KR101414713B1 - 리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법 - Google Patents

리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 2개의 헤어핀 올리고로서, 각 헤어핀 올리고는 동일한 또는 다른 상기 올리고의 절편 (segment)과 혼성화하지 않는 절편을 포함하고, 상기 2개 헤어핀 올리고의 각각은 다른 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단 서열과 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함하는 것인 2개의 헤어핀 올리고, (b) 양 말단에 상기 2개 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단 서열과 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함하는 표적 핵산, (c) DNA 리가제, (d) 엔도뉴클레아제, (e) DNA 폴리머라제, 및 (f) 프라이머를 포함하는 반응용액을 반응시켜, 단일가닥 환형 DNA 주형의 제조와 함께 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
리가제, 엔도뉴클레아제, RCA

Description

리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에 의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법{Method of amplifying target nucleic acids by rolling circle amplification in the presence of ligase and endonuclease}
본 발명은 리가제 및 제한 효소 존재하에서, 롤링 서클 증폭법에 의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
롤링 서클 증폭법 (Rolling circle amplification; 이하 RCA라고도 함)은 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 주형 DNA가 연속적으로 합성되도록 하는 것이다. 이 방법은 민감도가 아주 높은 장점이 있으나, 단일가닥 환형 DNA 주형을 제작하기 어려운 단점이 있었다. 상기 단일가닥 환형 DNA는 종래 화학적으로 합성되거나 별도의 반응을 통하여 제작되었다.
미국특허 제5,714,320호에는, 잘 정의된 말단을 갖는 선택된 올리고를 합성하는 방법으로서, (a) 효과적인 양의 올리고 프라이머를 단일가닥 원형 주형에 어닐링하여 프라임된 원형 주형을 생성하는 단계로서, 상기 단일가닥 원형 주형은 (i) 상기 선택된 올리고의 서열에 상보적인 적어도 한 카피의 뉴클레오티드 서열 및 (ii) 상기 올리고 멀티머 내의 절단 부위를 생성하기에 효과적인 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계; (b) 보조 단백질의 첨가 없이 상기 프라임된 원형 주형과 효과적인 양의 2타입 이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트 및 효과적인 양의 폴리머라제 효소를 조합하여 상기 원형 올리고 주형에 상보적인 단일가닥 올리고 멀티머를 생성하는 단계로서, 상기 올리고 멀티머는 복수 카피의 상기 선택된 올리고를 포함하는 것인 단계; 및 (c) 절단 부위에서 상기 올리고 멀티머를 절단하여 잘 정의된 말단을 갖는 상기 선택된 올리고를 생성하는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다. 또한, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 4641-4645 (1995년 5월)에는 RCA를 이용하여 34bp만큼 짧은 DNA 원을 증폭하는 것이 개시되어 있다.
그러나, 상기한 선행기술 기술에도 불구하고, 단일가닥 환형 DNA 주형의 합성과 표적 핵산의 증폭을 하나의 용기 내에서 수행하는 방법은 알려진 바 없다. 또한, 리가제와 엔도뉴클레아제를 동시에 포함하는 조건하에서 RCA를 수행하는 방법은 개시된 없다
따라서, 본 발명은 하나의 반응 용기 내에서 단일가닥 환형 DNA 주형과 표적 핵산을 증폭할 수 있는, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예는, (a) 2개의 헤어핀 올리고로서, 각 헤어핀 올리고는 동일한 또는 다른 상기 올리고의 절편 (segment)과 혼성화하지 않는 절편을 포함하 고, 상기 2개 헤어핀 올리고의 각각은 다른 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단 서열과 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함하는 것인 2개의 헤어핀 올리고,
(b) 양 말단에 상기 2개 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단 서열과 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함하는 표적 핵산,
(c) DNA 리가제,
(d) 엔도뉴클레아제,
(e) DNA 폴리머라제, 및
(f) 프라이머를 포함하는 반응용액을 반응시켜, 단일가닥 환형 DNA 주형의 제조와 함께 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공하다.
본 발명에 있어서, "올리고"란 "올리고뉴클레오티드"를 의미한다.
본 발명의 상기 방법은, 반응용액 중에 서로 반대 활성을 가진 리가제와 엔도뉴클레아제를 동시에 포함시킨 상태에서, DNA 폴리머라제를 이용하여 롤링 서클 증폭법에 의하여 표적핵산을 증폭하도록 한다. 즉, 리가제에 의하여 상기 2개의 올리고는 서로 연결되어 헤어핀 다이머를 형성하거나, 하나의 헤어핀 올리고와 표적 핵산이 연결된 산물, 표적핵산이 서로 연결된 산물 (concatemer), 상기 2개의 헤어핀 올리고와 표적 핵산이 연결된 단일가닥 환형 DNA가 형성될 수 있다. 여기서, 상기 단일가닥 환형 DNA는, 롤링 서클 증폭 (Rolling Circle Amplification: 이하 RCA라고도 함) 반응에서 주형으로서 작용할 수 있다. 이와 같이 리가제에 의하여 형성된 산물은 엔도뉴클레아제의 존재에 의하여, 절단될 수 있다. 따라서, 리가제 와 엔도뉴클레아제가 함께 존재하는 경우에는, 리가제에 의하여 생성되는 산물과 엔도뉴클레아제에 의한 그 산물의 절단물이 평행 상태로 존재하게 된다. 본 발명의 방법은 이러한 평형 상태에 존재하는 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하여, RCA 하는 방법에 관한 것이다.
이러한 평형 상태는 단일가닥 환형 DNA가 가능한 많이 생성되도록 하는 방향으로 유지하는 것이 바람직하다. 이는 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있는데,예를 들면, 상기 표적핵산과 상기 2개의 헤어핀 올리고의 연결에 의하여 형성된 단일가닥 환형 DNA는 그 이중가닥 선형 절편 (당업계에서는 스텝 (stem)이라고 함)은 상기 엔도뉴클레아제의 인식 부위가 제거되도록, 하기 헤어핀 올리고의 말단 단일가닥 서열을 설계함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 헤어핀 올리고의 농도가 상대적으로 표적 핵산의 농도에 비하여 높은 상태로 유지함으로써, 단일가닥 환형 DNA가 가능한 많이 생성되도록 하는 방향으로 유지할 수 있다.
본 발명의 상기 방법에 사용되는 "헤어핀 올리고"란 상기 헤어핀 올리고 또는 다른 헤어핀 올리고의 절편 (segment)과 혼성화하지 않는 절편 (이하 이를 편의상 "헤어핀 루프"라고도 함)을 포함하고 동일 분자 내에 서로 상보적인 절편을 이루어진 이중가닥 선형 절편(이하 이를 편의상 "스템"이라고도 함)을 포함하는 분자를 의미한다. 상기 헤어핀 올리고는, 핵산과 관련된 분야에서는 스템 앤 루프 (stem and loop) 구조라고도 한다.
본 발명의 상기 방법에 있어서, 상기 2개의 헤어핀 올리고는 상기 리가제에 의하여 연결되어, 양 말단에 단일가닥 헤어핀 루프를 가지고 있는, 상기 (d) 엔도 뉴클레아제의 제한 부위를 가진 이중가닥 선형 절편을 포함하는 모노머를 형성하는 것일 수 있다. 이 경우 비록 표적핵산 없이, 2개의 헤어핀 올리고가 서로 연결되어 헤어핀 다이머를 형성하더라도, 엔도뉴클레아제에 의하여 다시 절단될 수 있기 때문에, 헤어핀 다이머의 농도를 다시 감소할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 2개의 헤어핀 올리고와 표적 핵산은 상기 리가제에 의하여 연결되어, 양 말단에 단일가닥 헤어핀 루프를 가지고 있는, 이중가닥 선형 절편을 포함하는 모노머를 형성하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 이중가닥 선형 절편은 상기 (d) 엔도뉴클레아제의 제한 부위를 가지거나 가지지 않을 수 있다. 바람직하게는, 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적핵산이 연결되어 형성된 상기 모노머의 상기 이중가닥 선형 절편은, 상기 연결에 의하여 상기 (d) 엔도뉴클레아제의 인식 부위가 파괴되어 제거된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 (d) 엔도뉴클레아제는 EcoRI 효소로서 인식 부위는 GAATTC이고, 이 효소의 작용에 의하여 표적 핵산에는 ..AT 단일가닥 말단이 형성된다. 이 경우, 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단의 서열은 ...AT에 상보적인 TA...로 구성하되, TA 다음의 뉴클레오티드 서열을 EcoRI의 인식부위 서열과는 다른 서열로 구성함으로써, 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적핵산이 연결되어 형성된 상기 모노머의 상기 이중가닥 선형 절편에는 EcoRI 인식부위가 존재하지 않을 수 있다. 이러한 조합은 당업자가 알려진 제한 효소 및 그 인식 부위를 통하여 용이하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 사용되는 표적 핵산은 양 말단에 상기 2개 헤어핀 올리고의 단일가닥 말단 서열과 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함한다. 상기 표적 핵산은 미 리 제조하여 제공되거나, 반응용액 중에서 시료 중의 핵산으로부터 상기 (d) 엔도뉴클레아제에 의하여 인 시튜 (in situ)로 생성되는 것일 수 있다. 예를 들면, 반응용액 중에 게놈 DNA 용액을 시료로서 주입하고, 상기 DNA를 상기 (d) 엔도뉴클레아제의 작용에 의하여, 상기 표적 핵산은 인 시튜에서 생성될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 조건은 통상적으로 사용되는 리가제, DNA 폴리머라제 및 제한 효소 버퍼를 사용하여 이루어질 수 있다. 이 경우, 리가제 반응에 특이적으로 필요한 ATP, 제한효소 반응에 특이적으로 필요한 Mg2+, 폴리머라제의 반응에 특이적으로 필요한 dNTP와 같은 성분은 포함하여야 한다. 상기 버퍼는, 제한효소 반응에 통상적으로 사용되는, NEB (New England Biolab) 버퍼 계열, 예를 들면 NEB 버퍼 4, Bst DNA 폴리머라제 버퍼, T4 DNA 리가제 버퍼 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. .
상기 반응은 4℃ 내지 80℃, 바람직하게는 4℃ 내지 65℃에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 반응은 pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 7.5에서 이루어지는 것이다.
상기 반응은 Mg2+, dNTP, 및 ATP를 포함하는 반응용액 중에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 리가제는 Tag DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 및 Tfi DNA 리가제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 타입 I, II, IIs, lig, lib, 니킹 엔도뉴클레아제, McrBC 뉴클레아제 및 호밍 (homing) 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 대장균 DNA 폴리머라제 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 폴리머라제, vent DNA 폴리머라제, T4, T7 DNA 폴리머라제, 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 프라이머는 표적 핵산 및 2개의 헤어핀 올리고로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 상보적인 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 표적 핵산뿐만 아니라 상기 헤어핀 올리고에도 상보적인 서열을 포함하고 있어, 헤어핀 다이머를 증폭하는 것을 배제시킴으로써, 표적 핵산의 증폭 특이도를 높일 수 있는 것이다.
상기 프라이머는 2개의 프라이머로 이루어진 것이어서, 표적 핵산이 복수 개 연결된 콘카테머가 아닌 단위 표적 핵산으로 증폭할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 방법의 작용 원리를 예를 들어 도식적으로 설명하면, 도 1 내지 3과 같다.
도 1은 리가제와 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI이 동시에 존재하는 반응용액 중의 평형 상태를 나타내는 도면이다. 도 1A는 제한 엔도뉴클레아제의 인식부위를 포함하는 핵산 T만이 존재하는 경우의 평형 상태이고, 도 1B는 제한 엔도뉴클레아제의 인식부위를 포함하는 핵산 T 및 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의하여 형성되는 단일 가닥 말단 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 A (이하 어답터 (adaptor) 핵산)가 존재하는 경우의 평형 상태이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 리가제와 제한 엔도뉴클레아제가 동시에 존재하는 용액 중에서, 제한 엔도뉴클레아제의 인식부위를 포함하는 핵산 T 외에 어답터를 추가적으로 첨가함으로써, 반응의 평형 상태는 하이브리드 핵산 H (T1-A 하이브리드)이 형성되는 쪽으로 이동하는 것을 알 수 있다. 상기 어답터에는 본 발명에서 언급된 2개의 헤어핀 올리고가 포함되고, 제한 엔도뉴클레아제의 인식부위를 포함하는 핵산 T에는 증폭하고자 하는 표적 핵산이 포함될 수 있다. 상기 2개의 올리고는 리가제와 제한 엔도뉴클레아제가 동시에 존재하는 반응용액 중에서, 각각이 올리고와 서로 연결된 헤어핀 다이머가 평형상태로 존재할 수 있는 것이므로, 본 발명에서는 문맥에 따라 상기 2개의 올리고는 이들 서로 연결된 헤어핀 다이머로 서로 교환가능하게 사용되며, 권리 범위의 해석에 있어서도 동일하게 해석되어야 한다. 도 1에서 EcoRI의 인식부위 GAATTC는 하이브리드 핵산 H의 생성에 의하여 파괴된다. 이에 의하여 어답터 A에 대하여는 하이브리드를 형성하는 쪽으로만 평형이 진행하게 되어, 표적핵산 T의 농도가 낮더라도 단일가닥 원형 DNA 주형을 생성할 수 있다.
도 2는 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적 핵산이 연결되어 형성되는 모노머의 구조를 도식적으로 나타낸 도면이다. 도 2에서, ccgacgagcgagctttaacgtgcgctaactgcggtcagaagctgcatgtgtc (서열번호 1)로 구성되는 표적 핵산은, ccattctgttccgca tgattcctctgcggaacagaat (서열번호 2)로 구성되는 헤어핀 올리고와, ggattctgttccgcatgattcctctgcggaacagaat (서열번호 3)으로 구성 되는 헤어핀 올리고와 리가제에 의하여 연결된다. 도 2에 도시된 표적 핵산은 양쪽 말단이 서로 헤어핀 올리고에 상보적인 단일가닥 말단 서열을 포함하는 경우이나, 동일할 수도 있다. 도 2에서, 제한 효소 인지 부위는 tccc이며, 프라이머 I와 II의 결합 위치가 기재되어 있다. 프라이머 I와 II의 서열은 각각 cgacgagcgagctttaacgtg (서열번호 4) 및 gcggaacagaatgggacac (서열번호 5)이며, 프라이머 II의 경우 하나의 헤어핀 올리고와 표적 핵산 모두에 상보적이다.
본 발명의 방법에 따르면, 하나의 반응용기 내에서 단일가닥 환형 DNA 주형의 생성과 RCA를 동시에 수행할 수 있다. 또한, 등온증폭으로 증폭하기 어려운 이중가닥 DNA를 증폭할 수 있다. 본 발명의 방법은 표적 DNA를 직접 증폭 코어 (아령 (dumbbell)로 만들어 증폭하기 때문에, 증폭 특이도가 높다. 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 이용되는 제한 효소를 변화시켜, SNP 타이핑에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 타입 IIs 제한 효소를 이용하고, 프라이머를 헤어핀 올리고의 루프에 상보적인 서열을 사용함으로써, 전 게놈 증폭이 가능하다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 특허청구범위가 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 제한 효소 버퍼와 DNA 중합 버퍼의 호환성
본 실험예에서는 제한 효소 반응에 사용되는 버퍼와 DNA 중합에 사용되는 버퍼가 서로 호환성이 있는지를 확인하였다.
실험은 람다 DNA 1500 ng(제조원 기재 요망)를 NEB 버퍼 4 (50　mM　포타슘 아세테이트, 20　mM　Tris-아세테이트, 10　mM　마그네슘 아세테이트, 1　mM　디티오트레이톨 (Dithiothreitol), 25℃에서 pH 7.9) 10㎕에 첨가하고 3 유니트의 Hpy188III를 첨가하고, 상온에서 10 분 동안 반응시켰다 (제한 효소 버퍼 사용). Hpy188III는 인식 부위가 TCNNGA이며, 타입 IIs 타입이다. 또한, 람다 DNA 1500 ng (바이오니아, 한국)를 Mg2 + 및 ATP가 첨가된 Bst DNA 폴리머라제 버퍼 (1X Bst buffer (20　mM　Tris-HCl,10　mM　(NH4)2SO4,10　mM　KCl,2　mM　MgSO4,0.1　%　Triton X-100,25℃에서pH 8.8), Mg++ 7.5mM, 각각 프라이머 (서열번호 4와 5) 0.6μM, dNTP 0.3mM 각각, Bst DNA 폴리머라제 5 유니트, ATP 1mM, SYBR 2X) 10㎕에 첨가하고 3유니트의 Hpy188III를 첨가하고, 상온에서 10 분 동안 반응시켰다 (DNA 중합 효소 버퍼 사용). 대조군으로서, Hpy188III를 첨가하지 않고, 람다 DNA 1500ng를 NEB 버퍼 4 10㎕ 중에 동일하게 반응시켰다.
반응 산물을 Labchip (Agilent Technology)을 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은, 제한 효소 버퍼와 중합효소 버퍼의 상호 호환성을 나타내는 도면이다. 도 3에서, M은 마커이고, 레인 1은 NEB 버퍼 4, 레인 2는 Bst DNA 폴리머라제 버퍼, 레인 3은 음성대조군이다. 레인 1과 2에 나타낸 바와 같이, 절단 산물에는 서로 차이가 없으며, 따라서 중합효소 버퍼는 제한 효소의 반응에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
실험예 2: 제한 효소 버퍼와 리가제 버퍼의 호환성
본 실험예에서는 제한 효소 반응에 사용되는 버퍼와 리가제 버퍼가 서로 호환성이 있는지를 확인하였다.
실험은 람다 DNA 1500ng (바이오니아, 한국)를 T4 DNA 리가제 버퍼 (50　mM　Tris-HCl,10　mM　MgCl2,1　mM　ATP,10　mM　Dithiothreitol,25℃에서 pH 7.5) 10㎕에 첨가하고 3 유니트의 Hpy188III와 3 유니트의 T4 DNA 리가제를 첨가하고, 상온에서 20 분 동안 반응시켰다 (리가제 버퍼 사용). 또한, 람다 DNA 1500 ng (바이오니아, 한국)를 Mg2 + 및 ATP가 첨가된 Bst DNA 폴리머라제 버퍼 (1X Bst buffer (20　mM　Tris-HCl,10　mM　(NH4)2SO4, 10　mM　KCl, 2　mM　MgSO4 , 0.1　%　Triton X-100, 25℃에서pH 8.8), Mg2 + 7.5mM, each primer 0.6μM, dNTP 0.3mM each, Bst DNA polymerase 5unit, ATP 1mM, SYBR 2X) 10㎕에 첨가하고 3유니트의 Hpy188III 및 3 유니트의 T4 DNA 리가제를 첨가하고, 상온에서 20 분 동안 반응시켰다 (DNA 중합 효소 버퍼 사용). 대조군으로서, T4 DNA 리가제를 사용하지 않은 것을 제외하고는, 상기 리가제 버퍼를 사용한 경우와 동일하게 반응시켰다. 상기 프라이머는 서열번호 4와 5의 서열을 가진다.
반응 산물을 Labchip (Agilent Technology)을 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 리가제 버퍼와 제한 효소 및 중합효소 버퍼의 상호 호환성을 나타내는 도면이다. 도 4에서, M은 마커이고, 레인 1은 리가제 버퍼, 레인 2는 Bst DNA 폴리머라제 버퍼, 레인 3은 T4 DNA 리가제를 사용하지 않은 것을 제외하고는, 레인 1과 동일하게 실험한 결과이다. 레인 1과 2에 나타낸 바와 같이, 절단 산물은 서로 큰 차이가 없으며, 따라서 중합효소 버퍼는 리가제의 반응에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
실험예 3: 리가제 및 제한 효소가 동시에 존재하는 용액 중의 산물의 평형 상태
본 실험예에서는, 표적 핵산 및 2개의 헤어핀 올리고가 존재하는 용액에서 리가제, 제한효소 및 이들 모두를 처리한 경우, 그 산물의 평형 상태의 변화를 관찰하였다.
기본 반응 용액은 20㎕ 반응용액 중에 표적 DNA (서열번호 1) 0.5μmole, 헤어핀 올리고 (서열번호 2와 3) 각각 0.5μmole, 1X Bst 버퍼 (20　mM　Tris-HCl,10　mM　(NH4)2SO4,10　mM　KCl,2　mM　MgSO4,0.1　%　Triton X-100,25℃에서pH 8.8), Mg2+ 7.5mM, 각 프라이머 (서열번호 4 또는 5) 0.6μM, dNTP 0.3mM 각각, Bst DNA 폴리머라제 5 유니트, ATP 1mM, SYBR 2X를 포함한다. 여기에, T4 DNA 리가제 3 유니트 (레인 1), T4 DNA 리가제 3 유니트: 제한 효소 Hpy188III 3 유니트를 1:1로 첨가 (레인 2), 제한 효소 Hpy188III 3 유니트 (레인 3)를 각각 첨가하고, 상온에서 10분 동안 반응시키고, 반응 산물을 Labchip (Agilent Technology)을 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 제한 효소가 중합효소 버퍼 중에서 작용하는지를 표적 핵산 및 2개의 헤어핀 올리고가 존재하는 상태에서 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에서, M은 마커이고, 레인 1은 리가제만 첨가, 레인 2는 리가제: 제한 효소를 1:1의 비율로 첨가, 레인 3은 제한 효소만 첨가하여 실험한 결과이다. 레인 1과 2에 나타낸 바와 같이, 레인 2는 레인 1에 비하여 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적 핵산이 연결된 모노머 (아령 (dumbbell)이라고도 함)가 32% 증가하였고, 표적 핵산과 표적 핵산의 콘카테머는 66% 감소하였으며, 헤어핀 다이머는 32% 감소하였다. 이는 리가제와 제한 효소를 함께 반응시킴으로써, 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적 핵산이 연결된 모노머 즉, 롤링 서클 증폭법에서 주형으로 사용되는 DNA가 현저하게 증가한다는 것은 나타낸다. 도 5에서, a 위치의 밴드는 헤어핀 다이머, b 위치의 밴드는 하나의 표적 DNA, c 위치의 밴드는 하나의 헤어핀 올리고와 하나의 표적 핵산이 연결된 산물을 나타내고, d 위치의 밴드는 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적 핵산이 연결된 모노머를 나타내고, e 위치의 밴드는 표적 콘카테머를 나타낸다. c 위치의 밴드는 하나의 헤어핀 올리고와 하나의 표적 핵산이 연결된 산물을 나타내는 이유는, 헤어핀 올리고의 5' 말단에 인산화시키는 반응이 100% 수율로 일어나지 않았기 때문인 것으로 생각됩니다.
실시예 1: 리가제 및 제한 효소 존재하에서 롤링 서클 증폭 반응
본 실시예에서는, 상기한 바와 같은 실험예 1-3의 결과에 따라, 리가제와 제한효소가 함께 존재하는 상태에서, 롤링 서클 증폭법에서 주형으로 작용하는 단일 가닥 환형 DNA가 많은 양으로 증폭된다는 것을 확인하고, 이에 근거하여 RCA를 수행하였다.
반응용액은, 최종 20㎕ 중에 표적 DNA (서열번호 1) 0.5pM, 헤어핀 올리고 (서열번호 2와 3) 0.5pM, 1x Bst 버퍼 (20　mM　Tris-HCl,10　mM　(NH4)2SO4,10　mM　KCl,2　mM　MgSO4,0.1　%　Triton X-100,25℃에서pH 8.8), Mg2 + 7.5mM, 각 프라이머 (서열번호 4 또는 5) 0.6μM, dNTP 0.3mM 각각, Bst DNA 폴리어머라제 5유니트, ATP 1mM, SYBR 2X를 포함한다. 실험은 상기 반응 용액 중에, 리가제 3 유니트만 첨가한 경우 (양성 대조군), 제한 효소만 3 유니트 (음성 대조군), 리가제 3유니트 : 제한효소 3 유니트를 더 첨가하고 등온증폭반응, 즉 롤링 서클 증폭반응을 수행하였다. 즉, 상기 반응용액을 TMC-1000 thermal cycler (Samsung Electronics, Co. Ltd)에 장착하고, 상온에서 10분 동안 방치한 후, 60℃에서 5초, 및 60℃에서 40초 (즉, 60℃에서 45초임; 이와 구분한 이유는, TMC-1000 기기는 열 순환의 형식으로 셋팅되어 있기 때문임)를 40회 반복하였다. 매 사이클의 마지막 5초 동안을 형광 강도를 측정하였다.
도 6은 리가제 및 제한 효소 존재하에서 RCA를 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 도 6에서, 곡선 1과 4 (2반복 실험)는 리가제만 포함하고 있는 곡선이며, 곡선 2는 제한 효소만 포함하고 있는 곡선이며 (도면 상으로 하나의 곡선으로 보이나 실제적으로는 2반복 실험에 대한 2개의 곡선이 겹쳐 있는 것에 해당하는 것임), 곡선 3과 5 (2 반복 실험)는 리가제와 제한 효소가 1:1의 활성 비율로 첨가된 경우의 증폭 곡선이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 리가제와 제한 효소를 동시에 포함하는 용액 중에서 RCA를 수행하는 경우, 표적 핵산의 증폭이 더 빨리 되었다.
실시예 2: 리가제 및 제한 효소 존재하에서 롤링 서클 증폭 반응 -민감도에 미치는 영향
본 실시예에서는, 리가제와 제한효소가 함께 존재하는 상태에서, 표적 핵산의 농도를 달리하면서 RCA를 수행하였다.
반응용액은, 최종 20㎕ 중에 표적 DNA (서열번호 1)을 106 내지 10 카피의 농도고 각각 포함하고, 헤어핀 올리고 (서열번호 2와 3) 0.5pM, 1x Bst 버퍼 (20　mM　Tris-HCl,10　mM　(NH4)2SO4,10　mM　KCl,2　mM　MgSO4,0.1　%　Triton X-100,25℃에서pH 8.8), Mg2 + 7.5mM, 각 프라이머 (서열번호 4 또는 5) 0.6μM, dNTP 0.3mM 각각, Bst DNA 폴리어머라제 5유니트, ATP 1mM, SYBR 2X를 포함한다. 또한, 상기 반응 용액은 T4 DNA 리가제 3유니트 : Hpy188III 제한효소 3 유니트를 더 첨가하고 등온증폭반응, 즉 롤링 서클 증폭반응을 수행하였다. 즉, 상기 반응용액을 TMC-1000 thermal cycler (Samsung Electronics, Co. Ltd)에 장착하고, 상온에서 10분 동안 방치한 후, 60℃에서 5초, 및 60℃에서 40초 (즉, 60℃에서 45초임; 이와 같이 구분한 이유는, TMC-1000 기기는 열 순환의 형식으로 셋팅되어 있기 때문임)를 60회 반복하였다. 매 사이클의 마지막 5초 동안을 형광 강도를 측정하였다.
도 7은 리가제 및 제한 효소 존재하에서, 표적 핵산의 카피 수에 따른 RCA를 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 도 7에서, 곡선 1 내지 6은 각각, 표적 핵산의 카피 수가 각각, 106, 105, 104, 103, 102, 및 10 카피인 경우의 증폭 곡선을 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 리가제와 제한 효소를 동시에 포함하는 용액 중에서 표적 핵산의 카피 수에 감소함에 따라, RCA 증폭은 더 늦게 이루어졌다. 또한, 10 카피에서도 증폭이 이루어져, 민감도가 높음을 알 수 있다. 참고적으로, PCR은 각 단계가 온도로 확실히 구분되어 증폭이 급격하게 일어나는 Ct 값을 이용하여 주형의 양을 정량할 수 있지만, 등온 반응은 사실상 단계의 구분이 없어서, PCR과 같은 속도론 (kinetics)를 그대로 적용하기는 어려운 점이 있다.
도 1은 리가제와 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI이 동시에 존재하는 반응용액 중의 평형 상태를 나타내는 도면이다.
도 2는 2개의 헤어핀 올리고 사이에 표적 핵산이 연결되어 형성되는 모노머의 구조를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은, 제한 효소 버퍼와 중합효소 버퍼의 상호 호환성을 나타내는 도면이다.
도 4는 리가제 버퍼와 제한 효소 및 중합효소 버퍼의 상호 호환성을 나타내는 도면이다.
도 5는 제한 효소가 중합효소 버퍼 중에서 작용하는지를 표적 핵산 및 2개의 헤어핀 올리고가 존재하는 상태에서 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 리가제 및 제한 효소 존재하에서 RCA를 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 리가제 및 제한 효소 존재하에서, 표적 핵산의 카피 수에 따른 RCA를 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Method of amplifying target nucleic acids by rolling circle amplification in the presence of ligase and endonuclease <130> PN075488 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Targe nucleic acids <400> 1 ccgacgagcg agctttaacg tgcgctaact gcggtcagaa gctgcatgtg tc 52 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hairpin oligonucleotide sequence 1 <400> 2 ccattctgtt ccgcatgatt cctctgcgga acagaat 37 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hairpin oligonucleotide sequence 2 <400> 3 ggattctgtt ccgcatgatt cctctgcgga acagaat 37 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 4 cgacgagcga gctttaacgt g 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 gcggaacaga atgggacac 19

Claims (12)

  1. (a) 제1 헤어핀 올리고 및 제2 헤어핀 올리고로서, 제1 헤어핀 올리고는 제1 헤어핀 루프, 제1 스템 및 제1 단일가닥 말단 ("제1 오버행 서열")을 포함하고, 제2 헤어핀 올리고는 제2 헤어핀 루프, 제2 스템 및 제2 단일가닥 말단 ("제2 오버행 서열")을 포함하고, 제2 헤어핀 올리고의 제2 오버행 서열은 제1 헤어핀 올리고의 제1 오버행 서열과 상보적인 것인 제1 헤어핀 올리고 및 제2 헤어핀 올리고,
    (b) 양 말단에 제1 헤어핀 올리고의 제1 오버행 서열 및 제2 헤어핀 올리고의 제2 오버행 서열을 포함하는 표적 핵산,
    (c) DNA 리가제,
    (d) 엔도뉴클레아제,
    (e) DNA 폴리머라제, 및
    (f) 프라이머를 포함하는 반응용액을 반응시켜, 단일가닥 환형 DNA 주형의 제조와 함께 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하는, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 헤어핀 올리고와 제2 헤어핀 올리고는 상기 리가제에 의하여 서로 연결되어, 양 말단에 단일가닥 헤어핀 루프를 가지고 있는, 상기 (d) 엔도뉴클레아제의 제한 부위를 가진 이중가닥 선형 절편을 포함하는 제1 모노머를 형성하는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 헤어핀 올리고와 제2 헤어핀 올리고와 표적 핵산은 상기 리가제에 의하여 서로 연결되어, 양 말단에 단일가닥 헤어핀 루프를 가지고 있는, 이중가닥 선형 절편을 포함하는 제2 모노머를 형성하는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이중가닥 선형 절편은 상기 (d) 엔도뉴클레아제의 제한 부위를 가지거나 가지지 않는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반응은 4℃ 내지 80℃에서 이루어지는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 반응은 Mg2 +, dNTP, 및 ATP를 포함하는 반응용액 중에서 수행되는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은, 시료 중의 핵산으로부터 상기 (d) 엔도뉴클레아제에 의하여 인 시튜 (in situ)로 생성되는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리가제는 Tag DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 및 Tfi DNA 리가제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 타입 I, II, IIs, lig, lib, 니킹 엔도뉴클레아제 및 McrBC 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 대장균 DNA 폴리머라제 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 폴리머라제, vent DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 표적 핵산 및 제1 헤어핀 올리고 및 제2 헤어핀 올리고로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 상보적인 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 2개의 프라이머로 이루어진 것인, 롤링 서클 증폭법을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법.
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DE602008005082T DE602008005082D1 (de) 2007-10-11 2008-10-10 Verfahren zur Verstärkung einer Zielnukleinsäure durch Rolling-Circle-Verstärkung
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101414713B1 (ko) * 2007-10-11 2014-07-03 삼성전자주식회사 리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법
CN102369298B (zh) 2009-01-30 2017-03-22 牛津纳米孔技术有限公司 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体
US20120237451A1 (en) * 2009-09-18 2012-09-20 Antony Kuang-Shih Chen Novel molecular beacons
IN2014DN00221A (ko) 2011-07-25 2015-06-05 Oxford Nanopore Tech Ltd
AU2013271404B2 (en) * 2012-06-08 2017-10-12 Ionian Technologies, Llc Nucleic acid amplifications
EP2875154B1 (en) 2012-07-19 2017-08-23 Oxford Nanopore Technologies Limited SSB method for characterising a nucleic acid
EP2964779B1 (en) 2013-03-08 2018-08-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Use of spacer elements in a nucleic acid to control movement of a helicase
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
JP2016521120A (ja) 2013-03-15 2016-07-21 セラノス， インコーポレイテッド 核酸増幅
AU2014233152A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
AU2014233145A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
US10450595B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
KR102014989B1 (ko) 2013-04-15 2019-08-27 삼성전자주식회사 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
WO2015035260A1 (en) 2013-09-06 2015-03-12 Theranos, Inc. Systems and methods for detecting infectious diseases
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
CN106460065A (zh) * 2014-04-11 2017-02-22 雷德沃特生物科学公司 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
AU2018371063A1 (en) 2017-11-21 2020-06-11 4basebio Sl Methods and kits for amplification of double stranded DNA
CA3063752A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Stem Arts Projects, Llc Reaction condition composition for circularizing oligonucleotide probes
WO2019169304A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Mirna Analytics Llc Biomarker detection in pulmonary hypertension
WO2019193083A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-10 Aarhus Universitet Detection of endonuclease activity
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
JP2021528959A (ja) 2018-06-22 2021-10-28 アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド 細胞内で存続する遺伝子送達のためのベクター
WO2020113460A1 (zh) * 2018-12-05 2020-06-11 深圳华大智造极创科技有限公司 滚环扩增方法、测序文库制备方法及制得的dna纳米球
CN111876472B (zh) * 2020-06-17 2023-12-01 江门市灿明生物科技有限公司 多种混合核酸中检测痕量核酸的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6498023B1 (en) * 1999-12-02 2002-12-24 Molecular Staging, Inc. Generation of single-strand circular DNA from linear self-annealing segments
WO2005059157A2 (en) 2003-12-11 2005-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN PREPARING HAIRPIN RNAs
KR20060073815A (ko) * 2004-12-24 2006-06-29 삼성전자주식회사 변형된 ｒｃａ 및 2차 프라이머에 의한 핵산 증폭 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US6235502B1 (en) 1998-09-18 2001-05-22 Molecular Staging Inc. Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification
US7247429B2 (en) 2002-08-07 2007-07-24 Genetix Limited Biochemical amplification of nucleic acids
US20050069939A1 (en) 2003-09-26 2005-03-31 Youxiang Wang Amplification of polynucleotides by rolling circle amplification
DK1885880T3 (da) 2005-04-29 2010-11-08 Synthetic Genomics Inc Amplifikation og kloning af enkelte DNA-molekyler ved anvendelse af rolling circle-amplifikation
US20070031857A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-08 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of DNA, including using multiple enzymes in a single reaction
KR101414713B1 (ko) * 2007-10-11 2014-07-03 삼성전자주식회사 리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6498023B1 (en) * 1999-12-02 2002-12-24 Molecular Staging, Inc. Generation of single-strand circular DNA from linear self-annealing segments
WO2005059157A2 (en) 2003-12-11 2005-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN PREPARING HAIRPIN RNAs
KR20060073815A (ko) * 2004-12-24 2006-06-29 삼성전자주식회사 변형된 ｒｃａ 및 2차 프라이머에 의한 핵산 증폭 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMC Genomics. 2003, vol. 4, 21, pp. 1-18. *

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