JP7100680B2 - ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 - Google Patents

ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明の態様は、概して核酸分子の複製および増幅の分野に関する。より具体的には、本発明の特定の態様は、ローリングサークル複製を使用した、生物学的サンプルからのDNA分子の複製を含む。本発明の他の態様は、ローリングサークル増幅を使用した、生物学的サンプルからのDNA分子の増幅を含む。本発明の特定の態様は、生物学的サンプルに由来するゲノムにおける配列変異の特徴付けにおいて利用し得る。本発明の特定の態様は、生物学的サンプルに由来する全染色体またはその一部の分子計数において利用し得る。本発明の特定の態様は、生物学的サンプルに由来するゲノム中でのハプロタイプ構造の特徴付けにおいて利用し得る。本発明の特定の態様は、ゲノム科学、生物医学研究、診断アッセイ、ならびにワクチンおよび治療開発におけるサンプル調製および分析のために適用してもよい。
関連技術の説明
全ゲノム技術、例えば高密度ジェノタイピングアレイおよび次世代シークエンシング（NGS）は、配列変異、特に単一ヌクレオチド多型（SNP）および単一ヌクレオチド変異（SNV）を同定することができ、本明細書において集合的に、所与の個体または種の「配列変異体」として言及される。しかし現在の方法では、同じDNA分子上のこれらの配列変異体の組み合わせを決定することはできない。配列変異体の組み合わせを決定することは「フェーズ」、同じDNA分子上の配列変異体の特定の組み合わせは「ハプロタイプ」と呼ばれる。例えば、ヒト個体は二倍体であり、各々の体細胞が、各々の親から遺伝した常染色体の2セットを含む。所与の個体のハプロタイプ状態を特徴付けることは、疾患遺伝子をマッピングし、集団の履歴を解明し、表現型発現におけるシスおよびトランス作用変異体のバランスを研究するために重要である。
ハプロタイプ情報を決定するための3つの一般的なアプローチがある：（i）集団推測、（ii）親推測、および（iii）分子ハプロタイプ決定。ハプロタイプをフェーズ分類するための最も一般的なアプローチは、集団または親の遺伝子型から得られたデータからの推測および統計的手法を使用することである。全ゲノムにわたるハプロタイプ情報は、しかし、特に、所与の染色体領域についての連鎖不平衡が低い場合、および、稀な変異体の場合は、計算方法を使用して解明することができない。親推測方法は、他方で、家系図の文脈における配列変異の遺伝子遺伝の原理に依存する。適切に実施された場合には強力であるが、多くの生物学的サンプルで十分な血統情報が不足している、または、関心対象の所与のサンプルのハプロタイプ状態を推測するために適切なファミリーサンプルが要求される。
いくつかの分子ハプロタイプ決定方法によって、計算ベースのアプローチの限界が克服されることが公知である。これらの分子的方法は、個々のDNA分子または個々のDNA分子のセットを単離するための種々の戦略を含み、次いで所与の生物学的サンプルのハプロタイプ構造を決定するために遺伝子型決定または配列決定される。1つのそのような戦略は、大型インサートクローン（すなわち、フォスミド）ライブラリーの構築を含む。これらのクローンは、次に、マルチウェルプレート（すなわち、96または384ウェルプレート）の個々のウェル中に希釈され、テンプレートライブラリー中に作製され、特定のクローンを個々のウェルに追跡するためにバーコード化され、遺伝子型決定または配列決定方法により特徴付けられる。
個々の染色体またはその一部のハプロタイプをフェーズ分類するという課題は、マイクロタイタープレート内の希釈プール中のより小さなDNAフラグメント（すなわち、数百メガベースから数十～数百キロベースのサイズ）を特徴付けることに帰着する。大型インサートクローンを作製する代わりにDNAフラグメントをサイズ決定するまたはゲノムDNAを使用することもまた報告されており、希釈し、全ゲノム法により増幅し、テンプレートライブラリーを作製し、所与のサンプルのハプロタイプを決定するための配列決定が続く。全染色体またはその一部は、また、フローソーティング方法または顕微解剖的アプローチにより単離することができ、希釈し、全ゲノム法により増幅し、テンプレートライブラリーを作製し、生物学的サンプルからの所与のゲノムのハプロタイプ構造を決定するための遺伝子型決定または配列決定が続く。これらのアプローチの全てで、所与の生物学的サンプルのハプロタイプをフェーズ分類する際、高レベルの技術的専門知識および多数の（数百のオーダーの）個々のテンプレートライブラリーの作製が要求される。
大半のイメージングシステムは単一の蛍光事象を検出することができないため、サンプル中のDNA分子を増幅する必要がある。3つの次世代配列決定方法が現在存在する：（i）エマルジョンPCR（emPCR）、（ii）、固相増幅、および（iii）溶液ベースのローリングサークル複製。全てのこれらの方法について、ゲノムDNAは、典型的には、DNAフラグメントのライブラリーを作製するために、標準的な物理的剪断技術を使用して断片化される。断片化が必要ではないであろう例外がある。例えば、一部の生物学的供給源（例えば癌患者または妊娠女性から得られた血漿または血清）は、典型的には、1,000塩基対（bp）、一部の場合において、500bpを下回るサイズで存在する、循環する無細胞ゲノムDNAフラグメントを含む。サイズ選択の介在工程が必要であるか否かに依存し、ユニバーサルプライミング部位を含むアダプター配列を、次に、DNAフラグメントの末端に連結する。限定された数のPCRサイクルが、一般のPCRプライマーを使用して実施される。前記の3つの方法はこの工程で偏向するが、全ての場合において、これらのクローン増幅方法は、典型的には、1,000bp未満のサイズ、より典型的な例において、700bp以下に限定される小さなフラグメントを複製または増幅することに限定される。例えば、固相増幅のイルミナ方法によって増幅することができるのは、最良でもわずか700bpのサイズのDNAフラグメントである。このサイズ制約によって、デノボでヒトゲノムを組み立てる能力が限定される。
現在の全ゲノム技術、特にNGSの重大な欠点は、次いでこれらが大規模並列フォーマットにおいてクローン増幅される、短いテンプレートライブラリーに由来する配列読み取りに依存していることである。重要なことに、現在の対合末端ライブラリー構築方法は、正常なヒトゲノムに存在しかつ多くの疾患の発生において特に重要であると思われる大きく複雑な構造変化を容易に同定する能力を本質的に損なう。ゲノム構造変異は、早期腫瘍形成および癌進行、疾患感受性、ならびに治療抵抗の推進力を表し得る。短いテンプレートライブラリーに由来する配列読み取りによって、デノボアセンブリを通じて、新規の、反復性の、かつ疾患によって変化した配列を十分に解き明かすことが極めて困難になる。そのようなものとして、大半の全ゲノム配列決定の努力は、依然として、参照ゲノムへの、配列読み取りのアラインメントに依存する。結果的に、NGSデータセットは、特徴付けされていないままであるヒトゲノム配列の大きなストレッチを含み得るが、疾患機構の理解は、ゲノム構造情報が欠如していることによって、偏り得る。
大半の全ゲノム配列決定の努力が、依然として、参照ゲノムに配列読み取りを整列させることに依存する。アライメント実験によって、配列変異体の有意な部分を捕捉することができるが、10～100kbのオーダーの大きなテンプレートが、構造変異体の大部分を解き明かすために、および／または、ヒトゲノムにわたるハプロタイプのフェーズを提供するために必要とされる。サイズ制約を克服するために多数の分子生物学およびコンピュータソフトウェア技術が用いられてきた。一部改善が提供されはするものの、代わりに、生物学的なワークフローの複雑性ならびに試薬、作業、およびコンピュータハードウェアに関連付けられるコストにおける大幅な増加がある。
線状核酸フラグメントの末端を連結することによりDNAサークルを作製することは、高度に非効率的なプロセスであり、生物学的サンプルからの大量の出発材料が要求される。所与のDNAフラグメントの遠端を互いに近接させることによりサークルを作製することに関連する問題は、1980年代以来、当技術分野において十分に分かってきた。例えば、DNAフラグメントの末端を一緒に連結することによりサークルを作製することに関連する1つの問題は、「分子内」連結事象（すなわち、同じDNAフラグメントのDNAサークル）と「分子間」連結事象（すなわち、コンカテマーと呼ばれる2つ以上のDNAフラグメントの連結）との間の競合反応である。DNAフラグメントの末端を連結することによりサークルを作製することに関連する別の問題は、分子内サークルを作製する際に合理的な効率を達成するために、より大きなDNAフラグメントを、より小さなDNAフラグメントと比較して、さらに希釈しなければならないことである。
大きなDNAサークル（すなわち、5～7kbより大きな、サンガー配列決定において使用される大型インサートクローン）を作製することを、次世代の配列決定方法のハイスループット複製または増幅の性質と組み合わせる革新的な方法について、当技術分野における必要性がある。本発明の特定の態様は、サイズ非依存的な様式でDNAサークルを作製することにより、大きなDNAフラグメントからDNAサークルを作製するサイズ制約を克服する。本発明の他の態様は、多数のゲノム科学適用において有用な大型インサートテンプレートの作製および複製または増幅により、サイズ非依存的なDNAサークルを組み入れることにより、直接的に、増幅テンプレート＞1キロベースのサイズ制約を克服する。本発明は、また、配列決定適用のための複数のコピーを作製するためのローリングサークル複製およびローリングサークル増幅において、ダンベルサークルおよび改善方法を使用した大型インサートテンプレートの調製のためのより単純なワークフローを提供することにより、現在の方法での研究者の努力の複雑性および関連付するより高いコストを克服する。本発明の特定の態様は、また、ユニバーサルプライマー配列に依存する調製テンプレートのためのより単純なワークフローを提供することにより、多様なセットの異種核酸配列の遺伝子型決定および配列決定適用のために個々の対立遺伝子識別プライマーを要求とする制限を克服する。
概要
本発明の一態様は、少なくとも1つのDNA分子の複製方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の複製方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の増幅方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程；および、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程を含む。別の態様において、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートの配列決定からなる。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子をエキソヌクレアーゼを用いて処理することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程；および、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程を含む。別の態様において、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートの配列決定からなる。
特定の態様において、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程は、前記の少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートをオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたDNAプローブである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォアと結合されている。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの増幅されたDNA分子を検出する方法である。この方法は、少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたDNA分子を形成する工程；および、少なくとも1つの増幅されたDNA分子を検出する工程を含む。別の態様において、少なくとも1つの増幅されたDNA分子を検出する工程は、少なくとも1つの増幅されたDNA分子を配列決定することからなる。
特定の態様において、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程は、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートをオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたDNAプローブである。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォアと結合されている。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の複製方法である。この方法は、サンプルから少なくとも1つのDNA分子を単離する工程；少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の増幅方法である。この方法は、サンプルから少なくとも1つのDNA分子を単離する工程；少なくとも1つのDNA分子を断片化して少なくとも1つの断片化されたDNA分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化されたDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたDNA分子を形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の複製方法である。この方法は、サンプルから少なくとも1つのDNA分子を単離する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つのDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのDNA分子の増幅方法である。この方法は、サンプルから少なくとも1つのDNA分子を単離する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つのDNA分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたDNA分子を形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する方法である。この方法は、少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子をエキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する；および、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの核酸分子の増幅方法である。この方法は、サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子をエキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の態様はまた、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマーを含有する、キットを含む。
[本発明1001]
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、少なくとも1つの基板に付着されている少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程；および
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程
を含む、少なくとも1つの核酸分子の複製方法。
[本発明1002]
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、少なくとも1つの基板に付着されている少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程；
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程；および
該少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程
を含む、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する方法。
[本発明1003]
少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを配列決定することからなる、本発明1002の方法。
[本発明1004]
少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートをDNAプローブと接触させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
DNAプローブがフルオロフォアと結合されている、本発明1004の方法。
[本発明1006]
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、少なくとも1つの基板に付着されている少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程；および
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、少なくとも1つの基板に付着されている少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程；および
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程
を含む、少なくとも1つの核酸分子の複製方法。
[本発明1008]
少なくとも1つの核酸分子の配列を検出するためのダンベルテンプレートであって、以下の工程を含む方法によって作られる、ダンベルテンプレート：
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；および
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程であって、該ダンベルテンプレートが少なくとも約20キロベース長である、工程。
[本発明1009]
少なくとも1つの核酸分子の配列を検出するためのダンベルテンプレートであって、以下の工程を含む方法によって作られる、ダンベルテンプレート：
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；および
2つ以上の異なるヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程。
[本発明1010]
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、少なくとも1つの基板に付着されている少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程；および
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程
を含む、少なくとも1つの核酸分子の増幅方法。
[本発明1011]
以下の工程を含む、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する方法：
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；
少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程；および
該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程。
[本発明1012]
少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを配列決定することを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートをDNAプローブと接触させることを含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
DNAプローブがフルオロフォアと結合されている、本発明1013の方法。
[本発明1015]
以下の工程を含む、少なくとも1つの核酸分子の増幅方法：
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および
少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程。
[本発明1016]
以下の工程を含む、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する方法：
少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程；および
該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程。
[本発明1017]
少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートの配列決定からなる、本発明1016の方法。
[本発明1018]
少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートをDNAプローブと接触させることを含む、本発明1016の方法。
[本発明1019]
DNAプローブがフルオロフォアと結合されている、本発明1018の方法。
[本発明1020]
以下の工程を含む、少なくとも1つの核酸分子の増幅方法：
サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；
1つまたは複数のヘアピン構造を該少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の核酸分子を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程；
該少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および
該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程。
[本発明1021]
ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；
ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；および
少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマー
を含む、キット。
[本発明1022]
ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；
ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；および
少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマー
を含む、キット。
[本発明1023]
ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；
ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；および
少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマー
を含む、キット。
[本発明1024]
ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；
ヘアピン構造をサンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；
任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；および
少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマー
を含む、キット。
本発明の特徴および利点ならびに、明らかになる他のものがより詳細に理解され得るように、本発明の態様のより具体的な説明は、本明細書の一部を形成する添付の図面に例証されるその態様を参照することによって得られ得る。しかし、図面は、本発明の種々の態様だけを例証しているので、他の効果的な態様も含み得るため、本発明の範囲を限定するものと見なすべきではないことにも注意すべきである。
本発明の態様に従った、ダンベルテンプレートのローリングサークル複製の例示的な方法の概略図である。 本発明の態様に従った、ダンベルテンプレートから産生されたローリングサークル産物のアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従った、ダンベルテンプレートのローリングサークル複製の例示的な方法の概略図である。 本発明の態様に従って産生されたダンベルテンプレートおよびそれらのローリングサークル産物のアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従って産生されたダンベルテンプレートおよびそれらのローリングサークル産物のアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従って産生されたダンベルテンプレートのアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従って産生されたダンベルテンプレートのアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従って産生されたローリングサークル産物のアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従って産生されたローリングサークル産物のアガロースゲル分析の画像である。 本発明の態様に従った、蛍光によるヘアピン構造の検出を実証するグラフである。 図11AおよびBは、本発明の特定の態様に従った例示的なデバイスの画像である。
詳細な説明
本発明の態様を詳細に記載する前に、本発明の態様の文脈において使用されるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、他のものが、必要に応じて、本明細書の他の箇所で定義される。本明細書で明白に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語は、当技術分野で認識されている意味を有する。
本発明の理解をより容易に促進するために、本明細書において使用する用語の意味は、以下に提供される様々な用語および明示的定義の一般的な使用を考慮して、本明細書の文脈から明らかになるであろう。本明細書において使用する場合、用語「含む（comprise）または含んでいる（comprising）」、「含有する（contain）または含有している（containing）」、「含む（include）または含んでいる（including）」、および「例えば（such as）」は、それらのオープンで非限定的な意味で使用される。
「増幅されたダンベルテンプレート」は、ローリングサークル増幅の結果として標的配列の複数のコピーをもたらす、1つまたは複数のヘアピン構造を含有している1つの核酸分子を意味する。
「接触する」とは、ある物質が他の物質との相互作用を促進するために任意の方法で導入されるプロセスを意味する。例えば、非限定的に、ダンベルテンプレートを1つまたは複数の実質的に相補的なプライマーと接触させて、ローリングサークル複製またはローリングサークル増幅に関与することができる1つまたは複数の二本鎖である二重鎖領域を形成するための、1つまたは複数のハイブリダイゼーションプロセスを促進し得る。
「核酸分子を検出する」は、関心対象の核酸の存在を決定することができる、あるいは、その核酸配列、参照配列と比較した場合の核酸配列の変化、または、核酸配列の1つもしくは複数のコピーの存在もしくは非存在に関するより詳細な情報を決定することができる分析方法を使用することを意味する。
「ダンベルテンプレート」は、1つまたは複数のヘアピン構造を有する、構造的に線状で形態的に円形の、インビトロ複製可能なまたはインビトロ増幅可能な核酸分子を意味する。変性または実質的に変性している場合、ダンベルテンプレートは、円形の一本鎖核酸分子として存在する。ダンベルテンプレートは、インビボ複製可能な円形の二本鎖DNA、例えば、非限定的に、プラスミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、および酵母人工染色体（クローニングベクター技術を用いて作製される）とは異なる。適切な宿主細胞中で独立して複製するこれらの円形の二本鎖DNAとは異なり、ダンベルテンプレートは、そのような宿主細胞中での増殖複製を必要としない。
「断片化された核酸分子の末端」は、連結反応に関与することが可能な、またはそれに関与することを可能にさせる1つまたは複数の末端ヌクレオチド残基を意味する。特定の態様において、1つまたは複数の核酸分子は、核酸分子の各々の末端に1つまたは複数のヘアピン構造を付着させるために、連結反応が可能な、またはそれを可能にさせる官能性末端を含んでもよい。例えば、非限定的に、5'末端の末端ヌクレオチドはリン酸基を含有し、3'末端の末端ヌクレオチドはヒドロキシル基を含有する。
「断片化された核酸分子」は、断片化プロセスで任意のより小さな核酸分子となる、任意のより大きな核酸分子を意味する。
「断片化」は、化学的または生化学的薬剤を使用した、配列に依存しない様式（すなわち、ランダム）における、または配列特異的な様式における核酸分子の破壊を意味する。例えば、核酸は、DNアーゼI、エンドヌクレアーゼV、またはトランスポザーゼを使用する酵素的方法により、物理的方法（例えば、剪断、超音波処理、または小さな穴を通じて核酸溶液を通過させる噴霧）の使用により、または、例えば、非限定的に、超音波方法、特に適応的に集中させる超音波方法などの機械的な力の使用により、ランダムに断片化することができる。ランダムな核酸フラグメントは、ランダムプライマーを使用したPCRにより作ることができる。核酸は、配列特異的方法により、例えば、非限定的に、制限エンドヌクレアーゼおよびマルチプレックスPCRを使用して断片化することもできる。より大きな核酸分子の断片化プロセスに由来するフラグメントのコレクションをライブラリーと呼ぶ。
「ヘアピン構造」は、核酸分子内の2つ以上の部分配列が、互いに相補的または実質的に相補的であり、部分的な二本鎖領域および1つまたは複数の内部一本鎖領域の形成をもたらす核酸分子を意味する。ヘアピン構造はまた、2つ以上の核酸分子を含有することができ、それにより2つ以上の核酸分子がリンカーにより一緒に結合され、かつそれにより2つ以上の核酸分子の2つ以上の部分配列が互いに相補的または実質的に相補的であり、その結果、部分的な二本鎖領域および1つまたは複数の内部一本鎖領域が形成される。
「核酸分子を単離する」は、核酸分子がサンプルから得られるプロセスを意味する。
「連結剤」は、酵素的薬剤、例えば、非限定的に、DNAもしくはRNAリガーゼまたは化学的薬剤による2つ以上の核酸分子の共有結合、例えば、非限定的に、水溶性カルボジイミドまたは臭化シアンを使用した縮合反応ならびに自動化DNA合成技術に関連付けられる標準的な慣行を意味し、天然核酸骨格構造、修飾核酸骨格構造、およびこれらの2骨格構造の組み合せをもたらす。天然核酸骨格構造は、例えば、非限定的に、ヌクレオチド残基間の1つまたは複数の標準的なホスホジエステル結合からなる。修飾核酸骨格構造は、例えば、非限定的に、1つまたは複数の修飾ホスホジエステル連結、例えば窒素原子（すなわち、ホスホルアミデート連結）または硫黄原子（すなわち、ホスホロチオエート連結）を伴う非架橋酸素原子の置換、硫黄原子（すなわち、ホスホロチオレート）を伴う架橋酸素原子の置換、ペプチド結合（すなわち、ペプチド核酸またはPNA）を伴うホスホジエステル結合の置換、あるいは1つまたは複数の追加の共有結合の形成（すなわち、ロックド核酸またはLNA）（これはリボース糖の2'酸素と4'炭素の間に追加の結合を有する）からなる。修飾された連結は、全て、1つの型の修飾あるいは2つ以上の修飾型の任意の組み合わせでよく、さらに、1つまたは複数の標準的なホスホジエステル連結を含み得る。
「リンカー」は、2つの他の核酸分子の間の共有結合した分子架橋として機能する、1つまたは複数の2価の基（連結部材）を意味する。リンカーは、1つまたは複数の連結部材および1つまたは複数の型の連結部材を含み得る。例示的な連結部材は、-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-S(O)n（式中、nは、0、1、または2である）、-O-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)(O-)O-、アルカンジイル、アルケンジイル、アルキンジイル、アレンジイル、ヘテロアレンジイル、またはそれらの組み合わせを含む。一部のリンカーは、ペンダント側鎖またはペンダント官能基（またはその両方）を有する。ペンダント部分は、親水性修飾剤（すなわち、リンカーの水溶解性を増加させる化学基）、例えば、非限定的に、可溶化基（例えば-SO3H、-SO3 -、CO2H、またはCO2 -）であることができる。
「核酸分子」は、標準的なカノニカル塩基、超修飾塩基、非天然塩基、またはそれらの塩基の任意の組み合わせを含む、任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を意味する。例えば、非限定的に、核酸分子は、4つの標準的なDNA塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）または4つの標準的なRNA塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびウラシル）を含む。ヌクレオシドが2'デオキシリボース基を含む場合、ウラシルをチミンのために代用することができる。核酸分子は、RNAからDNAに、DNAからRNAから変換することができる。例えば、非限定的に、逆転写酵素を使用して、mRNAから相補的DNA（cDNA）を作製することができ、RNAポリメラーゼを使用して、DNAからRNAを作製することができる。核酸分子は、また、1つまたは複数の超修飾塩基、例えば、非限定的に、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-ヒドロキシウラシル、α-プトレシニルチミン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ヒドロキシシトシン、5-メチルシトシン、N4-メチルシトシン、2-アミノアデニン、α-カルバモイルメチルアデニン、N6-メチルアデニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2，6-ジアミンプリン、およびN7-メチルグアニンを含有することができる。核酸分子は、また、1つまたは複数の非天然塩基、例えば、非限定的に、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルアデニン、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルグアニン、イソシトシン（イソC）、5-メチルイソシトシン、およびイソグアニン（イソG）を含有することができる。カノニカル塩基、超修飾塩基、非天然塩基のみ、またはそれらの塩基の任意の組合せを含有する核酸分子はまた、例えば、非限定的に、ヌクレオチド残基間の各々の連結が標準的なホスホジエステル連結からなるものを含有することができ、加えて、該核酸分子は1つまたは複数の修飾された連結、例えば、非限定的に、窒素原子（すなわち、ホスホルアミデート連結）、硫黄原子（すなわち、ホスホロチオエート連結）、またはアルキルもしくはアリール基（すなわち、アルキルまたはアリールホスホネート）を伴う非架橋酸素原子の置換、硫黄原子（すなわち、ホスホロチオレート）を伴う架橋酸素原子の置換、ペプチド結合（すなわち、ペプチド核酸またはPNA）を伴うホスホジエステル結合の置換、あるいは1つまたは複数の追加の共有結合の形成（すなわち、ロックド核酸またはLNA）（これはリボース糖の2'酸素と4'炭素の間に追加の結合を有する）を、含有し得る。用語「2'-デオキシリボ核酸分子」は、2'-デオキシリボース基の2'-炭素原子が、少なくとも1つの水素原子を含むとの限定を伴う用語「核酸分子」と同じことを意味する。用語「リボ核酸分子」は、リボース基の2'-炭素原子が少なくとも1つのヒドロキシル基を含むとの限定を伴う用語「核酸分子」と同じことを意味する。
「核酸配列」は、カノニカル塩基、超修飾塩基、非天然塩基、または核酸分子中に存在するそれらの塩基の任意の組み合わせの順番を意味する。
「実施する」は、化学的または生化学的反応が生じて所望の産物を得ることを可能にする、全ての必要な成分、試薬、および条件を提供することを意味する。
「精製する」は、所与の混合物の所望の成分から実質的に全ての望ましくない成分を分離することを意味する。例えば、非限定的に、ダンベルテンプレートを精製することは、任意の所与のサイズ範囲についてダンベルテンプレートを形成するための連結に成功しなかった望ましくない核酸分子を除去する方法を指す。
「複製されたダンベルテンプレート」は、ローリングサークル複製の結果として標的配列の複数のコピーをもたらす、1つまたは複数のヘアピン構造を含有している1つの核酸分子を意味する。
「ローリングサークル増幅」または「RCA」は、元のダンベルテンプレートに加えて、コピーされた核酸分子が、その後の増幅ラウンドで出発核酸分子のさらなるコピーを作製するためのテンプレートとして働く、2つ以上のプライマーを使用する生化学的プロセスを意味する。
「ローリングサークル複製」または「RCR」は、コピーされた核酸分子が、その後の複製ラウンドで出発核酸分子のさらなるコピーを作製するためのテンプレートとして働かない、1つまたは複数のプライマーを使用する生化学的プロセスを意味する。特定の態様において、ダンベルテンプレートがプラス鎖である場合、ローリングサークル複製は、マイナス鎖のさらなるコピーをもたらす。特定の態様において、ダンベルテンプレートがマイナス鎖である場合、ローリングサークル複製は、プラス鎖のさらなるコピーをもたらす。本明細書において使用する通り、複製は増幅とは異なっており、増幅の場合はコピーされた核酸をその後の増幅ラウンドにおいて利用して開始核酸分子のさらなるコピーを作製する。
「サンプル」は、関心対象の核酸分子を含有する生物学的サンプルまたは合成的に作製された供給源より得られた材料を意味する。特定の態様において、サンプルは、データまたは情報が求められている所望の核酸を含む生物学的材料である。サンプルは、標的核酸分子を含むことが疑われる、少なくとも1つの細胞、胎児細胞、細胞培養、組織標本、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、膣分泌物、汗、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、糞便、身体滲出液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、多細胞胚、溶解物、抽出物、溶液、または反応混合物を含むことができる。サンプルは、また、非ヒト供給源（例えば非ヒト霊長類、げっ歯類、および他の哺乳動物）、病原性種（ウイルス、細菌、および真菌を含む）を含むことができる。特定の態様において、サンプルは、また、ヒトおよび非ヒト種、ならびに血液、水、空気、土壌、食品中の病原性種の検出のための、および、任意の予備知識を伴わず、サンプル中の全ての生物の同定のための、環境供給源からの単離物を含むことができる。特定の態様において、サンプルは、分解される核酸分子を含んでもよい。核酸分子は、物理的力（例えば剪断力）への、過酷な環境（例えば熱または紫外線）への、例えば臨床的または法医学的分析において用いられ得る化学的分解プロセスへの、微生物または熟成に起因する生物学的分解プロセスへの、精製または単離技術への、あるいは、それらの組み合わせへの曝露からもたらされる、ニック、切断、または修飾を有することができる。
「配列決定」は、複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートからのヌクレオチドの順番を同定することができる任意の生化学的方法を意味する。
「実質的に相補的なプライマー」は、別の核酸分子と安定な二本鎖である二重鎖を形成する核酸分子を意味するが、当該二重鎖領域内の核酸配列の1つまたは複数の塩基は、前述の別の核酸配列とは塩基対合しない。
一本鎖および二本鎖核酸分子の基本構造は、塩基対相互作用により左右される。例えば、2つの反対の鎖上の相補的または実質的に相補的なヌクレオチド間の塩基対の形成によって、二本の鎖が互いの周囲にコイルを形成し二重らせん構造を形成する。これは、2つ以上の核酸分子鎖の相補的なヌクレオチドの分子間塩基対合と呼ばれる。用語「ヌクレオチド」は、糖、塩基、および1つまたは複数のリン酸基からなる単位として本発明において広く定義され、これに関して、糖は、例えば、非限定的に、リボース、リボース基の1つまたは複数の原子に付着された追加の化学基を伴う修飾リボース、2'-デオキシリボース、または、2'-デオキシリボース基の1つまたは複数の原子に付着された追加の化学基を伴う修飾2'-デオキシリボースからなり、かつ、塩基は、例えば、非限定的に、上の核酸分子の定義において記載される通りの、カノニカル塩基、超修飾塩基、または非天然塩基からなる。相補的ヌクレオチドまたは実質的に相補的なヌクレオチドの塩基対合は、また、相補的ヌクレオチドまたは実質的に相補的なヌクレオチドの分子内塩基対合と呼ばれる同じDNA鎖分子上で生じ得る。
ヘアピン構造は、所与の核酸分子の相補的なヌクレオチドまたは実質的に相補的なヌクレオチドの分子内塩基対合により形成することができ、それは、ステムループ構造を形成することができる。ヘアピン構造のステム部分は、相補的なヌクレオチドまたは実質的に相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによって形成されて、二本鎖らせんストレッチを形成する。ヘアピン構造のループ領域は、ヌクレオチド配列の対を形成しないストレッチの結果である。ヘアピン構造の安定性は、ステム領域の、長さ、核酸配列組成、および塩基対相補性または実質的な相補性の程度に依存する。例えば、5つの相補的なヌクレオチドのストレッチは、3つの相補的なヌクレオチドのストレッチよりも安定と考えてもよく、あるいは、グアニンおよびシトシンで主に構成される相補的なヌクレオチドのストレッチは、アデニンおよびチミン（DNA）またはウラシル（RNA）で主に構成される相補的なヌクレオチドのストレッチよりも安定と考えてもよい。修飾ヌクレオチドを置換してこれらの天然塩基について二本鎖ステム領域の安定性を変化させてもよく、それらの例には、非限定的に、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2,6-ジアミノプリン、N6-メチルアデニン、5-メチルシトシン、7-デアザプリン、5-ヒドロキシルメチルピリミジンが含までる。修飾ヌクレオチドは、また、RNA種において見出される多数の修飾塩基を含み得る。天然のステムループ構造は、主に、RNA種、例えばトランスファーRNA（tRNA）、プレマイクロRNA、リボザイム、およびそれらの等価物において見出される。
核酸ヘアピン構造は、合成オリゴヌクレオチドを製造する方法を使用して、意図的な設計により生成され得る。オリゴヌクレオチドは、DNA配列決定およびPCRのためのプライマーとして、スクリーニングおよび検出実験のためのプローブとして、ならびに、クローニング目的のためのリンカーまたはアダプターとして広く使用される。15～25ヌクレオチドの範囲内の短いオリゴヌクレオチドを、精製せずに、直接的に使用することができる。段階的収率が100%未満であるため、より長いオリゴヌクレオチドでは、失敗したオリゴヌクレオチド画分（n-1、n-2などの産物としても公知である）を除去するために、高速液体クロマトグラフィーまたはHPLCによる、あるいは、分取ゲル電気泳動による精製が必要である。特定の態様において、核酸ヘアピンはおよそ約100塩基である。
実験の性質に依存して、所与のヘアピン構造は、本明細書において論じる通り、1つもしくは複数の超修飾もしくは非天然塩基および／または1つまたは複数の骨格連結を置換する、あるいは、他の合成塩基、例えば7-デアザ-7-ヒドロキシブリン、イソCおよびイソG、またはその同等物を含むように、ならびに、例えば、非限定的に、RNA-DNA、PNA）-DNA、PNA-RNA、PNA-PNA、LNA-DNA、LNA-RNA、LNA-LNA二本鎖である二重鎖を作製することにより、二本鎖である二重鎖の所望の安定性を含有するように設計されてもよい。合成的に設計されたヘアピン構造は、いくつかの分子生物学技術において、例えば、非限定的に、DNAフラグメントの末端にヘアピンを連結することによりDNAポリメラーゼのためのプライミング部位として、および、関心対象の配列を同定するためのプローブとして部分を検出する際に、および、線状フラグメントから環状DNA分子を形態的に作製する際に有用である。特定の態様において、1つまたは複数のヘアピン構造の5'末端を、例えば、非限定的に、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化して1つまたは複数の断片化された核酸分子の末端への、連結剤を使用した効率的な連結を促進する。
特定の態様において、増幅または複製されたダンベルテンプレートは、オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブであることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されたDNAプローブであることができる。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、酵素、もしくは発光化合物、またはそれらの組み合わせの1つまたは複数と結合させることができる。
特定のヘアピン構造はまた、オリゴヌクレオチドプローブとして使用されてきた。特定のDNAプローブはまた、分子ビーコンとしても公知であり、互いに相補的である2つの末端を伴う内部プローブ配列を含むように設計されたオリゴヌクレオチドである。適切な条件下で、末端はハイブリダイズしてステムループ構造を一緒に形成する。プローブ配列は、分子ビーコンのループ部分内に含有され、ステムアームとは無関係である。蛍光染料は、ステム上の1つの末端に付着され、非蛍光消光部分つまり「クエンチャー」は、ステムのもう一方の末端に付着されている。ステムループ構成において、ハイブリダイズしたアームは、蛍光色素およびクエンチャーを近接させて保ち、その結果、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の十分に理解されているプロセスによって蛍光色素シグナルの消光をもたらす。ループ構造内のプローブ配列が、その意図された標的配列を見出し、ハイブリダイズする場合、ステム構造では、より長く、より安定なプローブ-標的二重鎖が優先して破壊される。プローブハイブリダイゼーションは、蛍光色素およびクエンチャーの分離をもたらし（すなわち、近接は、ここで失われている）、これに関して、色素は、検出器の適切な励起源に曝露された場合、ここで蛍光を発することができる。分子ビーコンは、対立遺伝子の差を識別するために、多くの分子生物学技術、例えばリアルタイムPCRにおいて使用されてきた。
特定の態様において、ヘアピン構造は、単一のヘアピン構造を形成するように次に連結された2つ以上の核酸分子を使用して作製することができる。2つ以上の核酸分子は、ヘアピン構造を形成するために、連結試薬を使用して一緒に連結することができる。2つ以上の核酸分子は、また、ヘアピン構造を形成するために、リンカーを使用して一緒に化学的に連結することができる。特定の態様において、1つまたは複数のヘアピン構造の5'末端を、例えば、非限定的に、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、連結剤を使用して1つまたは複数の断片化された核酸分子の末端への効率的な連結を促進する。
特定の態様では、機能的に重要な情報は、ヘアピン構造のステム領域中に存在することができる。特定の態様において、機能的に重要な情報は、ヘアピン構造のループ領域中に存在することができる。機能的に重要な情報は、例えば、非限定的に、インビトロでの複製、インビトロでの増幅、固有の識別子（すなわち、バーコード）、および検出のために必要な配列を含むことができる。機能的に重要な情報が、ヘアピン構造のループ領域中に存在する特定の態様において、ステム領域の長さは、4または6塩基対と少数であることができる。機能的に重要な情報が、ヘアピン構造のステム領域中に存在する特定の態様において、ループ領域の長さは、1または2塩基と少数であることができる。
メイト対テンプレートライブラリーは、所与のサイズ、（例えば2kb）について選択された、環状化する剪断されたゲノムDNAにより調製され、したがって、以前には互いから遠位にあった末端が、近接するようになる。サークルは、次に、機械的または物理的手段により線状DNAフラグメントに切断される。接合フラグメントと呼ばれる、連結された遠位末端を含むDNAフラグメントは、メイト対テンプレートを作製するために使用される。「接合フラグメント」は、選択可能なマーカーとの組み合わせにおいてより大きなDNA分子の遠位末端を含有し、かつ、最初にDNAサークルを作る、DNAサークルを断片化する、選択可能なマーカーを含有するフラグメントについて選択することにより作製された、DNA分子である。
例えば、非限定的に、サークルを作製する方法は、制限エンドヌクレアーゼ（例えばMbo I）を用いて高分子量ゲノムDNAを部分的に消化することを含む。他の公知の4-、6-、もしくは8-塩基「カッター」または同等物も使用してもよい。非常に低濃度でのDNAフラグメントを、小さな選択可能なマーカーとの組み合わせにおいて一緒に連結して共有結合DNAサークルを作製する。このように、環状DNA分子は、DNAフラグメントの遠位末端の両方に隣接する選択可能なマーカーを伴って生成される。接合フラグメントのライブラリーは、異なる制限エンドヌクレアーゼ（例えばEcoRI）を用いてDNAサークルを消化し、次に、それらの遠位末端に隣接したマーカーフラグメントについて選択することにより作製される。接合フラグメントライブラリーは、遺伝的および物理的マッピング実験において、ならびに配列決定適用において使用される。
より一般的な用語において、いくつかの因子を、連結フラグメントの比率を最適化する際に考慮すべきであり、それらによって、「分子間」連結事象（すなわち、コンカテマーと呼ばれる、2つ以上の核酸分子の連結）よりも「分子内」連結事象（すなわち、同一の核酸分子のDNAサークル）が優先される。比率は、二つのパラメータにより支配される：同じ分子のもう一方の末端により経験される、分子の一方の末端の効果的な局所モル濃度（j）、および全ての他のDNA分子の末端のモル濃度（i）。パラメータjは、Jacobon-Stockmayer方程式から決定することができる：
j＝3.55×10-8M/kb3/2
式中、kbはキロベース対（kpb）の核酸分子の長さである。所与の連結反応のために、分子内事象のパーセンテージは、j/（i＋j）の比率により決定される。すなわち、より大きな核酸分子は、分子内サークルを作製する際に合理的な効率を達成するために、より小さな核酸分子と比較して、さらに希釈しなければならない。選択可能なマーカーが、合理的な確率を伴って分子内連結中に組み入れられるためには、そのモル濃度が、jと大まかに等価であるべきである。しかし、非常に希釈した連結条件下でさえ、分子間連結種を形成する確率が依然として生じ、結果として2つ以上の核酸分子の分子内サークルおよび線状コンカテマーの混合物がもたらされる。下記を含む大きな環状核酸分子を作製することに関連するいくつかの技術的な問題がある：（a）より小さな核酸分子へと破壊することなく、非常に大きな核酸分子を生成および取り扱うこと、（b）接合フラグメントについて濃縮するための適切な選択可能なマーカーを同定すること、および（c）完全で、代表的な核酸ライブラリーを作製する際に大量の出発核酸材料を必要とすること。大きな核酸分子を取り扱うための十分に確立された方法（例えばパルスフィールドゲル電気泳動）が当技術分野において存在し、代替戦略、例えば、接合フラグメントの選択を改善するためのビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン系が使用されてきた。しかし、大量の出発核酸材料についての必要性に関する問題は適切に対処されていない。従って、限定された量で出現する貴重な生物学的サンプル、例えば、手術手順中に得られる生検サンプルまたは全血、血漿、もしくは血清から得られる遊離の循環DNAの分析を考慮した場合、分子内連結事象の戦略により核酸サークルを作製することは、ほとんど適用可能ではない。
サンプルから核酸を単離する多数の方法がある。ひとたび単離されれば、1つまたは複数の核酸分子は、例えば、非限定的に、配列非特異的または配列特異的な様式で断片化のプロセスによって、より小さなフラグメントに破壊され得る。配列非特異的なまたはランダムな断片化プロセスは、関心対象の所与のゲノムに沿った、断片化された核酸分子の均一なまたは実質的に均一な分布を産生することが予測される。例えば、非限定的に、1,000,000の断片化された核酸分子を、等しいサイズの1000の位置（すなわち、ウィンドウ）にマッピングすることができ、各々のウィンドウが、1,000のマッピングされた断片化核酸分子のカウントを有する。特定の態様において、関心対象の所与のゲノムに沿った、断片化された核酸分子の均一なまたは実質的に均一な分布から得られたデータが、特定のデータ型を別のものよりも優先するバイアス、例えば、非限定的に、研究下のゲノムの所与の領域でのGC含量を示し得る。特定の態様において、核酸分子は、DNアーゼIを使用して酵素的に断片化され、それによって、二本鎖DNAが非特異的に断片化される。断片化の産物は、5'-リン酸化ジ-、トリ-、および異なるサイズのオリゴヌクレオチドである。DNアーゼIは、Mn2＋、Mg2＋、およびCa2＋を含むが、緩衝液中に他の塩を含まない緩衝液中で最適な活性を有する。DNアーゼIを使用した断片化は、典型的には、Mn2＋ベースの緩衝液の存在において使用された場合、平滑末端の二本鎖DNAフラグメントの優位を伴う、二本鎖DNAのランダムな消化をもたらす。Mn2＋ベースの緩衝液条件の使用下でさえ、断片化された核酸分子は、断片化された二重鎖のもう一方の核酸鎖の末端を越えて伸長する未知の配列の1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドの5'突出末端（本明細書で「5'末端オーバーハング」として言及される）および断片化された二重鎖のもう一方の核酸鎖の末端を越えて伸長する未知の配列の1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドの3'突出末端（本明細書で「3'末端オーバーハング」）として言及される）を含み得る。DNアーゼI消化に続く、ライブラリーのフラグメントサイズの範囲は、いくつかの因子、例えば、非限定的に、（i）反応で使用されるDNアーゼIの量（単位）、（ii）反応の温度、および（iii）反応の時間に依存する。
特定の態様において、核酸分子は、物理的または機械的手段を使用して、配列非特異的に断片化される。例えば、非限定的に、核酸分子は、噴霧を使用して断片化することができ、それによって、二本鎖核酸分子がより小さなフラグメントに剪断される。噴霧に続く、ライブラリーのフラグメントサイズの範囲は、いくつかの因子、例えば、非限定的に、（i）噴霧器に適用される圧力、および（ii）剪断プロセスの時間に依存する。フラグメントの剪断ライブラリーは、種々の末端型（平滑末端、5'末端オーバーハング、および3'末端オーバーハングを含む）を含む。ランダムな断片化方法を使用した、1つまたは複数の断片化された核酸分子の末端を、連結剤を直接的に使用し、アダプターに連結し、ダンベルテンプレートを形成する、またはダンベルテンプレートを連結することを可能にすることができる（下記参照）。
サンプルからの単離核酸分子は、また、例えば、非限定的に、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼを使用した配列特異的断片化プロセスによって、より小さなフラグメントに破壊することができる。配列特異的な断片化プロセスは、関心対象の所与のゲノムに沿った、断片化された核酸分子の不均一なまたは実質的に不均一な分布を産生することが予測される。ゲノムワイドな試験のために、配列特異的な断片化プロセスは最適ではない場合がある。なぜなら、ゲノム領域の一部分（有意であり得る）が、低頻度の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有することが予測されるからである。切断部位の分布は、所与の断片化プロセスのために使用される制限エンドヌクレアーゼの種類および数に依存する。低頻度の切断部位を伴う領域は、ゲノム情報の過小表現をもたらす。配列特異的断片化アプローチを使用すること、例えば、非限定的に、関心対象のゲノムのサブセットを標的とすることにはいくつかの利点があり、それによって、労力、費用、およびデータ分析を低減させ、断片化された核酸分子の末端は、平滑末端として定義されるかまたは5'末端オーバーハング核酸配列として定義され、かつ、3'末端オーバーハング核酸配列として定義される。定義された核酸配列を伴う突出末端は、「付着末端」として言及される。特定の態様において、2つ以上の制限エンドヌクレアーゼを使用して各々の末端が異なる付着末端配列を有する、より小さなフラグメントを作製し得る。例えば、非限定的に、単離核酸分子は、2つの制限酵素（すなわち、EcoRIおよびBamHI）を用いて消化され、3つの異なる付着末端型をもたらす（すなわち、5'-AATT［EcoRI］の同じ5'オーバーハング配列または5'-GATC［BamHI］の5'オーバーハング配列のいずれかを含有する両方の末端、あるいは異なる付着末端を含有する両方の末端（すなわち、5'-AATTの5'オーバーハング配列を有する一方の末端および5'-GATCの5'オーバーハング配列を有するもう一方の末端））。5'-AATTの相補性付着末端を有する1つのヘアピン構造は、連結剤を使用して、EcoRI付着末端を含有するフラグメントに連結することができ、5'-GATCの相補性付着末端を有する異なるヘアピン構造は、連結剤を使用して、BamHI付着末端を含有するフラグメントに連結することができる。異なるヘアピン構造を含有するダンベルテンプレートは、異なるヘアピン構造のための相補的な配列を含有する親和性支持体を使用して濃縮され得る（詳細については、実施例を参照のこと）。
サンプルからの単離核酸分子は、また、例えば、非限定的に、マルチプレックスPCRを使用して、配列特異的な断片化プロセスによって、より小さなフラグメントに作製し得る。例えば、非限定的に、2つ以上のPCRプライマーセットは、核酸分子を含む2つ以上の標的領域を特異的に増幅するように設計され得る。プライマーを含む標的特異的な核酸配列を設計することに加えて、機能的に重要な情報を有する追加の核酸配列は、例えば、非限定的に、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位および固有の識別子（すなわち、バーコード）を含むことができる。特定の態様において、1つまたは複数のフォワードPCRプライマーは、1つの所与の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含み得るが、1つまたは複数のリバースPCRプライマーは、1つの異なる制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含み得る。対応する制限エンドヌクレアーゼを用いて増幅されたPCR産物を接触させる際、それらの各々は、その切断部位を認識し、切断し、増幅されたPCR産物の末端は、付着末端を含み得るが、それらは、予測可能な様式において、2つの異なるヘアピン構造の付着のために使用してもよい。例えば、非限定的に、標的特異的な核酸配列に加えて、全てのフォワードPCRプライマーは、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有し、全てのリバースPCRプライマーは、BamHI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する。2つ以上のPCRプライマーセットを使用したマルチプレックスPCRに続き、EcoRIおよびBamHIを用いた増幅PCR産物の制限エンドヌクレアーゼ消化は、5'-AATTの5'-オーバーハング配列を有するフォワードプライマー末端および5'-GATCの5'-オーバーハング配列を有するリバースプライマー末端をもたらす。5'-AATTの相補性付着末端を有する1つのヘアピン構造は、連結剤を使用して、フォワードプライマーだけに連結することができ、5'-GATCの相補性付着末端を有する異なるヘアピン構造は、連結剤を使用して、リバースプライマー末端にだけに連結することができる。一部の態様において、サンプルからの単離核酸分子は、任意の断片化プロセスを要求しない場合がある。なぜなら、これらの単離核酸分子は、ダンベルテンプレートを作製するために十分に断片化され得るからである。例えば、非限定的に、妊娠女性または癌患者から得られた全血からの血清または血漿からの単離核酸分子は、インビボで十分に断片化され、追加的な断片化は、ダンベルテンプレートを作製するために必要ではない場合がある。特定の態様において、サンプルは、癌患者から得ることができる。特定の態様において、サンプルは、妊娠個体から得ることができる。特定の態様において、サンプルは、病理標本から得ることができる。特定の態様において、サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）標本から得ることができる。特定の態様において、サンプルは、環境サンプルから得ることができる。特定の態様において、核酸分子は、100bpから100kbpの範囲の長さであることができる。
核酸分子の単離されたインビボ断片化ライブラリーは、種々の末端型（平滑末端、5'末端オーバーハング、および3'末端オーバーハングを含む）を含有する。断片化された核酸分子の末端を、連結剤を直接的に使用して、アダプターに連結して連結ダンベルテンプレートを形成する、または、末端が連結ダンベルテンプレートを形成することができるように、最初に処理することができる（下記参照）。
平滑末端を含む断片化された核酸分子のパーセンテージは、研磨方法の使用により、例えば、非限定的に、3'エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを使用することにより増加させることができる。例えば、非限定的に、そのようなポリメラーゼは、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウDNAポリメラーゼ、またはPfu DNAポリメラーゼを含み得る。これらのDNAポリメラーゼの3'エキソヌクレアーゼ活性は、3'末端オーバーハングから未知または既知の配列の1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドを除去することにより、平滑末端の断片化された核酸分子を作製するように機能する。5'末端オーバーハングは、陥凹3'末端鎖への相補的なヌクレオチドの酵素的取り込みにより平滑末端にされて、また平滑末端の断片化された核酸分子が作製される。特定の態様において、1つまたは複数の断片化された核酸分子の5'末端は、例えば、非限定的に、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化することができ、連結剤を使用して、1つまたは複数のヘアピン構造の末端へのダンベルテンプレートの効率的な作製を促進することができる。
断片化核酸分子の平滑末端化およびリン酸化に続く特定の態様において、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターは、機能的に重要な情報、例えば、非限定的に、複製、増幅、および／または固有の識別子（すなわち、バーコード）配列を導入するため、ならびに、任意の付着末端配列を提供するように設計することができる。後者の配列は、連結剤を使用して、相補的な付着末端配列を有する5'-リン酸化ヘアピン構造を伴うダンベルテンプレートの効率的な作製を促進させるために有用であることができる。特定の態様において、トランスポザーゼおよびトランスポゾン複合体は、1つまたは複数の核酸分子を断片化し、同時に機能的に重要な情報、例えば、非限定的に、複製、増幅、および／または固有の識別子（すなわち、バーコード）配列を挿入し、かつ挿入点で付着末端配列を作製することが可能な任意の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を提供する際に使用することができる。特定の態様において、断片化された核酸分子の末端は、他の手段により、例えば、非限定的に、平滑末端の断片化された核酸分子の3'末端への2'-デオキシアデノシン（DA）ヌクレオチドの付加により修飾することができる。例えば、非限定的に、3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼ（例えばKlenow 3'-エクソマイナスDNAポリメラーゼおよびTaq DNAポリメラーゼ）を、平滑末端の断片化された核酸分子の3'末端に2'-デオキシアデノシン三リン酸を加えて、1つの2'-デオキシアデノシン一リン酸ヌクレオチドを伴う3'末端オーバーハングを生成することができる。dA-テーリング方法は、また、連結剤を使用した、1つの2'-チミジン一リン酸ヌクレオチドの相補的な3'末端オーバーハングを有する5'-リン酸化ヘアピン構造を伴う、効率的なダンベルテンプレートの構築を促進させる。特定の態様において、平滑末端の断片化された核酸分子は、また、連結剤を使用して、ダンベルテンプレートを作製するために直接的に使用され、対応する平滑末端を有する5'-リン酸化ヘアピン構造を連結することができる。
分子内連結事象の戦略により核酸サークルを作製する現在の方法（限定された量における貴重な生物学的サンプルの分析を考慮した場合にほとんど適用可能ではない）とは異なり、核酸サークルを作製する効率は、本発明の方法により大きく改善される。例えば、非限定的に、分子内連結事象の戦略により核酸サークルを作製するには、数十マイクログラムの出発物質が要求されるが、所望の核酸サークルを作製する際、1%またはそれ未満のおおよその効率となってしまう。分子内連結戦略に関連する問題はさらに複雑化する。なぜなら、この方法は、核酸分子のサイズに依存し、連結の効率に反比例するからである。すなわち、大きなサイズの核酸分子では、分子内連結アプローチによって、より少ないサークルが作製される。なぜなら、反応条件は、核酸分子の長さに比例して、ますます増加する希釈濃度を指示するからである。他方で、ダンベルテンプレートを作製するための本発明において記載する方法は、高度に効率的である。なぜなら、この方法は、分子内連結アプローチに依存しないからである。逆に、ダンベルテンプレートの作製は、分子間事象により実施され、そこで、ヘアピン構造に核酸分子を連結する連結効率は、非常に効率的にすることができる。連結反応は、完了にまたは実質的に完了に近くまで進行することができる。なぜなら、ヘアピン構造の濃度は、核酸分子の濃度を上回り、十分高く（すなわち、100倍）あることができるからである。連結反応は、また、1つまたは複数の核酸分子のサイズに非依存的または実質的に非依存的である。なぜなら、1,000bpのサイズのダンベルテンプレートは、5,000bpのサイズまたは10,000bpのサイズ、または、さらには100,000bpのサイズ、または、さらには100,000bpより大きなダンベルテンプレートと同様に効率的に作製することができるからである。本発明の特定の態様において、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、および10.0kbの漸増サイズの効率的な二重ヘアピンダンベルテンプレートが、ゲノムDNAから構築され得る。特定の態様において、ダンベルテンプレートは、次に、均質な反応溶液中でのローリングサークル機構を使用して複製または増幅され得る。特定の態様において、限界希釈法で基板上にダンベルテンプレートを導入することにより、1つまたは複数の固相結合プライマーを使用し、不均質な反応液中でのローリングサークル機構を使用して、ダンベルテンプレートが複製または増幅されてもよく、そのため、1つまたは複数の複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートが、核酸分子を検出するために、空間的およびスペクトル的に解像可能である。
特定の態様において、ダンベルテンプレートは、1つまたは複数のヘアピン構造を含有するプラス鎖核酸分子である。特定の態様において、ダンベルテンプレートを、形成することもでき、それにより一本鎖核酸分子の各々の末端がヘアピン構造に連結され、それにより1つのヘアピン構造がプライマーとして作用して一本鎖核酸分子をヘアピン構造のもう一方の末端に伸長およびコピーすることができる。連結工程に続き、ダンベルテンプレートが形成される。本発明の特定の態様において、線状二本鎖領域は、例えば、非限定的に、熱的、化学的、または酵素的手段により融解され得、ダンベルテンプレートは、完全に開いた一本鎖サークルに変換することができる。特定の態様において、ダンベルテンプレートは、固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する異なる核酸配列を有する2つの異なるヘアピン構造を使用して作製され得る。これらの円形テンプレートは、標的配列の複数のコピーを作製するために、ローリングサークル機構を使用して複製され得る。RCR工程に続いて、線状コンカテマーは適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化されて標的配列のモノマー単位が産生されてもよく、それらの末端は、次に、一緒に連結されて複数のコピーの円形の標的配列が作製された。本発明の特定の他の態様において、ダンベルテンプレートは、関心対象の遺伝子のRNA分子の転写において使用され得る。1つまたは複数のRNAプロモーター配列を含有するダンベルテンプレートが生成され、これらの閉鎖一本鎖核酸サークルは、関心対象の遺伝子のRNA分子のインビトロ転写のためのテンプレートとして使用される。
特定の態様において、ダンベルテンプレートを形成するための連結に成功しなかった望ましくない核酸分子を除去するために、エキソヌクレアーゼを使用することができる。これらの望ましくない核酸分子は、平滑末端、5'突出末端、および／または3'突出末端の形態であり得る、あるいは、一本鎖形態で存在し得る、1つまたは複数の5'末端または3'末端を有し得る。これらの望ましくない核酸分子は、非断片化および断片化核酸分子、ヘアピン構造を形成しなかったであろうオリゴヌクレオチド、および非連結ヘアピン構造を含むが、これらに限定されない。エキソヌクレアーゼIII（エキソIIIとも呼ばれる）は、二本鎖DNAの3'ヒドロキシル末端のモノヌクレオチドの段階的除去を触媒する。限定された数のヌクレオチドしか各々の結合事象の間に除去されず、結果としてDNA分子の集団内で協調的な連続する欠失がもたらされる。エキソIIIの好ましい基質は、平滑末端または5'突出末端を含有する核酸分子であるが、酵素は、また、二本鎖DNA中のニックで作用して一本鎖ギャップを産生する。エキソIIIは、一本鎖DNA上では活性でなく、よって3'突出末端は、切断に抵抗性である。抵抗の程度は、伸長の長さに依存し、4塩基またはそれ以上の伸長は、切断に本質的に耐性である。この特性は、1つの耐性（3'突出末端）および1つの感受性（平滑末端または5'突出末端）末端を伴う線状分子から一方向の欠失を産生するために利用することができる。エキソヌクレアーゼIII活性は、らせん構造に部分的に依存し、配列依存性（C＞A＝T＞G）を呈する。温度、塩濃度、およびDNAに対する酵素の比率が酵素活性に大きく影響し、反応条件を特定の適用に合わせて調整することが要求される。エキソヌクレアーゼVII（エキソVIIとも呼ばれる）は、一本鎖DNAを、5'→3'および3'→5'の両方の方向から切断する。この酵素は、線状または環状二本鎖DNA上で活性ではない。これは、ダンベルテンプレートを作製する際、完了したPCR反応物および連結後反応物からの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーおよびヘアピンの除去のために有用である。エキソヌクレアーゼVIIによる一本鎖DNAの消化は、金属非依存的である。エキソIIIおよびエキソVIIは、ダンベルテンプレートを形成するための連結に成功しなかった望ましくない核酸分子を除去するために、組み合わせて使用することができる。
基板は、任意の材料、例えば、非限定的に、固形材料、半固形材料（すなわち、［i］固形支持体およびゲルもしくはマトリックス材料の合成物、または［ii］線状または架橋ポリアクリルアミド、セルロース、架橋アガロース、およびポリエチレングリコール）、または流体もしくは液体材料で構成することができる。基板は、また、任意の寸法および形状、例えば、非限定的に、正方形、台形、球形、回転楕円形、管状、ペレット状、棒状、または八面体を有する任意の材料で構成することができる。基板は、本発明と適合性のある（すなわち、複製、増幅、または検出プロセスにあたり最小限の干渉を示す）特性を含むべきである。特定の態様において、基板は非多孔質である。特定の態様において、基板は多孔質である。特定の態様において、基板は、ヒドロゲルのような親水性多孔質マトリックスで構成することができる。特定の態様において、固形材料は、例えば、非限定的に、ガラス材料（すなわち、ホウケイ酸塩、調節孔ガラス、溶融シリカ、またはゲルマニウムドープシリカ）、シリコン、ジルコニア、二酸化チタン、高分子材料（すなわち、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、例えばナイロン、デキストラン、架橋デキストラン、ラテックス、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、ならびにそれらの他のコポリマーおよびグラフト）、または金属材料を含む。固形基板は、例えば、非限定的に、1つまたは複数の膜、平面状の面、実質的に平面状の面、非平面状の面、マイクロタイタープレート、球状ビーズ、非球状ビーズ、光ファイバー、球状ビーズを含有する光ファイバー、非球状ビーズを含有する光ファイバー、半導体デバイス、球状ビーズを含有する半導体デバイス、非球状ビーズを含有する半導体デバイス、球状ビーズを含有する1つまたは複数のウェルを伴うスライド、非球状ビーズを含有する1つまたは複数のウェルを伴うスライド、フィルター、検査片、スライド、カバースリップ、または試験管からなることができる。特定の態様において、半固形材料は、例えば、非限定的に、線状または架橋ポリアクリルアミド、セルロース、架橋アガロース、およびポリエチレングリコールを含む。
1つまたは複数のプライマーは、任意の適した手段により基板に付着させることができる。特定の態様において、基板への1つまたは複数のプライマーの付着は、例えば、非限定的に、共有結合により、水素結合（すなわち、それにより、プライマーが、基板に共有結合的に付着された別の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされるが、依然として、複製可能または増幅可能な機能を果たす）、ファンデルワールス力、物理的吸着、疎水性相互作用、イオン性相互作用または親和性相互作用（すなわち、結合対、例えばビオチン／ストレプトアビジンまたは抗原／抗体）により媒介される。特定の態様において、結合対の1つの部材は、基板に付着され、結合対の他の部材は、1つまたは複数のプライマーに付着される。基板への1つまたは複数のプライマーの付着は、結合対の2つの部材の相互作用を通じて生じる。
1つまたは複数のプライマーが基板に付着される順番は、「プライマーアレイ」として広く定義される任意の配置、例えば、非限定的に、ランダムアレイにおいて、パターン化アレイ中のランダム分類により、または、順番付けられたアレイ中の公知のパターン化によることができる。ローリングサークル機構によりダンベルテンプレートを複製するプライマーアレイは、「複製されたダンベルテンプレートアレイ」として広く定義される。ローリングサークル機構によりダンベルテンプレートを増幅するプライマーアレイは、「増幅されたダンベルテンプレートアレイ」として広く定義される。設計により、パターン化アレイおよび順番付けられたアレイは、核酸分子を検出するために空間的およびスペクトル的に解像可能な、複製されたダンベルテンプレートアレイまたは増幅されたダンベルテンプレートアレイを提供することが予測される。ランダムアレイの特定の態様において、平面または実質的に平面な面上に固定化されたプライマーの高密度ローンを形成するために、1つまたは複数のプライマーを基板に共有結合的に結合させることができる。1つまたは複数のプライマーは、任意の手段により、例えば、非限定的に、溶液、エマルジョン、エアロゾル、蒸気、または乾燥調製物を滴下、噴霧、プレーティング、または拡散させることを含む方法により付着させてもよい。限界希釈様式で基板上にダンベルテンプレートを導入することにより、1つまたは複数のプライマーをダンベルテンプレートに接触させて、ポリメラーゼの存在においてローリングサークル機構が、核酸分子を検出するために空間的およびスペクトル的に解像可能な、1つまたは複数の複製されたダンベルテンプレート（すなわち、複製されたダンベルテンプレートアレイ）あるいは増幅されたダンベルテンプレート（すなわち、増幅されたダンベルテンプレートアレイ）を産生することを可能にする。パターン化アレイのランダムな取り合わせの特定の態様において、1つまたは複数のプライマーを基板に共有結合的に結合させて、より多くの球状または非球状ビーズの1つの上で高密度の固定化プライマーを形成することができる。水中油型エマルジョン系を使用した限界希釈法で基板上にダンベルテンプレートを導入することにより、1つまたは複数のプライマーがダンベルテンプレートに接触して、ローリングサークル機構が1つまたは複数の複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートを産生することを可能にする。特定の態様において、複製されたダンベルテンプレートビーズまたは増幅されたダンベルテンプレートビーズを濃縮して、単一分子を分布させるポアソン統計に基づいて、ダンベルテンプレートを複製または増幅しなかったそれらのビーズを除去することができる。複製されたダンベルテンプレートビーズまたは増幅されたダンベルテンプレートビーズを、濃縮を伴いまたは伴わず、次に、平面状または実質的に平面状のスライド基板、光ファイバー基板、または、ウェルを含有する半導体デバイス基板、くぼみ、または他のコンテナ、容器、特徴、または場所で、順番付けられたパターンでランダムに分布させことができる。パターン化アレイにおけるランダムな取り合わせの他の特定の態様において、表面上の1つまたは複数の予め作製した親水性特徴（すなわち、スポット）は、基板への1つまたは複数のプライマーの共有結合のための疎水性表面により囲むことができる。例えば、非限定的に、パターン化アレイは、約300ナノメートルスポットの格子状アレイを伴って、フォトリソグラフィでエッチングされた表面修飾シリコン基板に作製することができる。限界希釈様式で、パターン化された基板上にダンベルテンプレートを導入することにより、プライマーがダンベルテンプレートに接触して、ローリングサークル機構が1つまたは複数の複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートを産生することを可能にする。特定の態様において、予め作製する親水性スポットは、1つの複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートだけを収容するようにさらに小さくすることができる。ポアソン統計結果に基づく単一分子の分布は、テンプレートスポットなしのかなりの部分をもたらすため、ローリングサークル手順に続き、分布、接触、およびローリングサークルの追加ラウンドを用いて、基板上での、複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートの密度を増加させ得る。順番付けられたアレイ中にパターン化された「公知」の特定の態様において、1つまたは複数の公知のプライマーをプリントする（すなわち、スポットアレイ）、または基板上のアドレス参照が可能な場所で、インサイチュで作製することができる。限界希釈様式でパターン化された基板上にダンベルテンプレートを導入することにより、1つまたは複数のプライマーがダンベルテンプレートに接触して、ローリングサークル機構が1つまたは複数の複製されたダンベルテンプレートまたは増幅されたダンベルテンプレートを産生することを可能にする。
ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）は、少量の核酸分子を特異的に増幅するために使用されて、関心対象の標的配列の数千から数百万のコピーを生成する。一般的に言えば、PCRは、二重鎖を変性または融解するために加熱を繰り返すこと、プライマーをハイブリダイズするために冷却すること、次に、インビトロで（すなわち、生物の外で）テンプレート配列を増幅するために再び加熱すること（通常はDNAポリメラーゼについての最適温度で、しかし、変性温度未満で）を含む。DNAポリメラーゼは、一本鎖テンプレートから相補鎖をコピーまたは合成する。この酵素反応が生じるためには、DNAの部分的に二本鎖の部位が要求される。典型的に、プライマーは、一本鎖テンプレートの相補的領域にハイブリダイズする。DNAポリメラーゼは、5'から3'方向に新生鎖を合成して二本鎖DNAを作製する。マルチプレックスPCRは、複数の標的領域の同時増幅を可能にし、X連鎖障害においてコードエクソン欠失を検出するために使用されてきた（これらのエクソンは、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写され、1つまたは複数のタンパク質に翻訳される遺伝子配列である）；そのようなX連鎖障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびレッシュ・ナイハン症候群を含む。代替法において、出発混合物中に存在する核酸のプール全体を増幅するためにPCRを使用することができ、結果として増幅をもたらすが、核酸の任意の所与のサブセットの標的化濃縮はもたらさない。これは、フラグメントの末端に共通配列またはアダプターを連結すること、ならびに、フラグメントを変性させ、配列が共通アダプターに相補的である共通プライマーをハイブリダイズし、かつDNAフラグメントをコピーすることによってフラグメントを増幅することにより達成される。このタイプのPCRは、「ユニバーサルPCR」と呼ばれる。
バクテリオファージ（またはファージ）（例えばΦX174、M13、ラムダ）、および一部のウイルスは、「ローリングサークル」機構により、それらのそれぞれのゲノムを複製することができる。ゲノム全体が、円形テンプレートからのコピーにより複製される。PCRとは異なり、ローリングサークル機構は、等温的に（すなわち、それは、加熱または冷却サイクルを必要としない）実施することができる。
ローリングサークルアプローチは、関心対象の核酸分子を複製する（すなわち、元のダンベルテンプレートだけをコピーする1つまたは複数のプライマーを使用する）または増幅する（すなわち、元のダンベルテンプレートおよびダンベルテンプレートのコピーの両方をコピーする2つ以上のプライマーを使用する）ためのインビトロ方法として使用されてきた。例えば、34～52塩基のサイズの範囲の円形の合成オリゴヌクレオチドテンプレートは、大腸菌（E.coli）のPol I DNAポリメラーゼおよび単一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したローリングサークル機構を使用して複製されてきた。同様のサイズのサークルを使用したローリングサークル機構は、26～74の範囲であり、いくつかのポリメラーゼ（大腸菌のPol I、Klenow DNAポリメラーゼ、およびT4 DNAポリメラーゼを含む）を伴う。
特定の態様において、DNAサークルを「パドロックプローブ」として作製することができる。パドロックアプローチでの主要な欠点は、環状核酸分子を作製するサイズ制限であり、例えば、非限定的に、CFTR G542X遺伝子座を標的化するために使用される46ヌクレオチドサークルである。これらのパドロックサークルは、DNAポリメラーゼ、例えばφ29DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、およびVent（エキソ-）DNAポリメラーゼを使用して、数百の標的コピーをわずか数分間に作製するのに有用であることができる。特定の態様において、パドロックサークルは、ローリングサークル増幅機構において2つのプライマーを使用することができ、それによって、テンプレートサークル（すなわち、マイナス鎖）のコピーが可能になっただけでなく、新たに合成されたプラス鎖のコピーも可能になった。2つの異なる46ヌクレオチドパドロックサークルを使用したRCA方法は、遺伝子型決定適用、例えば、非限定的に、CFTR G542X遺伝子座についての野生型配列および変異配列の検出のために使用することができる。遺伝子型決定用のRCAパドロック方法の別の欠点は、アッセイされている各々の変異遺伝子座についての個々の対立遺伝子識別プライマーの必要性である。
ローリングサークル増幅は、従来のクローニング供給源（例えば、DNAサークルとしてのプラスミドおよびファージ）を使用し、サイズは5～7kbのサイズの範囲で、溶液ベースのテンプレート調製のためのランダムヘキサマー（すなわち、2よりも多いプライマー）およびφ29DNAポリメラーゼを使用したサンガー配列決定適用において使用されてきた。DNAサークルを作製する際に従来のクローニングアプローチを使用することの欠点は、適切な細胞宿主を介してそのようなDNAサークルを伝播する必要性である。本発明のダンベルテンプレートによってこの制限が克服される。キメラDNAテンプレートを使用したローリングサークル複製は、連結方法による配列決定において使用されてきた。テンプレート調製方法では、複雑な一連の方向性アダプター連結およびタイプIIs制限酵素消化が使用されて分子内連結アプローチにより約300bpのサイズの小さなDNAサークルが作製されたが、それは、単一プライマーおよびφ29 DNAポリメラーゼを使用して溶液中で複製されて「DNAナノボール」が作製される。これらナノボールを、次に、パターン化された基板に吸着させ、それらの連結方法による配列決定を実施する。ナノボール方法の主な制限は、キメラテンプレートサークル中で利用可能なゲノムDNA配列の量が少ないということ（すなわち、76bpが実際の標的配列であり、残りの222bpはアダプター配列である）および分子内連結の必要性である。本発明によって、ローリングサークル機構において複製または増幅することができるダンベルテンプレートを使用したより単純なワークフローを提供することにより、分子内連結アプローチにより小さな円形テンプレートを構築するための複雑な方法の制限が克服される。
ローリングサークル機構において有用であるポリメラーゼおよび逆転写酵素は、一般的に、鎖置換の特性を示し、それは、核酸合成中に酵素によって、遭遇した「下流」の核酸鎖を置換する能力である。これらの鎖置換酵素は、また、5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。任意の鎖置換ポリメラーゼまたは逆転写酵素は、ローリングサークル複製またはローリングサークル増幅において使用することができる（例えば、非限定的に、φ29DNAポリメラーゼ、大腸菌Pol I、Klenow DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bsm DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bsu DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Vent（エキソ-）DNAポリメラーゼ、T7（エキソ-）DNAポリメラーゼ（T7シーケナーゼ）、またはTopoTaq（Taq DNAポリメラーゼおよびトポイソメラーゼVのキメラタンパク質）、ならびに、これらのDNAポリメラーゼの変異体バージョン、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、またはSP6 RNAポリメラーゼ、ならびに、これらのRNAポリメラーゼの変異体バージョン、あるいは、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、ならびに、これらの逆転写酵素の変異体バージョン、例えばThermoScript逆転写酵素、SuperScript逆転写酵素、またはPrimeScript逆転写酵素）。置換鎖ポリメラーゼおよび逆転写酵素に加えて、アクセサリータンパク質は、さらに、ローリングサークル機構のロバスト性、忠実度、および／または処理能力を増加させることにより、核酸合成中に、下流の核酸鎖の置換を増強させることができる。鎖置換アクセサリータンパク質は、任意の型であってもよく、例えば、非限定的に、ヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質、トポイソメラーゼ、リバースジャイレース、および、アクセサリータンパク質を刺激する他のタンパク質、例えば、非限定的に、大腸菌MutLタンパク質またはチオレドキシンを含む。DNAヘリカーゼは、DNA複製中に、2つの相補的または実質的に相補的なDNA鎖を分離または巻き戻すために、インビボで有用である。ヘリカーゼは、5'から3'の方向（例えば、限定的に、バクテリオファージT7遺伝子4ヘリカーゼ、DNABヘリカーゼ、およびRhoヘリカーゼ）および3'から5'の方向（例えば、限定的に、大腸菌UvrDヘリカーゼ、PcrA、Rep、およびC型肝炎ウイルスのNS3 RNAヘリカーゼ）の両方において核酸分子を巻き戻すことができる。ヘリカーゼは、任意の供給源から得てもよく、かつ例えば、非限定的に、大腸菌ヘリカーゼ（すなわち、I、II［UvrD］、III、およびIV、Rep、DnaB、PriA、およびPcrA）、バクテリオファージT4 gp41、バクテリオファージT7遺伝子4ヘリカーゼ、SV40ラージT抗原、Rhoヘリカーゼ、酵母RADヘリカーゼ、T.テングコンゲネシス（T. tengcongensis）からの耐熱性UvrDヘリカーゼ、およびC型肝炎ウイルスのNS3 RNAヘリカーゼ、ならびに、これらおよび他のヘリカーゼの変異バージョンを含む。一本鎖結合タンパク質は、二本鎖DNAよりも高い親和性で一本鎖DNAに結合する。これらのタンパク質は、協同的に結合し、一本鎖領域の侵入を支持し、そのため二重鎖構造を不安定化する。例えば、非限定的に、一本鎖結合タンパク質は、二次構造を除去することによりらせん不安定化活性を示すことができ、かつハイブリダイズした核酸分子を置換することができる。一本鎖結合タンパク質は、任意の供給源から得てもよく、例えば、非限定的に、バクテリオファージT4遺伝子32タンパク質、RB 49遺伝子32タンパク質、大腸菌一本鎖結合タンパク質、φ29一本鎖結合タンパク質、またはバクテリオファージT7遺伝子2.5、ならびに、これらのおよび他の一本鎖結合タンパク質の変異バージョン（例えばバクテリオファージT7遺伝子2.5 F232L）を含む。
ダンベルテンプレートは、高度に加工性の鎖置換ポリメラーゼ（例えばphi29ポリメラーゼ）を使用したローリングサークル複製に供することができる。ローリングサークル複製は、2つの工程において実施することができる。第1に、サイズ選択されたダンベルテンプレートは、適切な「ハイブリダイゼーション条件」（温度、因子、例えば塩、緩衝剤およびpH、界面活性剤、および有機溶媒を含む）下で、ダンベル相補的なプライマーとハイブリダイズさせることができる。ウシ血清アルブミン（BSA）またはデンハルト試薬のようなブロッキング剤を、ハイブリダイゼーション条件の一部として使用してもよい。第2に、適切なポリメラーゼまたはレプリソームおよびヌクレオチド混合物を第1の反応混合物に提供し、増幅または複製されたダンベルテンプレートを産生する。ハイブリダイゼーションおよび増幅または複製の条件は、いくつかの因子、例えば、非限定的に、ダンベルテンプレートのステム領域の長さおよび配列組成、ハイブリダイゼーション条件、本明細書において使用される特定のポリメラーゼまたはレプリソーム、および反応温度に基づいて最適化される。特定の態様において、反応温度を約10℃から35℃にすることができる。他の態様において、反応温度を約15℃から30℃にすることができる。他の態様において、反応温度を約20℃から25℃にすることができる。特定の態様において、温度を、選択した時間間隔で増加する。例えば、非限定的に、反応物を、10℃で5分間、次に15℃で5分間、20℃で5分間、次に25℃で5分間、および30℃で5分間にわたり維持する。
「レプリソーム」と呼ばれる複製複合体がインビトロで形成されて、複製されたダンベルテンプレートもしくは増幅されたダンベルテンプレートのより多くのコピーを作製すること、および／またはより大きなダンベルテンプレート（すなわち、＞1kb、＞5kb、＞10kb、および＞50kbのサイズで）を複製もしくは増幅することにより、ローリングサークル方法を増強し得る。ヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質、トポイソメラーゼ、およびリバースジャイレースを含む鎖置換アクセサリータンパク質は、ダンベルテンプレートのローリングサークル方法のために複製可能なまたは増幅可能なレプリソーム複合体を作製するために任意の組み合わせで鎖置換ポリメラーゼおよび逆転写酵素を用いて構成することができる。特定の態様において、適切な反応条件下でのφ29DNAポリメラーゼおよびφ29一本鎖結合タンパク質の組み合わせは、ローリングサークル機構の伸長を数倍増強することができる。特定の態様において、ヘリカーゼおよび一本鎖結合タンパク質の協調活性に依存するポリメラーゼまたは逆転写酵素の組み合わせは、ダンベルテンプレートを複製する、または10kbまたはそれ以上のダンベルテンプレートを増幅するために、ローリングサークル方法において使用することができる。例えば、非限定的に、10kbのプラスミドは、レプリソーム複合体を形成することにより、T7シーケナーゼ、T7ヘリカーゼ、およびT7一本鎖結合タンパク質の協調活性を使用して増幅することができる。
本発明の特定の態様は、高度に加工性の固相RCRシステムを伴う10kbサイズの二重ヘアピンダンベルの効率的な作製を含む。特定の局面において、固有に選択可能な、方法特異的な二重ヘアピンダンベルテンプレートを、サイズに非依存的で、密接に分布された様式（すなわち、10±1kb）において作製し、デノボアセンブリのための情報価値のある下流バイオインフォマティクス処理を可能にする。ダンベルテンプレートの作製によって、大量の出発ゲノムDNAについての必要性が排除される。なぜなら、これらの構築物は、単純なワークフローを用いて効率的に作製されるからである（すなわち、分子間 対 分子内連結）。これは、通常微量で得られる臨床サンプルを用いた場合、重要な考慮事項である。本発明の態様は、また、NGS技術における技術的ブレークスルーを表す利用可能なポリメラーゼにより課せられる現在のサイズ制約を緩和する固相RCRの開発および最適化を提供する。これらの革新的な大きなテンプレート高密度アレイは、研究、臨床、および診断適用のために、複雑で、新規の疾患ゲノムの真のデノボアセンブリを可能にし、また、より包括的なシステム生物学試験によって、ゲノムワイドなDNA-DNA、DNARNA、およびDNA-タンパク質相互作用を研究することを可能にする。
基板に付着された複製ダンベルテンプレートおよび増幅ダンベルテンプレート（すなわち、複製されたダンベルテンプレートアレイまたは増幅されたダンベルテンプレートアレイ）は、多くの異なる目的、例えば、非限定的に、核酸配列決定の全ての局面（すなわち、全ゲノムデノボ配列決定；配列変異体検出、構造変異体検出のための全ゲノム再配列決定、分子ハプロタイプの相の決定および／または異数体検出のための分子計数；配列変異体検出、構造変異体検出のための遺伝子パネル、全エキソーム、または染色体領域の標的配列決定、分子ハプロタイプの相の決定および／または異数体検出のための分子計数；ならびに、他の標的化配列決定法（例えばRNA-seq、Chip-seq、Methyl-seqなど）；全ての型の配列決定活性を、本明細書において広く「配列決定」として定義する）のために有用であることができる。複製されたダンベルテンプレートアレイおよび増幅されたダンベルテンプレートアレイは、また、核酸－核酸結合相互作用、核酸－タンパク質結合相互作用（すなわち、タンパク質-DNA親和性を定量的に測定する蛍光リガンド相互作用プロファイリング）を試験するための核酸分子アレイ、および、核酸構造／機能関係を試験するための核酸分子発現アレイ（すなわち、2'-デオキシリボ核酸分子をリボ核酸分子転写し、「リボ核酸テンプレートアレイ」として本明細書において定義される）を作製するために有用であることができる。特定の態様において、構造／機能アレイは、小分子阻害剤または活性化剤または核酸治療薬、例えば、非限定的に、治療用アンチセンスRNA、リボザイム、アプタマーおよび低分子干渉RNA（これは、核酸－核酸結合相互作用および核酸－タンパク質結合相互作用を検出するだけでなく、リボ核酸テンプレートアレイの1つまたは複数の構造／機能関係を撹乱することもできる）の効果を試験するために有用であることができる。本発明の特定の態様において、リボ核酸テンプレートアレイは、それらの対応するアミノ酸配列にさらに翻訳されることができ、本明細書において「タンパク質アレイ」として定義され、タンパク質アレイは、例えば、非限定的に、1つまたは複数の関連タンパク質受容体について特異的なリガンド（特にオーファンリガンド）のスクリーニング、小分子阻害剤または活性化剤または核酸治療薬、例えば、非限定的に、治療用アンチセンスRNA、リボザイム、アプタマー、および低分子干渉RNA（これは、タンパク質アレイの1つまたは複数の構造／機能の関係を撹乱することができる）についての薬物スクリーニングのため、タンパク質－核酸結合相互作用およびタンパク質－タンパク質結合相互作用を試験するために有用であることができる。
特定の態様において、複製されたダンベルテンプレートアレイおよび増幅されたダンベルテンプレートアレイは、単一目的用途を超えた付加的情報、例えば、非限定的に、全ゲノムデノボ配列決定に続いて、配列特異的核酸－タンパク質モチーフの同定のための核酸－タンパク質結合相互作用の検出を提供することによって、単に1つの目的を超えて有用であることができる。700bp以下のフラグメントを増幅するための固相方法に依存するDNAアレイを上回る本発明の利点は、少なくとも＞1kb、または、好ましくは＞5kb、または、より好ましくは10kb、および、最も好ましくは50kbの大きな核酸分子の複製または増幅である。増加するテンプレートサイズの複製されたダンベルテンプレートアレイおよび増幅されたダンベルテンプレートアレイは、さらなる情報、例えば、核酸分子に沿った2つ以上の核酸－タンパク質結合相互作用事象の協調的な長い範囲の相互作用を可能にすることができる。
本発明は、本発明の態様を示す添付の図面を参照して、本明細書の以下により十分に記載する。これらの発明は、しかし、多くの異なる形式において具体化され得るが、本明細書において示す例示的な態様に限定されると解釈すべきではなく；むしろ、これらの態様は、本開示が徹底しかつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
本発明の特定の態様において、ダンベルテンプレートを介した環状DNA分子の効率的な産生が、クローン的に複製された大きなインサート（10kbサイズ）の複製ダンベルテンプレートを作製するために、固相ローリングサークル複製と組み合わされており、上記の多くの異なる目的に適合する。本発明の特定の態様において、ダンベルテンプレートを介した環状DNA分子の効率的な産生が、クローン的に増幅された大きなインサート（10kbサイズ）の増幅ダンベルテンプレートを作製するために、固相ローリングサークル増幅と組み合わされており、上記の多くの異なる目的に適合する。ダンベルテンプレートは効率的に作製され、断片化された核酸分子のサイズに非依存的であり、現在の次世代配列決定方法における重要な制限を克服している。ダンベルテンプレートを使用したローリングサークル複製方法またはローリングサークル増幅方法は、他の固相増幅方法（例えばエマルジョンPCRおよび固相増幅）において観察される、断片化された核酸分子サイズの主要な制約を克服する。
本発明の一態様は、少なくとも1つのダンベルテンプレートの複製方法であって、この方法は、少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのダンベルテンプレートの増幅方法であって、この方法は、少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する方法であって、この方法は、少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程；および、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程を含む。別の態様において、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを検出する工程は、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートの配列決定からなる。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する方法であって、この方法は、少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程；および、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程を含む。別の態様において、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程は、少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートの配列決定からなる。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのダンベルテンプレートの複製方法であって、この方法は、サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施し、少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのダンベルテンプレートの増幅方法であって、この方法は、サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；少なくとも1つの核酸分子を断片化して少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの断片化された核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの核酸分子の複製方法であって、この方法は、サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
本発明の別の態様は、少なくとも1つの核酸分子を増幅する方法であって、この方法は、サンプルから少なくとも1つの核酸分子を単離する工程；連結剤を使用して1つまたは複数のヘアピン構造を少なくとも1つの核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；少なくとも1つのダンベルテンプレートを少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；および、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた少なくとも1つのダンベルテンプレート上でローリングサークル増幅を実施して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程を含む。
態様は、態様を強調して本明細書において記載してきたが、添付の請求項の範囲内で、態様は、本明細書において具体的に記載されている以外のものとして実施され得ることを理解すべきである。本発明は、その形態の少数だけにおいて示されているが、それが、それほど限定されず、しかし、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変化を受けやすいことは、当業者には明らかであろう。したがって、添付の特許請求項の主旨および広い範囲内にあるとして、全てのそのような代替物、改変、およびバリエーションを包含することが意図される。
当業者は、本発明の範囲および主旨を逸脱することなく、本発明を実行する方法に多くの変化および改変を加え得ることを認識するであろう。図面および明細書において、本発明の態様が開示されており、特定の用語が用いられるが、それらは、限定の目的のためではなく、一般的で説明的な意味でだけ使用され、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲において示されている。本発明は、これらの例証された態様を特に参照して、かなり詳細に記載されてきた。しかし、種々の改変および変更は、前述の明細書において記載されるように本発明の主旨および範囲の範囲内で行うことができることは明らかであろう。さらに、第1および第2のような順番に言及する言語は、限定的な意味ではなく、例示的な意味で理解すべきである。例えば、当業者は、特定の工程を単一の工程に組み合わせることができることを認識し得る。
以下の実施例は、組成物および方法をさらに例証する。
実施例1
2つの異なるヘアピン構造を含有するダンベルテンプレートのサイズ非依存性が実証された。サンプルDNA、pUC18ベクターを、プライマー（すなわち、
フォワード：
Figure 0007100680000001
およびリバース：
Figure 0007100680000002
）のセットを用いて増幅して425塩基対の産物をもたらした。各々のプライマーの5'末端は、BamHIおよびEcoRI制限酵素部位の両方を含有した。PCR産物を、次に、EcoRIを用いて消化し、5'-AATTオーバーハングを与え、QIAquick PCR精製キットを用いて精製した。
ヘアピン構造1：
Figure 0007100680000003
を50℃まで加熱しその後冷却することにより、オリゴヌクレオチドが、下線を引いた配列で自己アニーリングすることを可能にし、5'-AATTオーバーハングをもたらした。ループ構造は、M13ユニバーサルプライマー配列を含有した。ヘアピン構造1およびpUC18 PCR産物を10：1モル比でそれぞれ組み合わせ、37℃で40分間、5ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて処理し、16℃で30分間、T4 DNAリガーゼの400の付着末端単位を用いて連結し、次に、65℃で10分間、不活性化し、ダンベルテンプレートを形成した。変性した場合、ダンベルテンプレートは、一本鎖サークルになる。ダンベルテンプレートは、QIAquick PCRクリーンアップキットを用いて精製して、過剰の非連結ヘアピン構造を除去した。
ローリングサークル複製は、図1に示す通り、M13プライマーの逆相補体（RC）を使用してダンベルテンプレートで実施した。ここで、2μMの、
M13-RCプライマー：
Figure 0007100680000004
およびM13コントロールプライマー：
Figure 0007100680000005
を別々に、20μLの反応物において200μMのdNTPおよび200μg/mLのBSAを伴うφ29反応緩衝液中で、94℃で5分間加熱し、57℃で1分間冷却することにより、約10ngのpUC18ダンベルテンプレートにアニーリングした。反応物をさらに30℃まで冷却し、その時、10単位のφ29DNAポリメラーゼを、プライミングされたダンベルテンプレートに加え、30分間インキュベートし、続いて65℃で10分間熱不活化した。コントロールとして、通常のM13ユニバーサル配列決定プライマーを、別のローリングサークル複製の混合物中でインキュベートした。複製されたダンベルテンプレートを、次に、ゲル電気泳動により分析した。図2に示す通り、M13-RCR産物（レーン2）が、高分子量の産物（ウェル中の上のバンド）をもたらしたのに対し、M13コントロールは、目に見えるローリングサークル複製産物をもたらさなかった。レーン2の結果から、ローリングサークル複製方法によって、高分子量ダンベルテンプレートが作製されたことが明らかである。
上に示す方法は、断片化された核酸分子の末端にヘアピン構造を付着させるほんの1つの様式である。例えば、非限定的に、ヘアピン構造は、また、TAクローニングと平滑末端連結、例えば「T」オーバーハングを伴うヘアピン構造2：
Figure 0007100680000006
により付着させることができる。425bpのpUC18 PCRアンプリコンは、また、NEBNext dA-テーリングキットを用いて処理し、DNAフラグメントの3'末端に「dA」残基を付着させてもよい。pUC18アンプリコンおよびヘアピン構造2を、次に、リン酸化し、上記の方法を使用して一緒に連結させてダンベルテンプレートを作製する。このアプローチは、全ゲノムサンプルのための次世代配列決定ライブラリー構築方法の大部分に組み込まれる。
実施例2
ゲノムDNAは、また、出発サンプルとして使用することができる。例えば、非限定的に、HapMapサンプルNA18507からの精製ゲノムDNAを、Coriell Cell Repositoriesから得て、標準的な次世代配列決定方法を使用して（すなわち、Covaris E210Rデバイスを使用して）剪断し、次に、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、および10.0kbの漸増サイズでフラグメントについてサイズ選択することができる。上記と同様に、DNAサンプルを、異なるサイズのDNAフラグメントを産生するための断片化、フラグメントの開始数の定量化、同一条件を使用したhpA/hpBの連結、およびhpA-フラグメントhpBダンベルテンプレート濃縮に供することができる。濃縮係数は、二重標識蛍光顕微鏡を使用して、共局在した蛍光シグナルを数え、それを蛍光シグナルの合計数と比較することにより決定されるであろう。Nikon Eclipse顕微鏡分析ツールによって、多数の分析（強度測定、複数の蛍光シグナルの共局在化、およびコアパッケージ項目に含まれる他を含む）を実施することができる。
この実施例において、500ngの正常ヒトゲノムDNA（Millipore）を、希釈制限酵素反応においてEcoRIを用いて消化し、続いて65℃で不活性化した。これらのフラグメントは、いずれかの末端に5'-AATTオーバーハングを含んでおり、安定かつ固有のヘアピン構造HP1に連結させた。
HP1：
Figure 0007100680000007
を高塩緩衝液中で95℃に加熱しその後迅速に氷上で冷却することにより、オリゴヌクレオチドが、下線付きの配列で自己アニーリングすることを可能にし、5'-AATTオーバーハングをもたらした。HP1および消化したゲノムDNAをそれぞれ10：1モル比率で組み合わせ、16℃で30分間、400付着末端単位のT4 DNAリガーゼを用いて連結し、次に、65℃で10分間不活性化させてダンベルテンプレートを形成した（図3を参照のこと）。希釈消化およびHP1連結によって、約20kbから1kbまでのサイズの範囲のダンベルテンプレートDNAのスメアが生成された。ダンベルテンプレートをゲル精製し、過剰な未連結および自己連結HP1アダプターを除去し、3つの異なるフラグメントサイズ（10～6kb、6～3kb、および3～2kb）を単離するためにサイズ選択した。
HP1のループ構造は、M13ユニバーサルプライマー配列を含有した。RCR（すなわち、1つのプライマーを使用した）を、M13プライマーの逆相補体（RC）を使用して、ダンベルテンプレートで実施した（図3を参照のこと）。ここで、2μMのM13-RCプライマーとM13コントロールプライマー（図示せず）を、20μLの反応物において、200μMのdNTPおよび200μg/mLのBSAを伴うφ29反応緩衝液中で、94℃で5分間加熱し、45℃で2分間冷却することにより、約10ngのサイズ選択されたゲノムDNAダンベルテンプレートに、別々にアニーリングした。反応物を30℃にさらに冷却し、その時、10単位のφ29DNAポリメラーゼを、プライミングされたサークルに加え、60分間インキュベートし、続いて65℃で10分間熱不活性化した。開始材料および終了材料をアガロースゲル電気泳動により分析した。図4に示す通り、EcoR1消化され、HP1を連結されたゲノムDNAを、レーン1のウェルに添加した。サイズ選択され、精製されたダンベルテンプレートを、レーン2、3、および4のウェルに添加した。レーン5、6、および7に添加されたRCR産物は、ゲル電気泳動後にウェル中に残っている不動の複合体であるように見える。予測されるM13-RC RCR産物は、高分子量の産物をもたらしたのに対し（図4のレーン5、6、および7のウェル中で上方のバンド）、M13コントロールは、目に見えるRCR産物をもたらさなかった（示さず）。図4のレーン5、6、および7の結果から、ダンベルテンプレートを使用したRCR方法によって、高分子量DNAが作製されたことが明らかである。
実施例3
複製用のダンベルテンプレートは、また、dAテールを有する大きな断片化ゲノムDNAから作製した。ここでは、ヘアピンを、TAクローニングと平滑末端連結により付着させた。TAクローニングのアプローチは、現在のNGSプラットフォームの大部分において上手く組み込まれている。本発明者らは、「T」オーバーハングを伴うヘアピン2（HP2）：
Figure 0007100680000008
を設計した。ヒトゲノムDNA（500ng）を、図5のレーン1および2に示す通り、Covaris Gチューブを使用して断片化し、厳密に定義されたフラグメント長の集団を得た。このゲノムDNAを、次に、末端修復し、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kitの末端調製モジュールを使用してdAテールを付加した。HP2を、HP1と同様に自己アニーリングさせ、Blunt/TA Ligase Master Mix（5：1モル比）を使用して修復ゲノムDNAに連結した。過剰なHP2および非連結ゲノムDNAを、エキソヌクレアーゼIIIおよびVIIを使用して除去した。
結果として得られたダンベルテンプレートは、Qiaex iiビーズを使用して精製し、固有のプライマー：
Figure 0007100680000009
を使用したRCR反応を、以前に記載した反応と同様にして行った。図5に示す通り、2つの断片化ゲノムDNA集団は、Covaris Gチューブの高度に調整可能な断片化能を示した（レーン1および2）。末端修復され、dAテールを付加されたHP2連結フラグメントからもたらされたRCR産物は、高度に不動な複合体のままであり、ゲル電気泳動後にウェル中に残る（レーン3および4）。
実施例4
別の実験において、約20μLの高分子量の正常ヒトゲノムDNA（gDNA）（100ng/μL）を、130μLのHPLCグレードH2Oと組み合わせ、合計150μLをCovaris G-チューブ上にピペットした。チューブは、最初に5600RCF（すなわち、相対遠心力）で、1分間遠心し、次に、Gチューブの向きを逆にし、5600RCFで1分間遠心した。これによって、図6のレーン2に示す通り、ゲノムDNAの約8～10キロベースのフラグメントがもたらされた。
ゲノムDNAサンプルは、また、当技術分野において公知のいくつかの方法を使用して断片化することができる（例えば、非限定的に、New England Biolabs（NEB）のフラグメンターゼ、ヌクレアーゼ、および制限酵素を使用した酵素的断片化；機械的な力、例えば小さなゲージ針を通じた針剪断、超音波処理、ポイント・シンク剪断、噴霧、超音波断片化、およびトランスポゾン媒介性断片化を使用した断片化を含む）。
断片化DNAの末端を、次に、いくつかの手段（例えばオーバーハング5'および3'末端でのヌクレオチドの除去または取り込み、5'リン酸化、およびdA-テーリング）の1つを使用して適切なアダプターとの連結のために調製する。上記の通りに調製したH2O中の断片化gDNA 約55.5μLを、6.5μlの10×End-Repair緩衝液（NEB）および3μLのEnd-Preparation Enzyme Mix（NEB）と組み合わせ、サーモサイクラーのマイクロチューブ中に分注する。この反応混合物を次に、20℃で30分間、続いて、65℃で30分間インキュベートする。反応物を、反応チューブを氷の上または4℃で置くことによって次の工程のために冷却し、調製する。
ヘアピンアダプターを、線状オリゴヌクレオチドから作製した。凍結乾燥アダプターを、HPLC H2O中の100μMに再構成した。以下の成分をマイクロ遠心チューブ中で組み合わせた：10μLの100μMアダプターストック、5μLの10×End-Repair緩衝液（NEB）、1μLの500mM NaCl、および34μLのHPLC H2O。混合物を95℃で15分間にわたりインキュベートし、次に、直ぐに4℃に移した。
ダンベルテンプレートを、断片化して末端修復したgDNAの各々の末端でのヘアピンアダプターの付着により作製した。以下の成分を組み合わせ、サンプル反応混合物を形成した：上記の修復末端を伴う65μLの断片化gDNA、上記の通りに調製された3μLの20μMのアダプター、15μLのBlunt/TA ligation Master Mix（NEB）、および3μLのHPLC H2O。この連結反応は、20℃で1～16時間進行させ、次に、直ぐに4℃に移した。
未連結アダプターおよび断片化DNAを、エキソヌクレアーゼ消化に供した。以下の成分を組み合わせ、サンプル反応混合物を形成した：1μLの10×エキソヌクレアーゼVII緩衝液（NEB）、1μLのエキソヌクレアーゼVII、1μLのエキソヌクレアーゼIII、および7μLのHPLC H2O。この混合物を、ダンベルテンプレート、未連結アダプター、および遊離末端を伴う断片化DNAを含有する連結反応混合物に加えた。結果として得られた反応混合物を、37℃で1時間、次に、95℃で10分間インキュベートし；次に、4℃に戻した。
図6は、上記の通りに調製されたDNA産物のアガロースゲル分析の例である。レーン1は非断片化ゲノムDNAを示す；レーン2は、Covaris G-チューブ中での断片化後の断片化DNAを示す；レーン3は、1μgの断片化DNAへのアダプターの連結後に形成された産物を示す；レーン4は、500ngの断片化DNAへのアダプターの連結後に形成された産物を示す；レーン5は、任意のアダプターを伴わない、1μgの断片化DNAの連結反応後に形成された産物を示す；レーン6は、断片化DNAを伴わずアダプターだけを伴う連結反応後に形成された産物を示す；レーン7は、1μgの断片化DNAへのアダプターの連結から得られた産物のエキソヌクレアーゼ消化後に形成された産物を示す；レーン8は、500ngの断片化DNAへのアダプターの連結から得られた、エキソIIIおよびエキソVIIを用いた産物のエキソヌクレアーゼ消化後に形成された産物を示す；レーン9は、任意のアダプターを伴わない連結反応におけるエキソIIIおよびエキソVIIを用いた断片化DNAのエキソヌクレアーゼ消化後に形成された産物を示す；レーン10は、断片化DNAを伴わずアダプターだけを伴う連結反応から得られた、エキソIIIおよびエキソVIIを用いた産物のエキソヌクレアーゼ消化後に形成された産物を示す。レーン11は、断片化ゲノムDNAおよび連結されなかったアダプターの消化コントロールを示す。
DNAサンプルは、また、塩を除去し、エキソヌクレアーゼ耐性ダンベルテンプレートを濃縮する、濃縮に供した。エキソヌクレアーゼ消化後の反応混合物の体積を、約4μLのHPLC H2Oを用いて100μL溶液に調整した。約10μLの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および5μLのグリコーゲン（20mg/mL）を溶液に加え、続いて115μLの冷100%イソプロパノールを添加した。この反応混合物を-20℃で＞1時間冷却し、次に、10RCFで20分間にわたり室温で遠心した。上清を吸引し、沈殿物を70%エタノールで洗浄した。最終的な沈殿物を約15分間乾燥させ、次に、30μLの10μM Tris-HCl（pH8.0）中に再懸濁した。
図7は、上記の通りに調製されたDNA産物のアガロースゲル分析の例である。レーン1は、断片化DNAへのアダプター10.1の連結およびその後のエタノール沈殿後に形成された産物を示す；レーン2は、断片化DNAへのアダプター2.1の連結およびその後のエタノール沈殿後に形成された産物を示す；レーン3は、アダプターを伴わない、断片化DNAの連結反応およびその後のエタノール沈殿で形成された産物を示す；レーン4は、断片化DNAを伴わない、アダプター10.1のみの連結反応およびその後のエタノール沈殿で産物が形成されなかったことを示す；レーン5は、断片化DNAを伴わない、アダプター2.1のみの連結反応およびその後のエタノール沈殿で産物が形成されなかったことを示す；レーン6は、断片化DNAおよびアダプターを伴わない連結反応およびその後のエタノール沈殿で産物が形成されなかったことを示す。
ダンベルテンプレートもサイズ選択に供した。所望のサイズのエキソヌクレアーゼ耐性ダンベルテンプレートは、アガロースゲル電気泳動により単離して任意の望ましくない産物（例えばアダプター-アダプター連結産物）のキャリーオーバーを最小限にした。0.8%（重量/体積）1×TAEアガロースゲルを調製した。適切な量のDNAローディング色素を伴う濃縮ダンベルテンプレートを調製し、約20μLの濃縮ダンベルテンプレートをアガロースゲル上に添加した。産物の分離のための十分な時間後、ゲルをSybrSafeゲル染色で染色し、ライトボックス上で視覚化する。滅菌メスを使用し、ダンベルテンプレートの所望のサイズ範囲を含有するゲルの切片を切り出した。ダンベルテンプレートを、Qiaex ii単離プロトコールを使用して単離し、30μLのH2O中に再懸濁した。
ダンベルテンプレートを次に、高度に加工性の鎖置換ポリメラーゼを使用したローリングサークル複製に供した。第1の反応混合物を、以下の成分を用いて設定した：5μLのサイズ選択ダンベルテンプレート、1.5μLの10×phi29ポリメラーゼ緩衝液（NEB）、1μLダンベル相補的プライマー、0.5μLのウシ血清アルブミン（BSA） 100mg/mL、および7μLのHPLC H2O。反応混合物を95℃で10分間インキュベートし、45℃で5分間冷却し、次にさらに20℃まで冷却した。第2の反応混合物を、以下の成分を用いて設定した：1μLの10×phi29ポリメラーゼ緩衝液（NEB）、5μLの10mM dNTPミックス、0.5μLのphi29ポリメラーゼ、および3.5μLのHPLC H2O。上記の処理後の第1反応混合物および第2反応混合物を組み合わせ、25℃で1～4時間インキュベートした。次に、結果として得られた混合物を65℃で20分間加熱し、ポリメラーゼを不活性化した。
ローリングサークル複製産物を次にアガロースゲル電気泳動により分析した。それらの高い分子量のため、これらのローリングサークル複製産物はウェル中に存在し、電気泳動後のゲルに入らなかった。特定の追加の早期終結産物もまた目に見える。
図8は、図6において分析した産物のローリングサークル複製により調製されたDNA産物のアガロースゲル分析の例である。レーン1は、図6のレーン7から切り出した産物の非効率的なローリングサークル反応を示す。レーン2は、ゲル電気泳動後のウェル中に残っている高度に不動の複合体としての、図6のレーン8から切り出した産物のローリングサークル複製後に得られたローリングサークル産物を示す。レーン3は、ローリングサークル産物が、図6のレーン9から切り出した産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン4は、ローリングサークル産物が、図6のレーン10から切り出した産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン5は、ローリングサークル産物が、DNAが存在しないローリングサークル反応から得られなかったことを示す。レーン6は、ローリングサークル産物が、断片化DNA産物を用いたローリングサークル反応から得られなかったことを示し、断片化DNAからのランダムプライミングがないことを示す。
図9は、図7において分析した産物のローリングサークル複製により調製されたDNA産物のアガロースゲル分析の例である。レーン1は、図7のレーン1において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られたローリングサークル産物を示す。ゲル電気泳動後にウェル中に残っていた不動の複合体は、成功したRCR産物を示す。レーン2は、図7のレーン2において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られたローリングサークル産物を示す。レーン3は、ローリングサークル産物が、図7のレーン3において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン4は、ローリングサークル産物が、図7のレーン4において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン5は、ローリングサークル産物が、図7のレーン5において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン6は、ローリングサークル産物が、図7のレーン6において分析したサイズ選択産物のローリングサークル複製後に得られなかったことを示す。レーン7、8、および9は、ローリングサークル産物が、コントロール反応において得られなかったことを示す：断片化DNAを、連結を伴わないローリングサークル反応に提供した場合（レーン7）。断片化DNAを、プライマーを伴わないローリングサークル反応に提供した場合（レーン8）。断片化DNAを、連結を伴わないローリングサークル反応に提供しなかった場合（レーン9）。
実施例5
ローリングサークル複製産物は、また、ダンベルテンプレートのヘアピン配列の相補的領域に向けられた分子プローブまたはビーコンを使用することにより検出することができる。この方法の実現可能性を実証するために、H3ヘアピンアダプターの用量設定系列を、0μM～5μMの範囲の濃度で作製した。10μMのH3ヘアピンのストック液を連続希釈して2×試験濃度を得た。ヘアピンアダプター3（H3）は以下の配列：
Figure 0007100680000010
を有する。
例えば、10μMのストックを半分に希釈して5μMの試験サンプルを得た、5μMのストックを半分に希釈して2.5μMの試験サンプルを得た、など。これらは、実際の試験濃度の2倍（2×）を表す。2×H3アダプター濃度のもの 約5μLを、次に、1μLのNEB phi29反応緩衝液10×、1μLの200μMビーコン2、および3μLのHPLC H2Oと組み合わせた。分子ビーコン2は、以下の配列:
Figure 0007100680000011
を有し、「5,6-FAM」は、5-FAMおよび6-FAM異性体の混合物であり、「IABkFQ」はIowaBlackクエンチャーである。この反応混合物の設定において、試験サンプル中のH3濃度は、最終的な1×測定濃度まで低下させた。反応混合物を、次に、ホットプレート上で98℃に加熱し、その温度で10分間維持し、次に、ベンチトップ上でゆっくりと冷却させた。ビーコンからのシグナルの消失を防止するために、消灯してアルミ箔で覆われた反応管を用いて、全ての反応および熱サイクル工程を行った。一度室温まで冷却したら、反応物を、Molecular Devices SpectraMax Gemini XPS蛍光マイクロプレートリーダーでの読み取りのために調製した。具体的には、SpectraDropマイクロスライドを使用して非常に少量の測定を容易にした。各々の用量設定反応からの約2μLをマイクロボリュームスライドに添加した。機械に挿入したら、以下のプログラムを室温で実行した：
励起波長：495nm
発光波長：520nm
6フラッシュ／読み取り。
生データを収集し、図10に示す通りに処理した。0μMについてのRLU（相対発光単位）読み取りを、全てのサンプルから差し引き、バックグラウンド蛍光を除くことにより標準化した。
Figure 0007100680000012
実施例6
実験は、フラグメント長サイズに非依存的なダンベルテンプレートを作る効率を決定するように設計することができる。現在の大フラグメントNGSライブラリー構築方法の主な制限は、長いDNAフラグメントの末端を環状化することによりメイト対テンプレートを作製することである。理想的には、ダンベルテンプレートを作製するための効率的な能力は、サイズ非依存的であるべきである。これらのダンベルテンプレートは、種々のサイズ（例えば、非限定的に、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、または10.0kbを含む）であり得る。これらのフラグメントサイズは、最初に、同じゲノム領域を標的とするヒトBAC DNAを使用してプライマーを設計することにより、PCRを用いて作製し得る。このアプローチでは、リアルタイムPCRの使用によって異なるサイズのダンベルテンプレートのコピー数を定量することが可能になる。例において、TCF7L2 rs7903146対立遺伝子用のリアルタイムPCR試薬を作製しており、それは、Life TechnologiesのカスタムTaqManアッセイウェブサイトを使用して設計された。
5'-プライマー配列は：
Figure 0007100680000013
であり、3'-プライマー配列は：
Figure 0007100680000014
があり、プローブ配列は：
Figure 0007100680000015
であった。他の例において、異なるサイズのフラグメントを産生し、アンプリコンの開始数を定量化する、同一の条件を使用してヘアピン構造2を連結する、次に、リアルタイムPCRを用いてダンベルテンプレートコピー数を定量化することもできる。
他の実験において、定義されたフラグメント集団は、主に2つの方法（Covaris G-チューブおよびNEBフラグメンターゼ）を通じて作製することができる。ダンベルテンプレートの調製および単離は、本明細書において記載するTAクローニング方法に従う。ヘアピン配列とハイブリダイズする分子ビーコンは、蛍光プレートリーダーを使用して、異なるサイズのダンベルテンプレートの数を定量化するために使用することができる。これらの実験は、開始ゲノムDNAサンプルのフラグメントサイズに非依存的に、ダンベルテンプレートを効率的に作製することができることを実証する。さらに、これらの分子ビーコンは、また、RCR産物および反応効率を定量化するために使用することができる。
実施例7
NGS対合末端配列決定プラットフォーム中でのダンベルテンプレートの効率的な挿入には、DNAテンプレートの各々の末端での固有のプライマーまたはヘアピンの存在が要求される。これは、標準的な末端修復／dAテーリング方法、それに続く、2つの固有のヘアピンオリゴヌクレオチド（すなわち、hpAおよびhpB）（各々が、固有のユニバーサル複製／配列決定プライミングおよび分子ビーコン部位を含む）の連結を通じて達成される。ヘアピン連結後、本発明者らは、25% hpA-フラグメント-hpA、50% hpA-フラグメント-hpB、および25% hpB-フラグメント-hpBで構成される集団を予測する。所望の形態であるhpA-フラグメント-hpBは、最初に連結産物をヘアピンAの逆相補体を含むカラムを通過させることによって捕捉プローブクロマトグラフィーにより濃縮し、従って、hpA-フラグメント-hpAおよびhpA-フラグメント-hpBテンプレート（hpB-フラグメント-hpBテンプレートではない）を捕捉し得る。溶出後、部分的に濃縮されたサンプルを、次に、ヘアピンBの逆相補を含む第2カラムを通し、従って、hpA-フラグメント-hpB（しかし、hpA-フラグメント-hpAテンプレートではない）を捕捉する。この二重ヘアピンアプローチは、上述の通り、同様のアプローチを使用して実証される；0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、および10.0kbを中心とする固有のサイズのDNAフラグメントの集団を作製し、サイズ選択し、精製し、末端修復し、dAテールを付加する。これらを、次に、hpAおよびhpBヘアピンに連結し、二重標識し、hpA-フラグメント-hpBダンベルテンプレートを、上記の技術を使用して濃縮する。φ29DNAポリメラーゼおよびT7レプリソームシステムを使用した初期の実験を実施し、溶液ベースの分子ビーコンを使用してダンベルテンプレートサイズに対する複製コピー数の依存性を評価する。
実施例8
ローリングサークル増幅のための条件は、適切なDNAポリメラーゼ、複製因子、および反応条件を含むように最適化することができ、10kbダンベルテンプレートの少なくとも1,000倍複製を支持することができるようにする。1,000コピーの複製倍率が目標とされているのは、Illumina cBot機器で実現された、クローン増幅された短いテンプレートと同等の数であるからであり、したがって、配列決定プロセスの間に測定された蛍光シグナルの同様のレベルを予測することができる。DNAポリメラーゼのパネルを長い合成のために採用することができ、商業的に入手可能なDNAポリメラーゼ（φ29、LongAmp、Bst、Bst2.0、Q5、およびT7 DNAポリメラーゼ）ならびに少なくとも12種の非商業的な独自のファミリーA、B、およびD DNAポリメラーゼが含まれる。加えて、複製アクセサリー因子のパネルもまた、複製増強剤として使用することができる。アクセサリータンパク質は、所望のローリングサークル産物（DNAポリメラーゼの処理能力を増加させるための、処理能力を有するクランプおよびクランプローダー複合体、一本鎖DNA領域を安定化させるための一本鎖結合タンパク質、DNAポリメラーゼの前に二本鎖DNAを分離するためのヘリカーゼ、フラップDNA構造を分解するためのフラップエンドヌクレアーゼ、およびDNAニックをシールするためのDNAリガーゼを含むが、これらに限定されない）の産生の効率を増加させるために加えることができる。これらの因子は、同じファミリー内からのDNAポリメラーゼと互換性があり、適切なDNAポリメラーゼパートナーを用いて試験され得る。例えば、古細菌サーモコッカス種（Thermococcus sp.）9°Nからのコアアクセサリー因子は、ファミリーB DNAポリメラーゼを用いて使用され、ファミリーA DNAポリメラーゼは、大腸菌アクセサリー因子を用いて試験される。定量的PCRは、複製されたダンベルテンプレートDNAを測定するために使用される。qPCRプローブは、本明細書において記載する通りに作製された2kbおよび10kbのダンベルテンプレートのヘアピン領域を標的化することができる。プライミングされたダンベルテンプレートの複製を用いて、プローブは、合成されたヘアピン領域の各々のセグメントに結合することができる。したがって、プローブ強度は、希釈されたヘアピンテンプレートの標準系列と比較した場合のコピー数を示すために使用することができる（図11）。qPCRに加えて、増幅産物の長さは、アルカリアガロースゲル電気泳動によりモニターすることができる。アルカリアガロースゲル電気泳動では、DNAが一本鎖に分離され、全体的な複製物の長さが正確に測定される。
実施例9
この例において、ローリングサークル複製のための最適密度の機能的プライマーが、注文設計されたフローセルのガラス面に付着されている。2枚のスライドガラスの間に挟まれたカスタムカット接着剤ガスケットを、図11Aに示す通りに設計した。レプリコンは、カバースリップの下側に付着されている。カバーガラスは、ナノポート固定部で固定された入口／出口ポートを有する。ガスケットは、ここで、マイクロチャネルを伴う3M両面テープであり、標準的な顕微鏡スライドの上に位置する。この設計では、必要な光学的、化学的、および機械的特性に、使いやすさ、製造のスピード、単純性、および費用対効果のような実用的な必要性を組み合わせる。
図11Bにおいて示す通り、フローセル設計は、標準的な1mm厚の25×75mmホウケイ酸ガラススライド（VWR）と25×75mm＃1.5Hホウケイ酸カバーガラス（Schott Nexterion）の間に130μm厚の3M両面接着フィルムガスケットを挟んで形成されたマイクロチャネルからなる。マイクロ流体チャネルのガスケット層は、レーザーカッター（Universal X-660）を使用して3M両面テープを切り出し、入口／出口孔は、トップカバーガラス層を通じてサンドブラストした。スライドガラスの上部に接着ガスケットを配置し、ガスケットの上部にカバースリップを配置することにより、チャネルを密閉した。結果として得られるチャネルは、深さ130μm、幅3mm、および長さ4cmの長方形断面を有する。ナノポート固定具（IDEX Health & Science）を使用して、フローセル内の溶液および試薬を交換するための手段としての入口および出口ポートに100μmのID PEEKチューブを接続した。
事前に合成したオリゴヌクレオチドは、化学的戦略の使用によりガラス表面に付着させてもよい。最適な支持体の化学物質を同定することが重要である。なぜなら、以前の試験では、特定のカップリング戦略が、ハイブリダイゼーションおよび固相PCR適用の性能に影響を与えることができることが示されているからである。例において、シラン試薬（例えば3アミノプロピルトリエトキシシラン）を伴うガラス表面の機能化が最初の工程である。多くの化学的カップリング戦略はアミノ修飾オリゴヌクレオチドを含む。出発点としてこれらの末端官能基を使用することで、体系的なアプローチの使用によってガラス表面へのオリゴヌクレオチドの付着について異なる中間結合剤を評価することが可能になる。例えば、非限定的に、塩化シアヌル活性化方法は、オリゴヌクレオチド配列：
Figure 0007100680000016
をカバースリップ表面に付着させるために使用されてきた。他の例では、いくつかの他の活性化学物質、例えば、1,4-フェニレンジイソチオシアネートおよびジカルボン酸反応を利用してもよい。全てのこれらの活性化戦略によって、同様に良好なハイブリダイゼーションデータがもたらされる。本発明の態様は、異なる長さ（すなわち、n＝0、10、20）のポリ（dT）nリンカーを含む。
例において、広帯域LED光源を使用し、可視および近赤外領域に及ぶ異なる蛍光色素を伴う柔軟性を提供するNikon Eclipse FN1顕微鏡を利用することができる。例において、pUC18ダンベルテンプレートは、
ヘアピン構造3：
Figure 0007100680000017
を用いたdA-テーリング方法を使用して作製された。
分子ビーコン2：
Figure 0007100680000018
が、上記のフローセル中の固相ローリングサークル複製反応についてアッセイするために設計されている。下線を引いた配列は二本鎖ステム領域を表し、ボックスで囲った第1の配列はプローブ配列を表し、ボックスで囲った第2の配列は、固定化M13プライマー配列に結合するプライマー配列を表す。分子ビーコンは、バックグラウンド蛍光が低いため、良好なシグナル対ノイズ比（SNR）で、十分なローリングサークル複製で表面結合レプリコンを生成する。0.5-kbのダンベルテンプレートの希釈液は、視野当たり（FOV）25～50kのレプリコン密度を目標とするよう経験的に決定され得る。
特定の例において、表面効果は一部の反応を阻害することがあり、不動態化剤（例えばポリビニルピロリドンまたは高分子量PEG）の使用が必要とされる場合がある。特定の例において、低収率のホスホロチオエートプライマーを利用してもよい。なぜなら、φ29DNAポリメラーゼは、一本鎖DNAを用いて、有意なエキソヌクレアーゼ活性を示すことができるからである。
実施例10
上記の例から得た試薬および条件を、断片化ヒトゲノムDNAに適用して、10kbのダンベルテンプレートからのNGS適合性のクローン複製クラスタを作製する強固な能力を実証することができる。一部の例において、10kbのダンベルテンプレートは、1,000コピーの標的配列をもたらすことができる。いくつかのDNAポリメラーゼは、ローリングサークル複製方法において効率的に働く（φ29、Bst、およびベント（エキソ-）DNAポリメラーゼを含むが、これらに限定されない）。最近、変異体φ29DNAポリメラーゼが、DNA合成収率を数倍だけ増加させるために同定され、Sygnis, Inc.から商業的に入手可能である。特定の例において、レプリソーム複合体は、T7シークエナーゼ、T7ヘリカーゼ、およびT7一本鎖結合タンパク質の協調活動を使用し、10kbのダンベルテンプレートを複製するために使用することができる。特定の例において、ダンベルテンプレート（0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、および10.0kbの漸増サイズ）を溶液アッセイのために使用し、TCF7L2についてのリアルタイムPCR試験を使用して分析し得る。特定の例において、ローリングサークル複製方法の効率および精度を改善するために、アクセサリータンパク質（例えば、他のヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質、チオレドキシン、トポイソメラーゼ、リバースジャイレース、またはこれらの任意の組み合せを含むが、これらに限定されない）を含めてもよい。
特定の例において、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、または10.0kbのダンベルテンプレートを、ヘアピン構造3を用いて作製し、溶液ベースのリアルタイムPCRアッセイにおいて特定された最適条件のいくつかを用いて試験することができる。ローリングサークル複製方法に従って、複製されたダンベルテンプレートに、分子ビーコン2を用いてプローブ付加し、蛍光顕微鏡により分析し、複製されたダンベルテンプレートのシグナル強度を決定し得る。特定の例において、ローリングサークル複製は、HapMapサンプルNA18507から単離されたリアルワールドテンプレートとしての二重ヘアピンダンベルテンプレートを用いて実施し得る。
本発明の態様は、また、本明細書において記載する方法を実施し、組成物を産生するためのキットとして包装された1つまたは複数のヘアピン構造、酵素、他のヌクレオチドおよびタンパク質試薬を含むことができる。本明細書において記載する通りに方法を実施し、ローリングサークル産物の存在を検出するために使用する試薬を、個別に提供することができるか、またはキット形態で一緒に包装することができる。例えば、キットは、本明細書において記載する方法の種々の工程を行うための1つまたは複数のプライマー、1つまたは複数の標識ヌクレオシド三リン酸、関連酵素を含めて調製することができる。キットは、また、1つまたは複数の親和性標識ヘアピン構造およびダンベルテンプレートを精製するための対応する固形支持体の、包装された組み合わせを含むことができる。キットの容器内の試薬の配置は、含まれる特定の試薬に依存する。各々の試薬は、個々の容器中に包装することができるが、種々の組み合わせも可能であり得る。本発明の態様は、また、1つまたは複数のヘアピン構造を形成するための1つまたは複数のオリゴヌクレオチド、連結のための成分のセット（リガーゼ、補因子、アクセサリー因子、および適切な緩衝液を含む）、および、複製のための成分のセット（実質的に相補的なプライマー、本明細書において記載する種々の工程を実施する酵素、アクセサリー因子、および適切な緩衝液を含む）を含有する、キットを含むことができる。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能である少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造を、サンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するための成分の第1のセット（成分の第1のセットは、1つまたは複数の、リガーゼ、補因子、リガーゼの適切な緩衝液、およびそれらの組み合わせを含有する）；任意の非結合ヘアピン構造および任意の非結合核酸分子を消化することによって少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するための成分の第2のセット（成分の第2のセットは、1つまたは複数の、エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼの適切な緩衝液、およびそれらの組み合わせを含有する）；および、少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの増幅したダンベルテンプレートを形成するための成分の第3のセット（成分の第3のセットは、ポリメラーゼまたはレプリソーム、ヌクレオチド、アクセサリー因子、および、少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマーを含有する）を含有する、キットを含む。
本発明の態様は、また、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造を、サンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造を、サンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結し、少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを複製して少なくとも1つの複製されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの領域に実質的に相補的な少なくとも1つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造を、サンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、ポリメラーゼおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマーを含有する、キットを含む。
本発明の特定の態様は、ヘアピン構造を形成することが可能な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；ヘアピン構造を、サンプルからの少なくとも1つの核酸分子に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成するためのリガーゼ；任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結核酸分子を消化することにより、少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製するためのエキソヌクレアーゼ；ならびに、少なくとも1つのダンベルテンプレートを増幅して少なくとも1つの増幅されたダンベルテンプレートを形成するための、レプリソームおよび少なくとも1つのダンベルテンプレートの少なくとも2つの領域に実質的に相補的な少なくとも2つのプライマーを含有する、キットを含む。
さらに、本発明の特定の請求項の主題を形成する、本明細書の態様が本明細書に記載されている本発明の特徴および利点に照らしてより良く理解され得るように、上記は、本発明の特定の目的、特徴、および技術的利点ならびに本発明の詳細な説明を広く概説している。開示された概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を実行するために、他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用可能であり得ることを理解されたい。また、そのような等価な構成が、添付の特許請求の範囲に記載する本発明から逸脱しないことも理解されたい。その構成および操作方法の両方に関する、本発明の特徴であると考えられる新規な特徴が、さらなる目的および利点と一緒に、添付の図面と関連して考慮される場合、上記の説明からより良く理解される。しかし、そのような説明および図面は、例証および説明のみを目的として提供され、本発明の限界の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。該明細書において記載されるとおり、本発明の主旨および範囲内で種々の改変および変更が可能であることは、当業者に明らかであろう。

Claims (9)

  1. (a) ヘアピン構造を、サンプルから単離された5kbより大きい最小長を有する少なくとも1つの二本鎖核酸分子の各々の末端に連結して少なくとも1つのダンベルテンプレートを形成する工程；
    (b) 該少なくとも1つのダンベルテンプレートを、複製方法において少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと、または増幅方法において少なくとも2つの実質的に相補的なプライマーと接触させる工程であって、少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーが、少なくとも1つの基板に付着されている、工程；
    (c) 該少なくとも1つの実質的に相補的なプライマーと接触させた該少なくとも1つのダンベルテンプレート上で、ローリングサークル複製を実施して少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを形成する工程；および
    (d) 該少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートをクローン的にコピーされたテンプレートを含む次世代配列決定（NGS）方法で配列決定する工程
    を含む、少なくとも1つの核酸分子の複製または増幅方法。
  2. 二本鎖核酸分子が10kbより大きい長さを有する、請求項1記載の方法。
  3. ダンベルテンプレートが少なくとも20キロベース長である、請求項1記載の方法。
  4. 連結工程の前に、少なくとも1つの核酸分子を断片化して、5kbより大きい最小長または10kbより大きい最小長を有する少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 接触工程の前に、任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の核酸分子を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の増幅方法。
  6. (a) 少なくとも1つの核酸分子を断片化して、5kbより大きい最小長または10kbより大きい最小長を有する少なくとも1つの断片化された核酸分子を形成する工程；
    (b) 請求項1記載の複製方法に従って、断片化された核酸分子を複製または増幅する工程；および
    (c) 該少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程であって、該少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートをクローン的にコピーされたテンプレートを含む次世代配列決定（NGS）方法で配列決定することを含む工程
    を含む、少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを検出する方法。
  7. 少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを配列決定することからなる、請求項6記載の方法。
  8. 少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートを検出する工程が、該少なくとも1つの複製または増幅されたダンベルテンプレートをDNAプローブと接触させることを含む、請求項6記載の方法。
  9. 接触工程の前に、任意の非連結ヘアピン構造および任意の非連結の断片化核酸分子を、エキソヌクレアーゼを用いて処理することにより、該少なくとも1つのダンベルテンプレートを精製する工程をさらに含む、請求項6記載の方法。
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