啶修饰定位分析方法和试剂盒 |
CN115992203A (zh) * | 2022-07-26 | 2023-04-21 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | 一种全基因组羟甲基化捕获测序的文库构建方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102971434B (zh) * | 2010-08-11 | 2014-04-09 | 中国科学院心理研究所 | 一种甲基化dna的高通量测序方法及其应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002525129A (ja) * | 1998-10-01 | 2002-08-13 | バリアジェニックス,インク. | ポリヌクレオチドを分析するための方法 |
WO2005121361A2 (en) * | 2004-06-14 | 2005-12-22 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Sequence-specific detection of methylation in biomolecules |
CN103131754B (zh) * | 2011-11-24 | 2014-07-30 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | 一种检测核酸羟甲基化修饰的方法及其应用 |
CN103667442A (zh) * | 2013-09-13 | 2014-03-26 | 西南民族大学 | 一种针对微量样本的转录组高通量测序方法 |
CN104480214B (zh) * | 2014-12-30 | 2018-01-16 | 深圳市易基因科技有限公司 | 羟甲基化暨甲基化长序列标签测序技术 |
-
2016
- 2016-03-02 CN CN201610119096.2A patent/CN105648537B/zh active Active
- 2016-03-08 WO PCT/CN2016/075863 patent/WO2017147945A1/zh active Application Filing
-
2017
- 2017-01-20 TW TW106102252A patent/TWI626315B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102971434B (zh) * | 2010-08-11 | 2014-04-09 | 中国科学院心理研究所 | 一种甲基化dna的高通量测序方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Chun-Xiao Sond et al, Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine, Nat Biotechnol. 2011 January: 29(1):68-72. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105648537B (zh) | 2018-06-29 |
WO2017147945A1 (zh) | 2017-09-08 |
TW201732044A (zh) | 2017-09-16 |
CN105648537A (zh) | 2016-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI626315B (zh) | DNA 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine gene mapping method | |
US11162139B2 (en) | Method for genomic profiling of DNA 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine | |
JP7100680B2 (ja) | ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 | |
WO2016082129A1 (zh) | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂 | |
TWI647312B (zh) | Method for screening gene markers of intestinal cancer, gene markers screened by the method, and uses thereof | |
US7608402B2 (en) | DNA methylation specific signal amplification | |
JPWO2017039002A1 (ja) | 5−ヒドロキシメチルシトシン酸化剤及び5−ヒドロキシメチルシトシン解析方法 | |
JP5266828B2 (ja) | メチル化されたdnaの含量を測定する方法 | |
CN107760686B (zh) | Dkk-1蛋白的核酸适配体及其应用 | |
CN105734679B (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
CN109576346A (zh) | 高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
JP2015516814A (ja) | 標的化されたdnaの濃縮および配列決定 | |
WO2019006975A1 (zh) | 极小量细胞原位全基因组染色质构象捕获方法 | |
WO2018228029A1 (zh) | 用于检测肝癌的基因标志物及其用途 | |
CN112301115B (zh) | 一种基于高通量测序的FGFRs基因突变的检测方法及探针序列 | |
WO2023036271A1 (zh) | 一种构建高检测性能捕获文库的方法和试剂盒 | |
TW201321566A (zh) | 用於確定人體具有異常狀態的系統和方法 | |
CN107893067A (zh) | 用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法 | |
US20120107808A1 (en) | High throughput detection of gene-specific hydroxymethylation | |
JP4924014B2 (ja) | Dnaメチル化測定方法 | |
JP3853161B2 (ja) | 微量mRNA及びcDNAの増幅方法 | |
US20130130917A1 (en) | Method for specific enrichment of nucleic acid sequences | |
CN108130359A (zh) | 一种dna甲基化检测试剂盒及其应用 | |
CN103797130A (zh) | 用于确定人体具有异常状态的系统和方法 | |
WO2012083845A1 (zh) | 用于除去测序文库中载体片段的方法及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |