DE10236406C1 - Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren mit geringer Komplexität - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren, das die folgenden Schritte umfasst: DOLLAR A 1) die Isolierung einer Nukleinsäure-Probe, DOLLAR A 2) die Behandlung dieser Probe in einer Art, die zwischen methylierten und unmethylierten Cytosin-Basen in der Probe unterscheidet, DOLLAR A 3) das Amplifizieren von wenigstens einer Target-Sequenz in dieser behandelten Nukleinsäure mittels enzymatischer Amplifikation und eines Satzes von Primermolekülen, worin diese Primermoleküle dadurch charakterisiert sind, dass DOLLAR A a) jede Primermolekül-Sequenz ein vorher festgelegtes Maß an Komplexität erreicht, DOLLAR A b) jede Kombination zweier beliebiger Primermoleküle in dem Satz eine Schmelztemperatur unter einer spezifizierten Schwellenwert-Temperatur besitzt, DOLLAR A c) jede Kombination zweier Primermoleküle beim virtuellen Testen unter Verwendung der behandelten und der unbehandelten Proben-Nukleinsäure als Templat, unter Bedingungen, die eine Basenfehlpaarung oder mehr Basenfehlpaarungen pro Primer zulassen, nicht zur Amplifikation eines unerwünschten Produkts führt, DOLLAR A und DOLLAR A 4) das Detektieren dieser amplifizierten Target-Nukleinsäure. DOLLAR A Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren, wie DNA, mittels eines enzymatischen Amplifikationsschritts, wie einer Polymerase-Kettenreaktion, spezifiziert für Templat-Nukleinsäuren geringer Komplexität, d. h. vorbehandelter DNA wie, aber nicht begrenzt auf, mit Bisulfit vorbehandelter DNA. Die ...

Description

Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Gentechnik, der Molekularbiologie und Computerwissenschaft und genauer gesagt, das Gebiet der Nukleinsäure-Untersuchung, basie­ rend auf spezifischer Nukleinsäure-Amplifikation.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren, wie DNA, mittels eines enzymatischen Amplfikationsschritts, wie einer Po­ lymerase-Kettenreaktion, spezifiziert für Templat- Nukleinsäuren von geringer Komplexität, z. B. vorbehan­ delter DNA, wie, jedoch nicht begrenzt auf, mit Bisulfit vorbehandelter DNA. Die Erfindung basiert auf der Verwen­ dung spezifischer Oligonukleotid-Primermoleküle, um aus­ schließlich spezifische DNA-Stücke zu amplifizieren. Es wird offenbart, wie das Primer-Design für eine PCR zu op­ timieren ist, wenn die Templat-DNA von ungewöhnlich ge­ ringer Komplexität ist. Für das optimale Primer-Design wurde auch berücksichtigt, dass die behandelte Templat- DNA einzelsträngig ist.

Die Amplifikation von Nukleinsäuren stützt sich im We­ sentlichen auf ein Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ge­ nanntes Verfahren. Die PCR basiert auf der Aktivität des Enzyms DNA-Polymerase, welches Primermoleküle elongiert, die durch Hinzufügen von dNTPs an die Templat-DNA binden und dadurch die Templat-Sequenz kopieren (R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoeffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, T. Horn, K. B. Mullis und H. A. Erlich (1988). Primer­ directed enzymatic amplification of DNA with a thermosta­ ble DNA polymerase. Science 239: 487-491). Die Primermo­ leküle werden so designed, dass sie spezifisch an jene Regionen der Templat-DNA hybridisieren, welche beide En­ den des Amplifikats bestimmen. Der Vorwärts-Primer bindet an das 5'-Ende des Sense-Strangs des Amplifikats, wohin­ gegen der Reverse-Primer an das 5'-Ende des Reverse- Strangs bindet, wodurch die Startpunkte der Polymerase- Reaktion festgelegt werden und letztendlich die Länge des Amplifikats bestimmt wird.

Bevor die Polymerase beginnt, wird die Templat-DNA dena­ turiert, was gewöhnlich durch einen kurzen Zyklus des Er­ hitzens der Reaktionsmischung auf bis ungefähr 95°C, dann Abkühlen auf die Annealing-Temperatur, welche durch die Schmelztemperatur der verwendeten Primermoleküle be­ stimmt wird, geschieht, und schließlich wird es der Poly­ merase bei ihrer idealen Arbeitstemperatur für einige Mi­ nuten ermöglicht, die reassoziierten Primer zu elongie­ ren. Dieser Zyklus wird mehrere Male wiederholt, wobei jeder mit dem Denaturierungsschritt beginnt. Die Primer­ moleküle hybridisieren an die einzelsträngige DNA. Der Vorwärts-Primer ist das Startmolekül für eine Kopie des Sense-Strangs und der Reverse-Primer ist das Startmolekül für eine Kopie des Antisense-Strangs.

Diese ersten Kopien sind von unspezifischer Länge, nur begrenzt durch die Aktivität der Polymerase. Im folgenden Zyklus wird jedoch der Vorwärts-Primer auch an die erste Kopie des Antisense-Strangs binden, die Polymerase wird diese Kopie als Templat verwenden und wird den Primer nur so weit elongieren, wie dort Templat-DNA vorhanden ist. Hierdurch wird die Länge der zweiten Kopie auf die Länge begrenzt, die durch das erste Nukleotid des zweiten Pri­ mer festgelegt ist. In den folgenden Zyklen konkurrieren mehr und mehr Stücke von Templat-DNA um die Primermolekü­ le und letztendlich wird das DNA-Amplifikat mit definier­ ter Länge das Hauptprodukt sein.

Im Fall einer Bisulfit-behandelten DNA ist die Templat- DNA jedoch einzelsträngig. Die Bisulfit- oder eine gleichartige Behandlung verändert die Original-Sequenzen an beiden Strängen derart, dass diese nach der Behandlung nicht komplementär zueinander sind. Demzufolge existiert zur Target-Sequenz kein komplementärer Strang. Ein erstes Primermolekül bindet an das eine Ende der einzelsträngi­ gen Target-Sequenz. Die Polymerase elongiert diesen Pri­ mer und kopiert diese Target-Sequenz. Das zweite Primer­ molekül kann nicht an den komplementären, sogenannte An­ tisense-Strang, binden, wie es das in einer Standard-PCR täte. Deshalb wird das zweite Molekül so designed, dass es statt dessen an die erste kopierte Sequenz bindet. Ge­ nauer gesagt wird es an den Teil der kopierte Nukleinsäu­ re binden, der das Komplement zum anderen Ende dieser Target-Sequenz ist.

Die Ergebnisse einer PCR sind stark von der Auswahl des idealen Primers abhängig. Bei der Auswahl eines Primermo­ leküls müssen Nebenbedingungen beachtet werden, die eine korrekte Amplifikation erlauben, welche durch die Hybri­ disierungstemperatur-Bedingungen und die Verhinderung von Auto- oder Heterohybridisierung erfüllt werden.

Mit anderen Worten, da jede PCR zwei Primermoleküle benö­ tigt, um in einer Reaktion ein spezifisches DNA-Stück zu amplifizieren, müssen die Schmelztemperaturen beider Pri­ mer sehr ähnlich sein, um eine ordnungsgemäße Bindung von beiden bei der gleichen Hybridisierungstemperatur zu ges­ tatten. Deshalb wird bei den meisten Primer-Design- Programmen der Benutzer aufgefordert, eine bevorzugte Schmelztemperatur oder einen erlaubten Bereich von Schmelztemperaturen zu bestimmen. Diese Voraussetzung wird zum begrenzenden Faktor, wenn Primer für eine soge­ nannte Multiplex-PCR designed werden, da alle verwendeten Primerpaare die gleichen oder wenigstens sehr ähnliche Schmelztemperaturen haben müssen. Zusätzlich müssen Pri­ mer sehr spezifisch sein, um nur jene DNA-Stücke zu amplifizieren, die das Target sind.

Durch die Bereitstellung von Mitteln zum äußerst präzisen Designen von Primerpaaren für DNA-Hybridisierungs­ verfahren betrifft diese Erfindung das sogenannte PCR- Primer-Design. Genauer betrifft der Hauptinhalt dieser Erfindung die spezifischen Anforderungen an Primer und deshalb an das Primer-Design, wenn Templat-DNA verwendet wird, die im Wesentlichen nur aus drei verschiedenen Nukleotiden besteht und einzelsträngig ist. Das ist der Fall, wenn Bisulfit-behandelte DNA als Templat verwendet wird, da sie kein Cytosin außer den methylierten Cytosi­ nen in einem CG-Dinukleotid und einen Rest von ungenügend behandeltem und deshalb nicht überführten nicht- methylierten Cytosinen enthält. Diese Erfindung betrifft insbesondere das Primer-Design, wenn Bisulfit-behandelte DNA als Templat verwendet wird.

Für einen Durchschnittsfachmann ist es offensichtlich, dass die Verwendung der Primer, wie sie in dieser Erfin­ dung spezifiziert werden, nicht auf die Nukleinsäure- Amplifikation begrenzt ist. Die genannten Primer können für verschiedene Zwecke verwendet werden, wie Amplifika­ tion, aber auch für Nukleinsäure-Sequenzierung oder als Blocking-Oligonukleotide während der Analyse von Bisul­ fit-behandelter DNA. Deshalb ist die Verwendung dieser Primer nicht begrenzt auf Nukleinsäure-Amplifikation, sondern erstreckt sich auf alle molekularbiologischen Standard-Verfahren.

Paare dieser Primer werden verwendet, um spezifisch DNA aus einer kleinen Menge Proben-DNA zu amplifizieren, die aus Bisulfit-behandelter DNA besteht, welche von einer begrenzten DNA-Quelle, wie einer Körperflüssigkeit oder Gewebe-Probe, stammt.

DNA kann an bestimmten Positionen methyliert oder nicht- methyliert auftreten und diese Information ist für den Status einer Gen-Transkription relevant. Die Methylgruppe ist mit den Cytosin-Basen in CpG-Positionen verknüpft. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin in einer DNA- Sequenz, im Gegensatz zu unmethyliertem Cytosin, ist, wenn man beispielsweise die Rolle der DNA-Methylierung in der Tumorgenese untersucht, von größter Bedeutung. Weil sich 5-Methylcytosin in Bezug auf seine Hybridisierungs- Präferenz (eine Eigenschaft, auf die man sich bei der Se­ quenzanalyse stützt) genauso verhält wie Cytosin, können seine Positionen jedoch nicht durch normale Sequenzie­ rungsreaktion identifiziert werden. Weiterhin wird diese bedeutende epigenetische Information, methyliertes Cyto­ sin oder unmethyliertes Cytosin, in einer PCR- Amplifikation vollständig verloren gehen.

Dieses Problem wird gewöhnlich durch Behandlung der geno­ mischen DNA mit einer Chemikalie gelöst, die zu einer Um­ wandlung der Cytosin-Basen führt, welche es infolgedessen erlaubt, die Basen anschließend zu unterscheiden.

Ein äußerst geeignetes Instrument zur Analyse von DNA- Methylierung ist die Bisulfit-Umsetzung von DNA, welche Cytosin-Basen in Basen überführt, die ein Hybridisie­ rungsverhalten wie Thymin-Basen zeigen. Hierdurch wird die DNA-Komplexität um ein Viertel reduziert.

Die Bisulfit-Umsetzung ist das am häufigsten verwendete Verfahren zur Analyse von DNA auf 5-Methylcytosin. Es ba­ siert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cy­ tosin, welches nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, wohingegen 5-Methylcytosin unter diesen Bedingungen unverändert bleibt (Shapiro et al. (1970) Nature 227: 1047). In seinem Basenpaarungsver­ halten entspricht Uracil jedoch Thymin, das heißt es hybridisiert an Adenin; wohingegen 5-Methylcytosin seine chemischen Eigenschaften unter dieser Behandlung nicht ändert und deshalb noch das Basenpaarungsverhalten eines Cytosins besitzt, das heißt es hybridisiert mit Guanin. Somit wird die Original-DNA auf solche Art umgesetzt, dass Methylcytosin, das ursprünglich durch sein Basenpaa­ rungsverhalten nicht von Cytosin unterschieden werden konnte, nun als das einzige verbleibende Cytosin, unter Verwendung "normaler" molekularbiologischer Techniken, zum Beispiel durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, detektiert werden kann. Alle diese Techni­ ken basieren auf der Basenpaarung, die nun vollständig ausgewertet werden kann. Das Vergleichen der DNA- Sequenzen vor und nach der Bisulfit-Behandlung erlaubt eine einfache Identifizierung solcher Basen, die methy­ liert waren.

Wenn es im Rahmen dieser Erfindung heißt "ein Nukleotid (. . .) wurde umgesetzt durch die Behandlung. . ." ist diese Behandlung dafür bestimmt, zwischen methylierten und un­ methylierten Cytosin-Basen in dieser Probe unterscheiden zu können, wie zum Beispiel die Umsetzung unmethylierter Cytosin-Basen in Basen, welche durch die Behandlung mit Bisulfit an Adenin hybridisieren.

Ein alternatives Verfahren ist es, Restriktionsenzyme zu verwenden, die in der Lage sind, zwischen methylierter und unmethylierter DNA zu unterscheiden, aber dieses ist wegen der Selektivität des Restriktionsenzyms gegenüber einer spezifischen Sequenz, in seiner Verwendung be­ schränkt.

Einen Überblick über weitere bekannte Verfahren zur De­ tektion von 5-Methylcytosin gibt folgender Übersichtsar­ tikel: T. Rein, M. L. DePamphilis, H. Zorbas, Nucleic A­ cids Res. 1998, 26, 2255.

Hinsichtlich der Empfindlichkeit wird der Stand der Tech­ nik durch ein Verfahren bestimmt, das die zu analysieren­ de DNA in eine Agarose-Matrix einschließt, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert werden (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA), und welches alle Ausfällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (A. Olek, J. Oswald, J. Walter (1996) A modified and improved method for bisulphite ba­ sed cytosine methylation analyis. Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Durch die Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, einzelne Zellen zu analysieren, was das Potenti­ al dieses Verfahrens veranschaulicht.

Die Bisulfit-Technik wird bisher, bis auf wenige Ausnah­ men (z. B. M. Zeschnigk, C. Lich, K. Buiting, W. Doerfler, B. Horstehmke (1997) A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 5: 94-8), nur in der Forschung angewen­ det. Immer aber werden nur kurze, spezifische Fragmente eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert (A. O­ lek, J. Walter (1997) The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 3: 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine Primer-Extensions- Reaktion (M. L. Gonzalgo, P. A. Jones (1997) Rapid quan­ titation of methylation differences at specific sites u­ sing methylation-sensitive single nucleotide primer ex­ tension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 25: 2529-31; WO 95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Z. Xiong, P. W. Laird (1997) COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25: 2532-4) detek­ tiert.

Ein weiteres Verfahren um Hypermethylierung zu detektie­ ren ist die sogenannte methylierungsspezifische PCR (MSP) (J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen, B. D. Nelkin und S. B. Bylin (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA. 93: 9821-6). Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung von Primern, die zwischen einer methylier­ ten und nicht-methylierten Sequenz unterscheiden, wenn sie nach der Bisulfit-Behandlung dieser Sequenz angewen­ det werden. Der Primer enthält entweder ein Guanin an der Position, die zum Cytosin korrespondiert, wobei er in diesem Fall nach der Bisulfit-Behandlung nur binden wird, wenn die Position methyliert war. Oder der Primer enthält ein Adenin in der korrespondierenden Cytosin-Position und bindet deshalb an dieser DNA-Sequenz nach der Bisulfit- Behandlung nur, wenn die Cytosin-Position unmethyliert war und deshalb durch die Bisulfit-Behandlung derart ver­ ändert worden ist, dass es an Adenin hybridisiert.

Durch die Verwendung dieser Primer können Amplicons her­ gestellt werden, die speziell vom Methylierungsstatus ei­ nes bestimmten Cytosins abhängen und werden als solche dessen Methylierungsstatus anzeigen. Die vorliegende Er­ findung schließt jedoch bevorzugterweise keine CpGs in der Primer-Sequenz ein.

Eine andere neue Technik ist die Detektion von Methylie­ rung via Taqman-PCR, auch bekannt als "MethylLight" (WO 00/70090). Mit dieser Technik wurde es möglich, den Me­ thylierungszustand einer einzelnen Position oder mehrerer Positionen direkt während der PCR zu bestimmen, ohne die PCR-Produkte in einem zusätzlichen Schritt analysieren zu müssen.

Zusätzlich ist auch die Detektion durch Hybridisierung beschrieben worden (WO 99/28498).

Weitere Veröffentlichungen, die sich mit der Verwendung der Bisulfit-Technik zur Detektion von Methylierung in einzelnen Genen beschäftigen, sind:
G. Grigg, S. Clark. (1994) Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays 16: 431-6; M. Zesch­ nigk, B. Schmitz, B. Dittrich, K. Buiting, B. Horstehmke, W. Doerfler (1997) Imprinted segments in the human ge­ nome: different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the ge­ nomic sequencing method. Hum Mol Genet. 6: 387-95; R. Feil, J. Charlton, A. P. Bird, J. Walter, W. Reik. (1994) Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22: 695-6; V. Martin, S. Ribieras, X. Song-Wang, M. C. Rio, R. Dante (1995) Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the p52 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene 157: 261-4; WO 97/46705 WO 95/15373; WO 97/45560.

Bei allen diesen oben genannten Verfahren, welche auf der PCR-Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA basieren, ist die größte Herausforderung Primer zu Designen, die spezifisch sind.

DAS PROBLEM UND SEINE LÖSUNG

Es ist eine Anzahl von Programmen auf dem Markt erhält­ lich, die anbieten, Primerpaare zu Designen, um ein DNA- Stück in einer PCR zu amplifizieren. Gewöhnlich benötigen sie als Input die Templat-DNA-Sequenz, die bevorzugte Schmelztemperatur TM, die gewünschte Länge des Amplifi­ kats und optional die bevorzugte Länge der Primermolekü­ le.

Wenn jedoch ein Primer benötigt wird, der spezifisch an Bisulfit-behandelte DNA bindet, ist das Design der Pri­ mermoleküle besonders schwierig und jene im Stand der Technik bekannten Instrumente sind nicht befähigt Primer zu designen, die zu spezifischen Produkten führen. Die folgenden Probleme treten auf, wenn man sich mit Bisul­ fit-behandelter DNA anstelle von Standard-DNA befasst:
Erstens wird die Sequenz-Komplexität der Bisulfit­ behandelten DNA dramatisch reduziert. In diesem Zusammen­ hang soll Komplexität ein Maß für die Ähnlichkeit einer gegebenen Sequenz mit einer zufälligen oder stochasti­ schen Sequenz sein; je komplexer eine Sequenz ist, umso ähnlicher ist sie einer zufälligen Sequenz. Eine redu­ zierte Komplexität des Genoms bedeutet, dass es weniger Variationsgrade gibt. Dort wo es im Wesentlichen eher nur drei verschiedene Nukleotide gibt als vier ist die Wahr­ scheinlichkeit, dass eine Sequenz zweimal in einer vorge­ gebenen Sequenz-Länge auftritt, wesentlich höher. Bei­ spielsweise ist ein Primermolekül mit einer Länge von 20 Nukleotiden im menschlichen Genom wahrscheinlich einzig­ artig, wenn es nicht Teil einer Repeat-Sequenz ist: Es ist bekannt, dass das menschliche Genom aus ungefähr 3 × 10⁹ Basen besteht. Es gibt 4²⁰ ≈ 10¹² verschiedene We­ ge Sequenzen mit einer Länge von 20 Nukleotiden zu bil­ den, wenn die Gleichverteilung der Basen angenommen wird, was das mehrfache Auftreten eines gegebenen 20-Mers (Oli­ gonukleotid mit 20 Nukleotiden) extrem unwahrscheinlich macht. Weil jedoch nur 3²⁰ ≈ 3 × 10⁹ verschiedene 20-Mere bei einem 3-Buchstaben-Alphabet möglich sind, kann dieses mehrfache Auftreten nicht ausgeschlossen werden. Zusätz­ lich wird eine Bisulfit-behandelte Sequenz, angereichert mit Thymin im Sense-Strang und angereichert mit Adenin im reversen, komplementären Strang, mehr Wiederholungen und Regionen von allgemein geringer Komplexität enthalten.

Ein anderer Weg, um die Einzigartigkeit der Primer- und/oder Oligomoleküle zu erhöhen oder zu garantieren, ist es, ihre erwartete Häufigkeit im Genom, basierend auf einem Markov-Modell n-ter Ordnung für das menschliche Ge­ nom, abzuschätzen, oder ihre Einzigartigkeit genau durch Zählen ihres exakten Auftretens zu überprüfen. Die auf dem Markov-Modell basierende Abschätzung stützt sich auf die Bestimmung der Wahrscheinlichkeiten aller 4n n-Mere (Oligomoleküle mit n Nukleotiden) im menschlichen Genom oder in allen Amplifikaten, die in der Hybridisierung verwendet werden und auf die bedingten Wahrscheinlichkei­ ten aller vier Basen, welche diese n-Mere ergeben. Die Primerpaare werden durch Vorwärts- und Reverse-Oligos konstruiert, welche innerhalb eines geeigneten Abstands zueinander liegen und welche ein minimales, individuelles erwartetes Auftreten an anderer Stelle im Genom besitzen.

Eine zweite Herausforderung beim Primer-Design für Bisul­ fit-behandelte DNA ist, dass die Schmelztemperatur TM ei­ nes Bisulfit-DNA-Primers bestimmter Länge typischerweise geringer ist als die Schmelztemperatur TM eines Standard- Primers, der Cytosine enthält. Das ist auf die Tatsche zurückzuführen, dass jedes Cytosin in einer Bisulfit­ behandelten DNA - nach der Amplifikation durch PCR - durch Thymin ersetzt ist. Cytosin bindet seine korrespon­ dierende Base Guanin via drei Wasserstoffbindungen, wo­ hingegen Thymin seine korrespondierende Base Adenin nur via zwei Wasserstoffbindungen bindet, was zu einer allge­ mein schwächeren Bindung, einem geringeren TM, führt.

Ein drittes Problem entspringt der Tatsache, dass Bisul­ fit-behandelten Sequenzen nicht nur Cytosine fehlen, son­ dern dass sie auch Thymin-reich sind. Thymin hybridisiert auch unspezifisch mit Guanin. Das macht die Fehlpaarung (unspezifische Bindung eines Primers an eine nicht iden­ tische Sequenz) eines Primers, der für Bisulfit­ behandelte DNA designed wurde, viel wahrscheinlicher als die Fehlpaarung eines Standard-Primers, der aus vier ver­ schiedenen Nukleotiden besteht.

Es ist das Ziel dieser Erfindung diese Probleme zu über­ winden, die spezifisch für die Primer-basierte Amplifika­ tion Bisulfit-behandelter DNA sind.

Für eine sogenannte "Muliplex-PCR" wird es besonders schwierig werden, Primerpaare zu designen. Dieser Aus­ druck wird verwendet, um ein Experiment zu beschreiben, bei dem mehrere verschiedene DNA-Stücke gleichzeitig, in einem Reaktionsbehälter und zur gleichen Zeit, amplifi­ ziert werden. Offensichtlich erspart das viel Aufwand und Zeit und ist deshalb eine wesentliche Voraussetzung für Assays mit hohem Durchsatz, die auf PCR-Amplifikation ba­ sieren. Einen Überblick über den Stand der Technik in Be­ zug auf Multiplex-PCR wird durch Henegariu et al. (O. Henegariu, N. A. Heerema, S. R. Dlouhy, G. H. Vance und P. H. Vogt (1997) Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: 504-511) gege­ ben, die ein Schritt-für-Schritt-Protokoll dafür anbie­ ten, wie man Multiplex-PCR-Probleme löst. Jedoch wird in diesem Artikel nicht die Möglichkeit eines speziellen Primer-Designs erwähnt.

Um sicherzustellen, dass die Multiplex-PCR gelingt und die vielfachen Produkte amplifiziert werden, wird tat­ sächlich gewöhnlich eine Gelelektrophorese der Reaktions­ mischung durchgeführt. Die Produkte werden aufgrund ihrer verschiedenen Größen getrennt. Unglücklicherweise ist die Möglichkeit die Produkte mit Agarose-Gelelektrophorese zu unterscheiden, etwas begrenzt. Auf verschiedene Produkt- Größen zu prüfen ist jedoch mittels eines Fragment- Analysators möglich, der wesentlich genauer ist und in der Lage ist, Produkt-Größen mit einer Base Unterschied zu unterscheiden. Infolgedessen sind Produkt-Größen nicht länger eine Anforderung, die im Primer-Design für eine Multiplex-PCR zu beachten ist.

Im Patent WO 01/94643 wird ein Verfahren für eine Multip­ lex-PCR unter Verwendung von wenigstens zwei Primerpaaren beschrieben, das im Wesentlichen aus einem Zweischritt- Amplifikationsverfahren besteht, worin von dem einen Schritt als Pre-Amplifikation gesprochen wird. Nach der Pre-Amplifikation (mittels PCR) mit einer Anzahl von Primerpaaren wird die Probe in so viele Teile geteilt, wie es Primerpaare gibt. Wenigstens eines (und bevorzugt nur eines) der vorher verwendeten Primerpaare wird hinzu­ gefügt. Dieses Verfahren hängt in keiner Weise mit der hierin beschriebenen Auswahl oder dem Design von Primer­ molekülen zusammen.

In einem Artikel von Shuber et al. (A. P. Shuber, V. J. Grondin und K. W. Klinger (1995) A simlified procedure for developing multiplex PCRs. Genome Res 5 (5): 488-­ 493), der sich auf Multiplex-PCR bezieht, schlagen die Autoren vor Primer zu verwenden, welche eine 3'-Region, die komplementär zu sequenzspezifischen Erkennungsstellen ist, und eine 5'-Region einer definierten Länge von je­ weils 20 Nukleotiden, enthalten. Die Autoren beanspru­ chen, dass sie identische Reaktionsbedingungen, Zyklisie­ rungszeiten und Annealing-Temperaturen für jedes PCR- Primerpaar festsetzen können, das diesen Anforderungen entspricht.

In verschiedenen neuen Veröffentlichungen sind erfolgrei­ che Multiplex-PCRs eingeführt worden. Beispielsweise ha­ ben Becker et al. über die Entwicklung einer Multiplex- PCR-Reaktion für die Detektion von vielfachen staphylo­ coccalen Enterotoxin-Genen berichtet, welche individuelle Primer-Sätze für jedes Toxin-Gen verwendet (K. Becker, R. Roth und G. Peters (1998) Rapid and specific detection of toxigenic Staphylococcus aureus: use of two multiplex PCR enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic shock syndrome toxin 1 gene. J. Clin. Microbiol. 36: 2548-2553). Dieses ist von Monday und Bo­ hach sogar noch weiter entwickelt worden, durch die Erhö­ hung der Anzahl von in einer Reaktion verwendeten Primer­ paaren auf bis zu 10, um ein Assay zu haben, das alle der charakteristischen Enterotoxin-Gene amplifiziert. Es be­ durfte hier noch eines einzigartig aufgebauten Primer­ paars für die Detektion jedes individuellen Gens (S. R. Monday und G. A. Bohach (1999) Use of multiplex PCR to detect classical and newly described pyrogenic toxin ge­ nes in staphylococcal isolates. J. Clin. Microbiol. 37: 3411-3414).

In einer anderen Veröffentlichung durch Sharma et al. wird ein Verfahren für eine Ein-Reaktionsbehälter- Multiplex-PCR beschrieben, worin jedes der sechs ausge­ wählten Primerpaare aus einem identischen, universellen Vorwärts-Primer, basierend auf einer hoch konservierten Region der interessierenden Gene, und einem Reverse- Primer, der spezifisch für jedes einzelne Gen ist, be­ steht. Deshalb führt ein solches Assay zu einer schnellen Amplifikation einer Familie von Genen, welche alle eine konservierte Region gemein haben. Es wurde entwickelt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Gens in einer unbekannten Mischung zu detektieren. Es wird keine weitere Information über das Primer-Design gegeben, außer dass gesagt wird, dass sie in Ausrichtung auf publizierte DNA-Sequenzen gestaltet wurden. Das ist immerhin bestimmt nicht die einzige Anforderung, da eine große Begrenzung dieses Verfahrens die Notwendigkeit ist, PCR-Produkte von unterschiedlichen Größen zu erhalten, um diese am Ende zu identifizieren (N. K. Sharma, C. E. D. Rees und C. E. R. Dodd (2000) Development of a single-reaction multiplex PCR toxin typing assay for Staphylococcus aureas strains. Applied and Environmental Microbiology 66 (4): 1347-­ 1353).

In der Patentanmeldung WO 01/36669 wird ein Verfahren be­ schrieben, welches einen ähnlichen Ansatz für die kon­ trollierbare Amplifikation einer größeren Anzahl von Se­ quenzen verwendet, indem ein zufällig gewählter Reverse- Primer, der unspezifisch hybridisiert, und eine Anzahl spezifischer Vorwärts-Primer ausgewählt werden, um eine Gruppe von Sequenzen zu amplifizieren. Da der Reverse- Primer markiert ist, werden auch alle gebildeten Produkte markiert sein. Durch die Hybridisierung dieser Amplicons an immobilisierte Detektions-Oligos, welche in der Lage sind, die Produkte zu unterscheiden, wird es einfach sein zu sehen, welche Produkte amplifiziert wurden und hier­ durch kann die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Se­ quenzen in der Mischung bestimmt werden.

Der große Nachteil bei allen diesen Verfahren ist, dass jedes Primerpaar zuerst individuell aufgebaut werden muss um sicherzustellen, dass ein PCR-Produkt von erwarteter Größe hergestellt wurde und dass keine zusätzlichen oder nichtspezifischen Produkte erzeugt werden. Wenn einmal die Spezifität des Primerpaars bestimmt worden ist, müs­ sen die PCR-Bedingungen, Puffer und Primer- Konzentrationen optimiert werden um Bedingungen zu be­ gründen, unter welchen die Primermoleküle in einer ein­ zelnen PCR-Reaktion kombiniert werden können, ohne die Befähigung des Primerpaars zu beeinträchtigen, ein gen­ spezifisches Amplicon zu erzeugen.

Ein vor noch kürzerer Zeit veröffentlichter Ansatz von Nicodeme und Steyaert beschreibt die für Multiplex-PCR erforderlichen Bedingungen und schlägt einen Algorithmus vor, um automatisch Primerpaare auszuwählen (P. Nicodeme und J. M. Steyaert (1997) Selecting optimal oligonucleo­ tide primers for multiplex PCR. Proc. Int. Conf. Intell Syst Mol Biol; 5: 210-213). In diesem Ansatz sind die Be­ dingungen für die Vorauswahl von Primerpaaren für eine erfolgreiche Ein-Lokus-Amplifikation (Singleplex-PCR- Bedingungen) eher weitgefasst. Die drei grundlegenden An­ forderungen sind die Paarungsabstände zwischen einem Vor­ wärts- und einem Reverse-Primer, die Bedingung der Nicht- Spiegelbildlichkeit eines Primers und die Bedingung, dass das 3'-Ende eines Primers nicht revers komplementär zu irgendeiner der anderen Primer-Sequenzen sein darf. Diese Auswahl wird mit der Hilfe eines typischen Primer-Design- Programms durchgeführt, das PRIMER heißt. Jedoch ist PRIMER ein Zwei-Schritt-Programm und in diesem Ansatz verwendet das neue Verfahren zum Design von Primern für eine Multiplex-PCR den Output aus Schritt 1 als Input, welcher eine Liste möglicher Vorwärts- und eine Liste möglicher Reverse-Primer für jedes Amplifikat ist.

Die einzigen weiteren Auswahlkriterien für die Multiplex- PCR-Primer sind die Abwesenheit der Reverse- Komplementarität ihres 3'-Endes gegenüber der anderen Primer-Sequenz im Experiment. Ein zweiter hier berück­ sichtigter, kritischer Faktor ist das Verhältnis von GC zu AT. Bis zu einem gewissen Grad ist es dieses Verhält­ nis, das die Schmelztemperatur eines Primerpaars be­ stimmt. Die Autoren empfehlen, das GC/AT-Verhältnis so zu begrenzen, das es innerhalb eines vorgegebenen Bereichs liegt, was die gleichzeitige Hybridisierung verschiedener Primerpaare bei einer Reaktionstemperatur ermöglichen würde. Die letzte Anforderung ist der Elektrophorese- Abstand, der durch das Instrument, zum Beispiel eine Ge­ lelektrophorese, bestimmt wird, das zur Unterscheidung der PCR-Produkte verwendet wird. Dieses gebräuchlichste Verfahren verlangt, dass die Produkte von unterschiedli­ cher Größe sind. Das gesamte Konzept dieses Verfahrens verlangt auch, dass ein Pool möglicher Primerpaare für jedes Amplicon vorhanden ist.

Das Design geeigneter Primer für eine Multiplex-PCR mit Bisulfit-behandelter DNA ist sogar eine noch größere Her­ ausforderung. Die geringe Komplexität der DNA, die im We­ sentlichen eher auf drei verschiedene als auf vier ver­ schiedene Basen reduziert ist, erfordert eine besonders sorgfältige Auswahl der Primer, um Fehlpaarung und uner­ wünschte Amplifikation zu vermeiden.

Im Rahmen dieser Erfindung bezieht sich das Wort "Fehl­ paaren" auf den Umstand, wenn die Ausrichtung zweier Se­ quenzen, die im Wesentlichen komplementär sind, Positio­ nen in einer der Sequenzen zeigen, wo die Nukleotid-Base sich nicht zur ihrer korrespondierenden Base sondern zu einer anderen ausrichtet. Die korrespondierenden oder komplementären Basenpaare sind Adenin und Thymin, Cytosin und Guanin, Uracil und Adenin. Ein Cytosin, das sich bei­ spielsweise in seiner sonst komplementären Sequenz auf Thymin ausrichtet, erzeugt eine Fehlpaarung von einer Ba­ se oder eines Nukleotids.

Demgemäss bezieht sich "Basen-Fehlpaarungen" auf den Zu­ stand einer Base, die mit einer anderen als oben erklär­ ten, fehlpaart, entsprechend bezieht sich "eine oder mehr Basenfehlpaarungen" auf eine oder mehr Basen (in einer vorgegebenen Sequenz), die sich nicht zu ihrer korrespon­ dierenden Base bzw. zu ihren korrespondierenden Basen ausrichten können.

Auch wenn die Ausrichtung Einzel-Nukleotid-Lücken in ei­ ner der ausgerichteten Sequenzen aufzeigt, ist das im Rahmen dieser Erfindung unter dem Begriff "Fehlpaarung" zu verstehen.

Eine "Lücke" ist folgendermaßen zu verstehen: Wenn eine Ausrichtung zeigt, dass, um die höchste Anzahl von kor­ respondierenden, ausgerichteten Basenpaaren zu erreichen, einigen Basen eine korrespondierende Base in ihrer sonst komplementären Sequenz fehlt, nennt man das Lücke. Eine solche Lücke kann eine Länge von einem Nukleotid oder mehreren Nukleotiden haben.

Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, haben wir ein Verfahren erfunden, das aus verschiedenen Schritten be­ steht, welches für die Amplifikation von Nukleinsäuren in Singleplex- genauso anwendbar ist, wie in Multiplex-PCR- Experimenten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Zuerst wird die Nukleinsäure-Probe, welche die interes­ sierende, zu amplifizierende Region enthält, isoliert. Zweites wird diese Nukleinsäure-Probe in einer Art behan­ delt, die zwischen methylierten und unmethylierten Cyto­ sin-Basen in dieser Probe unterscheidet. Drittens wird eine Reaktionsmischung vorbereitet, enthaltend a) die be­ handelten Templat-Nukleinsäuren, welche die interessie­ rende, zu amplifizierende Region (auch bezeichnet als: Target-Nukleinsäure) tragen, b) spezifizierte Oligonukle­ otid-Primer, c) ein Enzym, das geeignet ist, diese Nuk­ leinsäuren in einer festgelegten Art zu amplifizieren, d) die notwendigen Nukleotide, welche für die Nukleinsäure- Synthese erforderlich sind und e) einen geeigneten Puf­ fer.

Diese spezifizierten Oligonukleotid-Primer sind dadurch gekennzeichnet, dass jede ihrer Sequenzen ein vorher bestimmtes Maß an Komple­ xität erreicht (wie unten im Detail beschrieben) jede mögliche Kombination zweier Primermoleküle in dieser Reaktionsmischung eine Schmelztemperatur unter einem ge­ nau festgelegten Temperaturschwellenwert hat keine der möglichen Kombinationen von zwei Primermolekü­ len in dieser Reaktionsmischung zur Amplifikation eines zusätzlichen unerwünschten Produkts führt, wie durch vir­ tuelles Testen der Amplifikation bestimmt wird.

Im letzten Verfahrensschritt wird diese Target- Nukleinsäure mit Mitteln detektiert, wie sie gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann verwendet werden.

Die Erfindung setzt sich aus einem Verfahren zur Amplifi­ kation von Nukleinsäuren zusammen, welches die folgenden Schritte der Isolierung einer Nukleinsäure-Probe, der Be­ handlung dieser Probe in einer Art, die zwischen methy­ lierten und unmethylierten Cytosin-Basen in dieser Probe unterscheidet, der Amplifizierung wenigstens einer Tar­ get-Sequenz in dieser behandelten Nukleinsäure, mittels einer enzymatischen Amplifikation und einem Satz von Pri­ mermolekülen, umfasst, worin diese Primermoleküle dadurch gekennzeichnet, dass a) jede Primermolekül-Sequenz ein vorher bestimmtes Maß an Komplexität erreicht, b) jede Kombination zweier be­ liebiger Primermoleküle in dem Satz eine Schmelztempera­ tur unter einem genau festgelegten Temperaturschwellen­ wert hat und c) jede Kombination zwei Primermoleküle, un­ ter Bedingungen, welche eine Basen-Fehlpaarung oder mehr Basen-Fehlpaarungen pro Primer erlauben, nicht zur Ampli­ fikation eines unerwünschten Produkts führt, wenn ein virtueller Test unter Verwendung der behandelten und der unbehandelten Proben-Nukleinsäure als Templat durchge­ führt wird und der letzte Schritt die Detektion dieser amplifizierten Target-Nukleinsäure ist.

Detailliertere Beschreibung des Verfahrens

Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Im ersten Verfahrensschritt muss die Nukleinsäure-Probe, welche die interessierende, zu amplifizierende Region enthält, aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert wer­ den. Diese Quellen können wenigstens eine Zelle, aber ge­ wöhnlich mehrere Zellen, Zell-Linien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten oder im Paraffin eingebet­ tetes Gewebe, enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Nukleinsäure-Probe aus einer Körperflüssigkeit, einer Zellkultur, einer Gewebeprobe oder Kombinationen von diesen isoliert.

Zum Beispiel kann eine bestimmte Art von Organ-Probe von einem Patienten oder einem Tier verwendet werden, um ge­ nomische DNA durch gewöhnlich angewendete Verfahren zu isolieren. Bevorzugt wird in dieser Erfindung DNA aus ei­ ner Gewebeprobe oder einer biologischen Flüssigkeit wie Blut, Serum, Urin oder anderen Flüssigkeiten, extrahiert. "Körperflüssigkeit" bezieht sich hier auf eine Mischung von Makromolekülen, die aus einem Organismus erhalten werden. Das schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf, Blut, Blutplasma, Blutserum, Urin, Sputum, Ejakulat, Sa­ men, Tränen, Schweiß, Saliva, Lymphflüssigkeit, Bronchi­ alspülung, Pleuralerguß, Peritonealflüssigkeit, Menin­ galflüssigkeit, Fruchtwasser, Drüsenflüssigkeit, Feinna­ del-Aspirat, Brustwarzen-Aspiratflüssigkeit, Spinalflüs­ sigkeit, Konjungtivalflüssigkeit, Vaginalflüssigkeit, Du­ odenalsaft, Pankressaft, Gallen- und Cerebrospinalflüs­ sigkeit. Das schließt auch experimentell abgetrennte Fraktionen aller vorangehenden ein. "Körperflüssigkeit" schließt auch Lösungen oder Mischungen homogenisierter fester Materialien, wie Stuhl, ein.

Die Nukleinsäuren können DNA oder RNA einschließen. Die Isolation kann durch Mittel geschehen, die für einen Durchschnittsfachmann üblich sind, dies schließt bei­ spielsweise die Extraktion von DNA unter Verwendung von detergenten Lysaten, Ultraschall und Verwirbeln mit Glas­ perlen ein. Ein Beispiel ist die Extraktion von DNA aus einem Stück einer Pflanze, wie einem Blatt oder einer Frucht. Sobald die Nukleinsäuren, wie doppelsträngige DNA, extrahiert worden sind, werden sie bei der Analyse verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung um­ fasst die Nukleinsäure Plasmid-DNA, BAC- (künstliches Bakterienchromosom), YAC- (künstliches Hefechromosom) o­ der genomische DNA.

In einer anderen, besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Nukleinsäure-Probe menschli­ che, genomische DNA. Es ist bevorzugt, dass die Nuklein­ säuren menschlichen Ursprungs sind.

Im zweiten Schritt wird diese Nukleinsäure-Probe in einer Art behandelt, die zwischen methylierten und unmethylier­ ten Cytosin-Basen in der Probe unterscheidet. Cytosin- Basen, die an der 5'-Position unmethyliert sind, werden in Uracil, Thymin oder eine andere Base überführt, welche bezüglich ihres Hybridisierungsverhaltens von Cytosin verschieden ist. Das wird nachstehend unter "Behandlung" verstanden. Das bis jetzt am häufigsten verwendete Ver­ fahren ist die sogenannte Bisulfit-Behandlung.

Dieser Schritt ist von essentieller Bedeutung für das Verfahren, da er das Methylierungsmuster dieser Nuklein­ säuren in ein Muster übersetzt, das so etwas wie ein Ab­ druck des Methylierungsstatus selbst ist. Es enthält im Wesentlichen die gleiche Information, aber die vorbehan­ delten Nukleinsäuren sind nicht länger empfindlich gegen­ über der Amplifikation via PCR. Die Amplifikation via PCR unterscheidet nicht zwischen methylierten und unmethy­ lierten Cytosin-Basen und führt deshalb zu einem Verlust dieser Informationsebene. Auf den ursprünglichen Methy­ lierungsstatus kann jedoch geschlossen werden, wann auch immer die Vorbehandlung vor dem Amplifikationsschritt durchgeführt worden ist. Daher sind alle Mittel, die ge­ eignet sind, zwischen methylierten und nicht-methylierten Cytosin-Basen zu unterscheiden, anwendbar, so lange die modifizierten Basen noch in der Lage sind, nach der Be­ handlung, durch enzymatische Mittel amplifiziert zu wer­ den.

Es ist eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, dass die genannte Probe mittels einer Bisulfit-, Hydro­ gensulfit- oder Disulfit-Lösung behandelt wird. Eine Be­ handlung von genomischer DNA, wie sie oben beschrieben wird, wird mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und nachfolgender alkalischer Hydrolyse durchgeführt, was in einer Überführung nicht-methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere Base resultiert, die bezüglich ihres Basenpaarungsverhaltens zu Cytosin verschieden ist.

Im dritten Schritt dieses Verfahrens wird eine Reaktions­ mischung zusammengestellt, die a) die behandelten Templat-Nukleinsäuren, welche die interessierende (auch Target-Nukleinsäure genannt), zu amplifizierende Region umfassen, b) spezifizierte Oligonukleotid-Primer, c) ein Enzym, das zur Amplifizierung dieser Nukleinsäure in festgelegter Art geeignet ist, zum Beispiel eine Polyme­ rase, d) die notwendigen Nukleotide, welche für die Nuk­ leinsäure-Synthese erforderlich sind und e) einen geeig­ neten Puffer, enthält. Die Templat-Nukleinsäure enthält wenigstens eine Target-Nukleinsäure, welche in der Reak­ tion amplifiziert wird. Ein Primermolekül, von dem min­ destens einem Primerpaar in der Reaktionsmischung, ist in der Lage, an das 3'-Ende einer spezifizierten Target- Nukleinsäure zu binden. Der erste Primer bindet an das 3'-Ende der Target-Sequenz, dieser Primer wird elongiert und es wird eine zur Target-Sequenz komplementäre Sequenz hergestellt. Die Polymerase beendet die unspezifische E­ longation. Der nächste Zyklus beginnt durch thermische Denaturierung der nun doppelsträngigen Templat- Nukleinsäure zu einzelsträngigen Templat-Nukleinsäuren. Dem folgt die nächste Phase von Annealing, wenn beide Primermoleküle spezifisch an die Target-Nukleinsäure und ihren komplementären Strang binden. Der zweite Primer ist identisch mit dem 5'-Ende des Target-Moleküls. Er bindet nicht an die Target-Sequenz selbst, sondern an die zur Target-Sequenz komplementäre Nukleinsäure, sobald diese aus dem Templat denaturiert worden ist.

Das Verfahren wird durch die eigentliche Amplifikati­ onsphase bei einer etwas geringeren Temperatur beendet, während welcher das Enzym, zum Beispiel die Polymerase, den Primer als zur Target-Nukleinsäure komplementäre Se­ quenz elongiert. Die Polymerase elongiert diesen zweiten Primer unter Verwendung der ersten Kopie als Templat, bis das Ende dieser kopierten Nukleinsäure erreicht ist. Auf diesem Weg wird eine identische Kopie der ursprünglichen einzelsträngigen Target-Nukleinsäure erzeugt. Daher wird die Länge des Amplifikats durch die Auswahl der zwei Pri­ mer bestimmt.

Die Elongationsprodukte, die zueinander komplementär sind und dadurch eine doppelsträngige Version der Target- Nukleinsäure bilden, dienen als zusätzliche Targets für die im nächsten Amplifikationszyklus bindenden Primermo­ leküle.

Im Wesentlichen umfasst Verfahrensschritt 3 die Amplifi­ kation wenigstens einer Target-Sequenz in dieser behan­ delten Nukleinsäure, mittels enzymatischer Amplifikation und einem Satz von Primermolekülen.

Diese in dem genannten Verfahren verwendeten Primermole­ küle sind dadurch gekennzeichnet, dass sie, zusätzlich zu der Erfüllung aller gewöhnlichen Anforderungen an einen PCR-Primer, wie später im Detail beschrieben wird, auch die folgenden Anforderungen erfüllen:
Zunächst erreicht die Sequenz eines jeden, im Verfahrens­ schritt 3 verwendeten Primermoleküls, ein festgelegtes Maß an Komplexität.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens erreichen die Primermoleküle einen bestimmten Wert an linguistischer Komplexität. Ein Begriff und ein Maß für linguistische Komplexität ist von Trifonov 1990 einge­ führt worden und ist zuvor für die Analyse von Nukleotid- Sequenzen verwendet worden (E. N. Trifonov (1990) Making sense in the human genome. In Structure & Methods. Vol 1 pp 69-77 (eds. R. H. Sarma und M. H. Sarma, Adenine Press, Albany, US). Die Technik der linguistischen Kom­ plexität erlaubt es, eine Berechnung der strukturellen Komplexität einer linearen Sequenz von Zeichen durchzu­ führen, ungeachtet ob der Text erkannt wird oder gegen­ wärtig unentschlüsselt ist. Die Sequenzen werden aus­ schließlich vom Standpunkt ihrer strukturellen Komplexi­ tät verglichen, ohne Bezug auf die Bedeutung des Textes zu nehmen. 1997 veröffentlichte Trifonov, wie die lingu­ istische Komplexität nukleosomaler Sequenzen definiert ist (A. Bolshoy, K. Shapiro, E. Trifonov und I. Ioshikhes (1997) Enhancement of the nucleosomal pattern in sequen­ ces of lower complexity. NAR 25 (16): 3248-3254). Zitat: "das Maß der linguistischen Komplexität nutzt das Haupt­ unterscheidungsmerkmal zwischen natürlichen Nukleotid- Sequenzen und einheitlich zufälligen: die Wiederholbar­ keit der natürlichen Sequenzen, d. h. die häufige Wieder­ holung, nicht notwendigerweise eine tandemartige, einiger Oligonukleotide ("Wörter"), während andere vermeiden wer­ den. (. . .) Komplexität kann direkt als Ausmaß berechnet werden, zu welchem das maximal mögliche Vokabular (alle Wortgrößen betrachtet) in einer vorgegebenen Sequenzstär­ ke benutzt wird (. . .)."

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Ver­ fahrens wird das genannte Maß der Komplexität durch die sogenannte Shannon-Entropie bestimmt (C. E. Shannon (1948) A Mathematical Theory of Communication, University of Illinois Press, Urbana). Das ist das gebräuchlichste Maß um den Informationsgehalt (in einer technischen, nicht sematischen Bedeutung) linearer Informationsträger abzuschätzen. Es ordnet den Maximalwert (der ohne Ein­ schränkung auf 1 gesetzt werden kann) Sequenzen zu, wo alle Symbole (Zeichen) mit gleicher Wahrscheinlichkeit auftreten und einen Wert von 0 Sequenzen zu, die aus nur einem wiederholten Symbol (Zeichen, Buchstabe) bestehen. Ein abgeleitetes und allgemeineres Maß ist die Shannon- Entropie höherer Ordnung, welche solchen Sequenzen den Maximalwert zuordnet, bei denen alle ihre Untersequenzen mit gleicher Wahrscheinlichkeit auftreten und einen Wert von 0 oder nahe 0 solchen Sequenzen, die aus periodischen Wiederholungen kurzer Untersequenzen bestehen. Die prak­ tische Bestimmung der Shannon-Entropie (höherer Ordnung) ist jedoch durch die endlichen Längen von Sequenzen be­ grenzt, was häufig eine genaue Abschätzung der Wahr­ scheinlichkeitsverteilung der sie bestimmenden Symbole nicht erlaubt.

Weitere mögliche Maße sind zum Beispiel die Lempel-Ziv- Komplexität (L. B. Lempel und J. Ziv (1976) On the complexity of finite sequences. IEEE Trans. Inf. Theory IT-22, 75-81), die Grammatik-Komplexität (W. Ebeling, M. A. Jimenez-Montano (1980) On Grammars, Complexity and In­ formation Measure of Biological Macromolecules. Mathema­ tical Biosience 52, 53-71), die algorithmische Komplexi­ tät (Chaitin, 1990) und die bedingte Entropie.

Zweitens werden die genannten Primermoleküle auch dadurch gekennzeichnet, dass jede mögliche Kombination zweier be­ liebiger Primermoleküle in dem Satz eine Schmelztempera­ tur unter einer spezifizierten Schwellenwerttemperatur besitzt. Dadurch wird die Anreicherung von Dimeren, ver­ ursacht durch die Bindung zweier Primermoleküle aneinan­ der, in dieser Reaktionsmischung ausgeschlossen. Die in diesem Schritt verwendete Anzahl von Primerpaaren kann jede zwischen eins und n sein, was entsprechend zu einem oder n Amplifikaten führt (n ist eine natürliche Zahl).

Wie im Text erwähnt, bezieht sich das Wort "Dimer" auf eine Sekundärstruktur, die durch Hybridisierung von zwei Primermolekülen aneinander, gebildet wird.

Im wie im Text hingewiesen, bezieht sich "Schmelztempera­ tur" auf die Temperatur, bei welcher 50% der Nukleinsäu­ re-Moleküle als Duplex vorliegen und 50% unter Standard- Reaktionslösungsbedingungen denaturiert sind.

Einige Primer-Design-Instrumente schließen einen Primer aus, wenn, neben der Target-Sequenz, eine zweite identi­ sche Sequenz im Templat gefunden werden kann. Jedoch ist es aufgrund der höheren Wahrscheinlichkeit eines Bisul­ fit-Primers mit nicht-identischer Bisulfit-behandelter DNA fehlzupaaren, eine erfindungsgemäße Ausführungsform, dass nur solche Primer in der genannten Amplifikation verwendet werden dürfen, für die keine Sequenzhomologie gefunden werden kann, und zwar soweit, dass sogar solche Sequenzen ausgeschlossen werden, die in einzelnen Nukleo­ tiden verschieden und/oder fehlgepaart sind. Dieses würde jedoch Primermoleküle unnötigerweise ausschließen. Des­ halb werden sie nur ausgeschlossen, wenn zwei Primermole­ küle dem Templat in einem Abstand entsprechen, der die Amplifikation eines unerwünschten Produkts erlauben wür­ de. Dieser Test wird zum Beispiel mittels der Elektroni­ schen PCR durchgeführt. Elektronische PCR (e-PCR) ist ei­ ne virtuelle In-Silico-PCR, die ausgeführt wird, um die Eignung von Primermolekülen vor der In-Vitro-PCR abzu­ schätzen. Im Rahmen dieser Erfindung wird dieses Testen "virtuelles Testen" genannt und es wird sich auf "virtu­ ell getestet" oder "virtuelles Testen" beziehen.

Drittens sind die im Schritt 3 dieser Erfindung verwende­ ten Primer dadurch gekennzeichnet, dass jede mögliche Kombination zweier Primermoleküle in dieser Reaktionsmi­ schung nicht zu einer Amplifikation eines zusätzlichen, unerwünschten Produkts führt, wenn die Amplifikation un­ ter Verwendung der behandelten und unbehandelten Nuklein­ säure-Probe als Templat, sogar unter Bedingungen, welche es erlauben, dass wenigstens eine Base aber nicht mehr als 20% der Gesamtzahl von Basen pro Sequenz pro Primer fehlpaaren, virtuell getestet wird. Im Rahmen dieser Er­ findung sollte es selbstverständlich sein, dass es bei solchen Primermolekülen in Betracht gezogen wird, dass sie an das Templat binden, für die eine Templat-Sequenz vorliegt, die wenigstens in 80% ihrer Nukleotid-Sequenz identisch mit der Target-Sequenz ist, für die der Primer ursprünglich designed wurde. Beispielsweise wird bei ei­ nem Primermolekül mit einer Länge von 50 Nukleotiden er­ wogen, dass es noch an eine Templat-Sequenz hybridisiert, die sich in weniger als 11 Nukleotiden (= ist in wenig­ stens 80% ihrer Nukleotid-Sequenz identisch) von der entsprechenden Target-Sequenz unterscheidet. Wenn eine Paarung als wahrscheinlich betrachtet wird, muss getestet werden, ob diese Verknüpfung zur Amplifikation eines un­ erwünschten Produkts führen würde. Das kann unter Verwen­ dung eines, der e-PCR ähnlichen, Programms, geschehen (siehe unten).

Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform dieses Ver­ fahrens, worin die Fähigkeit dieses Primermoleküls, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels In- Silico-PCR getestet wird, wobei als Templat-Nukleinsäure der kodierende Strang der behandelten Probe, der nicht- kodierende Strang der behandelten Probe und beide Stränge der unbehandelten Probe verwendet werden. Es ist beson­ ders bevorzugt, das virtuelle Testen mit einem Instrument wie der elektronischen PCR an der vorbehandelten, bevor­ zugt Bisulfit-behandelten, Templat-Sequenz, die aus dem behandelten Sense- und dem behandelten Anti-Sense-Strang besteht, und am unumgesetzten Templat, durchzuführen.

Weiterhin ist es bevorzugt, dass diese Behandlung eine Bisulfit-Behandlung und deshalb das Nukleinsäure-Templat der Bisulfit-umgesetzte kodierende Strang des menschli­ chen Genoms, der Bisulfit-umgesetzte nicht-kodierende Strang des menschlichen Genoms und beide Stränge des un­ behandelten menschlichen Genoms, ist. Bevorzugt ist eine Ausführungsform dieses Verfahrens, worin die Fähigkeit dieses Primermoleküls, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels elektronischer PCR getestet wird, wobei als Templat-Nukleinsäure der Bisulfit-umgesetzte kodierende Strang des menschlichen Genoms, der Bisulfit­ umgesetzte nicht-kodierende Strang des menschlichen Ge­ noms und beide Stränge des unbehandelten menschlichen Ge­ noms verwendet werden.

Es ist bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikation auf unerwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassen Anzahl von Fehlpaarungen gerin­ ger als 20% der Anzahl der Nukleotide des Primers ist.

Es ist auch bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikation auf unerwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassen Anzahl von Fehlpaarungen ge­ ringer als 10% der Anzahl der Nukleotide des Primers ist.

Es ist insbesondere bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikation auf unerwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassen Anzahl von Fehlpaa­ rungen geringer als 5% der Anzahl der Nukleotide des Primers ist.

Es ist eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikation auf un­ erwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zuge­ lassen Anzahl von Fehlpaarungen geringer als sieben ist.

Es ist besonders bevorzugt, dass die beim virtuellen Tes­ ten der Amplifikation auf unerwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassen Anzahl von Fehlpaa­ rungen geringer als fünf ist.

Es ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Er­ findung, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikati­ on auf unerwünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfin­ dung zugelassen Anzahl von Fehlpaarungen geringer als drei ist.

Im Rahmen dieser Erfindung ist besonders bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen der Amplifikation auf uner­ wünschte Produkte gemäß Schritt 3c) der Erfindung zuge­ lassen Anzahl von Fehlpaarungen eins ist.

In den Geltungsbereich dieser Erfindung ist es auch ein­ geschlossen, solche Primermoleküle in Betracht zu ziehen, die genügend ähnlich sind, um ihre Bindung an die Templat-Sequenz zu erleichtern, für welche eine Templat- Sequenz gefunden werden kann, die sich in der Anzahl der Nukleotide unterscheidet, aber ansonsten identisch zur Target-Sequenz ist. Wenn die Ausrichtung des Primers und der Templat-Sequenz zu einer Lücke von bis zu 20% der Nukleotide einer Sequenz, bevorzugt der Primer-Sequenz, führt, soll das noch als ausreichend für die Bindung und daher als ausreichend betrachtet werden, um möglicherwei­ se zur Amplifikation eines ungewünschten Produkts zu füh­ ren. Deshalb müssen diese Primer auch mittels virtueller PCR (beispielsweise mit einem Programm wie e-PCR) getes­ tet werden. Nur wenn dieser Test die virtuelle Amplifika­ tion einen unerwünschten Produkts, verursacht durch die Kombination von zwei Primern, zeigt, werden die entspre­ chenden Primerpaare aus dem Satz ausgewählter Primerpaare ausgeschlossen.

Es ist bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassene Anzahl der bei der Aus­ richtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat- Sequenz eine Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 20% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls be­ trägt.

Es ist auch bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassene Anzahl der bei der Ausrichtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat- Sequenz eine Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 10% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls be­ trägt.

Es ist bevorzugt, dass die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) der Erfindung zugelassene Anzahl der bei der Aus­ richtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat- Sequenz eine Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 5% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls beträgt.

Beide Situationen, Fehlpaarungen aufgrund eines alterna­ tiven Nukleotids oder keine Paarung aufgrund eines feh­ lenden Nukleotids, sollen mit dem Ausdruck abgedeckt wer­ den, der solche Primermoleküle beschreibt, die schließ­ lich ausgewählt werden: "Die genannten Primermoleküle sind dadurch gekennzeichnet, dass jede Kombination von zwei Primermolekülen, beim virtuellen Testen unter Ver­ wendung der behandelten und der unbehandelten Proben- Nukleinsäuren als Templat, unter Bedingungen, die eine oder mehr Basen-Fehlpaarungen pro Primer zulassen, nicht zur Amplifikation eines ungewünschten Produkts führen."

Es ist auch bevorzugt, dass die Primermoleküle, die eine vorher spezifizierte Schmelztemperatur überschreiten, wenn sie an die Templat-Sequenz binden, virtuell auf die Amplifikation ungewünschter Produkte, unter Verwendung der behandelten und der unbehandelten Proben- Nukleinsäuren als Templat, gemäß Schritt 3c) des Verfah­ rens, getestet werden müssen.

Die grundlegende Aufgabe, einen Primer zu finden, der spezifisch genug ist, um nur ein Produkt mit der wenig komplexen Bisulfit-DNA zu bilden, wird schließlich durch Testen jedes potentiellen Primerpaars auf Hybridisierung über das gesamte Bisulfit-umgesetzte menschliche Genom gelöst. Das erfordert die virtuelle Übersetzung der ge­ samten Information der menschlichen Genom-Sequenz in ihre Bisulfit-behandelte Version, bevor eine Ähnlichkeitssuche gegenüber den Primerpaaren, welche auf einem Verfahren wie der sogenannten e-PCR (G. D. Schuler (1997) Sequence Mapping by electronic PCR. Genome Research 7(5): 541-550) beruht, durchgeführt wird. Da jedoch die Bisulfit- Umsetzung zu zwei nicht länger komplementären Strängen führt, muss dieser virtuelle Hybridisierungs-Test mit beiden Bisulfit-umgesetzten Strängen durchgeführt werden. Zusätzlich ist die Templat-DNA in den meisten Fällen mit unumgesetzter genomischer DNA verunreinigt. Um auch die unerwünschte Amplifikation der unumgesetzten DNA als Templat auszuschließen, muss der gleiche Hybridsierungs- Test ein drittes mal, unter Verwendung der gesamten menschlichen Genom-Sequenz als Templat, durchgeführt wer­ den.

Deshalb ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Er­ findung, dass die Befähigung der genannten Primermolekü­ le, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels einer solchen elektronischen PCR getestet wird.

Im letzten Verfahrensschritt wird die genannte, amplifi­ zierte Target-Nukleinsäure mittels irgendeines Instru­ ments, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, detek­ tiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens umfasst der Satz von Primermolekülen wenigstens zwei Pri­ mermoleküle aber nicht mehr als 64 Primermoleküle, wobei die angegebene Zahl ein Vielfaches von 2 ist; mit anderen Worten umfasst der Satz 1-32 Primerpaare.

In einer anderen bevorzugte Ausführungsform dieses Ver­ fahrens umfasst der Satz von Primermolekülen zwischen 2 und 32 Primermolekülen, wobei die angegebene Zahl ein Vielfaches von 2 ist; mit anderen Worten umfasst der Satz 1-16 Primerpaare.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens umfassen diese Primermoleküle wenigstens ein Nukleotid innerhalb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Mo­ leküls, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Nukleotid der Target-Sequenz ist, das, als ein Ergebnis der im Schritt 2) der Erfindung durchgeführten Behand­ lung, sein Hybridisierungsverhalten geändert hat.

Es ist eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens, dass dieses Primermolekül wenigstens ein Nukleotid inner­ halb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Moleküls umfasst, das komplementär zu einem Nukleotid der Target- Sequenz ist, welches durch die im Schritt 2) des Verfah­ rens durchgeführte Behandlung zu einer anderen Base umge­ setzt wurde, die ein alternatives Basenpaarungsverhalten zeigt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dieses Nukleotid ein Cytosin vor der Behandlung, welche unmethy­ lierte Cytosine umsetzt. In einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform ist diese Behandlung eine Bisulfit-Behandlung. Das genannte Primermolekül umfasst wenigstens ein Nukleo­ tid innerhalb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Moleküls, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Cytosin ist, das durch Bisulfit-Behandlung zu einer ande­ ren Base umgesetzt wurde, die das Basenpaarungsverhalten von Thymin zeigt.

Dadurch soll die Bindung von Primermolekülen an die verbleibenden unbehandelten oder nicht ausreichend behan­ delten Nukleinsäuren ausgeschlossen werden, die in der PCR noch als Templat-Nukleinsäure dienen könnten.

Weiterhin ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, dass die genannten Primermoleküle nicht selbst oder miteinander Schleifen oder Haarnadeln bilden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Ver­ fahrens bilden diese Primermoleküle miteinander keine Di­ mere.

Im Text wird das Wort "Haarnadel" verwendet, um eine Se­ kundärstruktur zu bezeichnen, die durch ein Primermolekül gebildet wird, wenn die 3'-Terminalregion der genannten Nukleinsäure an die 5'-Terminalregion der genannte Nuk­ leinsäure unter Ausbildung eines doppelsträngigen Stamm­ bereichs hybridisiert, und worin nur die zentrale Region des Primers einzelsträngig ist.

Wie im Text beschrieben, bezieht sich das Wort "Schleife" auf eine Sekundärstruktur, die durch ein Primermolekül gebildet wird, wenn zwei oder mehr Nukleotide dieses Mo­ leküls hybridisieren und dadurch eine Sekundärstruktur ausbilden, die eine doppelsträngige Struktur mit einer Länge von einem oder mehr Basenpaaren umfasst, und wei­ terhin eine einzelsträngige Region zwischen dieser dop­ pelsträngigen Region umfasst.

Die Bindung des 3'-Endes eines Primermoleküls an irgend­ einen Teil eines zweiten Primermoleküls in dem Satz muss vermieden werden. Ansonsten würde die Polymerase den er­ sten Primer, unter Verwendung des zweiten Primers als Templat, verlängern, was zu einem unerwünschten Produkt, einem verlängerten Primer oder vielmehr einem Primer- Hybrid, führen würde, welches als das bevorzugte Templat für die nächste Runde der Polymerase-Kettenreaktion die­ nen würde und dadurch eine ausreichende Amplifikation des gewünschten Produkts verhindern würde.

Deshalb ist es eine andere bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens, dass jedes Primermolekül dadurch ge­ kennzeichnet ist, dass die letzten mindestens 5 Basen am 3'-Ende dieses Primermoleküls nicht komplementär zur Se­ quenz irgendeines anderen Primermoleküls im Satz sind.

Es ist auch bevorzugt, dass diese Primermoleküle nicht an Nukleinsäuren binden, die vor der Behandlung durch Schritt 2 eine 5'-CG-3'-Stelle enthielten. Dieses würde zu einer Bindung der Primer an Bisulfit-behandelte Nuk­ leinsäuren führen, die speziell vom Methylierungsstatus ihrer Cytosin abhinge. Ein CG-korrespondierender Primer würde nur an die behandelte, methylierte Version binden, wohingegen ein zu TG korrespondierender Primer nur an die behandelte, unmethylierte Version dieser Nukleinsäuren binden würde. Es ist deshalb bevorzugt, dass diese Pri­ mermoleküle keine Nukleinsäure-Sequenzen enthalten, die komplementär zu oder identisch mit Nukleinsäure-Sequenzen sind, welche vor der Behandlung von Schritt 2 eine 5'-CG- 3'-Stelle enthielten.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens liegen die Primermoleküle in einem spezifizierten Längen- Bereich.

Es ist besonders bevorzugt, dass diese Primer 16-50 Nukleotide umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens umfassen diese Primermoleküle keine Sequenzen, die kom­ plementär zu Regionen der Target-Nukleinsäuren sind, wel­ che vor der Behandlung, die das Basenpaarungsverhalten der unmethylierten Cytosin-Basen veränderte, spezifische Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthielten. Es ist bevorzugt, dass diese Primer komplementär zu Target- Sequenzen sind, welche vor der in Schritt 2 der Erfindung durchgeführten Behandlung, keine spezifizierte Restrikti­ onsenzym-Erkennungsstellen enthielten.

Durch das Auswählen des richtigen Primermoleküls wird auch die Sequenz des Amplifikats bestimmt. Deshalb muss berücksichtigt werden, nur solche Primermoleküle zu ver­ wenden, welche zur Amplifikation von Nukleinsäuren füh­ ren, die eine angemessen hohe Anzahl von zu analysieren­ den CpG-Stellen enthalten. Aufgrund der Behandlung von Schritt 2 dieser Erfindung werden diese CpG-Stellen, ab­ hängig vom Methylierungsstatus des Cytosins, umgesetzt und werden deshalb entweder als CG-Dinukleotide oder als TG-Dinukleotide im Amplifikat erscheinen.

Es ist bevorzugt, dass diese Primermoleküle Regionen von Nukleinsäuren amplifizieren, die vor der Bisulfit- Behandlung mehr als acht 5'-CG-3'-Stellen, auch als CG- Dinukleotide bezeichnet, umfassten.

Es ist auch bevorzugt, dass diese Primermoleküle Regionen von Nukleinsäuren amplifizieren, die vor der Bisulfit- Behandlung mehr als sechs 5'-CG-3'-Stellen, auch als CG- Dinukleotide bezeichnet, umfassten.

Es ist auch bevorzugt, dass diese Primermoleküle Regionen von Nukleinsäuren amplifizieren, die vor der Bisulfit- Behandlung mehr als vier 5'-CG-3'-Stellen, auch als CG- Dinukleotide bezeichnet, umfassten, und schließlich ist es besonders bevorzugt, dass diese Primermoleküle Regio­ nen von Nukleinsäuren amplifizieren, die vor der Bisul­ fit-Behandlung mehr als zwei 5'-CG-3'-Stellen, auch als CG-Dinukleotide bezeichnet, umfassten.

Diese Primermoleküle führen zu Amplifikaten innerhalb ei­ nes spezifischen Größenbereichs.

Es ist eine bevorzugte Ausführungsform dieser Sequenz, dass diese Primermoleküle zu Amplifikaten führen, die we­ nigstens 50 bp aber nicht mehr als 2000 bp umfassen.

Insbesondere bevorzugt sind Primermoleküle, die zu Ampli­ fikaten führen, die wenigstens 80 bp aber nicht mehr als 1000 bp umfassen.

Weiterhin ist ein Verfahren bevorzugt, worin diese Pri­ mermoleküle zu Amplifikaten von behandelten Nukleinsäuren führen, die vor der Behandlung, welche das Basenpaarungs­ verhalten der unmethylierten Cytosine veränderte, keine Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthielten. Diese Primermoleküle führen zu Amplifikaten, die amplifizierte Regionen der behandelten Nukleinsäuren sind, welche vor der in Schritt 2) des Verfahrens durchgeführten Behand­ lung keine spezifizierten Restriktionsenzym-Erkennungs­ stellen enthielten.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfah­ ren, wie diese Primermoleküle herzustellen sind. Der Hauptschritt der Herstellung eines Primermoleküls ist die Festlegung dessen Sequenz. Im Folgenden wird der Ausdruck "Primer-Design" anstelle von Primer-Herstellung verwen­ det, wann immer Bezug auf den Bestimmungsschritt dieser spezifischen Primer-Sequenzen genommen wird. Das Designen von Primermolekülen ist ein Verfahren, welches dem Durch­ schnittswissenschaftler als solches bekannt ist. Die für diesen Zweck gewöhnlich verwendeten Programme sind solche wie PRIMER3 oder OSP (S. Rozen und H. Skaletsky (2000) PRIMER3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 132: 365-386; L. Hillier und P. Green (1991) OSP: A computer program for choosing PCR and DNA sequencing primers. PCR Methods and Applica­ tions 1: 124-128). Andere Primer-Design-Systeme (wie in EP-A 1136932 beschrieben) basieren häufig auf diesen all­ gemein bekannten Programmen.

Eine Ausführungsform dieser Erfindung macht sich zuerst die Verwendung eines Programms wie PRIMER3 zunutze, um dann eine Anzahl von Schritten hinzuzufügen, die schließ­ lich in einem erweiterten Verfahren zum Designen von Pri­ mern, die speziell für die Amplifizierung von Sequenzen geringer Komplexität geeignet sind, resultiert.

Im ersten Schritt dieses Verfahrens zum Designen spezifi­ scher Primermoleküle für Nukleinsäuren geringer Komplexi­ tät, werden Primerpaare, die Einzelprodukte amplifizie­ ren, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standard-Werkzeugen für Primer-Design, wie zum Beispiel PRIMER3 (S. Rozen und H. Skaletsky (2000) Methods Mol Bi­ ol 132: 365-386), ausgewählt.

Im zweiten Verfahrensschritt werden diese Primerpaare darauf getestet, ob eines ihrer Primermoleküle, wenn es an irgendein anderes Primermolekül im Satz hybridisiert, eine bestimmte Schwellenwert-Schmelztemperatur TM über­ steigt. Wenn das der Fall ist, wird das Primerpaar, das diesen Primer umfasst, aus dem Satz der potentiell kombi­ nierten Paare ausgeschlossen.

Im dritten Verfahrensschritt wird die Anzahl der vorher ausgewählten Primerpaare durch die Einführung eines Maßes für die Komplexität der Primer-Sequenz, als neues Krite­ rium, auf eine kleinere Anzahl reduziert. Primerpaare, die aus einem Primermolekül bestehen, das dieses Kriteri­ um nicht erfüllt, werden ausgeschlossen.

Das Hauptproblem des Auffindens eines Primers, der spezi­ fisch genug ist, um nur ein Produkt bei gering komplexer Bisulfit-DNA zu bilden, wird schließlich durch das Testen jedes potentiellen Primerpaars auf Hybridisierung über das gesamte, Bisulfit-umgesetzte menschliche Genom, ge­ löst. Das erfordert das virtuelle (wie in "In-Silico") Übersetzen der gesamten Information der menschlichen Ge­ nom-Sequenz in ihre behandelte, zum Beispiel Bisulfit­ behandelte, Version, bevor eine Ähnlichkeitssuche gegen­ über den Primerpaaren durchgeführt wird, welche auf einem Verfahren wie der sogenannten e-PCR (G. D. Schuler (1997) Sequence Mapping by electronic PCR. Genome Research 7(5): 541-550) basiert. Da jedoch die Bisulfit-Umsetzung zu zwei verschiedenen Versionen der Doppelhelix führt, deren Sense- und Antisense-Stränge nicht länger wechselseitig komplementär sind, muss diese In-Silico-Amplifikation an beiden Bisulfit-umgesetzen Versionen des Genoms durchge­ führt werden. Zusätzlich ist die Templat-DNA in den meis­ ten Fällen mit nicht umgesetzter genomischer DNA verun­ reinigt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass Ein­ zel-Cytosine oder größere Abschnitte von DNA unumgesetzt verbleiben oder durch die Bisulfit-Behandlung nur unvoll­ ständig umgesetzt werden. Um auch die unerwünschte Ampli­ fikation der unumgesetzten DNA als Templat auszuschlie­ ßen, muss der gleiche Hybridisierungs-Test ein drittes mal unter Verwendung der ganzen menschlichen Genom- Sequenz als Templat, durchgeführt werden.

Da das ein ziemlicher Aufwand ist und Zeit erfordert (CPU-Zeit) ist dies der vierte und letzte Schritt dieses Design-Verfahrens, der vor dem abschließenden Testen in einem "nassen", laborgestützten Experiment absolviert wird.

Um zusätzlich die Spezifität dieser Primermoleküle zu verbessern, wird die Strenge der Auswahlkriterien erhöht:
Einige Standard-Werkzeuge zum Primer-Design schließen ei­ nen Primer aus, wenn in der Templat-Sequenz, eine zweite identische Sequenz neben der Target-Sequenz, gefunden werden kann. Auf diesem Weg wird Mispriming bei ziemlich stringenten Hybridisierungsbedingungen vermieden. Dieses Mispriming würde nicht notwendigerweise zu einem zusätz­ lich unerwünschten Produkt führen, würde aber zur Verdün­ nung der für die Amplifikation verfügbaren Primermoleküle führen. Diese Auswahl ist schon in Schritt eins (zum Bei­ spiel durch PRIMER3) durchgeführt worden. Aufgrund der höheren Wahrscheinlichkeit eines Bisulfit-Primermoleküls mit nicht-identischer, Bisulfit-behandelter DNA fehlzu­ paaren, besteht für diese noch eine Chance Primermoleküle zum Misprimen, auch wenn sich bis zu 20% der Nukleotide der Primer-Sequenz unterscheiden. Deshalb wird in dieser Erfindung beansprucht, nur Primermoleküle zu verwenden, für welche nicht einmal eine schwache Sequenzhomologie gefunden werden kann. Das würde jedoch unnötigerweise Primermoleküle ausschließen. Deshalb werden sie nur aus­ geschlossen, wenn zwei Primermoleküle an das Templat paa­ ren und ein unerwünschtes Produkt amplifizieren. Dieser Test wird zum Beispiel mittels der Elektronischen PCR durchgeführt. Elektronische PCR (e-PCR) ist eine virtuel­ le In-Silico-PCR, die ausgeführt wird, um die Eignung von Primern vor der In-Vitro-PCR abzuschätzen.

Im vierten Verfahrensschritt zum Designen dieser Primer wird deshalb getestet, ob es irgendwelche Regionen der Templat-Nukleinsäure gibt, wobei diese Templat- Nukleinsäure den Sense- und den Antisense-Strang der be­ handelten und unbehandelten Nukleinsäuren umfasst, die in der Sequenz mit dem Primermolekül zu mehr als 80% iden­ tisch sind und ob diese Primermoleküle in der Lage sind, ein ungewünschtes Produkt zu amplifizieren. Wenn das der Fall ist, wird das Primerpaar, welches das genannte Pri­ mermolekül umfasst, aus der Auswahl ausgeschlossen.

Die Templat-Nukleinsäure umfasst die behandelte Templat- Nukleinsäure und die unbehandelte Templat-Nukleinsäure. Die behandelte Nukleinsäure selbst umfasst zwei Stränge, welche nach der Behandlung zueinander nicht mehr komple­ mentär sind. Dieses virtuelle Testen kann zum Beispiel, wie von Gregory Schuler in seinem Artikel (oben zitiert) über Sequenz-Mapping durch "Elektronische PCR" beschrie­ ben, durchgeführt werden. Die verbliebenen Primerpaare können verwendet werden, um spezifisch Regionen von Nuk­ leinsäuren geringer Komplexität zu amplifizieren, was das Ziel dieser Erfindung ist. Daher ist Schritt 4 des De­ sign-Verfahrens das virtuelle Testen jeder möglichen Pri­ merpaar-Kombination darauf, dass keine ungewünschten Nuk­ leinsäuren amplifiziert werden, unter vorher spezifizier­ ten Bedingungen mit einer Stringenz, die ein oder mehr Basen-Paar-Fehlpaarungen zulässt. Dieses virtuelle Testen wird an beiden unbehandelten und behandelten Nukleinsäu­ ren ausgeführt. Der Ausdruck "mögliche Kombinationen" be­ zieht sich auf alle Kombinationen, die innerhalb eines Satzes von Primerpaaren, zur Verwendung in einem Amplifi­ kations-Reaktionsbehälter, möglich sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzli­ cher, auf das virtuelle Testen folgender, Schritt hinzu­ gefügt, der aus dem Testen aller verbliebenen Paare, durch laborbasierte Single-PCR-Assay, darauf besteht, ob das gewünschte Amplifikat erhalten werden kann oder nicht. Wenn das der Fall ist, können die ausgewählten Paare verwendet werden, um spezifisch, gemäß des oben be­ schriebenen Verfahrens, die Regionen von Nukleinsäuren mit geringer Komplexität, zu amplifizieren.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist der erste Schritt des Design-Verfahrens als Auswahl eines Pools möglicher Primerpaare pro Amplifikat, mittels eines Standard-PCR-Primer-Design-Programms, gekennzeichnet, wo­ bei als Templat die genannten Nukleinsäuren verwendet werden, die für Wiederholungen und SNPs entsprechend der folgenden Faktoren maskiert worden sind:
Länge des Amplifikats, Länge des Primers, Schmelztempera­ tur des Primermoleküls, Dimerbildungs-Parameter, Schlei­ fenbildungs-Parameter, Ausschluss unidentifizierter oder zweideutiger Nukleotide in der Primer-Sequenz, Ausschluss von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Maß für Komplexität ein Maß für linguistische Komple­ xität, wie von Bolshoy et al. (siehe oben) definiert. Es werden jene Primerpaare aus den vorher ausgewählten aus­ geschlossen, welche ein Primerpaar umfassen, das eine Satzebene dieser linguistischen Komplexität nicht er­ reicht.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Er­ findung ist dieses Maß für Komplexität ein Maß für Shan­ non-Entropie (wie oben beschrieben).

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform dieses Design-Verfahrens wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens von Primer­ paaren aus den verbliebenen Primerpaaren durchgeführt, welche aus einem wenigstens eine CpG-Stelle umfassenden Primermolekül bestehen.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens bezüglich des Designs dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens von Primerpaaren aus den verbliebenen Paaren durchgeführt, wenn eines ihrer Primermoleküle nicht wenigstens ein Nukleotid in den letzten drei Nukle­ otiden am 3'-Ende des Moleküls enthält, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Nukleotid der Target- Sequenz ist, das durch Bisulfit-Behandlung in ein anderes Nukleotid überführt wurde.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens bezüglich der Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens von Primerpaaren aus den ver­ bliebenen Primerpaaren durchgeführt, welche eine Nuklein­ säure amplifizieren, die vor der Behandlung mit Bisulfit nicht ein Minimum von zwei CpG-Stellen enthielt.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens von Primerpaaren aus den verbliebenen Paa­ ren durchgeführt, wenn eines ihrer Primermoleküle mehr als 5 Basen an seinem 3'-Ende enthält, die komplementär zu irgendeiner Sequenz eines anderen Primerpaars im Satz sind.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens jener Primerpaaren aus den verbliebenen Paaren durchgeführt, welche ein Primermolekül umfassen, das in Kombination mit anderen Primermolekülen im Satz bei dem virtuelle Testen gemäß Schritt 3c) des Amplifi­ kationsverfahrens unter Bedingungen, bei denen eine An­ zahl von fehlpaarenden Nukleotiden von 20% der Anzahl von Nukleotiden der Primermoleküle zulassen ist, ein un­ gewünschtes Produkt amplifiziert.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens bezüglich der Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens jener Primerpaaren aus den ver­ bliebenen Primerpaaren durchgeführt, welche ein Primermo­ lekül umfassen, das in Kombination mit anderen Primermo­ lekülen im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn das virtuelle Testen gemäß Schritt 3c) des Amplifi­ kationsverfahrens unter Bedingungen durchgeführt wird, die es zulassen, dass eine Anzahl von bis zu 20% der An­ zahl der Nukleotide des Primermoleküls eine Lücke bilden, wenn sich die Sequenz des Primermoleküls an die Templat- Sequenz ausrichtet.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens bezüglich der Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens jener Primerpaare aus den ver­ bliebenen Primerpaaren durchgeführt, welche ein Primermo­ lekül umfassen, das in Kombination mit anderen Primermo­ lekülen im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn das virtuelle Testen gemäß Schritt 3c) des Amplifi­ kationsverfahrens unter Bedingungen durchgeführt wird, die vier oder weniger fehlpaarende Basenpaare zulassen.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Herstellung dieser Primer, wird vor der Durchführung des Schritts d) der zusätzliche Schritt des Ausschließens jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren durchgeführt, welche ein Primermolekül um­ fassen, das in Kombination mit anderen Primermolekülen im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn das virtuelle Testen gemäß Schritt 3c) des Amplifikations­ verfahrens unter Bedingungen durchgeführt wird, die zwei oder weniger fehlpaarende Basenpaare zulassen.

Claims (51)

1. Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren, die folgenden Schritte umfassend

• 1. die Isolierung einer Nukleinsäure-Probe,
• 2. die Behandlung dieser Probe in einer Art, die zwi­ schen methylierten und unmethylierten Cytosin-Basen in der Probe unterscheidet,
• 3. das Amplifizieren von wenigstens einer Target- Sequenz in dieser behandelten Nukleinsäure, mittels enzymatischer Amplifikation und eines Satzes von Pri­ mermolekülen, worin diese Primermoleküle dadurch ge­ kennzeichnet sind, dass
  • a) jede Primermolekül-Sequenz ein vorher festge­ legtes Maß an Komplexität erreicht,
  • b) jede Kombination zweier beliebiger Primermole­ küle in dem Satz eine Schmelztemperatur unter ei­ ner spezifizierten Schwellenwert-Temperatur be­ sitzt,
  • c) jede Kombination zweier Primermoleküle beim virtuellen Testen unter Verwendung der behandel­ ten und der unbehandelten Proben-Nukleinsäure als Templat, unter Bedingungen, die eine Basenfehl­ paarung oder mehr Basenfehlpaarungen pro Primer zulassen, nicht zur Amplifikation eines uner­ wünschten Produkts führt,

und

• 1. das Detektieren dieser amplifizierten Target- Nukleinsäure.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin diese Primermolekü­ le keine Nukleinsäure-Sequenzen enthalten, die kom­ plementär zu oder identisch mit Nukleinsäure- Sequenzen der Target-Sequenz sind, die vor der Be­ handlung von Schritt 2 eine 5'-CG-3'-Stelle enthielt.

3. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 und 2, worin dieser Satz wenigstens ein Primerpaar aber nicht mehr als 32 Primerpaare umfasst.

4. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 und 2, worin dieser Satz wenigstens ein Primerpaar aber nicht mehr als 16 Primerpaare umfasst.

5. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 4, worin die Pri­ mermoleküle einen spezifischen Wert von linguisti­ scher Komplexität erreichen.

6. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 4, worin die Pri­ mermoleküle einen spezifischen Wert von Shannon- Entropie erreichen.

7. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 6, worin die Nuk­ leinsäure-Probe aus einer Körperflüssigkeit, einer Zellkultur, einer Gewebeprobe oder deren Kombination, isoliert wird.

8. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 7, worin die Nuk­ leinsäure-Probe Plasmid-DNA, BACs, YACs oder genomi­ sche DNA umfasst.

9. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 7, worin die Nuk­ leinsäure-Probe menschliche, genomische DNA umfasst.

10. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 9, worin diese Probe mittels einer Bisulfit-, Hydrogensulfit- oder Disulfit-Lösung behandelt wird.

11. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 10, worin dieses Primermolekül wenigstens ein Nukleotid innerhalb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Moleküls um­ fasst, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Nukleotid der Target-Sequenz ist, das durch die in Schritt 2) des Anspruchs 1 durchgeführte Behandlung, in ein anderes Nukleotid überführt wurde.

12. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 10, worin dieses Primermolekül wenigstens ein Nukleotid innerhalb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Moleküls um­ fasst, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Nukleotid der Target-Sequenz ist, das durch Bisulfit- Behandlung in ein anderes Nukleotid überführt wurde.

13. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 12, worin jedes dieser Primermoleküle dadurch gekennzeichnet ist, dass die letzten, wenigstens 5 Basen am 3'-Ende die­ ses Primermoleküls nicht komplementär zur Sequenz ir­ gendeines anderen Primermoleküls im Satz sind.

14. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die An­ zahl der beim virtuellen Testen auf die Amplifikation unerwünschter Produkte gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassenen Fehlpaarungen, geringer als 20% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

15. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassene Anzahl der bei der Ausrichtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat-Sequenz ei­ ne Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 20% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

16. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die An­ zahl der beim virtuellen Testen auf die Amplifikation unerwünschter Produkte gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassenen Fehlpaarungen weniger als 10% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

17. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassene Anzahl der bei der Ausrichtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat-Sequenz ei­ ne Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 10% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

18. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die An­ zahl der beim virtuellen Testen auf die Amplifikation unerwünschter Produkte gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassenen Fehlpaarungen weniger als 5% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

19. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die beim virtuellen Testen auf die Amplifikation eines unerwünschten Produkts gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassene Anzahl der bei der Ausrichtung der Primermolekül-Sequenz mit der Templat-Sequenz ei­ ne Lücke erzeugenden Nukleotide weniger als 5% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls ist.

20. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die An­ zahl der beim virtuellen Testen auf die Amplifikation unerwünschter Produkte gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassenen Fehlpaarungen weniger als 7 ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die Anzahl der zu­ gelassenen Fehlpaarungen weniger als fünf ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die Anzahl der zu­ gelassenen Fehlpaarungen weniger als drei ist.

23. Verfahren gemäß Anspruch 20, worin die Anzahl der zu­ gelassenen Fehlpaarungen eins ist.

24. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 13, worin die An­ zahl der beim virtuellen Testen auf die Amplifikation unerwünschter Produkte gemäß Schritt 3c) des An­ spruchs 1 zugelassenen Fehlpaarungen durch eine vor­ her spezifizierte, maximale Schmelztemperatur be­ stimmt wird.

25. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 24, worin diese Primermoleküle zum Amplifizieren von Nukleinsäure- Sequenzen verwendet werden, die vor der Behandlung von Schritt 2 mehr als acht 5'-CG-3'-Stellen umfass­ ten.

26. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 24, worin diese Primermoleküle zum Amplifizieren von Nukleinsäure- Sequenzen verwendet werden, die vor der Behandlung von Schritt 2 mehr als sechs 5'-CG-3'-Stellen umfass­ ten.

27. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 24, worin diese Primermoleküle zum Amplifizieren von Nukleinsäure- Sequenzen verwendet werden, die vor der Behandlung von Schritt 2 mehr als vier 5'-CG-3'-Stellen umfass­ ten.

28. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 24, worin diese Primermoleküle zum Amplifizieren von Nukleinsäure- Sequenzen verwendet werden, die vor der Behandlung von Schritt 2 mehr als zwei 5'-CG-3'-Stellen umfass­ ten.

29. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 28, worin die Be­ fähigung dieser Primermoleküle, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels elektronischer PCR getestet wird.

30. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 28, worin die Be­ fähigung dieser Primermoleküle, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels elektronischer PCR getestet wird, wobei als Templat-Nukleinsäure der ko­ dierende Strang der behandelten Probe, der nicht­ kodierende Strang der behandelten Probe und beide Stränge der unbehandelten Probe, verwendet werden.

31. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 28, worin die Be­ fähigung dieser Primermoleküle, ein unerwünschtes Produkt zu amplifizieren, mittels elektronischer PCR getestet wird, wobei als Templat-Nukleinsäure der ko­ dierende Strang des Bisulfit-umgesetzten menschlichen Genoms, der nicht-kodierende Strang des Bisulfit­ umgesetzten menschlichen Genoms und beide Stränge des unbehandelten menschlichen Genoms verwendet werden.

32. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 31, worin diese Primermoleküle verwendet werden, um Nukleinsäuren zu amplifizieren, die wenigstens 50 bp aber nicht mehr als 2000 bp umfassen.

33. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 31, worin diese Primermoleküle verwendet werden, um Nukleinsäuren zu amplifizieren, die wenigstens 80 bp aber nicht mehr als 1000 bp umfassen.

34. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 33, worin diese Primermoleküle 16-50 Nukleotide umfassen.

35. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 34, worin diese Primermoleküle miteinander keine Dimere ausbilden.

36. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 35, worin diese Primermoleküle keine Schleifen- oder Haarnadelstruk­ turen ausbilden.

37. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 36, worin diese Primermoleküle komplementär zu Target-Sequenzen sind, die vor der in Schritt 2) des Anspruchs 1 durchge­ führten Behandlung keine spezifizierten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthielten.

38. Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 37, worin diese Primermoleküle Regionen der unbehandelten Nukleinsäu­ ren amplifizieren, die vor der in Schritt 2) des An­ spruchs 1 durchgeführten Behandlung keine spezifi­ zierten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthiel­ ten.

39. Verfahren zum Designen von Primern gemäß Anspruch 1, die folgenden Schritte umfassend

• a) die Auswahl eines Pools möglicher Primerpaare pro Amplifikat mittels eines Standard-PCR-Primer-Design- Programms, unter Verwendung dieser Nukleinsäuren als Templat
• b) das Ausschließen jener Primerpaare, die einen Pri­ mer umfassen, der in Kombination mit anderen Primer­ molekülen des gleichen Satzes eine Schwellenwert- Schmelztemperatur überschreitet
• c) das Ausschließen jener Primerpaare, welche einen Primer umfassen, der nicht eine spezifizierte Ebene an Komplexität erreicht
• d) das Ausschließen jener Primerpaare, die einen Pri­ mer umfassen, welcher in Kombination mit einem ande­ ren Primermolekül im gleichen Satz, beim virtuellen Testen unter Bedingungen, die eine Fehlpaarung oder mehr Fehlpaarungen pro Primer zulassen, unter Verwen­ dung der behandelten und unbehandelten Proben- Nukleinsäure als Templat, ein unerwünschtes Produkt amplifiziert.

40. Verfahren zum Designen dieser Primermoleküle gemäß Anspruch 1 und 43, unter Hinzugügen des Schritt des

• a) Ausschließens jener Primerpaare aus den verbliebe­ nen, bestätigten Primerpaaren, welche in diesem Amplifikationsschritt nicht zur Amplifikation des be­ absichtigten Produkts führen, wenn ein Single-PCR- Experiment durchgeführt wird.

41. Verfahren zum Designen von Primern gemäß der Ansprü­ che 39 und 40, worin diese Templat-Nukleinsäuren vor dem Designen dieser Primermoleküle für Wiederholungen und SNPs maskiert werden und worin dieses Standard- PCR-Primer-Design-Programm einen oder mehrere der folgenden Faktoren berücksichtigt Länge des Amplifikats, Länge des Primers, Schmelztem­ peratur der Primer, Dimmerbildungs-Parameter, Schlei­ fenbildungs-Parameter, Ausschluss unidentifizierter oder zweideutiger Nukleotide in der Primer-Sequenz, Ausschluss von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.

42. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 41, worin dieses Maß der Komplexität ein Maß für linguistische Komple­ xität ist.

43. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 41, worin dieses Maß der Komplexität ein Maß für Shannon-Entropie ist.

44. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 43, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche aus einem Primermolekül beste­ hen, das wenigstens eine CpG-Stelle umfasst.

45. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 43, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche aus einem Primermolekül beste­ hen, das nicht wenigstens ein Nukleotid innerhalb der letzten drei Nukleotide vom 3'-Ende des Moleküls ent­ hält, worin dieses Nukleotid komplementär zu einem Nukleotid der Target-Sequenz ist, das durch die in Schritt 2) des Anspruchs 1 durchgeführte Behandlung in ein anderes Nukleotid überführt wurde.

46. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 45, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche aus einem Primermolekül beste­ hen, das mehr als 5 Basenpaare an seinem 3'-Ende ent­ hält, die zur Sequenz irgend eines anderen Primermo­ leküls im Satz komplementär sind.

47. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 46, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, die eine Nukleinsäure amplifizieren, die vor der Behandlung in Schritt 2 des Anspruchs 1 nicht wenigstens zwei CpG-Stellen enthielt.

48. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 47, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche ein Primermolekül umfassen, das in Kombination mit einem anderen Primermolekül im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn virtuell gemäß Schritt 3c) des Anspruchs 1 unter Be­ dingungen getestet wird, die eine Anzahl von fehlpaa­ renden Nukleotiden von 20% der Anzahl der Nukleotide des Primermoleküls zulassen.

49. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 47, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche ein Primermolekül umfassen, das in Kombination mit einem anderen Primermolekül im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn virtuell gemäß Schritt 3c) des Anspruchs 1 unter Be­ dingungen getestet wird, die beim Ausrichten der Pri­ mermolekül-Sequenz mit der Templat-Sequenz, eine An­ zahl von einer Lücke erzeugenden Nukleotiden von bis zu 20% der Anzahl der Nukleotide der Primermoleküle zulassen.

50. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 47, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche ein Primermolekül umfassen, das in Kombination mit einem anderen Primermolekül im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn virtuell gemäß Schritt 3c) des Anspruchs 1 unter Be­ dingungen getestet wird, die vier oder weniger fehlpaarende Basenpaare zulassen.

51. Verfahren gemäß der Ansprüche 39 bis 47, worin bevor der Schritt d) ausgeführt wird, der folgende Schritt durchgeführt wird Ausschließen jener Primerpaare aus den verbliebenen Primerpaaren, welche ein Primermolekül umfassen, das in Kombination mit einem anderen Primermolekül im Satz ein unerwünschtes Produkt amplifiziert, wenn virtuell gemäß Schritt 3c) des Anspruchs 1 unter Be­ dingungen getestet wird, die zwei oder weniger fehlpaarende Basenpaare zulassen.