CN107849603B - 利用有限核苷酸组成的引物扩增 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用单一引物或一对有限核苷酸组成的正向引物和反向引物进行扩增的方法。有限核苷酸组成意味着该引物在至少一种核苷酸类型中是非充分的。这样的引物极大地降低了相互引发的能力，或者降低了在目标核酸的靶引物结合位点以外的地方的错引而引起的延伸。

Description

利用有限核苷酸组成的引物扩增

相关申请的交叉引用

本申请是非临时的，要求于2015年4月24日提交的美国专利62/152,756的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

PCR扩增是由Kary Mullis在1983年发明的(Mullis,1987U.S.Patent No.4,683,202；Saiki et al.,1985,Science(New York,N.Y.),230(4732),1350–1354)，Kary Mullis因此获得了诺贝尔奖。自那以后，出现了多种基于引物的模板依赖型核酸扩增方法，其中包括链置换方法(George T.Walker,Little,&Nadeau,1993,U.S.Pat.No.5,270,184；GeorgeT.Walker,1995,U.S.Pat.No.5,455,166；G.T.Walker et al.,1992,nucleic acidsResearch,20(7),1691–1696,1992,Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,89(1),392–396)以及基于转录的扩增系统，包括US.Pat.Nos.5437990、5409818和399491中描述的方法；转录扩增系统(TSA)(Kwoh et al.,1989,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,86(4),1173–1177；Kacian&Fultz,1995,U.S.Pat.No.5,480,784；Kacian&Fultz,1996,U.S.Pat.No.5,399,491)；以及自我持续序列复制(3SR)(Fahy,Gingeras,Guatelli,Kwoh,&Whitfield,1992,WO 92/08800；Guatelli et al.,1990,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,87(5),1874–1878)；连接链反应(有时也称为寡核苷酸连接酶扩僧OLA)(Laffler,Carrino,&Marshall,1993,Annales De Biologie Clinique,51(9),821–826)；循环探针技术(CPT)(Duck,Alvarado-Urbina,Burdick,&Collier,1990a,BioTechniques,9(2),142–148),rollingcircle amplification(RCA)(Fire&Xu,1995,Proceedings of the National Academy ofSciences,92(10),4641–4645；Lizardi,1998,U.S.Pat.No.5,854,033)；基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton,1991,Nature,350(6313),91–92,Malek,Davey,Henderson,&Sooknanan,1992)；有创裂解技术(HDA)(Kong,Vincent,&Xu,2004,US 2004-0058378 A1；Kong,Vincent,&Xu,2007US pat.US2007/0254304A1)；指数式扩增(EXPAR)(Van Ness,VanNess,&Galas,2003,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,100(8),4504–4509)；杂交链反应(HCR)(R.M.Dirks&Pierce,2004,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,101(43),15275–15278,R.Dirks&Pierce,2012,U.S.Pat.No.8,105,778)；催化颈环组装(CHA)(Li,Ellington,&Chen,2011,nucleic acids Research,39(16),e110)。上述所有参考文献以引用的方式并入本文。尽管核酸扩增技术已经广泛应用，其并非没有缺陷，这些缺陷限制了其精度和灵敏度。目标扩增产物通常来自于一对正向引物和反向引物的延伸，正向引物和反向引物结合到其完全互补的引物结合位点。但是非目标扩增产物可能来源于引物互配(primer duplexing)，一条引物作为另一条引物(引物二聚体)的延伸模板，也可能来源于引物匹配到第二引物结合位点(非目标引物结合位点)，根据沃森克里克配对规则，发生了一定程度的错配。结果是目标扩增产物和多种非目标产物或背景产物一起被合成。当样品中意向目标物的起始浓度降低或者PCR循环次数增加时，或者当在多重扩增中使用了不止一对引物时，这些非目标产物或背景产物的存在更加明显(参考附图2和3，比较了常规引物和本发明的有限组成引物)。结果是，检测灵敏度受到循环范围的限制，超过循环范围可能检测到目标扩增产物信号的线性增加。

减少反应启动前引物延伸产物的形成可以减少非特异性扩增。在一种被称为“热启动”过程的方法中，反应混合物中不加入一种或多种关键试剂，直到反应温度上升到足以提供必要的杂交特异性。在人工热启动方法中，在起始高温孵育步骤后，打开反应管，加入之前没有添加的试剂，这种方法劳动强度大，且增加了反应混合物污染的风险。可选地，热敏物质，例如蜡，可以用于隔离或隔绝反应组分，如Bloch,Raymond,&Read,1995US.Pat.No.5411876和Chou,Russell,Birch,Raymond,&Bloch,1992,nucleic acidsResearch,20(7),1717–1723所述，该文献以引用的方式并入本文。在这些方法中，高温预反应孵育融化了热敏物质，使得反应试剂混合。

另一种减少反应启动前引物延伸产物形成的方法依赖于DNA聚合酶的热可逆失活。Birch,Laird,&Zoccoli,1997U.S.Pat.No.5677152以及Birch,Laird,&Zoccoli,1998U.S.Pat No.5773258描述了通过改性剂基团的共价结合而可逆调节的DNA聚合酶，这两篇文献以引用的方式并入本文。失活DNA聚合酶在高温下孵育会导致改性剂-酶之间的键的裂解，从而使酶复活。

Scalice,Sharkey,Christy Jr.,Esders,&Daiss,1994,US Pat.Nos.5338671描述了通过DNA聚合酶特异性抗体实现DNA聚合酶的非共价可逆抑制，该文献以引用的方式并入本文。

根据Gelfand,Kwok,&Sninsky,1995,US Pat.No.5418149描述的方法，也可以通过酶降解反应启动前形成的延伸产物来减少非特异性扩增，该文献以引用的方式并入本文。在反应混合物中加入dUTP和UNG，在进行扩增反应前，在45-60℃下孵育反应混合物，可以实现新近合成延伸产物的降解。引物延伸导致含有尿嘧啶的DNA的形成，在预扩增条件下，含有尿嘧啶的DNA会被UNG降解。该方法的缺陷在于，延伸产物的降解与延伸产物的形成相互竞争，因此非特异性引物延伸产物的清除不是很彻底。该方法的优点在于，在之前的反应中作为污染物引入到反应混合物中的含有尿嘧啶的DNA也被降解了，因此，该方法也缓解了从之前的反应扩增的核酸进行PCR的污染问题。

另一种减少反应启动前引物延伸产物形成的方法依赖于在3’端或者临近3’端增加一部分到环外胺基而被修饰的引物的使用，如Will,1999,US Pat No.6001611中所描述，该文献以引用的方式并入本文。

尽管致力于减少非特异性扩增，大部分的方法着力于在低温下减少来源于引物延伸的假阳性产物。很少有方法能在扩增循环启动后在高温下解决由于引物相互作用而导致的假阳性产物问题，该问题在本文中描述为扩增过程中引物间的短暂作用(Transientinteraction)。由于在扩增反应中越来越多的引物被混合以达到高通量的结果，上述问题更加突出了。当引物的内部片段在一条引物内或者两条引物之间彼此杂交时，短暂作用形成。杂交可以是依据沃森-克里克配对规则的连续碱基对，也可以是混合了沃森-克里克配对规则(完美匹配)和非沃森-克里克配对规则(错配或错对)的碱基对。Seela&Budow,2008,Molecular bioSystems,4(3),232–245论述了溶液中DNA错配的形成。在8种可能的错配中，GG,GT和GA对是最稳定的。尽管错配的碱基对不如非沃森-克里克配对稳定，且稳定性受到序列上下游碱基的影响，但由于扩增反应中越来越多的引物被混合以达到高通量的结果，错配问题变得非常严重，可能导致非常高的序列多样性。理论上，临近引物3’端的错配极大地影响引物延伸效率。即使该理论是真的，Kwok et al.,1990,nucleic acids Research,18(4),999–1005以及Stadhouders et al.,2010,The Journal of MolecularDiagnostics:JMD,12(1),109–117显示3’端的错配可能有很轻微的后果，也可能有很严重的后果，但是不会消除引物延伸。当错配位于引物3’端的#2位时，仅AA GA对会对引物延伸有很大的损害作用。总而言之，带有错配的DNA双链体在预扩增阶段和扩增阶段通过短暂作用形成。引物3’核苷酸与模板的动态配对(完美配对或错配)启动了引物延伸，导致不想要的扩增产物。

发明内容

在所有的扩增方法中，引物之间的相互作用以及非特异性扩增是基本的问题。为了克服该基本问题，发现了一种新颖的引物或引物设计方法，其基本能够抑制引物二聚体以及不想要的副反应扩增产物。本发明提供了一种扩增目标核酸的片段的方法，其包括：使含有目标核酸的样品与正向和反向引物接触；进行扩增反应，其中所述目标核酸的扩增片段通过正向引物和反向引物的延伸形成，目标核酸作为模板；其中所述引物中四种标准核苷酸类型中的一种或多种是非充分的(underrepresented)，引物中非充分的核苷酸类型是相同的，扩增的片段是通过所述正向和/或反向引物的延伸而形成的主要扩增产物。

本发明进一步提供了扩增目标核酸的方法，其包括：使目标核酸与具有3’杂交片段的引物接触，所述3’杂交片段在连接至5’人工片段的引物中随机变化，所述人工片段在不同的引物中是相同的，其中所述5’人工片段仅由三种类型的核苷酸组成，除了5’核苷酸可以是非充分核苷酸；且所述3’片段仅由三种相同类型的核苷酸组成，在除了3’端的位置至多20％的单位可以是第四种核苷酸类型。

本发明进一步提供了一种扩增目标核酸的方法，其包括使目标核酸与由四种核苷酸类型A,T,C和I(肌苷，肌苷)组成的随机引物接触。

本发明进一步提供了一种延伸目标核酸的片段的方法，其包括：使含有目标核酸的样品与引物接触；进行延伸反应，其中所述目标核酸的延伸片段通过引物的延伸而形成；其中所述引物中四种标准核苷酸类型中的一种或多种是非充分的，所述延伸片段是由引物延伸而形成的主要延伸产物。

在本发明中，待检测的目标物可能含有一个特别的区域，其中引物或探针杂交或结合区域仅含有三种类型的核苷酸。在这种情况下，引物或探针的组成也仅仅只有三种类型的核苷酸：ATC,ATG,ACG或TCG。缺失的核苷酸被称为非充分核苷酸(underrepresentednucleotide)。在引物或探针中，非充分核苷酸可以是一种类型的核苷酸或两种类型的核苷酸或三种类型的核苷酸。举个例子，引物或探针组成仅仅只有ATC，那非充分的核苷酸就是G。引物含有三种类型的核苷酸，其3’核苷酸与不充分核苷酸互补。例如，对于ATC引物来说，3’核苷酸是C，其与不充分的核苷酸G互补。三种核苷酸类型或探针不会形成引物二聚体而产生假阳性产物，因为引物或探针的3’端总是错配，不能被延伸。这种引物或探针被称为不充分引物或探针。引物结合位点被称为不充分结合位点。在一个模板扩增系统中，引入合适的试剂以延伸不充分的引物，用目标核酸作为模板。在单一的扩增系统中，包括合适的试剂，以允许不充分的探针与目标杂交而产生检测信号。

在指数扩增条件下，例如PCR，需要两条引物。一条或两条引物可以是非充分引物。在正向和反向引物都是非充分引物的条件下，待检测的目标核酸可能具有一个区域，该区域含有三种片段：正向引物结合片段，反向引物结合片段，位于两个引物结合位点之间的片段。两个引物结合片段均含有相同的三种核苷酸类型。位于两个引物结合位点之间的片段含有0个核苷酸，或者不含有非充分核苷酸以及非充分核苷酸的互补核苷酸。在这种情况下，PCR扩增仅仅只需要三种类型的脱氧核苷酸三磷酸腺苷。这种正向和反向非充分引物不会用彼此作为模板而形成引物二聚体产物。此外，由于正向和反向非充分引物错误杂交而形成的不想要的扩增引物也会被终止，因为系统不含有第四种核苷酸。设计了软件搜寻目标中适合这种扩增的区域。

在另一个实施例中，上述提到的扩增系统的引物中可能包括与不充分核苷酸互补的双脱氧核苷酸三磷酸。任何来自正向和反向引物的不想要的产物可以通过双脱氧核苷酸的加入而终止。

在另一个实施例中，在目标物中不能找到不充分引物结合片段，该不充分引物可能包括有限数目的不充分核苷酸，例如，1个，2个或3个，不超过引物长度的20％。含有1个，2个或3个不充分核苷酸的引物可以显著地减少引物间的相互作用，而增加引物与模板的杂交效率。当引物中含有有限数目的非充分核苷酸时，反应系统需要包括一组全部四种类型的脱氧核苷三磷酸，以进行扩增。

在另一个实施例中，当非充分引物中含有有限数目的非充分核苷酸时，在扩增系统中可能采用数量减少的与非充分核苷酸互补的脱氧核苷酸三磷酸。相对于扩增系统中常规的脱氧核苷酸三磷酸的量，其数量可能减少到99％至0.001％。

在另一个实施例中，没有找到目标物中的非充分引物结合片段，引物可能含有有限数量的错配碱基对，以排除非充分引物中至少一种或所有非充分核苷酸。

在另一个实施例中，当非充分引物与具有有限数目的错配碱基对的引物结合片段杂交时，可以采用多种方法增强非充分引物的杂交效率。例如，扩增系统可以含有错配结合试剂，以改善非充分引物杂交效率。例如，具有C-C错配的引物杂交效率可以通过含有银离子、铑复合物、2-氨基-7-甲基-1,8-萘啶衍生物等而增强。

在另一个实施例中，非充分引物可以用于扩增目标物的任意片段，而在扩增系统中含有常规的一组全部四种脱氧核苷酸三磷酸类型。

在另一个实施例中，非充分引物的5’端是非充分核苷酸，以抑制任何产生的引物二聚体产物，引物二聚体产物可以进一步作为引物产生连环引物二聚体。

在另一个实施例中，引物由具有有限核苷酸组成的3’片段、具有常规的四种核苷酸组成的5’片段、以及位于两个片段间的连接物组成，该连接物具有与3’链段相同的有限核苷酸组成的人工序列。

在另一个实施例中，上述描述的连接物能够形成发夹结构。

在另一个实施例中，非充分引物需要结合探针，与目标物共杂交，形成三方接合结构(three way junction structure)，从而促进非充分引物结合到其结合位点。

在另一个实施例中，非充分引物的5’端尾接有人工序列。

在另一个实施例中，当非充分引物的5’链段具有人工序列时，人工序列可能包含与特异性酶相互作用的序列，或者可能包括在引物的互补链合成之前或之后形成特定化学识别结构的序列。例如，对于缺口扩增(nicking扩增)，人工序列将包括限制性酶识别序列。对于转录扩增(例如，TMA，转录介导的扩增)，人工序列将包含启动子序列。5’端序列可能形成G-四联体，以识别特异性配体等。人工序列可能含有条形码(barcode)。

在另一个实施例中，非充分引物是简并引物混合物。在另一个实施例中，非充分引物是随机引物混合物。混合物中的所有寡核苷酸在相同的核苷酸类型方面非充分。在一些实施例中，引物具有大于1％但不超过20％的非充分核苷酸。在一些实施例中，简并引物或随机引物具有含有人工序列的5’尾端。

在另一个实施例中，当目标序列是来自多个物种或基因型的生物体时，或来自不止一个等位基因的混合物时，带有非充分核苷酸的引物可能在某些位点含有简并碱基，以匹配不同的序列变体，扩增可能含有非充分引物和简并引物的组合。非充分引物和简并引物的浓度比率可以变化。

在另一个实施例中，非充分引物带有辅助引物，以促进目标物杂交和扩增。辅助引物结合到与带有更少数目的错配的非充分引物相同的引物结合位点。辅助引物以低浓度提供(例如，小于或等于非充分引物浓度的0.01％,0.1％,0.5％,1％,2％,5％,10％,或50％)。

在另一个实施例中，当需要不止一种非充分引物或探针时。引物或探针可能结合到模板的相反链或相同链。对于三方接合信号(three ways junction signal)扩增，两种探针将与相同的链杂交。对于PCR扩增，正向和反向非充分引物将与相反链杂交。

在另一个实施例中，在非充分引物或探针与目标核酸杂交后，扩增目标物的延伸反应可以是线性扩增或指数扩增，且扩增条件可以是等温或温度循环。

在另一个实施例中，当一种或不止一种引物或探针用于反应系统时，并非所有的引物或探针都是非充分引物。例如，在LAMP扩增中，需要四种引物。BIP或FIP或BIP和FIP两者可以是非充分引物。但是其他引物不需要是非充分引物。

在另一个实施例中，当需要一种非充分探针时，例如锁式探针，探针的3’端链段或5’端链段或3’端链段与5’端链段两者可能具有相同类型的非充分核苷酸。3’端和5’端之间的连接段可以是任意人工序列。

在另一个实施例中，在高的多重扩增系统中，需要多对非充分引物。在一些实施例中多对非充分引物在5’端具有一种或不止一种通用序列。5’端通用序列可以是任意人工序列。在多重扩增中，扩增的目标物可以来自相同的基因或不同的基因，或来自相同的样品或不同的样品。

在另一个实施例中，非充分引物或探针可能具有非天然核苷酸，例如，肌苷，5’硝基吲哚，7-去氮-2'-脱氧腺苷脱氧腺苷，7-去氮-2′-脱氧鸟苷，IsoC或isoG。非充分引物或探针也可能是PNA,LNA等。在一些实施例中，引物中上述非天然核苷酸的存在增加了其Tm和与模板的杂交效率。

在另一个实施例中，非充分引物的5’端连接有寡核苷酸链段，该寡核苷酸链段能够形成茎环结构。链段的5’端碱基与非充分核苷酸互补。当PCR扩增中采用了两种这样的引物时，且扩增系统中含有三种类型的脱氧核苷酸三磷酸时，扩增产物可以通过连接酶连接而形成环状产物。在另一个实施例中，当仅仅只有一种引物具有5’茎环结构时，扩增产物被连接以形成发夹结构。

在另一个实施例中，非充分引物内部含有非充分核苷酸。当反应中不含有与非充分核苷酸互补的脱氧核苷酸三磷酸时，延伸会在引物的内部非充分核苷酸处终止，扩增产物将会含有一个设计的粘性末端。该设计的粘性末端可能与任意的接头连接，以用于下游应用。

在另一个实施例中，非充分引物反应中提供有一种、两种或三种类型的dNTPs。

在另一个实施例中，扩增反应中提供有脱氧肌苷三磷酸，和/或7-去氮-2′-脱氧鸟苷5′-三磷酸，和/或7-去氮-2′-脱氧腺苷5′-三磷酸。

在另一个实施例中，提供有四种类型的dNTPs，但是为了非充分引物延伸反应，dNTPs中的一种，两种或三种类型是不同浓度的。

在另一个实施例中，在非充分引物延伸反应中提供有一种、两种或三种类型的核苷酸三磷酸单体。

在另一个实施例中，在非充分引物延伸反应中提供有非天然核苷酸三磷酸单体。

在另一个实施例中，当使用不止一种非充分引物时，反应中引物可以以不同的浓度提供。例如，较高浓度的引物将会进行非对称扩增。

在另一个实施例中,非充分引物或探针可以涂覆或链接在例如珠子表面或玻璃表面。对于扩增反应，或者正向引物，或者反向引物，或者正向和反向引物两者都可以附着在表面上。

在另一个实施例中，对于具有多对非充分引物的多重扩增，扩增产物可以通过微阵列、测序、磁珠或纳米球检测。一对非充分引物中的一个被连接到溶液中缀合有游离引物的表面。这种方法允许同步扩增以及PCR产物连接到表面上。可选地，两条引物都可以连接到表面以进行扩增。非充分引物或探针如何连接到表面的模式可以是模式化的或非模式化的，或随机分布的。

在另一个实施例中，扩增通过荧光掺入染料、荧光探针、检测标记标签、质谱标签、电镜、磁性标签或熔融曲线分析检测。

在另一个实施例中，一种非充分引物的5’端连接到人工寡核苷酸，人工寡核苷酸的熔融温度不同于由引物引导的扩增产物。基于从人工寡核苷酸的熔融峰值到扩增产物的熔融峰值的转变来监控扩增反应。通过将不同的引物连接到具有不同熔融温度的不同寡核苷酸，这种形式可以是多样的。在另一个实施例中，非充分引物5’端连接有人工序列，该人工序列可以形成茎环结构，其熔融温度不同于扩增子的熔融温度。在一些实施例中，通过双链嵌入染料的存在而进行熔融曲线分析。在另一个实施例中，荧光团和淬灭剂连接到5’端人工序列。在另一个实施例中，荧光团和淬灭剂连接到5’端人工序列的互补序列。在另一个实施例中，荧光团和淬灭剂分别连接到5’端人工序列以及5’端人工序列的互补序列。在另一个实施例中，非充分引物的5’端人工序列可以形成颈环结构。

在一些实施例中，在多重反应中，非充分引物5’端连接到不止一种类型的人工序列。反应中含有一种或不止一种类型的5’端人工序列的互补序列。在一些实施例中，5’端人工序列的不同互补序列连接有不同的荧光团和淬灭剂。在另一个实施例中，非充分引物上的多个5’端人工序列能够与5’端人工序列的常规互补序列形成双链。5’端人工序列通过仅仅一个或多个突变而不同。熔融峰值的消失指示其对应的目标物存在。

在另一个实施例中，在模板扩增反应中提供有标记有荧光团和淬灭剂的寡核苷酸。该寡核苷酸与扩增子上的链段互补。在扩增反应之后的熔融曲线分析中，寡核苷酸从结合中的扩增子上解离出来，其Tm处的熔融峰值指示模板的存在。在一些实施例中，反应中提供有具有不同Tm的多个寡核苷酸。在一些实施例中，与寡核苷酸杂交的扩增子上的链段含有突变，以改变Tm。在一些实施例中，反应中含有标记有不同荧光团的多个寡核苷酸，在多个通道进行熔融曲线分析，以增加多重性。

在另一个实施例中，一种非充分引物的5’端连接有荧光团标记的人工序列。反应中也提供有标记有淬灭剂的寡核苷酸。淬灭剂寡核苷酸与非充分引物杂交，荧光被淬灭。一旦模板扩增，非充分引物参与引物延伸，变成双链扩增子。淬灭剂寡核苷酸从引物上解离，荧光释放。

在另一个实施例中，一种非充分引物5’端连接到人工序列上，所述人工序列的3’端具有非充分核苷酸。反应中也提供有标记有荧光团和淬灭剂的寡核苷酸。寡核苷酸与引物上的人工序列杂交，杂交区域涵盖了非充分核苷酸。在扩增中，DNA聚合酶的5’核酸酶活性消化隔离荧光团和淬灭剂的寡核苷酸，从而释放荧光。延伸在非充分核苷酸处终止，且消化的寡核苷酸从其结合位点解离，使另一种未改变的寡核苷酸去杂交。该过程重复，信号被放大。

在另一个实施例中，对于具有多对非充分引物的多重扩增，带有人工序列的通用尾部连接到非充分引物的5’端。反应中也提供有通用检测探针，其由带有3’突出链段的双链DNA组成。通用探针的一条链上标记有荧光团，另一条链上标记有淬灭剂，使得探针在双链形式中是不发荧光的。所述3’突出链段含有与非充分引物上的通用尾部相同的序列。与通用尾部互补的合成序列与通用探针的3’突出链段杂交，延伸导致通用探针的双链分离，释放荧光。在一些实施例中，对于多重反应而言反应中提供有不止一种类型的通用尾部或通用探针。在一些实施例中，通用探针是具有3’突出的信号标(molecular beacon)。在另一个实施例中，荧光团连接到非充分引物上，反应中提供有插入淬灭剂化学剂的双链。在指数扩增中，液体淬灭剂插入扩增的双链产物，以淬灭用于实时监测的荧光标签。液体淬灭剂是不发荧光的化学剂，其与双链DNA相互作用，基本淬灭荧光标签。

在另一个实施例中，荧光团连接到非充分引物上，当连接的引物延伸形成双链时，其产生增强的荧光(点亮探针，light-up probe)。

在另一个实施例中，荧光团连接到非充分引物上，且一种类型的dNTP标记有不同的荧光团。实时荧光通过FRET检测。在一些实施例中，提供有荧光团标记的ddNTP。

在另一个实施例中，寡核苷酸模板可以连接到分析物上。例如，分析物可能是蛋白质或抗体。带有非充分引物的寡核苷酸模板的扩增指示分析物的存在。在一些实施例中，非充分引物或探针连接到分析物上。带有非充分引物或探针的扩增指示分析物的存在或不存在。

在另一个实施例中，当前发明用于突变检测。这些突变包括核苷酸插入、缺失、重排、转变、颠换、多态性和替换。

在另一个实施例中，当前发明提供了一种用于测序、重测序、基因表达监测、遗传多样性描述、诊断、筛选、全基因组测序、全基因组多态性发现和评估、转录组分析、或其他涉及核酸扩增或检测或测序的试剂盒。该试剂盒包括本文描述的任意非充分引物或引物对或探针以及用于特定应用的必需试剂。

在另一个实施例中，本发明提供了一种执行本发明方法的装置。该装置能够进行样品处理、非充分引物或探针混合、试剂混合、扩增和信号检测。

附图说明

图1显示了目标核酸、示例性的三核苷酸引物和引物结合位点。该图的上半部分显示了含有与反向引物结合位点(ATG位点)邻接的正向引物结合位点(ATC核苷酸)的互补序列的目标核酸的一条链。下半部分显示了结合到相对链上各自的结合位点的引物。扩增可以在dTTP、dATP和dGTP(和其他典型的PCR组分)的存在下进行，但是不需要dCTP，因为在扩增的目标核酸的链中没有G核苷酸。

图2A-B比较了常规四核苷酸类型引物(A)和三核苷酸引物(B)的短暂引物相互作用。

图3A-B比较了来自三核苷酸引物(A)与常规四核苷酸类型引物(B)的引物二聚体扩增的扩增产物。

图4A-B显示了与无模板对照(B)相比，利用三种核苷酸型引物和三种dNTP的人类基因组DNA(A)的实时PCR。

图5显示了其中引物结合位点对于三核苷酸型组成的引物存在三个错配(正向引物)或两个错配(反向引物)的模板。

图6显示了错配结合试剂的实例。

图7显示了其中三个核苷酸型引物结合位点被包含所有四核苷酸类型的链段分开的模板的扩增。扩增是在所有四核苷酸类型的单核苷酸三磷酸腺苷的存在下进行的。

图8A-C显示了使用三种核苷酸类型引物和所有四种dNTP进行的扩增随时间推移测得的荧光(A，B)和凝胶电泳(C)的情况。

图9比较了三核苷酸引物和四核苷酸引物之间的引物二聚体。

图10A-D显示了利用含有一个或两个单位的非充分核苷酸(G)引物的PCR。

图11A-C显示了利用非充分核苷酸的互补单核苷酸三磷酸(其浓度比其他三磷酸核苷类型要低)进行的扩增(A)，在模板存在下进行的扩增(B)以及没有模板存在下进行的扩增(C)。

图12显示了利用引物中的非充分核苷酸的互补单核苷酸三磷酸(以ddNTP的形式供应)进行的扩增。

图13A、B显示了通过熔解曲线分析进行多个模板的多重检测。

图14显示了三核苷酸类型引物的连接太短而不能自我引发扩增，产生toehold片段。

图15示出了另一种toehold形式。

图16显示当三核苷酸引物太短而不能支持自行扩增时使用三方接合(three wayjunction)结构。

图17A-B和18A-B显示了可选的三方接合(three way junction)形式。

图19显示多重扩增(multiplex amplification)和检测，其中三核苷酸型引物的5'末端连接到与荧光基团连接的人工链段。

图20A、B显示了模板扩增(A)和无模板对照(B)随时间推移测得的荧光。

图21A、B显示模板扩增(A)和无模板对照(B)随时间推移测得的荧光。

图22显示了具有过量的反向引物的不对称PCR。

图23示出了Taqman探针形式。

图24显示分子信号(molecular beacon)形式。

图25为使用具有通用荧光末端和淬灭剂的三核苷酸型引物的多重扩增(multiplex amplification)和检测。

图26为粘性末端产物的扩增和检测。

图27为循环产品的扩增和检测。

图28为使用三种核苷酸型引物进行的全基因组扩增。

图29为组合使用三种核苷酸引物和缺口扩增或转录介导的扩增。

图30为使用三种核苷酸型引物进行LAMP扩增或重组酶聚合酶扩增。

图31A、B、C：通过缺口机制(nicking mechanism)实现的等温扩增，转录介导的扩增或滚环扩增。

图32A和B显示了免疫PCR，其中目标核酸通过一种或多种抗体附着于分析物上。

图33显示了扩增反应，其中用第一荧光基团标记引物，扩增中使用的核苷酸三磷酸用第二荧光基团标记。扩增产物中荧光基团之间的能量转移产生信号。

图34显示了扩增反应，其中引物用荧光基团标记，扩增中使用的核苷酸三磷酸用淬灭剂标记。来自荧光基团的信号在扩增产物形成时淬灭，产生信号。

图35显示了扩增反应，其中用荧光基团标记引物，并将DNA插入剂引入到扩增混合物中。当扩增产物形成时，试剂嵌入扩增产物中，荧光基团的信号猝灭。

图36显示了扩增反应，其中引物用发光荧光基团标记。这样的荧光基团在引物中没有信号，但是当引物被并入到扩增产物中时，荧光基团插入扩增产物并产生信号。

图37显示了使用双链末端为非充分引物的多重扩增反应，和熔解曲线分析的检测方法。

图38A-E显示了特定末端的非充分引物及其部分互补链进行的多重扩增反应，以及采用5'翼(5’Flap)DNA聚合酶活性的检测方法。图38A显示了引物和用荧光基团和淬灭剂标记的互补寡核苷酸。图38B显示了延伸。图38C显示了通过5'翼(5’Flap)内切核酸酶活性从其寡核苷酸分离荧光团，从而产生荧光信号。图38D和E显示了另一个模板的延伸和切割。

图39A、B显示监测扩增反应的方法，其中在扩增反应中引物之一与人工寡核苷酸尾部连接，包括与标记有荧光团和淬灭剂标记的尾部互补的寡核苷酸。在扩增之前(A)，淬灭剂剂与荧光团相邻，信号弱。扩增后(B)，标记的寡核苷酸与互补引物尾部杂交，淬灭剂和荧光基团分离从而增强信号。

图40A、B显示监测扩增反应的方法，其中引物之一连接有包含淬灭剂和荧光团的人工寡核苷酸尾部。在扩增之前(A)，淬灭剂和荧光基团在空间上接近，所以信号弱。在扩增(B)之后，人工寡核苷酸与互补链形成双链，进一步分离荧光基团和淬灭剂，荧光信号增强。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中通常理解的相同的含义。以下定义对本领域的相关内容进行了补充，仅针对当前申请，不转嫁到任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管在本发明的实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。因此，这里使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，而不是限制性的。术语“一个”或“一个”实体是指一个或多个该实体；例如“核酸”代表一个或多个核酸。因此，术语“一”(或“一个”)，“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。

核酸包括DNA和RNA，DNA-RNA嵌合体可以是双链或单链的。DNA可以是基因组DNA、cDNA或合成DNA。RNA可以是mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等等。术语“核酸”涵盖了可以被认为是一串核苷酸的任何物理性单体单元，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA或RNA聚合物)、肽核酸(PNA)，修饰的寡核苷酸(例如，相对于生物RNA或DNA溶液，寡核苷酸包含有非典型碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化的寡核苷酸)等。核酸可以是例如单链或双链。

四种常规核苷酸碱基是A、T/U、C和G，T存在于DNA中，U存在于RNA中。发现的靶核苷酸通常是天然核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)。核苷酸形成引物也是这种情况。

核酸链的互补性意味着链的核碱基基团之间的氢键使之形成稳定的双链体。在DNA中，A与T为互补碱基，C与G为互补碱基，在RNA中，C与G为互补碱基和U与A为互补碱基。当核酸链最大限度地对齐，各链中的核苷酸形成上述任意一种配对(沃森-克里克配对(Watson-Crick pairings))时，各链中的核苷酸是互补的。当核酸链最大限度地对齐，而各链中的核苷酸不形成互补配对，则核苷酸错配。链的互补性可以是完美的或基本完美的。两条链之间的完美互补意味着两条链可以形成双链体，双链体中的每个碱基通过沃森-克里克配对(Watson-Crick pairings)连接到互补碱基上。基本上互补意味着大多数但不一定是全部碱基形成沃森-克里克配对(Watson-Crick pairings)从而在杂交条件(例如盐浓度和温度)下形成稳定的杂合复合物。例如，某些引物可以与引物结合位点形成双链体，尽管最多有1、2或3个错配位点，只要这种错配不在3'末端，优选不在3'末端附近(例如4个核苷酸内)即可。通过序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm值，或者通过使用常规方法依经验测定Tm。Tm是指在两条核酸链之间形成的杂交复合体其50％发生变性时的温度。温度低于Tm，有利于杂交复合物的形成，而温度高于Tm，则有利于杂交复合物中的链的熔解或分离。可通过使用例如Tm＝81.5+0.41(％G+C)-675/N-％错配来估计在1M NaCl水溶液中已知G+C含量的核酸的Tm值，其中N＝总碱基量。

错配意味着核酸的一条链中的核苷酸没有或不能通过沃森-克里克碱基配对与相对的互补核酸链中的核苷酸配对。错配的例子是但不限于AA、AG、AC、GG、CC、TT、TG、TC、UU、UG、UC和UT碱基对。DNA和DNA分子，DNA和RNA分子，RNA和RNA分子以及其他天然或人工核酸类似物之间皆可能发生错配。

错配结合剂或试剂是在非充分引物中的任何分子或任何修饰，其可以通过化学相互作用或物理相互作用来稳定非充分引物结合位点与非充分引物的杂交。非充分引物的修饰可以以任何方式进行，只要给定的修饰与给定的非充分引物的期望功能相容，这可以很容易地确定。修饰包括碱基修饰、糖修饰或骨架修饰。一些小分子可以通过氢键与不匹配的碱基结合，推测这些小分子与未配对碱基中的氢键是互补的，以此稳定双链体且具有较高的碱基选择性。已知金属离子与核酸相互作用以形成结构并折叠。Ono A.,Togashi H.(Ono&Togashi,2004,AngewandteChemie(International Ed.in English),43(33),4300–4302)证实在溶液中加入汞离子会增加T-T错配，DNA双链体Tm提高了5℃。Torigoe H.、Okamoto I.等(Torigoe et al.,2012,Biochimie,94(11),2431–2440)证实了阴离子选择性地结合并稳定C-C错配。一系类可高选择性地识别错配位点的铑复合物由Cordier C.、Pierre V.C.等设计并合成(Cordier,Pierre,&Barton,2007,Journal of the AmericanChemical Society,129(40),12287–12295).Nakatani K.、Sando S.等(Nakatani,Sando,Kumasawa,Kikuchi,&Saito,2001,Journal of the American Chemical Society,123(50),12650–12657)开发出一系列以萘啶为基础的小分子，可选择性地识别错配的DNA。

杂交或退火条件包括含有核酸的水相或有机相溶液的化学成分和其浓度(例如盐、螯合剂、甲酰胺)，以及混合物的温度，其中第一条核酸链与第二条核酸链通过互补链相互作用结合而产生杂交复合物。

样品是可存在一种或多种目的目标核酸的组合物，包括患者样品、植物或动物材料、废物材料、用于法医分析的材料、环境样品、循环肿瘤细胞(CTC)、细胞游离DNA和液体活体组织切片等。样品包括源自活体或死亡生物体中可能含有目标核酸的任何组织、细胞或提取物，例如外周血、骨髓、血浆、血清，以及包括淋巴结、呼吸组织或分泌物、胃肠组织在内的活检组织，还有尿液、粪便、精液或其他体液。目标样品来自患有或怀疑患有疾病或病症，特别出现病毒感染的人或动物的组织样品(包括体液)。其他目标样品包括工业样品，例如用于水测试，食品测试，污染控制等的样品。样品成分可以包含靶标和非靶标核酸，以及其他材料，例如盐、酸、碱、去污剂、蛋白质、碳水化合物、脂质和其他有机或无机材料。在扩增之前，样品可以或不可以经过处理来纯化目标核酸。进一步的处理可以使用去污剂或变性剂，让核酸从细胞或病毒中释放出来，去除或灭活非核酸成分并浓缩核酸。

目标核酸是指样品中存在或可以存在的核酸分子或相关核酸分子群体。目标核酸包括由引物结合位点定义的待扩增的片段。该片段可以是整个核酸或其任何长度可扩增的片段。例如，目标核酸可以是完整的染色体、基因或cDNA，目标链段可以是例如上述物质中的40-500个核苷酸。目标片段可以存在于该结构的任何链(有义或反义)上。目标核酸可以是RNA(例如，病毒RNA、微小RNA、mRNA、cRNA、rRNA、hnRNA或DNA(基因组或cDNA)等)。

目标核酸可以来自病原微生物，例如病毒、细菌或真菌，或是患者内源的。病毒核酸(例如基因组，mRNA)形成分析病毒序列的有用靶标。可以检测的病毒的一些例子包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV和EB病毒)、腺病毒、XMRV、流感病毒、虫媒病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、MLV相关病毒、乳头瘤病毒、软体动物病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病脑炎病毒。这些细菌的实例包括衣原体、立克次氏体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、特雷西克菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和圆球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、瘟疫、细螺旋体病、莱姆病病菌、链球菌或奈瑟氏菌。rRNA是用于细菌分型的特别有效的目标核酸。人或动物基因的检测对于检测疾病的存在或易感性是有效的。可以作为检测对象的基因的实例包括BRACA-1或BRAC-2、p53、CFTR、细胞色素P450(例如，法医鉴定、亲子鉴定、纯合基因的杂合载体、HLA分型)，用于基因分型、确定个体药物疗效(例如伴随诊断)和其他用途。

非充分核苷酸类型是在引物或引物结合位点或引物和引物结合位点两者中不超过20％的位点存在的核苷酸类型。通常，引物具有A、G、C、T或A、G、C、U的核苷酸组成。引物可以包括非天然核苷酸，例如Iso C和Iso G，去氮G或去氮A。在确定非充分核苷酸的数量或百分比时，与标准核苷酸的计算方式相同。如果类似物与其他天然核苷酸具有相同的相对配对亲和力，则该类似物与天然核苷酸相对应。因此，去氮G或肌苷是G的类似物，因为它们与C的配对性比任何其他天然核苷酸都强。例如，如果G是非充分核苷酸类型，为了确定引物中非充分核苷酸类型的百分比，去氮G被包含在分子(以及分母)中，而去氮A仅在分母中。因此，在含有一个G和一个去氮G的核苷酸总数为20个的引物中，非充分核苷酸的百分比是10％。通常，非充分核苷酸类型在每个引物的内部位置以0、1或2个单位存在，可选地，在5'末端位置1个单位，在每个引物结合位点以0、1、2、3或4个单位存在，在人工序列中为0个单位。理想情况下，有且仅有一个单位的非充分核苷酸类型位于5'末端位置。如果四种核苷酸类型中有且仅有一种是非充分的，则该非充分核苷酸在四种标准核苷酸类型中代表性最低(包括没有代表性)。如果引物含有简并位置，如果简并性包括非充分核苷酸类型，则该位置被计为非充分核苷酸类型位置(即在分子以及分母中)，否则仅在分母中。不能与天然核苷酸类型优先结合的核苷酸类似物采用与简并位点相同的处理。含有非充分核苷酸类型的引物被称为非充分引物。含有非充分核苷酸类型的探针称为非充分探针。

术语“dNTP”通常是指含有三磷酸盐形式的磷酸盐，糖和有机碱的脱氧核苷酸的个体或组合，其被提供用于DNA合成的DNA聚合酶所需的前体。dNTP混合物可以包括每个天然存在的脱氧核苷酸(即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))。在一些实施例中，每个天然存在的脱氧核苷酸可被替换或补充有合成类似物；如肌苷、Iso G、Iso C、脱氮G、脱氮A等等。当核苷酸在引物或探针中代表性不足时，核苷酸被称为非充分核苷酸。非充分核苷酸可以作为脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸或核糖核苷酸的形式包含在反应体系中。它们的补体称为非充分核苷酸的互补核苷酸。术语“ddNTP”通常是指含有三磷酸盐形式的磷酸盐，糖和有机碱的双脱氧核苷酸的个体或组合，其为DNA合成提供DNA聚合酶所需的前体。ddNTP混合物可以包括每个天然存在的双脱氧核苷酸(即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))。在一些实施例中，每个天然存在的双脱氧核苷酸可被替换或辅以合成类似物；如肌苷、iso G、IsoC、去氮G、去氮A等等。术语“NTP”通常是指含有三磷酸盐形式的磷酸盐，糖和有机碱的核糖核苷酸的个体或组合，其被提供用于RNA合成的RNA聚合酶所需的前体。NTP混合物可以包括每个天然存在的核糖核苷酸(即，腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))。在一些实施例中，每个天然存在的核糖核苷酸可被替换或辅以合成类似物；如肌苷、iso G、Iso C、去氮G、去氮A等等。

引物结合位点或探针结合位点可与本发明中非充分引物结合位点或非充分探针结合位点互换。引物结合位点是与引物杂交的目标核酸中的完整或部分位点。可以提供包含部分引物结合位点的立足点序列和连接序列，添加到部分位点中。来自立足点或连接序列的部分结合位点可以与目标核酸上的部分引物结合位点结合，以形成完整的引物结合位点。

术语“引物”或“探针”可与本发明中非充分引物或非充分探针互换。引物或探针是与由目标核酸全部或部分的引物或探针结合位点互补的寡核苷酸。引物或探针可以在其5'端与另一个在目标核酸中不存在或互补的核酸(有时称为尾部)连接。5'尾部可以有一个人工序列。对于与引物或探针结合位点完全互补的引物或探针，引物或探针与尾部之间的分界线是显而易见的，因为尾部从遇到的第一个非互补核苷酸开始，从引物或探针的3'末端移动。对于与引物结合位点基本互补的引物，引物的最后一个核苷酸是与引物结合位点互补的最后一个核苷酸，所述引物结合位点远离引物的3'末端，这有助于引物与目标核酸的结合(即，具有此5'核苷酸的引物相比不具有5'核苷酸的引物具有更高的目标核酸TM)。引物中的核苷酸与引发结合位点之间是否存在互补性由沃森-克里克配对(Watson-Crickpairing)决定，或不取决于各个序列最大对齐。

引物或探针是寡核苷酸。术语“寡核苷酸”包括单数“寡核苷酸”以及复数“寡核苷酸”，并且是指在本发明的扩增方法以及随后的检测方法中用作试剂的核苷酸、核苷、核碱基或相关化合物中的两种或更多种的任何聚合物。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或其类似物和/或DNA RNA嵌合体。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能，而是一般用于涵盖本文所述的所有这些试剂。寡核苷酸可以用作不同的用途，例如，如果其能够与互补链杂交并且可以在核酸聚合酶存在下进一步延伸，则它可以用作引物，如果它含有序列由RNA聚合酶识别并且允许转录，其可包含用于信号生成/扩增的检测试剂，并且如果适当地定位和/或修饰，其可用于防止杂交或妨碍引物延伸。下面更详细地描述本发明的特定寡核苷酸。如本文所用，寡核苷酸实际上可以是任何长度，仅受限于其在扩增反应中的特定功能或检测扩增反应的扩增产物。序列和化学结构确定的寡核苷酸可以通过常规技术例如通过化学或生物化学合成，以及通过重组核酸分子例如细菌或病毒载体的体外或体内表达来产生。如本公开所预期的，寡核苷酸不仅仅由野生型染色体DNA或其体内转录产物组成。寡核苷酸可以以任何方式修饰，只要给定的修饰与给定的寡核苷酸的所需功能相容，这可以容易地确定。修饰包括碱基修饰，糖修饰或骨架修饰。碱基修饰包括但不限于使用腺嘌呤、胞苷、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的碱基：C-5丙炔、2-氨基腺嘌呤、5-甲基胞苷、肌苷和dP和dK碱基。核苷亚基的糖基团可以是核糖、脱氧核糖及其类似物，包括例如对呋喃核糖基部分进行2'-O-甲基(2′-O-ME)取代的核糖核苷。参见Method for Amplifying Target NucleicAcids Using Modified Primers,”(Becker,Majlessi,&Brentano,2000,U.S.Pat.No.6,130,038)。其他糖修饰包括但不限于2'-氨基、2'-氟、(L)-α-呋喃苏糖基和戊基蔗糖基修饰。核苷亚基可以通过连接如磷酸二酯键，修饰的连接或通过不阻止寡核苷酸与其互补的目标核酸序列杂交的非核苷酸部分连接。修饰的键包括其中标准的磷酸二酯键被不同的键(如硫代磷酸酯键或甲基膦酸酯键)替代的键。例如，核碱基亚单位可以通过用假肽主链例如2-氨乙基甘氨酸(2-aminoethylglycine)主链代替DNA的天然脱氧核糖磷酸主链，所述假肽主链通过羧甲基接头将核碱基亚单元偶联到中心仲胺上。(具有假肽骨架的DNA类似物通常被称为“肽核酸”或“PNA”，并由Nielsen等人公开(Nielsen,Buchardt,Egholm,&Berg,1996,U.S.Pat.No.5,539,082)。其它连接修饰包括但不限于吗啉代键。本发明考虑的寡核苷酸或寡聚体的非限制性实例包括，含有双环和三环核苷和核苷酸类似物(LNA)的核酸类似物。参见Imanishi等人的“Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues,”(Imanishi&Obika,2001,U.S.Pat.No.6,268,490)和Wengel等人的“OligonucleotideAnalogues,”(Wengel&Nielsen,2003,U.S.Pat.No.6,670,461)。本发明涵盖了任何核酸类似物，条件是修饰的寡核苷酸可以执行其预期功能，例如在严格杂交条件或扩增条件下，与目标核酸杂交或与DNA或RNA聚合酶相互作用，从而启动延伸或转录。在检测探针的情况下，修饰的寡核苷酸还必须能够在严格杂交条件下优先与目标核酸杂交。如下所述，寡核苷酸(或其他核酸)的3'末端可以使用封闭部分以各种方式封闭。通过DNA或RNA依赖性DNA聚合酶向其3'末端添加核苷酸以产生DNA的互补链，“封闭的”寡核苷酸不能有效地延伸。这样，“封闭的”寡核苷酸不能成为“引物”。

术语“简并引物”是指在不同位置具有不同碱基的相似引物的混合物(Mitsuhashi,J.Clin.Lab.Anal.,10(5):285 93(1996)；von Eggeling et al.,Cell.Mol.Biol.,41(5):653 70(1995)、(Zhang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5847 5851(1992)；Telenius et al.,Genomics,13(3):718 25(1992))。这些引物可以包括肌苷，因为肌苷能够与腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸苷碱基配对，简并引物允许退火和扩增各种靶序列，从靶DNA上退火的简并引物可以作为进一步扩增的引发位点，简并区域是引物变化的区域，而引物的其余部分可以保持不变，简并引物(或区域)表示一个以上的引物，且可以是随机的，随机引物(或多个区域)表示该序列未被选择，并且可以是简并的但不是必须的。在一些实施例中3'靶标特异性区域具有约5℃到50℃之间的Tm。在一些实施例中，15聚体(15-mer)具有小于约60℃的Tm。

引物3'链段，或3'结合区域，或3'结合位点，或3'杂交区域能够以特定频率结合基因组中出现的基因组序列。在一些实施例中，该频率在约0.01％到2.0％之间，例如在约0.05％到0.1％之间，或在约0.1％到0.5％之间。在一些实施例中，引物“结合位点”的长度主要取决于基于生物信息学计算预测的PCR产物的平均长度。该定义包括但不限于长度在约4到12个碱基之间的“结合区域”。在更具体的实施例中，3'结合区的长度可以是，例如约4到20个碱基，或约8到15个碱基。具有在约10℃到60℃之间的Tm的结合区域。这些都包含在定义中。术语“引物结合链段”在本文中使用时是指特定序列的引物。

术语“随机或随机区”是指能够在一组靶序列中的未指定位点(例如在基因组中)退火的寡核苷酸引物的区域。如本文所用的术语“随机引物”是指可包含3'链段靶特异性结合区和5'链段人工序列的引物。“随机区域”便于引物与靶DNA的结合，以及PCR扩增中使用的聚合酶与引物和靶DNA之间形成的双链体的结合。随机区核苷酸可以是简并或非特异性的，混合的核碱基或核碱基类似物。除此之外，寡核苷酸引物“随机区域”的长度取决于特定区域的长度。在某些实施例中，但并不限于此，“随机区”的长度在约2至15个碱基之间，约4至12个碱基之间，或约4至6个碱基之间。在另一个实施例中，组合的特定区和随机区的长度约为9个碱基，例如，如果特定区域具有4个碱基，那么随机区域将具有5个碱基。

在一些实施例中，引物3'链段包含特定区域和随机区域，或包含特定区域和简并区域。在其他实施例中，3'链段包含特定区域，还包含随机区域或简并区域。在其他实施例中，靶引物的3'链段仅包含特定区域，随机区域或简并区域。当然，也可以使用已知的区域(序列已知)或这里公开的选项的一部分。

聚合酶是可使与模板杂交的引物沿模板定向延伸的酶。它可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶。DNA聚合酶的实例包括：大肠杆菌DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶、肺炎链球菌DNA聚合酶I、Tfl DNA聚合酶、耐辐射奇球菌DNA聚合酶I、Tth DNA聚合酶、Tth XL DNA聚合酶、结核分枝杆菌DNA聚合酶I、M.thermotrophrophicum DNA聚合酶I、单纯疱疹病毒-IDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、热亲核酶或野生型或修饰的T7DNA聚合酶、Φ29聚合酶、Bst聚合酶、Vent聚合酶、9Nm聚合酶、DNA聚合酶I Klenow片段。逆转录酶的实例：AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶、HIV逆转录酶。RNA聚合酶的实例包括：T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶，细菌RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶。

扩增是指通过模板定向延伸引物(靶标扩增)或扩增检测信号以定性/定量测量(信号放大)，或两者，来产生目标核酸的额外拷贝或全部或部分拷贝。扩增可以在温度循环或等温或其组合的条件下进行。扩增可以是线性或指数的。

许多众所周知的核酸靶扩增方法需要热循环来交替地变性双链核酸并杂交引物，然而，还有一些广为人知的核酸扩增方法是等温的。通常称为PCR(Mullis,1987U.S.PatentNo.4,683,202；Saiki et al.,1985,Science(New York,N.Y.),230(4732),1350–1354)的聚合酶链式反应使用多个变性循环，退火将引物结合至另一条链，引物延伸以指数方式增加靶序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变体中，使用逆转录酶(RT)从mRNA制备互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝(Gelfand et al.,“ReverseTranscription with Thermostable DNA Polymerases—High Temperature ReverseTranscription,”(Gelfand,1994,U.S.Pat.Nos.5,322,770；Gelfand&Myers,1994,U.S.Pat.Nos.5,310,652)。另一种核酸扩增的方法叫做LCR(ligase chain reaction,Laffler,Carrino,&Marshall,1993,Annales De Biologie Clinique,51(9),821–826).LCR(Laffler et al.,1993,Annales De Biologie Clinique,51(9),821–826)反应基于其中两个相邻探针与靶序列杂交，并通过连接酶相互连接，两种探针在靶核苷酸序列不存在时不能连接，因此连接产物的存在对于靶核苷酸序列具有指示性。LCR方法也需要控制从模板分离互补链的温度。另一种方法是链置换扩增(George T.Walker,Little,&Nadeau,1993,U.S.Pat.No.5,270,184；George T.Walker,1995,U.S.Pat.No.5,455,166；G.T.Walker et al.,1992,Nucleic Acids Research,20(7),1691–1696,1992,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,89(1),392–396)，通常称为SDA，其可退火将引物序列引入靶序列的另一条链，在dNTP的存在下引物延伸以产生双链体硫代磷酸酯化的引物延伸产物，核酸内切酶在半修饰的限制性内切核酸酶识别位点介导产生缺口，以及聚合酶从该缺口的3'端介导引物延伸，以取代现有的链并产生用于下一轮引物退火、切割和链置换的链，使得产物几何式扩增。嗜热性SDA(tSDA)以基本上相同的方法在较高温度下使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(Fraiser,Spargo,Van,Walker,&Wright,2002,European Pat.No.0 684 315)。其他扩增方法包括：基于核酸序列的扩增(Compton,1991,Nature,350(6313),91–92,Malek,Davey,Henderson,&Sooknanan,1992)，通常称为NASBA；一种使用RNA复制酶来扩增探针分子本身(Lizardi,Guerra,Lomeli,Tussie-Luna,&Russell Kramer,1988,Nature Biotechnology,6(10),1197–1202)，通常称为Qβ复制物；基于转录的扩增方法(Kwoh et al.,1989,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,86(4),1173–1177)；自动维持序列扩增(3SR)(Guatelli et al.,1990,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,87(5),1874–1878；Landgren(1993)Trends in Genetics 9,199-202；and Lee,H.et al.,NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES(1997))；还有转录介导的扩增(Kwoh et al.,1989,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,86(4),1173–1177；Kacian&Fultz,1995,U.S.Pat.No.5,480,784；Kacian&Fultz,1996,U.S.Pat.No.5,399,491)通常称为TMA。关于已知扩增方法的进一步讨论参见Persing,David H.,1993,“In Vitro Nucleic Acid AmplificationTechniques”in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persing et al.,Eds.),pp.51-87(American Society for Microbiology,Washington,D.C.)。适用于本发明的其他说明性扩增方法还包括滚环扩增(RCA)(Fire&Xu,1995,Proceedings of the National Academy of Sciences,92(10),4641–4645；Lizardi,1998,U.S.Pat.No.5,854,033)；使用尼克剂的核酸扩增(Van Ness,Galas,&Van Ness,2006,U.S.Pat.No.7,112,423)；缺口延伸扩增反应(NEAR(Maples et al.,2009,US 2009-0017453 A1)；解链酶依赖扩增技术(HDA)(Kong,Vincent,&Xu,2004,US 2004-0058378 A1；Kong,Vincent,&Xu,2007US pat.US2007/0254304A1)；环介导等温扩增(LAMP)(Notomi&Hase,2002,U.S.Pat.No.6,410,278)；四重启动扩增(Quadruplex primingamplification，QPA)(Analyst，2014,139,1644-1652)。指数扩增(PNAS April 15,2003100,4504–4509)。交叉引发扩增(Sci Rep.2012；2：246)。SMAP扩增(Nature Methods 04/2007；4(3)：257-62)。多重置换扩增(MDA，Proceedings of the National Academy ofSciences 2005,102(48)：17332-6)，重组酶聚合酶扩增(Journal of Clinical Virology54(4)：308-12)。单引物等温扩增(SPIA)(clinical chemistry，2005vol.51no.10 1973-1981)。

扩增的另一个方面是信号放大。当得到足量待检的核酸时，相对于制备更多该靶标的拷贝，直接检测该序列更有利(例如，在PCR和LCR中)。传统的直接检测方法包括Northern印迹法、Southern印迹法和核糖核苷酸酶保护实验(RNase protection assays)，通常需要使用放射性且不适合自动化。其他技术已经试图消除放射性和/或提高可自动化程式的灵敏度。循环探针反应(CPR)(Duck,Alvarado-Urbina,Burdick,&Collier,1990b,BioTechniques,9(2),142–148))使用长嵌合寡核苷酸，其中中央部分由RNA组成，末端由DNA组成。探针与靶DNA杂交并暴露于热稳定的RNA酶H导致RNA部分被酶解。这使双链体的剩余DNA部分不稳定，从靶DNA释放剩余的探针并允许另一个探针分子重复该过程。由Urdeaet al.,1987,Gene,61(3),253-264描述的分枝DNA(bDNA)包括具有允许每个单个寡核苷酸携带35-40个标记(例如碱性磷酸酶)的分支结构的寡核苷酸。虽然这增强了来自杂交事件的信号，但来自非特异性结合的信号也同样增加。其他信号扩增包括：核酸的侵入性切割(Invasive Cleavage)(Prudent,Hall,Lyamichev,Brow,&Dahlberg,2006,U.S.Pat.No.7,011,944)、杂交链式反应(HCR)((R.M.Dirks&Pierce,2004,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,101(43),15275–15278,R.Dirks&Pierce,2012,U.S.Pat.No.8,105,778)和基于G四链体(G-quadruplex)脱氧核酶的比色检测。CHA扩增(J.Am.Chem.Soc.,2013,135(20),pp7430–7433)。SMART信号放大(Biotechniques 2002Mar；32(3):604-6,608-11)。

可以定性检测扩增产物(即相对于对照的阳性信号)或定量检测(信号强度与扩增产物带来的分析物的绝对量或相对量有关)。检测可以包括例如扩增产物测序的进一步分析，但这不是必需的。本发明提供的方法还可以包括直接检测捕获反应产物或扩增反应产物(例如特定靶扩增子或扩增子组)中的特定核酸。因此，本发明的混合物可以包含专门的探针组，包括TAQMAN^TM，其使用含有可检测的报道分子和猝灭基团的可水解探针，该探针可以被具有5'→3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶释放(Livak,Flood,&Marmaro,1996,U.S.Pat.No.5,538,848)；分子信标，其使用在两端分别具有报道分子和淬灭基团的发夹探针(Tyagi，Kramer，&Lizardi，1999,U.S.Pat.No.5,925,517)；荧光共振能量转移(FRET引物，其使用分别具有荧光供体和受体基团的一对相邻引物(Wittwer,Ririe,&Rasmussen,2001,U.S.Pat.No.6,174,670)；和LIGHTUP^TM，一种仅在结合靶标时发荧光的短探针(Kubista&Svanvik,2001,U.S.Pat.No.6,329,144)。类似地，SCORPION^TM(Whitcombe,Theaker,Gibson,&Little,2001,U.S.Pat.No.6,326,145)和SIMPLEPROBES^TM(Wittwer etal,2003,U.S.Pat.No.6,635,427)使用单个报道分子/染料探针。扩增子检测探针可以根据所使用的特定检测模式来设计，并且如上面引用的专利中所讨论的那样。其他检测方法包括：凝胶电泳、质谱或毛细管电泳、熔解曲线、基于核酸的荧光螯合染料如SYBR green，或使用荧光标记和可溶性淬灭剂检测扩增产物((Will,Gupta,&Geyer,2014,U.S.Patent No.8,658,366)。

术语“多重扩增”是指超过一种目的核酸的扩增。例如，它可以指来自相同样品的多个序列的扩增或样品中几个序列之一的扩增，例如在George T.Walker,Nadeau,&Little,1995U.S.Pat.Nos.5,422,252和George T.Walker,Nadeau,Spears,et al.,1995,U.S.Pat.Nos.5,470,723中提供了多重链置换扩增的实例。该术语还指同时或以逐步方式扩增存在于多个样品中的一个或多个序列。

实时扩增是指当反应进行时监控反应产物(即扩增子)的量的扩增反应。实时扩增的形式主要在用于监测反应产物的检测机制上有所不同。在Mackay,Arden,&Nitsche,2002,Nucleic Acids Research,30(6),1292–1305中综述了检测方法，通过引用将其并入本文。

术语“检测标记”是指可以用于提供或帮助提供可检测(优选可定量)的信号并且可以连接至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标签可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量、磁性、酶活性等检测的信号。检测标记可以以多种方式掺入：(1)引物中包含标记，例如连接至核酸类似物中的碱基、核糖、磷酸盐或类似结构；(2)核苷酸三磷酸在碱基或核糖(或核酸类似物中的类似结构)上用标记修饰；然后用延伸酶如聚合酶将标记修饰的核苷酸掺入新合成的链中；(3)使用修饰的核苷酸，其包含可用(于酶促反应后)以添加可检测标记的官能团；(4)使用包含可用于以类似方式添加可检测标记的官能团的修饰引物；(5)可以使用直接标记并与扩增子的一部分杂交的标记探针；(6)可以掺入扩增产物的标签；(7)可以与扩增反应的副产物反应的标签。

术语“热循环”(thermally cycling,thermal cycling,thermal cycles orthermal cycle)是指温度变化的重复循环，温度从完全变性温度到退火(或杂交)温度到延伸温度又回到完全变性温度。这些术语还涉及变性温度和延伸温度的重复循环，其中退火和延伸温度被组合成一个温度。完全变性温度将所有双链片段解链成单链。退火温度允许引物与核酸模板的分离链的互补序列杂交或退火。延伸温度允许合成扩增子的新生DNA链。

术语“反应混合物”、“扩增混合物”“PCR混合物”是指从核酸模板扩增至少一个扩增子所必需的组分的混合物。混合物可以包含核苷酸(dNTP)、热稳定聚合酶、引物和多个核酸模板。该混合物可以进一步包含Tris缓冲液、单价盐和Mg²⁺。每种组分的浓度在本领域中为公知且可进一步优化。

术语“扩增产物”或“扩增子”是指在诸如PCR的扩增方法中使用一对引物通过聚合酶扩增的DNA片段。

“荧光团”是指在限定的激发波长下吸收光能并且以不同的限定波长发射光能的部分。

“淬灭剂”包括当其位于荧光标签附近时能够吸收激发态荧光标签的能量并且能够耗散该能量的任何基团。淬灭剂可以是荧光淬灭剂或非荧光淬灭剂，非荧光淬灭剂也被称为暗淬灭剂(dark quencher)。上述的荧光基团在接近另一荧光基团时可以起到猝灭的作用，其中可以发生FRET猝灭或接触猝灭。使用不发射任何可见光的暗猝灭是优选的。暗淬灭剂的实例包括但不限于DABCYL(4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯(DABCYL(4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoic acid)succinimidyl ester)、二芳基罗丹明羧酸(diarylrhodamine carboxylic acid)、琥珀酰亚胺酯(QSY-7)和4'，5'-二硝基荧光素羧酸(4′,5′-dinitrofluorescein carboxylic acid)、琥珀酰亚胺酯(QSY-33)、quencherl或“黑洞淬灭剂”(BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3)、核苷酸类似物、核苷酸G残基、纳米颗粒和金颗粒。

术语“突变”是指目标核酸序列中的一种或多种核苷酸，其与指定为野生型的目标核酸的原型不同。被指定为野生型的序列是序列最常见的等位基因形式、序列的首次发现形式和/或与正常(非患病表型)相关的序列形式。单核苷酸多态性(SNP)是突变的一种形式。

术语“表面”是指可与核酸共价连接的任何固体表面，例如乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅晶片。优选地，固体支持物是玻璃表面。

如本文所用的术语“连接到表面”(attached to surface)是指包括化学可修饰的官能团的任何化学或非化学连接方法。“连接”(attachment)涉及通过共价连接或不可逆连接或分子之间的亲和力(例如，通过生物素化分子固定在抗生物素蛋白包被的表面)将核酸固定在固体支持物上。连接必须具有足够的强度，其在DNA变性条件下不能被水或缓冲水溶液洗脱。

粘性末端是与核酸的双链片段相邻的核酸的单链末端。具有互补序列的末端的核酸可以通过粘性末端退火并相互连接。

人工序列是与样品中已知或怀疑可能存在的天然目标核酸缺乏互补性或至少无意具有互补性的序列。除了其他目的之外，人工序列可以用作连接与目标核酸杂交的片段的接头，或用作标记引物的尾部。

具体实施方式

I.综述

本发明提供了利用有限核苷酸组成的单个引物或一对正向和反向引物的扩增的方法。有限的核苷酸组成意味着引物在至少一种核苷酸类型中是非充分的。这样的引物大大降低引物间相互引发，或者大大降低在目标核酸的靶引物结合位点以外的地方错引而引起的延伸。使用这样的引物进行靶特异性扩增需要鉴定支持引物结合和扩增的目标核酸中的引物结合位点。在一些目标核酸中，可以鉴定与有限核苷酸组成的引物具有完全互补性的引物结合位点。更常见的是，目标核酸中有限的核苷酸组成的片段本身太短而不能充当引物结合位点。然而，这样的位点可以适应于通过下面描述的多种技术用有限的核苷酸组成的引物进行扩增，包括使用辅助toehold或连接寡核苷酸，与引物结合位点具有错配杂交的引物，错配稳定剂和有限数量的存在于引物中的非充分核苷酸。所公开的发明包括可以将非充分引物杂交至非充分引物结合位点的效率提高的方法。本发明的方法可用于多种扩增形式，如PCR、TMA、连接酶链式反应、NEAR、LAMP、RPA、EXPAR等，并具有多种检测形式。该方法也可以是多重的，以同时检测多个目标核酸。

II.引物设计

a.基本原则

本方法始于有限核苷酸组成的引物的基本概念，有限核苷酸组成的引物的中一个或多个核苷酸类型是非充分的(例如A、T、C和G)，然后在与该组成(例如，A，T和G)引物配对的目标核酸内选择最佳引物结合位点。根据选择的引物结合位点，可以进一步调整引物的核苷酸组成(例如，通过允许有限数量单位的非充分核苷酸)来改善与引物结合位点的互补性。

优选的引物设计是四种标准核苷酸类型中有且仅有一种在正向和反向引物中均是不充分的。换句话说，这样的引物可以由A、T/U和C组成，其中G是非充分的，A、T/U、G，其中C是非充分的，A、G和C，其中T是非充分的，或者T、G和C，其中A是非充分的。非充分核苷酸类型优选为G或C。如果引物中存非充分核苷酸类型，则其优选位于除3’核苷酸以外的位置，最优选为5'核苷酸或连接到引物的5'核苷酸的5'尾部核苷酸。包含5'非充分核苷酸增加了引物结合的解链温度(TM)，而不会增加非预期的扩增产物中的解链温度。

引物的3'核苷酸优选被非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型占据。例如，如果非充分核苷酸类型是G，则3'核苷酸优选为C，反之亦然。末端C或G抑制引物二聚体延伸，因为引物上没有互补碱基与之配对。一种核苷酸类型的消除或非充分基本上限制了引物之间或引物和错配的引物结合位点之间形成沃森-克里克配对的核苷酸的数量。引物的3'核苷酸的正确碱基配对对于支持模板依赖性延伸是最重要的。在这个位置使用非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型大大减少了引物二聚体和引物错配延伸。

引物设计的其他特征与常规引物类似。引物具有与其引物结合位点互补的序列。一些引物长至少15、20、25、30、35或40个核苷酸。一些引物长度不超过25、30、40、50或75个核苷酸。引物可以在更长的长度或更短的长度上进行任何变换，例如从15-50个核苷酸到20-30或30-40个核苷酸。引物与其引物结合位点的解链温度可以是，例如45-80℃，或优选55-65℃。按照惯例，对于结合相反链的引物，其中一条是编码链，正向引物与非编码链互补，所以延伸产物是编码链，反向引物与编码链互补，所以延伸产物是非编码链。对于不具有编码链和非编码链的目标核酸，正向和反向引物的命名是任意的。当正向和反向引物与同一链上的引物结合位点结合时也是如此。引物可以具有与目标核酸不互补的5'尾。这样的尾部可以用于连接荧光基团或淬灭剂，或者可以包含识别码，或者可以连接与其目标核酸互补的引物的不连续链段。

就缓冲液、Mg²⁺、酶、温度等而言，扩增条件通常与常规引物类似。常规扩增是在所有四种标准核苷酸类型作为dNTP单体存在时进行的。可以用由有限核苷酸组成的引物进行扩增，但是也可以在非充分核苷酸类型的互补核苷酸不存在或以降低的浓度存在或以以ddNTP的形式提供的情况下进行，见下文进一步描述。

正向和反向引物通常但不总是结合目标核酸的相反链。因此，目标核酸的一条链含有例如正向引物结合位点或反向引物结合位点的互补序列，另一条链含有例如正向引物结合位点或反向引物结合位点的互补序列。在某些形式中，正向和反向引物结合位点在同一条链上。例如，连接的正向和反向引物可以结合到同一链上的结合位点并通过滚环机制扩增。一些方结合引物(three way junction primer)对也可以结合到相同核酸链上的位点，使得一个引物作为另一个的模板。

通过引物设计的原则可在目标核酸中寻找合适的引物结合位点，因为引物结合位点应该与引物互补。例如，为了使用单核苷酸类型非充分引物，可以在目标核酸中搜索正向引物结合位点和反向引物结合位点，所述正向引物结合位点和反向引物结合位点在引物中的非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型中是非充分的。优选地，鉴定了不存在非充分核苷酸类型的互补核苷酸的正向引物结合位点和反向引物结合位点。然而，如果不能找到这样的位点，则仍然可以使用其他的引物结合位点，优选非充分核苷酸类型的互补核苷酸数目最小化的那些引物结合位点。通常，引物中的非充分核苷酸类型的互补核苷酸本身在引物结合位点中是非充分的，但这不是必需的。一些正向和反向引物结合位点各自具有不超过4、3、2或1个单位的引物中的非充分核苷酸类型的互补核苷酸。

对于ATC引物，可以使用软件来分别寻找代表正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列的连续或邻近的ATC和ATG区域。为了使用ATG引物，软件可以分别寻找分正向引物结合位点和反向引物结合位点互补的ATG和ATC区域。为了使用CGA引物，软件可以分别寻找代表正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列的CGA和CGT区域。为了使用CGT引物，软件可以分别寻找正向引物结合位点和反向引物结合位点互补的CGT和CGA区域。

正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列(或正向引物结合位点本身，如果在与反向引物位于同一条链上的话)可以彼此连续或通过在目标核酸的一条链中插入核苷酸而分开。插入的核苷酸(如果有的话)不含有引物及其互补序列中的非充分核苷酸，或者可以包括这些核苷酸中的一种或两种以及四种标准核苷酸类型中的另外两种中的任一种。如果不连续，则正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列(或正向引物结合位点本身)应足够接近，以便引发与扩增技术相容的延伸(例如，不超过100、500、1000或10000个核苷酸)。

图1简单示意了该方法，其中正向和反向引物各自由A、T和C核苷酸组成，且3'位置具有C核苷酸。换言之，G是非充分核苷酸类型。反向引物结合位点由A、T和G组成(C的互补核苷酸，在引物中是非充分的)。所示的正向引物结合位点的互补序列由A、T和C组成，意味着正向引物结合位点(与反向引物结合位点相似)由A、T和G组成。正向和反向引物分别与正向和反向引物结合位点完美互补。正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列是连续的。当向反应体系提供与正向和反向引物中的三核苷酸类型互补的三核苷酸三磷酸单体A、T和G时，可以形成扩增产物。引物二聚体形成和错引被抑制，因为很少碱基可以在引物之间和/或在引物和错配引物结合位点之间配对。但是即使引物可以充分地结合到足以引发延伸的非预期的引物结合位点，也不会形成扩增产物，因为每当延伸链需要掺入C时，扩增混合物中省去的核苷酸三磷酸酯单体都会使扩增停止。

或者如图7所示，引物结合位点可以是不连续的，并且被包含所有四种标准核苷酸的区域分开。在这种情况下，用全部四种标准核苷酸三磷酸酯单体进行扩增。

b.引物结合位点和引物之间的错配

图5显示了更典型的情况，其中对目标核酸的正向和反向引物结合位点的搜索没有显示具有与由A、T、C核苷酸组成的引物完全互补的合适的正向和反向引物结合位点对(即，没有非充分核苷酸类型完全不存在的引物结合位点)。最长的ATC区域含有7个核苷酸(CATCCTC)，最长的ATG区域(CGATTGGTATG)含有12个核苷酸。这些区域不足以用作引物，因为它们的Tm值太低。在这种情况下，可以使用与引物结合位点错配的引物。在图5中，正向引物结合位点具有三个C单位，反向引物结合位点具有与引物中C核苷酸对齐的两个C单位。因此，当这样的引物和引物结合位点彼此杂交时，正向引物与其结合位点之间有三个错配位置，反向引物与其结合位点之间有两个错配位点。尽管如此，杂交和延伸仍然会发生，尽管效率降低。如果反应混合物提供有错配稳定剂，杂交和延伸可以增加。错配结合剂或稳定剂是在非充分引物中的任何可以通过化学相互作用或物理相互作用来稳定非充分引物结合位点与非充分引物的杂交的分子或修饰，(见图6)。非充分引物的修饰可以以任何方式进行，只要给定的修饰与给定的非充分引物的期望功能相容，这可以很容易地确定。修饰包括碱基修饰、糖修饰或骨架修饰，例如PNA、LNA或2-氟-2-甲氧基(2’Fluorine2’methyloxy)。铑金属嵌入剂(metalloinsertors)作为错配稳定剂的例子由Ernst etal.J.Am.Chem.Soc.131,2359–2366(2009)提供。诸如铑金属嵌入剂(metalloinsertors)的化学物可以特异性结合DNA错配，并且在CC错配时具有2.0×10⁷M^-1的结合常数。铑金属嵌入剂(metalloinsertors)的结合可以将包含错配的双链DNA的解链温度提高18.7℃。因此，可以将这种错配结合试剂添加到三核苷酸型引物PCR反应中以特异性地稳定错配并提高PCR效率。除了C-C错配之外，T-C或A-C错配可以通过这些试剂以及其他可能性来稳定。即使使用这样的稳定剂，错配的引物也可以与模板杂交，但效率略有下降，但是可以进行扩增。

C.包含少量单位的非充分核苷酸

作为使用错配稳定剂的替代或补充，可以通过在引物位置中引入有限数量单位的非充分核苷酸类型(通常至多2个内部位置)来减少错配数目，该引物减少了其与引物结合位点的错配。也可以在引物的5'位使用非充分核苷酸，或者临近引物5'末端的5'尾端使用非充分核苷酸。例如，在图5所示的引物和引物结合位点，在正向引物和反向引物中各引入两个G，将在正向引物的情况下的错配减少到一个，而在反向引物的情况下则没有错配。

是否使用错配稳定剂或是否在引物中引入一个或多个非充分核苷酸类型单元，取决于设定的完全缺乏非充分核苷酸类型的正向和反向引物与它们各自的结合位点之间的错配的数量。如果这样的引物与其结合位点之间存在多于两个错配或者在靠近引物的3'末端(例如，在4个核苷酸内)发生错配，则优选通过在引物中引入一个或多个非充分核苷酸来消除一个或多个错配。

在ATC引物的情况下，不将G引入非充分(underrepresented)引物，而可以引入一个或多个非天然碱基作为替换物，只要与常规ATGC引物相比，所述非天然碱基可有助于减少引物二聚体相互作用即可。非天然碱基的示例为肌苷。引入G增加了引物与其结合位点的杂交效率，同时由于CG对的存在而增加了引物间和引物内的相互作用。另一方面，肌苷借助于侧翼碱基对保持引物与其结合位点的杂交效率。然而，引物之间或引物之内的单个或几个CI对对结合的影响很小，并且不会导致大量的引物二聚体的形成。优选地，此类引物由仅包含A、T和C以尽可能减少错配对引物延伸效率的影响的3'片段和仅包含任意数量的肌苷残基(例如1-10个)的5'片段组成。

在引物结合位点与引物(其中完全不存在非充分核苷酸类型)不完全匹配的情况下，扩增仍然可以发生，尽管没有引物中作为核苷三磷酸单体提供的非充分核苷酸类型的互补核苷酸，但是如果提供该核苷酸类型，扩增则更有效地进行。然而，与其它标准的四种核苷酸相比，该核苷酸类型可以以降低的浓度(例如，<10X、<100X或<1000X的其它核苷三磷酸单体)提供，或者可以作为双脱氧NTP提供。引导错误所致的延伸终止于双脱氧NTP。使用任一策略(降低核苷酸浓度或使用ddNTP)来减少引导错误或引物二聚体所致的非预期扩增产物。具有肌苷置换的引物在反应中需要dCTP以有效地延伸肌苷碱基。然而，与其它类型的核苷三磷酸单体相比，dCTP可以以降低的浓度提供。

当靶序列来自各种不同的物种或基因型的生物体时，模板是不止一个等位基因的混合物。具有非充分核苷酸的引物可以在某些位置包含简并碱基以匹配不同的序列变异。

在扩增反应中，具有错配或肌苷置换的非充分引物可以与其原始序列(即，无错配或肌苷置换)的常规引物组合使用。然而，常规引物的浓度应当降低，是非充分引物的浓度的0.1％至50％。相较于非充分引物，常规引物与其结合位点则更有效地杂交，并且它们的延伸产物为非充分引物提供了更多的模板。如上所述，作为非充分核苷酸的互补核苷酸的dNTP类型以降低的浓度提供，或者根据非充分引物的组成而完全省略。常规引物和非充分引物的这种组合有利于基于非充分引物的扩增，并且维持低的引物-引物相互作用。

d.立足点(Toe Hold)引物

图14示出了一种情况，其中针对合适的引物结合位点的靶核酸搜索显示出合适的反向引物结合位点和潜在的正向引物结合位点，该正向引物结合位点具有有限的核苷酸组成(例如，缺少一种核苷酸类型)，然而其本身太短而不能支撑引物结合。在这种情况下，正向引物设计为其中具有非充分核苷酸类型的引物片段在其5'端与具有相同的非充分核苷酸的人工序列(即，与靶核酸不互补)的核酸片段连接，该人工序列本身在其5'端连接到与靶核酸互补的第二引物片段(所有四种核苷酸均是充分的)。这样的引物可以与靶核酸杂交，其中人工序列的片段形成侧翼为与靶核酸杂交的两个引物片段的环。尽管第一引物片段本身太短而不能形成稳定的双链体，但由于第二引物片段有助于第一引物片段形成靶核酸的双链体，因此第二引物片段可被称为Toehold引物。可以在扩增混合液中对此类引物进行扩增，其中非充分核苷酸类型的互补核苷酸不作为核苷三磷酸单体来提供，或者其中提供了所有的四种标准核苷三磷酸单体。任一种引物或两种引物都可以具有所述的Toehold序列和人工序列。在另外的变型中，如图14所示，当第一引物片段和第二引物片段与靶核酸杂交时，人工序列可以形成图15所示的茎环结构，而不是形成简单的环。接头区域的3'端互补于5'引导区域的3'端。所述引物形成发夹结构，该发夹结构稳定引物与模板的杂交并且提高引物扩增效率。

在另一种形式中，单个引物结合位点可以使用两种引物同时进行扩增。一种引物被称为辅助引物，其中具有非充分核苷酸的3'引物片段直接连接到类似于常规引物的5'引物片段。辅助引物可以以足够的效率与靶序列杂交，以借助于常规引物片段来启动扩增。为了检测多个等位基因，5'引物片段可以含有简并碱基。另一种引物是非充分引物，并且与辅助引物非常类似，仅用非充分核苷酸类型的互补核苷酸改变了其5'片段中的第四个核苷酸。提供有限数量的辅助引物，以尽量减少非预期的扩增，同时足以启动扩增。第二引物以常规浓度来提供以进行扩增。

e.三向接合(three-way junction)引物

图14所示情况的类型，即其中具有非充分核苷酸类型的引物结合位点中的一者或两者太短而不能支撑引物结合，作为选择，可以通过使用如图16所示的三向接合序列来解决。此处，具有非充分核苷酸类型的引物片段(1)在其5'端与具有相同的非充分核苷酸类型的人工片段(2)连接。然后，使用包含靶结合位点(4)和人工片段的互补片段(3)的接合引物(junction primer)在靶核酸上将该引物固定就位。接合引物的靶结合位点包括所有的四种标准核苷酸。相对于有限的核苷酸组成引物，接合结引物可以以降低的浓度(拷贝数)来使用。正向和反向引物中的任一者或两者都可以被三向接合序列所代替。

图17示出了三向接合探针的替代形式。在这种形式下，具有非充分核苷酸类型的引物片段(2)在其3'端与相同核苷酸类型的非充分人工片段(1)连接。接合探针具有靶结合片段(3)，该靶结合片段(3)在其5'端与具有引物片段(2)中的非充分核苷酸的互补的非充分核苷酸的人工片段(4)连接。两个人工片段(1)和(4)彼此互补，但长度不相等，使得较短的人工片段(1)可以使用较长的人工片段作为模板延伸。使用类似的方法设计反向引物。来自正向和反向引物的延伸产物具有互补序列，并且可以作为另一个的延伸模板而产生扩增产物。

图31B示出了类似的排列，其中具有非充分核苷酸类型的引物片段在其3'端与具有启动子序列的互补序列的核酸连接。提供了一种接合探针，该接合探针具有包括非充分核苷酸的靶结合片段，在其5'端连接到具有启动子序列的核酸，该核酸又在其5'端连接到具有人工序列的核酸。启动子可以启动转录，以产生与启动子连接的人工序列的转录物，从而指示靶核酸的存在。

图31A示出了类似于图31B的排列，但是其中作为启动子的替换物，连结探针可以通过具有限制性位点的核酸与具有人工序列的核酸连接。这种排列支持切口式扩增。寡核苷酸1(左侧)由具有与5'片段连接的限制性位点的3'人工片段组成，该5'片段是三核苷酸型(three-nucleotide-type)引物。寡核苷酸2(右侧)由与三核苷酸型引物3'片段连接的5'人工三核苷酸型序列和与寡核苷酸1的3'序列互补的接头片段组成。寡核苷酸1和2与模板形成三向连结结构。寡核苷酸1延伸并形成完整的限制性位点。切口酶使形成切口并释放延伸产物。在后续循环里重复切口和延伸。

图18A、18B示出了图17形式的变型，其中正向引物如图17中所描述，而反向引物是具有与正向引物相同的非充分核苷酸类型的人工通用引物。正向引物对于靶序列具有特异性，而通用引物对于不同的靶序列保持不变。在图18A中，引物1的三核苷酸型区域(序列2)与模板杂交。引物1(序列1)的3'端与三核苷酸型区域(序列4)杂交并延伸序列5。该正向引物的延伸产物可以用作模板，用于延伸通用引物而产生扩增产物(图18B)。

f.滚环形式

图31C示出了由人工序列的核酸连接的正向和反向引物。该正向和反向引物以及人工序列都具有非充分核苷酸类型。正向和反向引物结合至核酸靶标的相同链上的结合位点，并且切口填充有连接酶。连接之后，酶切游离的引物，只留下经连接的环状产物。经连接的产物可以通过滚环复制来扩增。

g.检测形式

上述方法与各种检测形式兼容。在一种形式中，用于扩增的一个或多个核苷三磷酸单体被标记，以便将检测标记与标记的单体一起并入到扩增产物中。扩增产物与任何未并入的标记单体的区分允许检测扩增信号。在另一种形式中，正向和反向非充分引物中的任一者或两者连接到检测标记物。扩增产物与任何未并入的标记引物的区分允许检测扩增信号。检测标记物可以附于引物的任何位置。在另一种形式中，正向和反向非充分引物中的任一者或两者与酶识别片段(例如由聚合酶识别的启动子)连接。在另一种形式中，核苷三磷酸单体和用于扩增的正向和反向非充分核苷酸引物中的任一者或两者都被标记。扩增产物与任何未并入的标记引物和/或核苷三磷酸单体的区分允许检测扩增信号。在另一种形式中，扩增混合物中所包括的特殊试剂或化学物质(如SYBR)允许监测扩增。在另一种形式中，副产物如焦磷酸盐允许检测扩增反应。在另一种形式中，基于质量、大小、温度、电流、辐射、颜色、吸收、反射、速度等来检测扩增产物。在另一种形式中，正向和反向非充分引物中的任一者或两者或非充分引物的一部分用荧光团标记。可以在扩增反应中提供淬灭化学物质，如新型亚甲蓝、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸或7-脱氮-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸。淬灭化学物质特异性地并入到扩增产物中并淬灭荧光信号，而它们对游离的荧光团标记引物没有影响。

在一个变型中，人工片段最初与互补寡核苷酸杂交，所述互补寡核苷酸与淬灭剂连接，该淬灭剂淬灭来自荧光标记物的荧光。具有淬灭剂的互补寡核苷酸在进行扩增时逐渐分离，从而随着扩增的进行出现荧光信号。图19在左侧示出用F1标记引物1。在右侧，用F2标记引物2。可以实时检测这种扩增产物而无需去除未并入的荧光标记引物。任选地，这种检测形式可以用过量的未标记引物(如图20所示的反向引物)来进行，以提高探针检测效率。这种检测形式可多重使用以同时检测多个靶。

图25A示出了示例性方法所采用的引物组成。其中一种三核苷酸型引物在其5'端用通用人工三核苷酸序列加尾。5'端荧光团标记的探针由与引物的人工序列相同的3'序列和5'检测探针组成。还提供了与5'检测探针互补的3'端淬灭剂标记的探针。在未发生扩增时淬灭荧光。

图25B示出了具有用于检测多个靶的相同5'人工尾巴的多个引物对。反向引物延伸至人工尾巴序列并产生人工尾巴的互补序列。在其3'端延伸的新产生的反向引物与荧光标记的探针杂交，并且延伸以取代淬灭剂标记的探针。最终要检测游离的荧光。不同的荧光标记的探针和引物尾巴序列可用于多色检测。

在图23所示的另一种检测形式(

形式)中，其中一个引物可以在其5'端与人工片段连接，该人工片段具有与所连接的引物相同的非充分核苷酸。这种引物提供有互补的寡核苷酸，该寡核苷酸一端具有荧光标记，另一端具有淬灭剂。当反向引物延伸遇到淬灭剂寡核苷酸时，聚合酶的5'核酸外切酶活性酶切

探针并将荧光团和淬灭剂分离，从而产生荧光信号。这种信号可被检测到而无需去除未使用的引物，从而允许实时检测。

图38A-38E示出了使用Taq DNA聚合酶的5'Flap核酸内切酶活性的另一种检测形式。图38A示出了引物结构。其中一个引物在其5'端连接至人工片段，该人工片段与所连接的引物具有相同的非充分核苷酸。单个核苷酸“G”作为引物和人工片段之间的接头。在一端具有标记荧光团且在内部具有淬灭剂标记的互补寡核苷酸以等量或过量提供。互补寡核苷酸的3'片段与引物的人工片段杂交，并且5'片段与引物序列不互补。图38B显示出引物已经产生了引物延伸产物，并且反向引物与该产物结合并延伸。图38C显示出当反向引物延伸遇到人工片段和互补寡核苷酸之间的杂交连结点时，DNA聚合酶的5'Flap核酸内切酶活性切割互补的寡核苷酸并将荧光团和淬灭剂分离，从而产生荧光信号。反向引物的延伸在“G”处停止，因为在反应中不提供dCTP。另一种互补寡核苷酸现在可以与引物上的人工片段结合(图38D)，并被切割释放荧光信号(图38E)。重复该过程并放大荧光信号。

图39A、39B示出了使用荧光团淬灭剂标记的寡核苷酸进行多重扩增的实时检测形式。图39A示出了引物结构。其中一个引物在其5'端连接至人工片段，该人工片段具有与所连接的引物相同的非充分核苷酸。在扩增反应中，还提供了荧光团和具有与人工片段相同的序列的淬灭剂标记的寡核苷酸。在其单链形式中，荧光团和淬灭剂接近，荧光被淬灭。图39B显示出在靶扩增期间，反向引物延伸产生人工尾巴的互补序列。具有与人工尾巴相同的序列的FQ标记寡核苷酸可以与合成的互补序列杂交。荧光团和淬灭剂不再接近，荧光被释放。该反应可以通过过量的反向引物的不对称反应来促进，使得互补序列的单链可用于FQ寡核苷酸杂交。

图40A、40B示出了可用于多重扩增的另一种实时检测形式。图40A示出了引物结构。其中一个引物在其5'端连接至人工片段，该人工片段具有与所连接的引物相同的非充分核苷酸。将荧光团和淬灭剂附于人工片段，并且至少一个标记位于人工片段的内部。在单链形式中，荧光团和淬灭剂接近，荧光被淬灭。图40B显示出在靶扩增期间，人工片段变成双链。荧光团和淬灭剂不再接近，荧光被释放。

图24示出了另外的检测形式(分子信标)。其中一个引物再次在其5'端连接至人工片段，该人工片段具有与所连接的引物相同的非充分核苷酸。在分子信标探针的存在下实施扩增，该分子信标探针具有发夹茎结构和环序列，该发夹茎结构在发夹末端具有荧光团和淬灭剂，该环序列与连接至引物的人工片段的互补序列互补。当形成扩增产物时，分子信标的环片段与人工片段杂交，荧光团和淬灭剂分离而产生荧光信号。该信号可以实时检测，而无需除去未并入的分子信标。

通过使用针对待检测的每个靶标的不同荧光标记和不同人工序列，可以容易地对涉及标记引物或具有与标记寡核苷酸杂交的经连接人工序列的引物的所有形式进行多重扩增。当使用多个引物或引物对进行多重扩增时，存在于多重扩增中的所有引物中的非充分核苷酸类型通常是相同的。例如，所有的引物都可以具有非充分G或非充分C。

扩增产物也可以通过熔解曲线分析(吸收随温度的变化)、质谱分析、凝胶电泳或毛细管电泳等技术来检测。

所公开的方法大大减少了引物二聚体形成和非特异性扩增，由此允许使用双链嵌入染料来检测扩增子，这与荧光团标记的寡核苷酸的使用相比非常具有成本效益。这些方法可以适用于使用熔解曲线分析根据它们的Tm来区分不同的扩增子。在一定温度下是否存在熔解峰决定了其相应的扩增子的存在与否。优选地，3或4或5或6个扩增子可以通过其65℃至95℃范围内的Tm来区分。然而，由于常规扩增子的性质，其Tm不能处于较低的Tm范围(即40℃-65℃)。Tm范围较低(40℃-65℃)的人工尾巴序列与一个或多个非充分引物(图37)的5'端连接。人工尾巴序列的一条链可以具有与所连接的引物相同的非充分核苷酸类型。不同的非充分引物可以具有相同的人工尾巴或Tm不同的不同人工尾巴。反应中还提供了人工尾巴的互补序列，以便它们可以形成双链。如果引物不参与PCR反应，则其在溶液中保持不变。在PCR之后，双链尾巴保留，并且在熔解曲线分析期间在其Tm处显示出熔解峰。然而，如果引物参与PCR反应，则其延伸产物作为其它引物杂交和延伸的模板，并成为双链扩增子的一部分。双链尾巴分离，并且其在低Tm范围(40℃-65℃)的相应熔解峰消失。因此，随着扩增的进行，从引物尾巴的熔解峰转变为并入该引物的扩增产物的熔解峰。优选地，可以将具有不同Tm的3或4或5或6种人工尾巴类型引入到不同的非充分引物中。一个熔解峰的消失表明存在相应的靶。这种方法大大增加了只有一种双链嵌入染料的反应的多重性。也可以使用茎环结构代替人工尾巴和互补链来连接非充分引物。

多通道荧光检测和Tm区分相结合可以实现更高的多重性。一系列具有不同Tm的人工序列可以用荧光团标记，它们的互补序列用淬灭剂标记。第二系列的人工序列可以用另一种荧光团标记，它们的互补序列用另一种淬灭剂标记。当两个系列的序列连接到不同的非充分引物的5'端时，在扩增反应后的荧光通道中的熔解峰的消失表明存在相应的靶。也可以在互补序列上标记荧光团和淬灭剂，使得其荧光性在单链形式下处于最低水平，而在与非充分引物上的人工尾巴杂交时增加。当使用茎环结构连接非充分引物时，在茎环结构的两端标记荧光团和淬灭剂，换言之，在内部将荧光团和淬灭剂中的一者标记在该引物上。通过使用不同的序列或通过在一条链上使用错配碱基，可以引入双链/茎环之间的Tm差异。

在多通道熔解曲线分析的另一种形式中，非充分引物在其5'端通过人工序列加尾。还提供了具有与人工尾巴相同序列的荧光团和淬灭剂标记的寡核苷酸。如果非充分引物参与反应，则合成人工尾巴(或荧光团和淬灭剂标记的寡核苷酸)的互补序列。在扩增反应之后的熔解曲线分析过程中，荧光团和淬灭剂标记的寡核苷酸与互补序列杂交并在温度达到Tm时解离。当寡核苷酸与其互补链形成双链体时，与其单链形式下的信号相比则具有更高的荧光信号。因此观察到了熔解峰。在一个荧光团通道中，可以在温度范围内分辨出优选为2或3或4或5或6个熔解峰。该方法可以在多通道形式中检测更多的靶。可以通过具有不同碱基组成的序列、不同长度的序列、与其互补链错配的序列等等来引入Tm差异。

所公开的方法可用于检测除核酸以外的分析物，例如蛋白或抗体。寡核苷酸模板可以附于分析物上。在分离未结合的寡核苷酸模板之后，用非充分引物扩增寡核苷酸模板表明存在分析物。或者，非充分引物或探针可以附于分析物上。非充分引物或探针的检测指示分析物的存在与否。例如，在附于分析物的非充分引物或探针的邻近连接之后，连接产物的检测指示分析物是否存在。

图32A和32B示出了免疫PCR的示例性形式，其中引物具有一种或多种非充分核苷酸类型。在图32A中，用通过作为实时PCR模板的寡核苷酸连接的抗体检测包覆到固体表面的抗原。实时PCR信号指示抗原的存在。寡核苷酸也可以附于结合第一抗体的第二抗体上。该测定也可以用于夹心免疫测定。在图32B中，抗原上的不同表位特异性的抗体或多种抗体附于不同的寡核苷酸上。当抗体结合抗原时，寡核苷酸1和2借助于辅助寡核苷酸连接。连接产物作为检测抗原的实时PCR模板。该测定也可以用于蛋白相互作用的检测，其中每种蛋白与用寡核苷酸连接的特异性抗体结合。当之后用作检测的实时PCR模板时，蛋白的相互作用实现两个寡核苷酸的邻近连接。

图33示出了荧光团之间的能量转移的实时PCR检测。

具有非充分核苷酸类型的引物1(或两种引物)在其5'端用荧光团1标记。例如，如图所示，引物1在其5'A上标记。在PCR反应中，将荧光团2标记的dTTP并入产物中。荧光团2的激发使得能量从荧光团2转移到荧光团1。然后激发荧光团1并检测信号。

图34示出了使用化学修饰的dNTP进行的实时PCR检测。用荧光团标记一个或多个具有非充分核苷酸的引物。一种或多种类型的dNTP用双链DNA嵌入化学物质来标记或者被修饰，如脱氮dGTP或脱氮dATP。被标记或修饰的dNTP可嵌入到PCR产物中，来自引物的荧光被淬灭。信号下降指示存在模板。在另一个实施例中，经修饰的dNTP可用于选择性地检测来自双链DNA嵌入染料的信号。例如，deaza-G或deaza-A将会淬灭其附近的SYBR Green信号，因此含有均匀分布的deaza-G的常规PCR产物未被SYBR Green检测到。非充分引物可以在其5'端具有这样的人工序列，即不含与经修饰的三磷酸脱氧核苷酸互补的碱基。5'端的人工序列的合成互补序列将不含有会淬灭嵌入染料的修饰dNTP。例如，当ATC引物通过不含C的人工序列在其5'端加尾时，PCR扩增产物包括两个片段：含有deaza-G的片段和不含有deaza-G的片段。嵌入染料SYBR绿色荧光将被第一片段中的脱氮-G淬灭，而第二片段中的SYBR绿色荧光将不被淬灭。

图35示出了荧光团和DNA嵌入化学物质之间的能量转移的实时PCR检测。用荧光团标记一个或多个具有非充分核苷酸的引物。将dsDNA嵌入化学物质加入到PCR反应中。该化学物质可以是荧光淬灭剂，其在存在模板时会导致荧光信号下降。当存在模板时，该化学物质也可以作为能量转移供体而激发引物上的荧光团。

图36示出了使用

荧光团的实时PCR检测。具有非充分核苷酸的一个或多个引物用

荧光团标记。当引物为单链形式时，荧光团不具有荧光。在PCR反应中，引物与模板杂交并延伸形成双链。然后荧光团嵌入到双链DNA中，并检测荧光。

为了用多对非充分引物或探针进行多重扩增，可用微阵列、或序列、或磁珠或纳米棒检测扩增产物。其中一对非充分引物与溶液中的游离引物一起移植到表面。这些方法允许同时扩增并允许PCR产物附于表面上(Oroskar等，1996，Clinical Chemistry，42(9)，1547-1555)。任选地，两种引物都可以移植到表面以进行扩增。附于表面上的非充分引物或探针可以是编码或非编码的，或者是随机分布的。

WO96/04404(Mosaic Technologies公司等)公开了一种检测潜在含有靶核酸的样品中的靶核酸的方法。该方法涉及仅当靶核酸存在于被测试样品中时才诱导基于PCR的靶核酸扩增。为了扩增靶序列，将两种引物附于固体载体上，这使得扩增的靶核酸序列也附于该固体载体上。该文献中公开的扩增技术有时被称为“桥式扩增”技术，其中正向和反向非充分引物都附于载体上。在该技术中，相对于常规PCR，两种非充分引物经特别设计，使得它们位于待扩增的特定靶DNA序列的侧翼。因此，如果样品中存在特定的靶核酸，则靶核酸可以与非充分引物杂交，并通过PCR扩增。该PCR扩增过程的第一步是将靶核酸与附于载体的第一特定非充分引物(“引物1”)杂交。然后通过延伸引物1序列形成与靶核酸互补的第一扩增产物。在将载体置于变性条件下时，靶核酸被释放，然后可以与可附于载体的其它引物1序列参与进一步的杂交反应。然后，附于载体的第一扩增产物可以与附于载体的第二特异性非充分引物(“引物2”)杂交，并且包含与第一扩增产物互补的核酸序列的第二扩增产物可以通过引物2序列的延伸而形成并且也附于载体上。因此，靶核酸以及第一和第二扩增产物能够参与多个杂交和延伸过程(仅受初始存在的靶核酸以及引物1和引物2序列初始存在的数量的限制)，并且得到附于表面的靶序列的多个拷贝。

如果存在靶核酸，则仅形成扩增产物。因此，针对一种或多种扩增产物的存在与否监测载体指示特定靶序列是否存在。

可以使用Mosaic技术来实现一定量的多重扩增，因为可以通过排列如本文所公开的不同组的第一和第二非充分引物来同时扩增几种不同的靶核酸序列，该第一和第二非充分引物对固体载体的不同区域上的每个不同靶核酸序列具有特异性。

h.具有粘性末端的产物的扩增

通常，用限制性酶切位点加尾引物，然后进行限制性内切酶酶切，或者通过Taq聚合酶的腺嘌呤转移酶活性在3'端上添加额外的腺嘌呤，从而产生具有粘性末端的PCR产物。尽管第一种方法给出了理想的结果，但是需要额外的步骤，这样耗时且并非总是适于下游应用。第二种方法只产生结合效率低的短突出端(overhangs)。如图26所示，在本发明中公开的是，非充分引物在其5'端与人工序列连接，并且非充分核苷酸位于5'端人工序列和非充分引物之间。根据应用，可以用人工序列对一个或两个非充分引物进行加尾。当仅提供了3个核苷三磷酸单体而省略了非充分核苷酸的互补核苷酸时，引物延伸停止在引物中非充分核苷酸的位置。扩增产生了在一侧或两侧具有5'突出端的产物。人工尾巴的序列和长度的自由选择使得各种应用成为可能，例如克隆，与固体表面上的单链DNA杂交，与衔接子的连接等等。

i.用于滚环扩增产物的Smrt^TMBell引物

该方法也可以用与发夹环连接的引物来进行，从而形成可用于产生第二代测序环状产物的钟形引物，如图26和27所示。具有非充分核苷酸类型的正向和反向引物各自在5'端与发夹引物(其可以具有任何核苷酸组成)的一个臂连接。引物的最5'端核苷酸是非充分核苷酸的互补核苷酸。两种引物与靶核酸上的连续结合位点或者与不连续但不含非充分核苷酸类型的结合位点杂交。在缺乏非充分核苷酸的互补核苷酸的扩增混合液中延伸两种引物。当需要并入非充分核苷酸的互补核苷三磷酸时，延伸停止。两个引物的延伸链彼此杂交，得到在一个引物的3'端和另一个引物的5'端之间具有切口的环状结构。用连接酶封上切口而产生环状产物，该环状产物可用作SMRT^MBell测序的模板。在图27A-27C中更详细地示出了该过程。图27A示出了第一引物，其包含靶结合区A和连接至具有互补茎区C的发夹结构的非充分核苷酸，该互补茎区C也是靶结合区，并且其C'和环E 3'是靶结合区。反向引物具有靶结合区B，该靶结合区B具有与发夹环连接的非充分核苷酸类型，其中具有片段D的发夹环也是靶结合区，并且形成茎的D'和环F 3'是靶结合区。在该构象中，如同反向引物中的片段B、D和F的一部分，正向引物中的片段A、C和E的一部分与模板结合。图27B示出了两个引物与模板的退火。引物1的ACE序列与模板的A'C'E'序列杂交并延伸B'序列。引物2的BDF序列与模板的B'D'F序列杂交并延伸A'序列。当需要非提供的核苷酸时延伸停止。图27C显示出从步骤B得到的两个延伸产物形成发夹结构并在A'B或AB'区域彼此杂交。连接箭头处的切口。产生环状产物。系统中的非环状寡核苷酸可以用核酸外切酶酶切。可替换地，非充分引物可以在5'端片段具有茎环结构。当在扩增系统中使用了这种类型的非充分引物用于非链置换聚合酶的扩增时，可以利用连接酶连接扩增产物以形成环状产物。系统中的非环状寡核苷酸可以用核酸外切酶酶切。对于两种非充分引物，5'端片段的茎环序列可以相同或不同。连接的环状产物可以用不同的化学物质或酶切割，以使该环状产物线性化而用于下游应用。所公开的发明方法可以用于第二代序列文库的制备。

i.不止一种核苷酸类型的非充分引物

针对具有单一非充分核苷酸类型或者具有两种或甚至三种非充分核苷酸的引物的策略和原理可以应用于引物(或换言之，完全或主要由单一核苷酸组成)。单一核苷酸的非充分引物的使用在天然靶核酸中具有更广泛的适用性，因为此类引物的结合位点以统计学上更高的频率出现。然而，某些扩增形式(如免疫PCR)对人工序列的核酸进行扩增。正如单一非充分核苷酸类型，这种人工序列可以设计成使用两种或甚至三种非充分核苷酸类型的引物来扩增。

在两种核苷酸类型的非充分引物中，两种非充分核苷酸类型应当不互补。换言之，非充分核苷酸类型可以是A与C、A与G、T/U与C或T/U与G。这形成完全或主要由相同的两种非互补核苷酸类型组成的引物。此类引物支持引物二聚体或引物错配延伸的能力下降。引物具有三种非充分核苷酸，换言之，完全或基本上由单一核苷酸类型组成的引物支持引物二聚体或错配引物延伸的能力也下降。采用类似于上述的原理选择引物结合位点，并且如果需要，可以调整引物序列以适应少量的非充分核苷酸。也可以使用Toehold和连结引物策略。用这种引物进行的扩增至少使用引物中的非充分核苷酸的互补核苷酸进行，并且任选地也可以用非充分核苷酸的互补核苷酸进行，如所指出的，可以以降低的浓度提供，或者作为双脱氧核苷酸提供。

j.扩增方法

上述策略和原理可以纳入涉及基于单个或成对引物的模板引导延伸的任何扩增方法。聚合酶链式反应是一种实施方式，包括任选的RT-PCR。PCR的特征在于温度的循环以实现引物退火、引物延伸和其模板的延伸链的变性。

转录介导的扩增(TMA)是替代等温形式，如图29所示，一种或两种引物在其5'端连接启动子，通常是T7启动子。一旦形成双链启动子，RNA聚合酶开始转录扩增。扩增产物是单链RNA分子。TMA也可以与反转录相结合。

适用于本发明的引物的另一等温扩增形式是切口扩增反应(NEAR)。NEAR使用聚合酶和切口酶在恒定温度下以指数方式扩增DNA。用于切口扩增的引物在其5'端连接至人工片段，5'片段包含切口酶的切割位点(如图29所示)。在第一个循环中，两种引物都与模板杂交并延伸。在第一个循环中，两种引物都可以与第一循环产物杂交并延伸，以在人工尾巴上产生完整的切口位点。一旦形成切口位点，切口酶则切割并释放一条链。在下一循环中重复延长和切割。

适用于本发明的引物的另一等温扩增程序是环介导的等温扩增或LAMP。根据本发明，LAMP使用一种或多种具有非充分核苷酸的引物。(图30，左图)。在LAMP中，除了复制活性以外，使用两组或三组引物和具有高链置换活性的聚合酶在60-65℃的恒定温度下扩增靶序列。通常，使用4种不同的引物来识别靶基因上的6个不同的区域，这极大地增加了特异性。另外一对“环引物”可以进一步加速反应。

另一等温扩增形式是重组酶聚合酶扩增(RPA)，是替代聚合酶链式反应(PCR)的单管等温形式(图30，右图)。RPA过程采用了三种核心酶：重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换聚合酶。重组酶能够将寡核苷酸引物与双链DNA中的同源序列配对。SSB与DNA的置换链结合，并且防止引物被置换。最后，链置换聚合酶开始DNA合成，其中引物与靶DNA结合。通过使用两个相反的引物(很像PCR)，如果靶序列确实存在，则启动指数DNA扩增反应。如上所述，两种引物都可以是具有非充分核苷酸类型的引物。

可使用本发明引物的其它扩增形式包括链置换测定，基于转录的扩增系统、自持序列复制(3SR)、连接链式反应(有时称为寡核苷酸连接酶扩增OLA)、循环探针技术(CPT)、滚环扩增(RCA)、核酸序列碱基扩增(NASBA)、侵入性切割技术、解旋酶依赖性扩增(HDA)、指数扩增(EXPAR)、杂交链式反应(HCR)和催化发夹装配(catalyzed hairpin assembly)(CHA)。

另一扩增形式是免疫PCR，其中分析物与核酸(其可具有人工序列)连接，并且通过核酸扩增来检测分析物。这样的扩增可以用具有非充分核苷酸类型(例如，完全不存在)的引物对来进行，该引物对与非充分核苷酸的互补核苷酸中的非充分引物结合位点互补。

上述方法扩增了由所选引物及其互补引物结合位点确定的特定的预定靶核酸或其片段(换言之，靶特异性扩增)。相对于由相同的引物对引发的或通过靶序列上的引物二聚体结合或引导错误导致的任何或所有的其它扩增产物，通过与其预期引物结合位点结合的引物对得到的扩增产物占优势。优选地，通过与其预期引物结合位点结合的引物得到的扩增产物过量存在，是由引物对引发的任何或所有其它扩增产物的至少10、50、100或1000倍(以摩尔、质量或拷贝数计)。在一些方法中，使用单对引物进行扩增。在其它方法中，使用多个引物对进行多重扩增。引物对的数目可以是：例如2-50或更多，优选为5-25或10-20，或至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。当使用多个引物对时，通过引物对与其预期引物结合位点的结合得到的每个引物对的预期扩增产物过量存在，是由该引物对引发的任何或所有其它扩增产物的至少10、50、100或1000倍(以摩尔、质量或拷贝数计)。除了以下描述的随机引发形式之外，该方法使用的引物不是随机引物，其中大部分或全部引物位置被引物之间变化的核苷酸的随机或简并选择所占据。反而，每个引物对设计成与靶核酸中的特定引物结合位点杂交，并且根据所检测的靶核酸中的不同引物结合位点，一般不同的引物对彼此不相关。例如，可以将一个引物对设计成与一种病原体中的靶核酸上的引物结合位点和不同病原体中的不同靶核酸上的第二引物对结合位点结合。除巧合之外，不同的靶核酸以及随后的引物结合位点和引物彼此不相关。

III.使用简并引物的随机引发

本发明还提供了使用简并非充分引物(称为非充分简并引物)的随机引发扩增的方法。该方法采用具有3'杂交片段的引物，该3'杂交片段在连接到5'人工片段的引物之中随机变化(如图28所示)，这在不同的引物中是相同的。5'人工片段仅由三种类型的核苷酸组成，可能的例外是5'端的非充分核苷酸，3'杂交片段由相同的三种类型的核苷酸组成。在另一个实施例中，3'片段也由相同的三种类型的核苷酸组成，除了其在3'端之外的位置还可以包括有限数量的第四核苷酸类型的单元。存在于3'随机片段中的有限数量的第四核苷酸类型(G)的单元大于1％但小于20％。通常，在3'随机片段中存在不超过1、2或3个此类核苷酸。在3'片段中包含有限数量的非充分核苷酸类型的单元显著增加了随机引物的多样性，而没有显著增加非预期随机引物的相互作用。在另一个实施例中，非充分简并引物可以包括非天然核苷酸，例如肌苷、硝基吲哚，只要包含在非充分引物中的非天然核苷酸与传统的A、T、G、C引物相比可以帮助减少引物相互作用即可。非天然核苷酸可以包含在5'人工片段或3'随机杂交片段中，或者包含在5'人工片段和3'随机杂交片段两者中。3'杂交片段的一个示例由A、T、C组成，第四非天然核苷酸肌苷可以随机包括在内。在这种情况下，3'随机杂交片段由A、T、C和I四种核苷酸组成。在另一个实施例中，在简并非充分引物中也可以包含非天然核苷酸。A、T、C简并非充分引物的示例可以包括量为0.1％至25％的肌苷。所公开的发明可以包括一步或两步扩增：用四种核苷三磷酸单体中的每一种进行的初始扩增产生侧翼为5'人工片段及其互补序列的初级扩增产物。然后，使用具有3'片段的引物进行二次扩增，该3'片段互补于随机引物的5'人工片段的互补序列。这种方法尤其适用于扩增大的DNA区域(如BACS、YACS、全染色体或全基因组或单细胞扩增)。在其它方法中，扩增产物可以通过添加SYBR绿色染料或通过荧光标记探针来检测。对于其它应用，例如测序文库制备、单细胞扩增等，二次扩增中使用的引物可具有5'尾巴。扩增可以通过本文公开的PCR或等温方法进行。

IV.延伸反应

以上讨论的引物设计的原理也可以用于延伸反应所用的引物，如单碱基延伸，其中引物杂交邻近但不跨越突变(如SNP)；或等位基因特异性延伸，其中引物在突变位点上杂交。在涉及基于单一引物延伸的反应中，引物二聚化不是问题，但是引物与靶核酸(或非靶核酸)的错配结合是一个问题，并且引物二聚体问题也可能出现在多重延伸中。

V.突变检测

本发明可用于检测靶核酸中的突变而指示基因组的不稳定性。例如，突变检测方法可用于检测和/或识别与疾病相关的突变或其它改变，例如癌症和其它病理遗传病症、障碍或综合征。这种突变包括核苷酸插入、缺失、重排、转换、转译、颠换、多态性和置换。更具体地，突变可以包括单核苷酸多态性(SNP's)。本发明可以用于识别突变的存在与否。通常，突变可以包括靶核酸的任何改变，例如杂合性丢失或基因组不稳定性的其它标记。

通常，用于检测靶核酸中的突变的方法包括基于杂交的测定，或将疑似含有突变的靶核酸模板暴露于能够与靠近疑似突变的已知区域杂交的非充分引物。延伸非充分引物，一个或多个互补核苷酸通过疑似含有突变的位点杂交。通过分析并入或未并入非充分引物的核苷酸来确定是否存在突变。在一种形式中，一个或多个非充分引物在3'端含有7-脱氮-2'-脱氧鸟苷和/或7-脱氮-2'-脱氧腺苷。3'端的非天然核苷酸进一步抑制或促进模板上的扩增以检测突变。

文献中报道的许多突变检测方法可以使用本发明来提高检测精度。例如，SNPs检测使用传统方法和高通量方法两种主要方法进行。传统的基于凝胶的方法采用标准分子技术，如扩增不应性突变体系(ARMS)、限制性酶切和各种形式的凝胶电泳(例如RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和单链构象多态性(SSCP)。高通量方法包括等位基因鉴别方法(等位基因特异性杂交、等位基因特异性单碱基引物延伸)、挂锁探针、分子倒置探针(MIP)、高通量测定化学法(Flap核酸内切酶鉴别、寡核苷酸连接)、DNA阵列、焦磷酸测序、第二代测序以及实时定量PCR仪(light cycler)。

VI.计算机实现方式

引物结合位点和引物的选择可以通过计算机中由计算机实现的靶核酸分析(由非暂时性计算机可读存储介质编程)来进行。在计算机中接收靶核酸(一条或两条链)的序列。计算机还存储或接收用户输入的所需的引物核苷酸组成(例如A、T、C)。然后对计算机进行编程以搜索靶序列，从而识别与最密切对应于引物组成的扩增相容的彼此距离内的正向和反向引物结合位点。如果引物组成是A、T、C，则正向和反向引物结合位点应该最密切对应于A、T和G。计算机可以识别相反链上的正向和反向引物结合位点，或者可以识别同一链上的正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补序列，并且通过其互补序列计算正向引物结合位点。然后计算机可以提供候选的引物结合位点对的输出，其可以与所寻求的理想组成有不同程度的差异。计算机还可以显示与每个引物结合位点对杂交的引物设计。对于相同的引物结合位点对，在非充分核苷酸的单元数量不同和错配数量不同的情况下，可以显示出多个引物设计。

计算机系统可以包括总线，该总线与主要的子系统互连，如中央处理器、系统存储器、输入/输出控制器、外部设备(如打印机，通过并行端口)、显示屏(通过显示适配器)、串行端口、键盘、固定磁盘驱动器和互联网连接。还可以连接许多其它设备，如扫描仪(通过I/O控制器)，连接到串行端口的鼠标或网络接口。许多其它设备或子系统可以以类似的方式连接。而且，如下面所讨论的，并不需要存在的所有设备都能够实践本发明。所述设备和子系统可以以不同的方式互连。用于实现本发明的源代码可以可操作地设置在系统存储器中或存储在诸如固定磁盘、光盘等的存储介质上。计算机系统可以是主机、PC、台式机或手机等等。

VII.应用方法和试剂盒

任何公开的引物和探针都可以纳入到试剂盒中。这种试剂盒优选地包含至少一个引物对，优选为至少5、20或20个引物对。试剂盒中的引物对优选地能够在相同的多重反应中使用，这意味着它们具有相容的解链温度以及相同的非充分核苷酸类型。公开为与此类引物和探针一起使用的任何其它试剂都可以包括在此类试剂盒中，包括扩增反应中包含的NTP、错配稳定剂、荧光团或其它标记。试剂盒还可以包括详细说明如何在所公开的任何方法中使用试剂盒的说明书。

所公开的发明提供了用于检测和鉴定微生物(例如感染哺乳动物的病原体)的试剂盒。因此，本发明可用于例如鉴定感染人受试者的特定病毒株，例如特定的人类免疫缺陷病毒株或乳头瘤病毒(HPV)等。微生物菌株通常在几个核苷酸中彼此不同，而其基因组的其余部分是相同的。因此，可以使探针识别保守区域并鉴定特定的可变核苷酸。

例如，通过本发明的方法可以检测各种感染性疾病。通常，这些是由细菌、病毒、寄生虫和真菌感染病原体引起的。各种感染病原体对药物的耐药性也可以使用本发明来确定。

本发明还可用于检测感染病原体的耐药性。例如，耐万古霉素的屎肠球菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐青霉素的肺炎链球菌、耐多药的结核分枝杆菌和耐AZT的人类免疫缺陷病毒都可以用本发明来鉴定。

遗传疾病也可以通过本发明的方法来检测。这可以通过染色体和遗传畸变或遗传疾病的产前或产后筛查来进行。可检测的遗传疾病的示例包括：21羟化酶缺乏症、囊性纤维化、脆性X综合征、特纳综合征、杜氏肌营养不良症、唐氏综合征或其它三体性疾病、心脏病、单基因疾病、HLA分型、苯丙酮尿症、镰状细胞性贫血、泰-萨二氏病、地中海贫血、克兰费尔特综合征、亨廷顿病、自身免疫性疾病、脂沉积症、肥胖缺陷、血友病，先天性代谢异常以及糖尿病。

可通过本发明的方法检测的癌症通常涉及癌基因，肿瘤抑制基因或参与DNA扩增、复制、重组或修复的基因。这些的示例包括：BRCA1基因、p53基因、APC基因、Her2/Neu扩增、Bcr/AB1、K-ras基因和人乳头瘤病毒16型和18型。本发明的各个方面可用于鉴定以下常见的人类癌症中的上述基因的扩增、大的缺失以及点突变和小的缺失/插入：白血病、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、脑肿瘤、中枢神经系统肿瘤、膀胱肿瘤、黑素瘤、肝癌、骨肉瘤及其它骨癌、睾丸癌和卵巢癌、头颈部肿瘤以及宫颈肿瘤。

在环境监测领域，本发明可用于检测、鉴定和监测自然和工程生态系统和微观世界(如城市废水净化系统和水库或者正在进行生物修复的污染地区)中的致病微生物和土着微生物。还可以检测含有可代谢异生物质的基因的质粒，在群体动态研究中监测特定的目标微生物，或者检测、鉴定或监测环境中和工业厂房中的经基因修饰的微生物。

本发明可以用于NGS的文库制备测序、单细胞扩增和诸如RNA-seq的检测、诸如唐氏综合征的产前检测等。

本发明还可以用于多种法医领域，包括用于军事人员的人员识别和刑事调查，亲子鉴定和亲属关系分析，HLA相容性分型，短串联重复序列(STR)以及筛查血液、精子或移植器官污染。

在食品和饲料工业中，本发明具有广泛的应用。例如，它可以用于鉴定和表征微生物生产，例如用于生产啤酒、葡萄酒、奶酪、酸奶、面包等的酵母。另一个使用领域是关于污染物的质量控制以及产品和工艺的检定(例如家畜、巴氏消毒和肉类加工)。其它用途包括用于育种目的的植物、鳞茎和种子的表征，植物特异性病原体存在的鉴定以及兽医感染的检测和鉴定以及用于动物育种计划。

尽管为了便于清楚理解已经详细描述了本发明，但是在所附权利要求书的范围内可以实施某些修改。出于所有目的，本申请中引用的所有出版物(包括登录号、网站等)以及专利文献的所有内容通过引用并入本文，如同各自单独所表示的那样。对于序列版本的差异，网站或其它参考可以在不同的时间出现，意指有效申请日期下与参考相关联的版本。有效申请日期是指公开所涉及的登录号的最早优先权日。除非上下文中另有说明，否则本发明的任何要素、实施例、步骤、特征或方面可以与其它任何事物组合来实施。

示例

示例1和示例2：常规引物和三核苷酸引物中的短暂相互作用

尽管尚未完全了解引物二聚体的形成，但清楚的是，引物相互作用是非预期扩增产物的导致因素。理论上，借助于计算，可以很细致地设计常规的四核苷酸引物，以避免次级结构和引物相互作用。这样的计算对于单个引物对来说效果很好，但是对于多重扩增来说效果不太理想。

我们通过理论计算设计了一组四核苷酸引物(常规引物1-32)。在使用32个引物的多重扩增中，我们发现了极高程度的引物相互作用。对具有随机序列的一组三核苷酸型引物也进行了多重扩增。三核苷酸型引物多重扩增中的引物相互作用则低得多。

我们使用SYBR Green来检测反应中形成的任何引物相互作用。25μl的反应物包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl(AmpliTaq Gold PCR缓冲液II的1:10稀释液，美国生命技术公司)，2mM MgCl₂(25mM MgCl₂原液的1:12.5稀释液，美国生命技术公司)，0.2mM的每种dNTP(2.5mM的每种dNTP溶液的1:12.5稀释液，由100mM的每种dNTP原液制备，美国生命技术公司)和1X SYBR green II(100X原液的1:100稀释液，由10000X原液制备，Sigma-Aldrich公司)。加入32个四核苷酸型引物或三核苷酸型引物(IDTDNA)至最终浓度为2.6μM、5.2μM、13μM、26μM、39μM和52μM。将反应物加热至95℃达2分钟，然后冷却至65℃进行信号检测。

图2A示出了四核苷酸型引物相互作用。当不存在引物(0μM)时，荧光信号为零。2.6μM显示出约100K的荧光信号。5.2μM显示出约150K-180K的荧光信号。13.1μM显示出约250K-300K的荧光信号。26μM和39μM显示出约300K-350K的荧光信号。

图2B示出了三核苷酸型引物的相互作用。2.6μM、5.2μM和13μM的引物浓度仅显示出小于10k的最小荧光水平。26μM、39μM和52μM的浓度显示出从12.5k到25K逐渐增大的荧光性。

示例3：PCR反应中的四核苷酸和三核苷酸引物二聚体形成

如示例2所示，对于四核苷酸型引物，引物相互作用处于非常高的水平，对于三核苷酸型引物则处于非常低的水平。因此，在PCR反应中，三核苷酸类型的引物应该具有低得多的引物二聚体形成。在PCR反应中，我们对先前示例所使用的相同引物组进行了多重扩增。

对于三核苷酸引物，25μl PCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mMMgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.875U AmpliTaq GoldDNA聚合酶(美国生命技术公司)。对于四核苷酸引物，还加入了0.2mM dCTP。加入三核苷酸引物和常规四核苷酸引物至浓度为2.6μM。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。两个反应重复48次。

图3A示出了三核苷酸型引物二聚体的形成。48次重复中只有2次在50和55次循环处具有引物二聚体。图3B示出了四核苷酸型引物二聚体的形成。所有的48个反应在30次循环之前始终具有引物二聚体。

示例4：使用三核苷酸型引物和三核苷酸型dNTP的实时PCR反应

设计具有错配的三核苷酸型引物，以检测人类基因组DNA。

25μl PCR反应包含100ng人类基因组DNA(NEB)，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II，0.8mM的每种引物(Hemo2F、Hemo2R)，1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。无模板对照反应不含人类基因组DNA。在StepOne^TM实时PCR系统(美国生命技术公司)上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃15秒”循环60次。在退火步骤记录荧光信号。

图4A示出了以人类基因组DNA作为模板的PCR反应随时间变化的荧光性。图4B示出了无模板对照的PCR反应随时间变化的荧光性。

使用三核苷酸型引物实时PCR容易检测100ng人类基因组DNA。当不存在模板时，不形成引物二聚体。

示例5：使用三核苷酸型引物和4种核苷酸dNTP的实时PCR和终点检测

在该示例中，以与常规的四核苷酸型引物相同的方式使用三核苷酸型引物。检测两组引物用于HPV11的检测。HPV11-1F和HPV11-1R没有错配，HPV11MM1F在12和18位置错配，而HPV11MM1R在11和22位置错配。

将HPV模板稀释至10⁵(1pg)、10⁴(100fg)、10³(10fg)、10²(0.1fg)、10¹(0.01fg)拷贝数/μl。25μl PCR反应包含1μl模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM的每种dATP、dTTP和dGTP，1X SYBR green II，0.8mM的每种引物，1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃15秒”循环60次。在退火步骤记录荧光信号。60次循环后，加入6X DNA加载染料，并将10μl样品加载到0.8％琼脂糖凝胶上。

图8A、8B示出了所有模板(包括无模板对照H₂O)随时间变化的荧光性。可以容易地检测到少至10个拷贝数的HPV模板，而无模板对照在60次循环中没有扩增。图8C示出了扩增产物的凝胶电泳图像。所有模板都用适当大小的产物进行扩增，而不论引物序列中是否存在错配。

示例6：具有5'G的三核苷酸型引物

模板上的三核苷酸型引物的杂交区域通常在其3'端侧翼为C。否则当它是A、T或G时，符合有限组成的该引物中可包括更多的碱基。在该示例中，我们设计了一个在其5'端具有G的三核苷酸型引物，以与模板上的3'C相匹配。这种引物具有更高的Tm且杂交效率提高。

在5'端添加G潜在地使得能够配对相同引物或不同引物的C。然而，这样的配对对引物二聚体形成没有影响，因为在5'端不会发生延伸。在一些极端情况下，当引物二聚体形成时，如同其它引物，非预期的延伸产物在其3'端以C结束。当该产物与其它引物相互作用时，3'C阻止进一步的延伸，因为3'C不能与引物上的任何其它碱基配对。

示例7：错配结合试剂稳定引物模板杂交

可以使用具有错配的引物进行扩增。当将更多的错配引入到引物中时，引物-模板杂交效率变低。在该示例中，在反应中加入了错配结合试剂，以稳定引物-模板杂交并提高扩增效率。

为了测试错配结合剂对引物-模板杂交的影响，将具有不同程度错配的合成寡核苷酸对与错配结合试剂混合。通常，在10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl₂、0.2mMdATP、0.2mM dTTP、0.2mM dGTP、1X SYBR green II的存在下，寡核苷酸提供为0.1-1μM。在0x、0.001x、0.01x、0.1x或1x浓度的寡核苷酸中提供错配结合试剂。按下列条件进行熔解曲线分析：将混合物加热至95℃达1分钟，以使两种寡核苷酸完全变性；然后将混合物缓慢冷却至根据两种寡核苷酸的理论解链温度修正的所需温度，例如假设没有错配，比一种寡核苷酸的解链温度低10-20度；然后将混合物每步加热0.1-0.3℃，每步收集一次荧光信号。绘制各种错配度的寡核苷酸和不同量的错配结合试剂的熔解曲线，并计算解链温度。选择错配结合试剂用于扩增，所述错配结合试剂增加具有错配的寡核苷酸的解链温度。

25μl的扩增反应物包含模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入三核苷酸引物至浓度为100nm、200nM、400nM或800nM。在反应中加入错配结合试剂至其浓度与引物浓度的比值为1:1000、1:100、1:10、1:1、10:1、100:1、1000:1。PCR循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。

示例8：三核苷酸引物和四核苷酸引物之间的引物二聚体形成的比较

我们已经比较了三核苷酸引物与三种核苷酸dNTP和四核苷酸引物与四种核苷酸dNTP之间的引物二聚体形成。在该示例中，我们比较了又一种情况下的引物二聚体形成：三核苷酸引物与四种核苷酸dNTP。设计三核苷酸型引物，以扩增靶向血红蛋白(Hemo1F、Hemo1R、Hemo2F、Hemo2R)、PPIA(PPIAF和PPIAR)、GAPDH(GAPDHF、GAPDHR)和YWHZ(YWHZ1F、YWHZ1R、YWHZ2F、YWHZ2R)的人类基因组序列。四核苷酸型引物(常规引物1-12)设计用于HPV检测，但在这里用于与三核苷酸引物进行比较。所有反应都含有12个寡核苷酸。

25μl PCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。在与4种dNTP的反应中，加入0.2mM dCTP。加入三核苷酸型引物和常规四核苷酸型引物至总浓度为2.62μM。在StepOne^TM实时PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。不存在模板。实施PCR后，在1.5％琼脂糖凝胶上对混合物进行凝胶电泳。任何可检测的产物将会由引物二聚体形成导致的扩增结果。

图9示出了琼脂糖凝胶图像。泳道1是一个DNA梯状条带。泳道2是具有三种核苷酸dNTP的三核苷酸型引物。泳道3是具有四种核苷酸dNTP的三核苷酸型引物。泳道4是具有四种核苷酸dNTP的四核苷酸型引物。使用三核苷酸型引物的这两个反应都没有任何可见的产物，而四核苷酸引物在不存在模板的情况下形成引物二聚体。

示例9：使用具有1种或2种非充分核苷酸的限制性引物(constrained primers)的 PCR

某些模板不适用于设计三核苷酸型引物。例如，当错配非常接近于一个或两个引物的3'端，或者当必须存在许多错配时，引物可能是不适合的。在这种情况下，可以使用具有1或2种非充分核苷酸的限制性引物。如果需要，这些引物相对于模板可仍然具有错配，但是具有不超过2种的非充分核苷酸，以尽可能减少引物相互作用。

针对靶向atm和csf1r.ATM_F和ATM_R(各包含1个G和2个错配)的人类基因组序列设计了两组引物。CSF1R_F和CSF1R_R各包含2个G。预期产物大小为301bp和232bp。25μl PCR反应包含10ng人类基因组DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，0.2mM dCTP，1X SYBR green II，400nM的每种引物以及1.25UAmpliTaq Gold DNA聚合酶。在StepOne^TM实时PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、72℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒、72℃30秒”循环35次。在1.5％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行凝胶电泳。

图10A示出了琼脂糖凝胶图像。泳道1是DNA梯状条带。泳道2是atm PCR产物。泳道3是csf1r PCR产物。

实施无模板对照反应来比较限制性引物和常规四核苷酸引物的引物二聚体形成。25μl PCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mMdTTP，0.2mM dGTP，0.2mM dCTP，1X SYBR green II和1.875UAmpliTaq Gold DNA聚合酶。将两种限制性引物(ATC-1G-1至ATC-1G-10，ATC-2G-1至ATC-2G-10)和常规四核苷酸引物(常规1-10)与10个寡核苷酸进行多重扩增，并且添加至总浓度为50μM。在StepOne^TM实时PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。在退火步骤收集荧光信号。

图10B示出了具有1个G(非充分核苷酸)的限制性引物随时间变化的荧光性。图10C示出了具有2个G的限制性引物随时间变化的荧光性。

图7

示出了常规四核苷酸型引物随时间变化的荧光性。两种限制性引物都减少了引物二聚体的形成，并且直到40次循环才检测到假阳性扩增。常规四核苷酸引物具有强烈的引物相互作用，并且在约25次循环时始终出现假阳性扩增。

示例10：Toehold引物

当需要扩增某些靶序列但没有足够长度的三核苷酸型序列可用于靶时，可以使用Toehold引物。Toehold引物的5'片段和3'片段都可以与靶序列结合，因此引物-模板杂交的效率比短的三核苷酸型引物的效率要高。然后，三核苷酸型人工接头用作延伸的模板，并为后续的循环提供足够的引物-模板结合长度。由于省略了一种类型的核苷三磷酸单体，因此5'片段的四核苷酸型性质不会显著增加非预期的扩增。也可以以低浓度提供Toehold引物，以进一步降低非预期扩增的可能性。

25μl PCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.25UAmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入三核苷酸引物至浓度为100nM、200nM、400nM或800nM。通常加入Toehold引物至浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、400nM、800nM。PCR循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。

示例11：三核苷酸引物的三向连结形式

图16A示出了待扩增的模板。在图16B中，三向连结辅助子的四核苷酸型5'区域(序列4)与模板杂交。正向引物(序列1)与紧随序列4的杂交区域的模板杂交。连接至正向引物(序列2)的5'端和三向连结辅助子(序列3)的3'端的人工片段彼此互补，并且一起杂交以稳定完整的结构并引发聚合酶延伸。在另一条链上，反向引物在序列1杂交的三核苷酸区域中杂交并延伸。在图16C中，正向引物延伸产物与反向引物杂交并产生全长产物。三向连结形式可应用于两种引物。

25μl PCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入三核苷酸引物至浓度为100nM、200nM、400nM或800nM。通常加入三向连结辅助子至浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、400nM、800nM。PCR条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。

示例12：使用有限量的四种核苷单磷酸之一的三核苷酸错配引物或限制性引物 PCR

当三核苷酸型引物缺少G且具有至少一个错配而用于三核苷单磷酸的扩增时，引物延伸在需要dCTP时停止。中间产物将彼此杂交或与引物杂交以延伸成完整的产物。当dCTP的数量有限时，在引物延伸中并入dCTP会产生更多的模板，因此将会产生更多的中间产物用于三核苷酸引物PCR，从而提高PCR效率。限制性引物优选地含有不超过2个G。当模板允许时，提供有限数量的dCTP，以便扩增PCR；然而它仍然限制了引物二聚体的形成或与模板的非特异性扩增。

针对HPV设计了一组引物：正向引物中含有1个G，而反向引物中含有2个G(11-1G-F、11-2G-R)。25μl PCR反应含有1pgHPV11 DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mMMgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，4X SYBR green II，400nM的每种引物以及1.875U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。在与dCTP的反应中，加入1μM(常规量的1/200)dCTP。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。在退火步骤收集荧光信号。

图11A示出了使用1μM dCTP的限制性引物PCR随时间变化的荧光性。图11B示出了不含dCTP的限制性引物PCR随时间变化的荧光。图11C示出了限制性引物随时间变化的荧光，以及使用1μMdCTP的无模板对照。低至1μM的dCTP足够用于限制性引物的扩增。当没有提供dCTP时，引物延伸在需要dCTP时停止。因此只形成短的双链产物，从而得到延迟的扩增曲线和低的扩增信号。在无模板对照中，使用1μM dCTP，在60次循环中没有形成引物二聚体。

示例13：通过加入第四核苷单磷酸作为ddNTP，用三核苷酸型引物减少多重PCR中 的非特异性扩增

三核苷酸型引物也可以减少非特异性模板扩增，因为引物不能在没有dCTP的情况下在非特异性引发位点延伸长序列。当在PCR反应中提供ddCTP时，非特异性引物延伸随时遇到模板上的G，ddCTP被并入并防止该产物进一步延伸。然而，特异性三核苷酸引物PCR不并入ddCTP，因此不受加入ddCTP的影响。我们设计了三核苷酸引物，用于在患者宫颈样本中检测HPV56。人类基因组DNA始终大量存在于患者样品中。有时HPV56引物可以与人类基因组DNA反应，并且在不存在HPV56 DNA时具有非特异性扩增。当将ddCTP以0.2mM加入到反应中时，非特异性扩增速率下降至无法检测的水平。

5μl的PCR反应物含有100ng人类基因组DNA模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II，400nMHPV56引物和400nM人YWHZ引物，以及1.875U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。对于ddCTP反应，加入0.2mM ddCTP。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，以及“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。

在PCR反应中使用了HPV56引物(56MM1F、56MM1R)和人YWHZ引物(YWHZF1Tm尾巴、YWHZR1Tm尾巴)。重复与ddCTP的反应，使得具有非特异性扩增产物。重复没有ddCTP的反应，没有观察到非特异性扩增。图12示出了凝胶图像。泳道1是DNA梯状条带。泳道2显示出当不提供ddCTP时，116bp处为YWHZ产物，81bp处为非特异性HPV56引物产物。泳道3显示出当提供ddCTP时，仅存在YWHZ产物。

示例14：使用熔解曲线分析对多模板进行多重检测

如示例13所示，我们设计了三核苷酸型HPV引物来检测患者样品中的HPV与人YWHZ引物(作为内部对照)。当使用DNA嵌入染料SYBR Green作为信号检测试剂时，使用相同的染料来检测HPV和内部对照。为了区分这两种类型的反应，对引物进行修饰，使得HPV和内部对照的PCR产物具有不同的Tm，并且通过熔解曲线分析进行分离。仅用人类基因组DNA作为模板作为阴性对照。

25μl PCR反应包含10pgHPV56 DNA模板，10ng人类基因组DNA模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和1.875U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。对于每种引物，引物浓度是100nM。在阴性样品中，不添加HPV56DNA。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒”循环10次，“95℃15秒、65℃30秒”循环50次。在退火步骤记录荧光信号，在循环程序结束时进行熔解曲线分析。

图13A示出了在72.47℃和79.86℃下产生的两个分辨率良好的熔解曲线峰，与HPV56和人YWHZ产物相对应。相反，在图13B中，阴性对照没有显示出72.47℃熔解曲线峰，表明不存在HPV56。

示例16：使用荧光标记的三核苷酸引物的实时PCR检测

除了基于SYBRGreen的检测，我们还用三核苷酸引物测试了基于荧光的检测。荧光标记的引物能够实现高度多重性，并能够在单管反应中进行多通道检测。我们在人YWHZ引物上添加了人工三核苷酸尾巴，并在5'端用FAM荧光团标记了尾巴，用淬灭剂标记了与人工尾巴互补的探针。我们细致地设计了Tm低于引物的尾巴/探针序列，使得可以在更高的退火温度下发生延伸，以确保完全延伸至尾部区域，之后淬灭剂探针在较低温度下与游离的荧光引物杂交而用于信号检测。在反向引物过量提供以优先产生链(通过荧光标记的引物检测到)的PCR反应中，不对称的引物浓度可有利于测定(图22)。由于信号的产生依赖于反向引物延伸，因此过量的反向引物增强了信号，从而提高了反应的效率。

25μl PCR反应包含10ng人类基因组DNA模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，100nM荧光标记引物，100nM BHQ-探针和100nM反向引物。在StepOne^TMReal-Time PCR系统上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、50℃30秒和50℃15秒”循环60次。在第二个50℃步骤记录荧光信号。

图20A示出了模板扩增随时间变化的荧光性。图20B示出了无模板对照反应随时间变化的荧光性。用FAM标记的引物较好地检测到10ng人类基因组DNA。在对照中未观察到来自引物二聚体的扩增产物。

示例17：使用通用荧光标记引物的多重扩增

最后一个示例中的荧光直接标记的引物能够实现高水平的多重扩增和多通道信号检测。然而，引物的单独标记不具有成本效益。在该示例中，我们设计了一种荧光标记的通用引物，其可以检测多重反应中的多种产物。除了常规的三核苷酸PCR引物之外，我们在每个引物的5'端引入通用的三核苷酸尾巴。在反应中，包括了具有与引物尾巴相同序列的通用引物。通用引物也用双链序列加尾，其中一条链是三核苷酸序列，并且用荧光团标记，互补链用淬灭剂标记。我们使用YWHZ引物来设计测定。我们使用不对称PCR来优先产生由通用引物检测到的链。我们证明荧光标记的通用引物可以与三核苷酸多重PCR反应组合以有效地扩增多个靶序列。

25μl PCR反应包含100ng人类基因组DNA，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mMMgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，100nM荧光标记的通用引物，100nM BHQ-探针，100nM加尾的YWHZ正向引物和400nM YWHZ反向引物。在BioRad CFX96实时PCR仪上进行PCR循环。循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、50℃30秒和50℃15秒”循环60次。在第二个50℃步骤记录荧光信号。

图21A试出来了模板扩增随时间变化的荧光。图21B示出了无模板对照反应随时间变化的荧光。用FAM标记的通用引物容易地检测到100ng的人类基因组DNA。在无模板对照中未检测到来自引物二聚体形成的扩增产物。

示例18：Taqman探针形式

在这种形式中，不在引物上标记荧光，而是在探针上标记荧光作为Taqman探针形式。当反向引物延伸至Taqman探针时，DNA聚合酶的5'外切核酸酶活性酶切探针，从而释放待检测的游离荧光。

在该示例中，三核苷酸引物用通用人工序列加尾。在PCR反应中，提供了Taqman形式探针。探针与通用人工序列互补，并用荧光团和淬灭剂标记。以一种引物作为所述形式或两种引物作为所述形式进行PCR。当引物延伸与Taqman探针相遇时，DNA聚合酶的5'外切核酸酶活性酶切探针，并将荧光团与淬灭剂分离，从而产生荧光信号。

25μl的PCR反应包含模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mMdATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP和1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入三核苷酸引物至浓度为100nM、200nM、400nM或800nM。通常加入Taqman探针至浓度为100nM、200nM、400nM。PCR循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒”循环60次。

示例19：分子信标形式

在反应中提供了荧光标记的分子信标。正向引物用含有与分子信标相同序列的三核苷酸人工序列加尾。当反向引物延伸到人工序列并产生其互补序列时，分子信标与该序列杂交，荧光不再被淬灭并被检测到。

在该示例中，三核苷酸引物用通用人工序列加尾。在PCR反应中，提供了分子信标形式探针。该探针具有发夹结构并用荧光团和淬灭剂标记。作为游离探针，它仍然是发夹结构，并且荧光团被淬灭。该探针的环序列与通用人工序列相同。当进行PCR时，引物延伸产生通用人工序列的互补序列。探针现在与互补序列杂交并且不再是发夹结构。这导致荧光团和淬灭剂的分离，从而产生荧光信号。

25μl的PCR反应包含模板，10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mMdATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP和1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入三核苷酸引物至浓度为100nM、200nM、400nM或800nM。通常加入分子信标探针至浓度为100nM、200nM、400nM。PCR循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒”循环60次。

示例20：全基因组扩增

含有一个非充分核苷酸的限制性随机三核苷酸引物用人工序列加尾。这些随机引物用于扩增全基因组DNA。使用通用引物进一步扩增PCR产物，通用引物的序列与随机引物的人工序列相同。扩增产物可用于测序。

不同于采用温度循环进行的PCR技术，三核苷酸型引物也用于在恒温下进行的等温扩增，并且不需要热循环仪。扩增产物可以通过添加SYBR绿色染料或荧光标记的探针进行检测。通常用链置换DNA聚合酶进行等温扩增。

25μlPCR反应包含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP，1X SYBR green II和2.5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。通常加入随机引物至浓度为100nM、200nM、400nM、800nM、1μM、2μM、5μM或10μM。PCR循环条件如下：95℃10分钟，“95℃15秒、60℃30秒、72℃60秒”循环60次。在二次PCR反应中，来自先前反应的产物以1:10、1:100、1:1000或1:10000稀释，并且加入1μl的稀释液作为模板。通常以100nM、200nM、400nM或800nM的浓度使用通用引物。其它试剂以类似的方式提供。对于等温反应，在60℃下培养扩增达所需时间。

示例21：等温扩增

在该示例中示出了四种类型的等温扩增：环介导的等温扩增(LAMP)，切口酶扩增反应(NEAR)，转录介导的扩增(TMA)，滚环扩增(RCA)，解旋酶依赖性扩增(HDA)，指数扩增(EXPAR)，杂交链式反应(HCR)，催化发夹装配(CHA)。

LAMP通常在总共25-100μl的反应混合物中进行，该反应混合物包含0.1-0.8mMFIP和0.1-0.8mM BIP，0-0.2mM的每种反向引物，0.1-0.4mM的每种环引物，0.8-1.6mMdNTP，0.25-1M甜菜碱，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2-4mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，4-8单位的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs公司)和指定量的双链靶DNA。在60℃下培养混合物并进行实时分析。用SYBR绿色染料或荧光标记的探针检测扩增。

NEAR通常在总共10-100μl的反应混合物中进行，该反应混合物包含模板，45.7mMTris，13.9mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，50mM NaCl，0.5mM DTT，15mM MgCl₂，0.1％Triton X-100，0.008mM EDTA，6μg/mL BSA，3.9％甘油，0.1-0.3U/μL切口酶，0.1-0.4U/μL链置换酶0.1-0.8μM的每种引物。在54-60℃下培养混合物，用荧光标记的探针检测扩增。

TMA通常在总体积为25-100μl的反应混合物中进行，该反应混合物包含2mM的每种dNTP，8mM的每种rNTP，80mM Tris-HCl(pH 7.5，25℃)，50mM MgCl₂，35mM KCl，10％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和0.1-1μM的具有启动子序列的引物和反向引物。将反应混合物在油下于60℃培养10分钟以使RNA变性。然后将混合物冷却至42℃达5分钟，之后在8mM Hepes(pH7.5)、50mM N-乙酰基-L-赖氨酸、0.04mM乙酸锌，80mM海藻糖、140mM Tris-HCl(pH8.0，25℃)、70mM KCl、1mM EDTA、0.01％(w/v)酚红、10％(v/v)Triton X-100和20％(v/v)甘油中加入含有MMLV逆转录酶(2000单位/测定)和T7 RNA聚合酶(2000单位/测定)的酶混合物，并且在42℃下继续培养60分钟。

RCA扩增反应通常在50μl含有以下物质的混合物中进行：模板，8U Bst DNA聚合酶(New England Biolabs公司)，100-800nM的每种RCA引物和400μMdNTP混合液。将混合物在65℃下培养60分钟，并在10℃冷却。

用SYBR绿色染料或荧光标记的探针检测扩增产物，扩增产物也可用于其它应用。

HDA扩增反应通常在50μl含有以下物质的反应中进行：1×HDA缓冲液(360mMTris-醋酸盐(pH7.5)，250mM KOAC，100mM DTT，1mg/ml BSA和50mM镁乙酸盐)，模板，0.1-0.8μM的每种引物，0.4mMμl dNTP，4mM ATP，DNA聚合酶，解旋酶和T4 gp32。扩增反应在没有初始变性的情况下进行(例如，加入如上所述的试剂)，或者在初始变性和退火(例如，在初始步骤完成后加入DNA聚合酶和解旋酶)的情况下进行。将反应物在37℃培养1小时。用SYBR绿色染料或荧光标记的探针检测扩增产物。EXPAR扩增反应通常在60℃下进行。反应包含85mM KCl，25mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，2.0mM MgSO₄，5mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％(体积：体积)Triton X-100，0.5mM DTT，切口酶，Vent外切聚合酶，400μM dNTP，10μg/mlBSA，模板和引物。用SYBR绿色染料或荧光标记的探针检测扩增产物。

HCR反应通常在4-50μL含有以下物质的反应中进行：1×HBN缓冲液(150mM Na₂HPO₄和1.5M NaCl，pH 6.8)，1.0μM的发夹H1，1.0μM的发夹H2和0.1-1μM引发剂。该反应在以下条件下进行：在水浴中煮沸5分钟，然后逐渐冷却至室温达1小时。

CHA反应通常在含有以下物质的混合物中进行：10-1000nM的发夹H1，10-1000nM的发夹H2，50-1000nM的报告基因双链体(荧光标记的寡核苷酸：淬灭剂标记的寡核苷酸＝1:2)，1×TNaK缓冲液(20mM Tris，pH7.5，140mM NaCl，5mM KCl)，在使用前，立即在TNaK缓冲液中分别将H1和H2重新折叠(90℃下持续1分钟，然后以0.1℃/s冷却至室温)。然后加入靶寡核苷酸，在37℃下培养反应以用于荧光检测。

序列表

<110> 阿提拉生物系统公司

<120> 利用有限核苷酸组成的引物扩增

常规引物1 gtccattgcaggtttactgtgcagcattcgagtgctggagcagatgtt 1

常规引物2 gtgaaggtacaaatgaggaggggcgatattgtgtcccctgtatgtttttcc 2

常规引物3 gtggtgttacaagtgtgacaacaggttaggaccggccagatggacaa 3

常规引物4 agttcgtttatgtgtcaacagtacagcacaggtagggcacacaatattcactg 4

常规引物5 cggtaccccctcgaagtcgtttgtccataccaaagcctgctccgt 5

常规引物6 Acaaccccaccaagcgagtgcgacccggtctttgtttgtgcagtcag 6

常规引物7 ctaccagctgcagtgtgttgttacacgggatgaaccacagcgtca 7

常规引物8 tagaagcctcacgggatactctgcgggtttgcagttgcacaccacg 8

常规引物9 tcctagtgagtccataaacagctgctgctgcagctggtagtagaagcc 9

常规引物10 gtgcaactgcaaaccagtaacctgctgcctgtactagaaaccatccgtt 10

常规引物11 accgtggacttagatccgtctccacatgcaggaggcagcaagga 11

常规引物12 agtgggcacaaaaaagcaaaacgacgctgagtctctgcagcttccacttc 12

常规引物13 ctccactgctttccactgccagttgcgtgttacagaattgaagctccgt 13

常规引物14 ccttcgcgttgtacagcagatgttagtccatcgccgttgctagt 14

常规引物15 gccgtaatgtgctatcacaactgtgaggccagatggacaagcagaacaa 15

常规引物16 gcattcatagcactgcgacggaccttctatagccgtgcacagccgg 16

常规引物17 ggtctacttcatcctcatcctcatcctataccacaaactgagattgacctgc 17

常规引物18 agccacagcaagctagacgggacgagccaactgcaccaacgactc 18

常规引物19 caactgcaccacaaacttacactgacagcggccacagcaagctaga 19

常规引物20 acattcagagtaccaaagaggacctgcgcgcagagtgggcacgttac 20

常规引物21 ccgtccaagcctatttcatcctcgtctatttacatcctgaaccaactgacct 21

常规引物22 atggacaagcacaaccggccacagctactgttgatacacaaacgaaccgtg 22

常规引物23 atggtgtttattgctgtgcacagctagacaaccgacgtacgaaccct 23

常规引物24 tggatgaccctgaaggtacaaacgggctcctgttcttcgttctattaccgc 24

常规引物25 accgtggtgccacaagtgtaacgggccagatggacaagcacaac 25

常规引物26 caacagtacaacaaccgacgtacgaactgtttattgctgtgcacagctagg 26

常规引物27 ctcgcgctctgcctgtacacatgcaacagatacaggttcagactt 27

常规引物28 gcacaggccttgtttaatgtgcaggatctatactgcacccaaactttcgtt 28

常规引物29 ccataagcagctgttgtaccacacgtgtgagttggtggtgcagttg 29

常规引物30 aacgtgcccactctgcgcaccacaacatcccatcccctcc 30

常规引物31 caactgcaccaccaactcacacttacaacagcaagctagacaagctgaac 31

常规引物32 ccaaagaggagctacgtgtggtacaacccattgcagttatttagatgatgcgc 32

ATC随机引物1 aatacctcctcactctcacccaatttctcccccaacaccc 33

ATC随机引物2 acaccacacataatttcacctctctatctcccacccccac 34

ATC随机引物3 tcccctccctttactcccatttcaccttaaccttcccaac 35

ATC随机引物4 ccataaactactcccatatcttcccattccccttcctccc 36

ATC随机引物5 aactaccatccttctctacatcctctccaaatctcccccc 37

ATC随机引物6 cacaccataccatcccactcccatttactttctacccctc 38

ATC随机引物7 tcctatccccccttccatatcaccccctatccccttcacc 39

ATC随机引物8 accactcttcctcacaacatatccttcctccacccacacc 40

ATC随机引物9 aaccccctacaaaatccccaccaccaaccccatctacacc 41

ATC随机引物10 ccaccaccaactataacttcattcctctcacttccctccc 42

ATC随机引物11 accccttaaaacccacctactccatacctcccctcaaccc 43

ATC随机引物12 atcccccatacccaatctctatcctatcacaccaaccacc 44

ATC随机引物13 acacctaattaccctctccaaccttactccctcattcccc 45

ATC随机引物14 cttacacactcttccatcctccctctaaaccacctctctc 46

ATC随机引物15 ccccattttaacccctccccaaacaacacctacaactccc 47

ATC随机引物16 cccactacatctttcccttctactcctacctactcccatc 48

ATC随机引物17 aacctccacctaccattcctcccacaactcacacaccctc 49

ATC随机引物18 ctttataccccaaaccatatcctttaccccttccctcccc 50

ATC随机引物19 ctcctccattcaccttccacctcttttcaaacccaacacc 51

ATC随机引物20 aatccccaccaaaccatctactatcattccctccatcccc 52

ATC随机引物21 aattaaacttcctccacccttccttccaaccaccccacac 53

ATC随机引物22 taactcaactaatttcttaccttccacctcccccccctcc 54

ATC随机引物23 tacccctacccacaccccctcaactaaaccatacactaac 55

ATC随机引物24 ccctcattttctcaaacacaaccctctcctcactctcccc 56

ATC随机引物25 ctatacccatccctaaacacatcaactccaccctcttccc 57

ATC随机引物26 tcccaatcctatctcacactccttctccacccccccaacc 58

ATC随机引物27 tctccctactaactaaccatcctcccctccaaaccacttc 59

ATC随机引物28 ctaccccctctactactactcacaccccccactaacttac 60

ATC随机引物29 cccatacatcaaactctcattatcccctccacccccaccc 61

ATC随机引物30 ttcaccccccaaaccatcccttccctctcactccctcctc 62

ATC随机引物31 atattaacacccttctccctcacatccccacttccttccc 63

ATC随机引物32 acaacaacacctccccctaaaccaaccaacccctcctaac 64

Hemo2F aatttctattaaaccttcctttcttccctaactccaactactaaac 65

Hemo2R cacaatccacatcctcaacccccttcataatatccccc 66

HPV11-1F cttatcttacctccacacctaataccctttcacaatc 67

HPV11-1R ccaccatacccaccactattttctacatcatc 68

HPV11MM1F tacaatcaacaacatcctcactcacaattacaac 69

HPV11MM1R taaacaaccacacaaacaaccatctatcaccatc 70

Hemo1F cccttcatcttttctttccccttcttttc 71

Hemo1R ccctcttacttctccccttcctatcacatcaacttaacc 72

PPIAF ctcttactctaccatttcccttctatttaacccttctattc 73

PPIAR ccaaatctccaaccttcaaactttaaacccaacttcaaac 74

GAPDHF ccatcaataaactaccctctcctcaaccacttacttctcctctcttattc 75

GAPDHR ccaccttccctcccctctcccccacaccc 76

YWHZF1 ccctttccttactttctcatcaaatcattccaacaacc 77

YWHZR1 tttctcaattccacataccaatttctaatccc 78

YWHZF2 tctttccatctcccatcatcccctctcttcctccccaccc 79

YWHZR2 tttctaatcaatccccccctctcccacaaaaaataccaactcatttttttc 80

ATM_F cttattcccaaggcctttaaactgttcacctcac 81

ATM_R catatactgaagatcacacccaagctttccatcc 82

CSF1R_F ctccctgtcgtcaactcctc 83

CSF1R_R ccctcccaccctcaggactataccaatc 84

ATC-1G-1 aatacctcctcactctcacccaatttctcccccaagaccc 85

ATC-1G-2 acaccacacataatttcacctctctatctcccaccccgac 86

ATC-1G-3 tcccctccctttactcccatttcaccttaacgttcccaac 87

ATC-1G-4 ccataaactactcccatatcttcccattcccgttcctccc 88

ATC-1G-5 aactaccatccttctctacatcctctccaaatctgccccc 89

ATC-1G-6 cacaccataccatcccactcccatttagtttctacccctc 90

ATC-1G-7 tcctatccccccttccatatcaccccctatccccttcagc 91

ATC-1G-8 accactcttcctcacaacatatccttcctccagccacacc 92

ATC-1G-9 aaccccctacaaaatccgcaccaccaaccccatctacacc 93

ATC-1G-10 ccaccaccaactataacttcattcctgtcacttccctccc 94

ATC-2G-1 aatacctcctcactctcacccaatttctcccccaagaccc 95

ATC-2G-2 acaccacacataatttcacctctctatctcccagcccgac 96

ATC-2G-3 tcccctccctttactcccatttcaccttaacgttccgaac 97

ATC-2G-4 ccataaactactcccatatcttcccattcccgttcctgcc 98

ATC-2G-5 aactaccatccttctctacatcctctccaaatctggcccc 99

ATC-2G-6 cacaccataccatcccactcccatttagtttctacgcctc 100

ATC-2G-7 tcctatccccccttccatatcaccccctatccccttgagc 101

ATC-2G-8 accactcttcctcacaacatatccttcgtccagccacacc 102

ATC-2G-9 aaccccctacaaaatccgcaccaccagccccatctacacc 103

ATC-2G-10 ccaccaccaactataacttcattcctgtcacttgcctccc 104

11-1G-F ccctttacatttccaaatccattcccctttgac 105

11-2G-R catctcatagttcatatactgcattcccatttc 106

56MM1F attactctctcactaaccacaataccaaaacaaacattccc 107

56MM1R ccaaccctaccctaaataccctatattcatatccactaac 108

YWHZF1Tm尾部 accacacacccacaccaccacccacacccctttccttactttctcatcaaatcattccaacaacc 109

YWHZR1Tm尾部 cccttcctctcctctccctctcaactttctcaattccacataccaatttctaatccc 110

YWHZF1加尾部F FAMacctccaccctccccctttccttactttctcatcaaatcattccaacaacc111

YWHZF1通用尾部

accacacacccacaccaccacccacccctttccttactttctcatcaaatcattccaacaacc 112

UP F FAMacctccaccctccaccacacacccacaccaccacccac 113

淬灭剂探针 ggagggtggaggtBHQ 114

Claims (70)

1.一种扩增目标核酸的链段的方法，包括：

使包含目标核酸的样品与正向和反向引物接触；以及

进行扩增反应，其中所述目标核酸的链段的扩增产物通过正向和/或反向引物的延伸而形成，所述目标核酸作为模板；

其中引物中的四种标准核苷酸类型的一种或多种是非充分的，所述引物中的非充分核苷酸类型是相同的，在每个所述引物中，所述非充分核苷酸类型存在于两个或更少的内部位置和/或5'末端位置；

其中所述方法采用复数对正向和反向引物多重进行，形成复数个链段的扩增产物，所述非充分核苷酸类型在每对中是相同的；在每对的每个引物中，所述非充分核苷酸类型存在于两个或更少的内部位置和/或5'末端位置。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸具有链，所述链含有正向引物结合位点的互补区和反向引物结合位点。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸具有链，所述链含有正向引物结合位点和反向引物结合位点的互补区。

4.如上述任一项权利要求所述的方法，其中所述目标核酸的链段的扩增产物占由所述正向和反向引物的延伸而形成的所有扩增产物中的至少99％。

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述正向和反向引物对于正向和反向引物结合位点的互补性比对于所述样品中任何其他支持扩增的引物结合位点对的互补性更高。

6.如权利要求1-3任一项所述的方法,其中所述正向和反向引物有且仅有四种非充分的标准核苷酸类型中的一种。

7.如权利要求2所述的方法,其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点在所述正向和反向引物中的非充分核苷酸类型的互补核苷酸方面是非充分的。

8.如权利要求7所述的方法,其中所述正向和反向引物具有不多于两个单位的非充分核苷酸类型，且所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点具有不多于四个单位的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型。

9.如权利要求7-8任一项所述的方法,其中所述正向和反向引物具有不多于一个单位的非充分核苷酸类型，且所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点具有不多于三个单位的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型。

10.如权利要求7-8任一项所述的方法,其中所述正向和反向引物由除了非充分核苷酸类型之外的三种核苷酸组成，且所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点由除了所述正向和反向引物中的所述非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型之外的三种标准核苷酸类型组成。

11.如权利要求1-3、7-8任一项所述的方法，其中所述正向和反向引物各自在5’末端具有一个单位的所述非充分核苷酸类型。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述正向和反向引物具有四种非充分的标准核苷酸类型中的两种。

13.如权利要求12所述的方法，其中正向引物结合位点和反向引物结合位点在所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型方面是非充分的。

14.如权利要求2、7、8任一项所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区是连续的。

15.如权利要求2、7、8任一项所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区被一段区域分隔开，该区域不含有所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型及其互补核苷酸类型。

16.如权利要求2、7、8任一项所述的方法，其中所述正向引物结合位点和所述反向引物结合位点的互补区被一段区域分隔开，该区域含有所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型或其互补核苷酸类型或两者。

17.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法,其中所述正向和/或反向引物的3’核苷酸与所述正向和反向引物的所述非充分核苷酸类型之一是互补的。

18.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的3’核苷酸是C或G。

19.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物含有非天然核苷酸，所述非天然核苷酸是肌苷、isoC、isoG、7-去氮-2'-脱氧鸟苷或7-去氮-2'-脱氧腺苷。

20.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法,其中所述正向和/或反向引物含有至少一种非天然核苷 酸类型，所述非天然核苷酸类型是肌苷、次黄嘌呤、氮杂羧胺衍生物、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、硝基咪唑、3-硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、5-咪唑、4-5-二唑酰胺或5-硝基吲唑。

21.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法,其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有人工寡核苷酸，所述人工寡核苷酸具有与所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述人工寡核苷酸包含非天然碱基。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述非天然碱基为肌苷。

24.如权利要求1-3、7-8、12、13任一项所述的方法，其中所述扩增反应是采用核苷酸三磷酸单体进行的，去除了与所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型互补的核苷酸三磷酸单体。

25.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23任一项所述的方法，其中所述扩增反应中存在全部四种标准核苷酸三磷酸单体。

26.如权利要求25所述的方法，其中相对于其他的核苷酸三磷酸单体，所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸三磷酸单体以更低的浓度存在。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸三磷酸单体以双脱氧核苷酸三磷酸提供。

28.如权利要求25所述的方法，其中dNTPs包括7-去氮-2'-脱氧腺苷三磷酸和/或7-去氮-2'-脱氧鸟苷三磷酸。

29.如权利要求2、7、8任一项所述的方法,进一步包括搜寻目标核酸链的序列，以寻找所述正向引物结合位点的互补区和所述反向引物结合位点，其中所述搜寻是通过计算机进行的，所述计算机被编程以通过寻找ATC和ATG区域、ATG和ATC区域、CGA和CGT区域或CGT和CGA区域来识别所述正向引物结合位点的互补区和所述反向引物结合位点。

30.如权利要求2所述的方法,其中所述正向引物结合位点和/或所述反向引物结合位点包括至少一个单元的正向和反向引物的非充分核苷酸类型的互补核苷酸类型，且所述引物和引物结合位点的杂交导致至少一个错配。

31.如权利要求20所述的方法，其中所述正向和反向引物与引物结合位点的杂交导致所述引物中非天然核苷酸类型与引物结合位点的非充分核苷酸类型的互补核苷酸之间的配对。

32.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物在至少一个位置含有简并引物。

33.如权利要求30所述的方法，其中提供与正向或反向引物结合位点完全互补的第二正向或反向引物，所述第二正向或反向引物的浓度是正向或反向引物浓度的0.1至50％。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述扩增反应是在错配稳定剂的存在下进行的。

35.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有人工序列连接链段，所述人工序列连接链段具有与正向或反向引物相同的非充分核苷酸类型，其5’末端被连接有5’链段，所述5’链段包括四种标准核苷酸类型且与所述目标核酸互补。

36.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物是5’末端连接有人工链段的引物链段，所述人工链段具有与所述引物链段相同的非充分核苷酸类型，所述扩增反应是采用接合引物进行的，所述接合引物包括目标物结合位点以及所述人工链段的互补链；且所述接合引物的所述目标物结合位点包括全部四种标准核苷酸。

37.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸的其中一条链具有与其连接的所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型，其中所述双链寡核苷酸的熔融温度不同于由正向和反向引物延伸而形成的所述扩增产物的熔融温度；其中所述扩增产物的形成通过熔融曲线分析监测，其中主要熔融温度转变为从所述双链寡核苷酸的熔融温度转变至所述扩增产物的熔融温度。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述复数对所述正向和反向引物的每对的所述正向和/或反向引物连接到具有不同熔融温度的不同人工链段的不同的引物。

39.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有人工寡核苷酸，所述人工寡核苷酸具有与其连接的所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型，其中所述目标核酸的链段的扩增产物用荧光团和淬灭剂标记的寡核苷酸检测，所述寡核苷酸具有与所述人工寡核苷酸相同的序列，其与所述扩增反应中形成的所述人工寡核苷酸的互补链杂交，从而隔离开所述荧光团和所述淬灭剂，产生指示所述目标核酸的链段的所述扩增产物的存在的荧光信号。

40.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有单链人工寡核苷酸，所述单链人工寡核苷酸具有与其连接的所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型，其中所述单链人工寡核苷酸用荧光团和淬灭剂标记，通过正向和反向引物延伸而形成的所述链段的扩增产物隔离开所述荧光团和淬灭剂，产生指示所述目标核酸的链段的所述扩增产物的存在的荧光信号。

41.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38任一项所述的方法,其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有荧光标记的尾部，所述尾部具有与其连接的所述正向和/或反向引物相同的非充分核苷酸类型。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述正向和/或反向引物提供有荧光标记的尾部，所述荧光标记的尾部与淬灭剂标记的寡核苷酸杂交，在所述扩增反应过程中，所述寡核苷酸从引物上解离，将所述淬灭剂与所述荧光标记的尾部隔离开来，产生荧光信号。

43.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42任一项所述的方法，其中复数对所述正向和反向引物的每对中的所述正向和/或反向引物连接具有不同荧光标记的尾部。

44.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42任一项所述的方法，其中复数对所述正向和/或反向引物的每对中的所述正向和/或反向引物连接通用的5’人工链段，且所述扩增反应采用具有与所述通用的5’人工链段的互补链互补的3’链段的检测探针进行。

45.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有人工尾部，所述人工尾部具有与其连接的正向或反向引物相同的非充分核苷酸类型，且所述引物提供为与含有荧光团和淬灭剂的寡核苷酸杂交，其中所述荧光团或所述淬灭剂在所述扩增反应过程中从所述寡核苷酸上解脱，产生荧光信号。

46.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42任一项所述的方法，其中所述正向和/或反向引物的5’末端连接有尾部，所述尾部的非充分核苷酸类型与其连接的所述正向和/或反向引物相同，且提供有含有颈环的分子信号寡核苷酸，其一个环与5’尾部的互补链杂交，所述分子信号寡核苷酸的尾部具有荧光团和淬灭剂，其中所述分子信号寡核苷酸与所述链段的扩增产物杂交，从而隔离开所述荧光团和所述淬灭剂，并产生荧光信号。

47.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42任一项所述的方法,其中所述正向和/或反向引物具有3’信号链粘性末端和位于5’末端链段的颈环结构，且所述颈环结构的5’末端的最后一个核苷酸与非充分核苷酸类型互补。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述链段的扩增产物被连接以形成连接产物。

49.如权利要求47所述的方法，其中所述链段的扩增产物被连接以形成环状产物。

50.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49任一项所述的方法,其中所述样品与彼此间浓度不同的正向和反向引物接触。

51.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49任一项所述的方法,其中所述扩增反应是采用温度循环进行的。

52.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49任一项所述的方法，其中所述扩增反应是等温进行的。

53.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49任一项所述的方法，其中所述目标核酸的链段的扩增产物通过熔融曲线分析、毛细管电泳、质谱、实时荧光、测序或与微阵列杂交检测。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述目标核酸的链段的扩增产物通过其熔融峰值的出现而检测。

55.如权利要求53所述的方法，其中所述目标核酸的链段的扩增产物通过与所述正向和反向引物或连接到其5’末端的寡核苷酸相关的熔融峰值的消失而检测。

56.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55任一项所述的方法，其中正向或反向引物被连接到酶识别链段。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述酶识别链段是核酸酶或启动子识别位点。

58.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57任一项所述的方法,其中所述扩增反应被用于突变检测。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述突变检测为核苷酸插入、缺失、重排、转变、颠换、多态性和替换的检测。

60.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57、59任一项所述的方法，其中所述目标核酸被连接到分析物上，且所述目标核酸的链段的扩增产物的检测指示所述分析物的存在。

61.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸通过连接到结合在分析物上的抗体上而被连接到所述分析物上。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述目标核酸通过寡核苷酸的连接而形成，其中所述寡核苷酸连接到结合在所述分析物上的不同表位上的抗体上。

63.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57、59、61任一项所述的方法，其中所述正向和反向引物中的一种或两种均连接有荧光团，且检测到所述荧光团的荧光改变指示所述目标核酸的链段的扩增产物的存在。

64.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57、59、61任一项所述的方法,其中非充分核苷酸的互补核苷酸以连接有荧光团的核苷酸三磷酸提供，且检测到所述荧光团的荧光改变指示所述目标核酸的链段的扩增产物的存在。

65.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57、59、61任一项所述的方法,其中所述引物中的一种或两种均标记有第一标记，所述非充分核苷酸的互补核苷酸提供为连接有第二标记的核苷酸三磷酸，其中所述第一标记和所述第二标记之间的能量转换或淬灭指示所述目标核酸的链段的扩增产物的存在。

66.如权利要求1-3、7-8、12、13、22、23、26-28、31、34、38、42、48-49、54-55、57、59、61任一项所述的方法，其中至少一种引物标记有荧光团，且所述扩增反应是在双链DNA嵌入剂的存在下进行的，其中所述双链DNA嵌入剂嵌入到所述目标核酸的链段的扩增产物会淬灭来自荧光团的信号，指示所述目标核酸的链段的扩增产物的存在。

67.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增反应是在一种或多种含有标记的NTPs的存在下进行的，以标记所述目标核酸的链段的扩增产物。

68.如权利要求1所述的方法，其中所述正向和/或反向引物连接到表面上。

69.如权利要求68所述的方法，其中正向或反向引物在表面上占据模式化或随机位点。

70.如权利要求1所述的方法，其中所述目标核酸的链段的扩增产物通过微阵列分析、测序、磁珠或纳米球检测。

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