EP1366190A2 - Verfahren zur quantifizierung von cytosin-methylierungen in komplex amplifizierter genomischer dna - Google Patents

Verfahren zur quantifizierung von cytosin-methylierungen in komplex amplifizierter genomischer dna

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EP1366190A2
EP1366190A2 EP01989384A EP01989384A EP1366190A2 EP 1366190 A2 EP1366190 A2 EP 1366190A2 EP 01989384 A EP01989384 A EP 01989384A EP 01989384 A EP01989384 A EP 01989384A EP 1366190 A2 EP1366190 A2 EP 1366190A2
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EP
European Patent Office
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dna
sample
adapters
amplified
genomic dna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01989384A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Olek
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1366190A2 publication Critical patent/EP1366190A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantification of cytosine methylations of a genomic DNA sample with an unknown methylation status by comparison with a demethylated reference DNA.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, genomic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • a chemical reaction or enzymatic treatment of the genomic DNA is usually carried out, as a result of which the cytosine can be distinguished from the methylcytosine bases.
  • a common method is the implementation of genomic DNA with bisulfite, which is alkaline
  • Demethylated DNA is used in the prior art in numerous methods for quantifying DNA methylation. Representative are: “Rapid quantification of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension” (Gonzalgo, ML, Jones PA Nucleic Acids Res. 25, 2529 (1997)) and “Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA “(Warnecke, PM, Stirzaker, C, Melki, JR, Douglas, SM, Paul, CL, Clark, SJ 25, 4422 (1997)).
  • This demethylated DNA is e.g. obtained from cells that are demethylated in the target sequence or from cells that lack the enzyme DNA methyltransferase.
  • this method is not suitable for carrying out complex amplifications which are intended to provide many fragments at the same time for the methylation detection.
  • this is essential since the sample to be examined, for the methylation analysis of which the reference DNA is produced, is usually only amplified after the bisulfite treatment. In the case of a complex PCR reaction, the comparability of reference and sample is no longer possible, since they contain potentially different fragments.
  • the present invention provides a method for the analysis of cytosine methylations in genomic DNA samples, for which purpose DNA with a degree of methylation of 0% is produced as reference material. This is the first time possible to provide an essentially unmethylated reference DNA for complex amplifications.
  • the present invention describes a method for providing demethylated DNA as reference material for the analysis of cytosine methylations in genomic DNA samples using complex amplifications.
  • the following process steps are carried out in detail:
  • a genomic DNA sample is amplified with primers which are either very short or degenerate oligonucleotides or oligonucleotides complementary to adapters.
  • primers which are either very short or degenerate oligonucleotides or oligonucleotides complementary to adapters.
  • a restriction enzyme is cut before amplification and the adapters, which are short nucleotide fragments of known sequence, are ligated to the ends of the resulting DNA fragments.
  • the amplificates are treated chemically in such a way that at the 5-position unmethylated cytosine bases are converted into uracil, thymine or into another base which is unlike the cytosine in hybridization behavior, while the 5-methylcytosine bases remain essentially unchanged. This is understood below as chemical pretreatment.
  • the chemically pretreated amplificates are in turn amplified. Either several specifically hybridizing oligonucleotides or oligonucleotides complementary to the adapters are used as primers. In the latter case, chemical pretreatment is also carried out.
  • a genomic DNA sample to be examined is cut using a restriction enzyme. Adapters are ligated to the ends of the DNA fragments and the sample is subsequently divided. The first part of the sample is amplified with primer oligonucleotides that are complementary to the adapters. However, the second part of the sample is not amplified.
  • the two parts of the sample are chemically pretreated and amplified separately, using primer oligonucleotides complementary to the adapters.
  • the two parts of the sample are then analyzed.
  • the first part of the sample provides the reference value for a degree of methylation of 0%.
  • the second part of the sample provides the measured value which essentially corresponds to the degree of methylation in the original genomic DNA sample.
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from the usual sources for DNA, such as. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, for example tissue from the eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lungs, chest, liver, skin or bone marrow, histological slides and all possible combinations of them.
  • the polymerase chain reaction (PCR) is used for the amplification.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a heat-resistant DNA polymerase is used for the polymerase chain reaction.
  • the amplification of several identical or several different DNA sections is preferably carried out in a reaction vessel.
  • restriction endonucleases The following are preferably used as restriction endonucleases: Rsal, Dpnl, Dpnll, Msel, Sau3AI, Alul, NIalll, Hael- II, Bfal, Tsp509I, BstUI or Mbol.
  • the amplificates are separated from the reagents and other constituents of the reaction mixture by binding to a solid phase or to a gel and washing steps.
  • the reagents and the other constituents of the reaction mixture are preferably diluted in such a way that they are no longer a hindrance in the subsequent amplification, but the concentration of the amplified treated is still sufficient for the second amplification.
  • the demethylated reference DNA produced is particularly preferably analyzed in the same way as a sample DNA to be examined. In the analysis, this reference DNA provides the comparison value for a degree of methylation of 0%.
  • an enzymatically methylated DNA which was treated in the following in the same way as the sample DNA, is preferably used as a reference for a degree of methylation of 100%.
  • Example la Preparation of a demethylated reference DNA by means of multiplex PCR
  • the following example relates to the preparation of a downmethylated DNA sample that serves as a reference in comparison to an unknown methylated DNA.
  • you uses a genomic DNA sample, which in this case was digested with the restriction enzyme, Mssl.
  • (1-40 ng) of the cut DNA are multiplied by a pre-amplification by a DOP-PCR (degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction) according to the Nelson method (VG Cheung, SF Nelson, PNAS 93, 1476-1479, 1996) with the genomic primer oligonucleotide 5 '-CCGACTCGAGNNNNNNATGTG G-3'.
  • the method is primarily used to pre-amplify very small amounts of genomic DNA in order to allow multiple genetic analysis from 2-15 ⁇ g (200-1000 bp). In the amplification, all methyl cytosines are treated as cytosine bases.
  • the PCR reaction is carried out in the Master Cycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) with the following program.
  • the bisulfite reaction leads to the conversion of all cytosine bases into uracil.
  • To purify the bisulfited DNA it is bound to a reversed phase C18 solid phase and freed of chemicals by washing with a suitable buffer solution. Then the DNA with a polar solvent such as. B.
  • the specific amplification is carried out with 128 primer oligonucleotides, at least 64 primer oligonucleotides being labeled with Cy5 (Amersham Pharmacia). This is a primer oligonucleotide from a pair of primers.
  • primer oligonucleotide mixture (128 primer oligonucleotides, 64 of which are labeled Cy5, 0.78 pmol / ul of each)
  • the PCR reaction is carried out in the Master Cycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) with the following program. 15 min 95 ° C
  • the generated PCR certificates were analyzed by agarose gel electrophoresis (1.5% agarose in 0.5 ⁇ TBE buffer, Sambrook et al.). For this, 4 ⁇ l of the PCR approach are subjected to gel electrophoresis. Under the specified conditions, 64 genes are successfully amplified simultaneously.
  • Example Ib Preparation of an unknown methylated DNA sample by means of multiplex PCR
  • example Ib relates to the preparation of an unknown methylated DNA sample, which is compared with the downmethylated reference DNA from example la.
  • a genomic DNA sample is used, which in this case was cleaved with the restriction enzyme Mssl.
  • the sample is then reacted with hydrogen sulfite (bisulfite, disulfite).
  • the first method (Olek et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066) is a reaction with hydrogen sulfite and a radical scavenger, the DNA being embedded in agarose. The desulfonation of the DNA also takes place in agarose.
  • An organic reagent that supports denaturation is added and the mixture is incubated at elevated temperature.
  • hydrogen sulfite all cytosine bases are converted to uracil in both methods, methyl cytosines being retained.
  • a polar solvent such as. B.
  • the preamplification of the hydrogen sulfite-treated DNA is carried out using degenerate primer oligonucleotides (5 '-TTATAATGTTTT and 5' -TATATACTAAT).
  • the subsequent amplification with Cy5-labeled bisulfite-specific primer oligonucleotides is carried out with the 128 primer oligonucleotides described in Example 1a, the same primer oligonucleotide being Cy5-labeled.
  • the amplificates are also subjected to agarose gel electrophoresis for analysis.
  • Example lc Comparison of the unknown methylated DNA sample with the downmethylated reference DNA
  • the comparison of the unknown methylated DNA sample with the downmethylated reference DNA is preferably carried out by hybridization to an oligonucleotide array. Fluorescent dots are visible according to the position on the array. It is noticeable that certain points on the array are relative to the others and to the reference DNA shows a significantly increased or decreased fluorescence, provided the amplified products are present in a comparable concentration in the individual samples to be examined. The intensities of the fluorescent dye Cy5 (635 nm) in the individual amplificates are measured. The manner in which fluorescence measurements are evaluated is known to the person skilled in the art.
  • a genomic sequence is enzymatically cleaved by adding a restriction enzyme, here Nallall (Fermentas), which recognizes the sequence CATG. Fragments with an average size of 400 bp are generated. The cleaved fragments have 3 'overhanging CATG ends and are ligated to the sequence sections with the oligomer with the genomic sequence TGTCATCCTGTTGTCATG with addition of T4-DNA ligase according to standard conditions (fermentas) and non-ligated adapters according to standard conditions with a cleaning kit (Qiaquick PCR Purification Kit, Qiagen) removed.
  • a restriction enzyme here Nallall (Fermentas)
  • Fragments with an average size of 400 bp are generated.
  • the cleaved fragments have 3 'overhanging CATG ends and are ligated to the sequence sections with the oligomer with the genomic sequence TGTCATCCTGTTGTCATG with addition of T4-DNA ligase according to standard
  • the single-stranded ends are then supplemented to form the double-strand with Klenow enzyme (DNA polymerase I, Röche Molecular Biochemicals) and dNTPs (FIG. La).
  • Klenow enzyme DNA polymerase I, Röche Molecular Biochemicals
  • dNTPs FIG. La
  • a reference DNA proceed as follows: In the following step, the ligated sequence sections are amplified in a PCR reaction with the addition of primer oligonucleotides with the sequence TGTCATCCTGTTGTCATG and with a heat-resistant DNA polymerase. The PCR reaction is carried out in
  • the DNA is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a way that all of the cytosines that are not methylated at the 5-position of the base are changed in such a way that a base which is different with regard to the base pairing behavior is formed, while the base in 5-position methylated cytosines remain unchanged.
  • bisulfite hydrogen sulfite, disulfite
  • the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Desulfonation of the DNA (20 min, 96 ° C.) at pH 9 is then preferably carried out.
  • the DNA sample is amplified with the primers now complementary to the bisulfite-treated DNA, again in a polymerase chain reaction.
  • the PCR reaction is carried out in the master cycler gradient (Eppendorf, Hamburg) with the following parameters: Denaturation: 15 minutes (min) at 96 ° C, the following cycles are repeated 45 times: 60 seconds (sec) at 96 ° C , 45 sec at 42 ° C, 60 sec at 72 ° C and subsequent incubation for 10 minutes at 72 ° C (Fig. Ib).
  • the cut DNA ligated with adapters (FIG. 1 a) must be treated with bisulfite.
  • a PCR is carried out, the primer oligonucleotides with the sequences TGTTATTTTGTT-GTTTAG and TATCATCCTATTATGATA being used.
  • the PCR reaction is carried out in the master cycler gradient (Eppendorf, Hamburg) with the following parameters: Denaturation: 15 minutes (min) at 96 ° C, the following cycles are repeated 45 times: 60 seconds (sec) at 96 ° C, 45 sec at 42 ° C, 60 sec at 72 ° C and subsequent incubation for 10 minutes at 72 ° C.
  • the detection of the hybridization product is based on Cy5 fluorescence-labeled primer oligonucleotides which were used for the amplification.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide only occurs if there is a methylated cytosine in the bisulfite-treated DNA at this point. The methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product.
  • Figure la Restriction enzyme, Nlalll b. Adapter 1 5 '-TGTCATCCTGTTGT, ligase e.g. T4 DNA c. Klenow enzyme (DNA polymerase I), dNTP's, buffer d. Cleaning (Qiaquick cleaning kit)
  • Figure Ib e. PCR, primer 5 '-TGTCATCCTGTTGTCATG, dNTP's, buffer, TAQ f. Reaction with hydrogen sulfite g. PCR, primer 1 5 '-TGTTATTTTGTTGTTATG, primer 2 5'- TATCATCCTATTATCATA
  • Figure 2a Reaction with hydrogen sulfite b. PCR, primer 1 5 '-TGTTATTTTGTTGTTATG, primer 2 5'- TATCATCCTATTATCATA

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikation.

Description

Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen einer genomischen DNA-Probe mit unbekanntem Metylierungsstatus durch den Vergleich mit einer demethylierten Referenz-DNA.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Da- rüberhinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Die Amplifikation von DNA mittels PCR ist Stand der Technik.
Es sind mehrere Verfahren bekannt, die diese Probleme lösen. Meist wird eine chemische Reaktion oder enzymatische Behandlung der genomischen DNA durchgeführt, infolge derer sich die Cytosin von den Methylcytosin Basen unterscheiden lassen. Eine gängige Methode ist die Umsetzung von genomischer DNA mit Bisulfit, die nach alkalischer
Hydrolyse in zwei Schritten zu einer Umwandlung der Cytosin Basen in Uracil führt (Shapiro, R., Cohen, B., Ser- vis, R. Nature 227, 1047 (1970) . 5-Methylcytosin bleibt unter diesen -Bedingungen unverändert. Die Umwandlung von C in U führt zu einer Veränderung der Basensequenz, aus der sich durch Sequenzierung nun die ursprünglichen 5- Methylcytosine ermitteln lassen.
Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5- Methylcytosin stellt bis heute den wichtigsten und bestuntersuchten epigenetischen Parameter dar. Trotzdem gibt es bis heute zwar Methoden, umfassende Genotypen von Zellen und Individuen zu ermitteln, aber noch keine vergleichbaren Ansätze auch in großem Maße epigenotypische Information zu generieren und auszuwerten.
Demethylierte DNA wird im Stand der Technik bei zahlreichen Verfahren zur Quantifizierung von DNA-Methylierung eingesetzt. Stellvertretend seien genannt: „Rapid quanti- tation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension" (Gonzalgo, M.L., Jones P.A. Nucleic Acids Res. 25, 2529 (1997)) und „Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA" (Warnecke, P.M., Stirzaker, C, Melki, J.R., Douglas, S.M., Paul, C.L., Clark, S.J. 25, 4422 (1997)). Diese demethylierte DNA wird z.B. aus Zellen gewonnen, die in der Zielsequenz demethyliert sind oder aus Zellen, denen das Enzym DNA Methyltransferase fehlt.
Andererseits ist es leicht möglich, demethylierte DNA- Fragmente mittels PCR herzustellen, da während der Ampli- fikation die Methylierungsinformation verloren geht, d.h. es wird anstelle von Methylcytosin immer Cytosin einge- baut, wenn wie üblich in der Polymerasereaktion dCTP eingesetzt wird.
Möchte man jedoch Cytosin-Methylierung wie oben erwähnt mittels der Bisulfit-Methode untersuchen, bei der alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil und letztlich in Thymin umgewandelt werden, so muss für die Quantifi- zierung eine Referenz-DNA hergestellt werden, welche anstelle aller methylierten und nicht methylierten Cytosine Thymin enthält. Diese DNA dient dann als Referenzmaterial für einen Methylierungsstatus von 0%. Am einfachsten kann man diese DNA für die Analyse einzelner Fragmente erhalten, indem man zunächst in einer ersten Am.plifikation eine PCR der genomischen DNA-Probe durchführt und dabei das gewünschte Fragment erzeugt, welches dann im wesentlichen keine Methylierung mehr aufweist. Nachfolgend wird die Bisulfit-Behandlung durchgeführt und das betreffende
Fragment, nun mit entsprechend anderen Primern, zum zweiten Mal amplifiziert .
Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht zur Durchfüh- rung komplexer Amplifikationen, die viele Fragmente gleichzeitig für die Methylierungsdetektion bereitstellen sollen. Hier stellt sich das Problem, dass nur schwer sichergestellt werden kann, dass die erste Amplifikation auch wesentlich die Fragmente bereitstellt, die in der zweiten PCR nach der Bisulfit Reaktion amplifiziert werden sollen. Dies ist aber essentiell, da die zu untersuchende Probe, für deren Methylierungsanalyse die Vergleichs-DNA hergestellt wird, üblicherweise ausschliess- lich nach der Bisulfitbehandlung amplifiziert wird. Damit ist bei einer komplexen PCR-Reaktion eine Vergleichbarkeit von Referenz und Probe nicht mehr gegeben, da sie potentiell unterschiedliche Fragmente enthalten.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben bereit, wozu als Referenzmaterial DNA mit einem Methylie- rungsgrad von 0% hergestellt wird. Damit ist es erstmals möglich, für komplexe Amplifikationen eine im wesentlichen unmethylierte Referenz-DNA bereitzustellen.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomi- sehen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen. Dazu werden im Einzelnen die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt:
a) Eine genomische DNA-Probe wird mit Primern amplifi- ziert, die entweder sehr kurze oder degenerierte Oligo- nukleotide oder zu Adaptoren komplementäre Oligonukleoti- de sind. Für den zweiten Fall wird vor der Amplifikation mit einem Restriktionsenzym geschnitten und die Adaptoren, unter denen man kurze Nukleotidfragmente bekannter Sequenz versteht, an die Enden der entstandenen DNA Fragmente ligiert.
Die Amplifikate werden chemisch derart behandelt, dass an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thy- min oder in eine andere im Hybridisierungsverhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.
Die chemisch vorbehandelten Amplifikate werden wiederum amplifiziert. Als Primer werden dazu entweder mehrere spezifisch hybridisierende Oligonukleotide oder aber zu den Adaptoren komplementäre Oligonukleotide verwendet. Für den letzteren Fall wird ebenfalls die chemische Vorbehandlung durchgeführt. b) Eine zu untersuchende genomische DNA-Probe wird mittels eines Restriktionsenzyms geschnitten. An die Enden der DNA-Fragmente werden Adaptoren ligiert und die Probe nachfolgend geteilt. Der erste Teil der Probe wird mit Primeroligonukleotiden amplifiziert, die zu den Adaptoren komplementär sind. Der zweite Teil der Probe wird hingegen nicht amplifiziert.
Die beiden Teile der Probe werden chemisch separat vorbe- handelt und amplifiziert, wobei zu den Adaptoren komplementäre Primeroligonukleotide verwendet werden. Die beiden Teile der Probe werden anschließend analysiert. Dabei liefert der erste Teil der Probe den Referenzwert für einen Methylierungsgrad von 0%. Der zweite Teil der Probe hingegen liefert den Messwert, der dem Methylierungsgrad in der ursprünglichen genomischen DNA-Probe im wesentlichen entspricht.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust, Leber, Haut oder Knochenmark, histolo- gische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird für die Amplifikation die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Für die Polymerasekettenreaktion wird vorzugsweise eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwendet. Die Amplifikation von mehreren gleichen oder mehreren unterschiedlichen DNA-Abschnitten wird bevorzugt in einem Reaktionsgefäß durchgeführt.
Als Restriktionsendonukleasen werden vorzugsweise verwendet: Rsal, Dpnl, Dpnll, Msel, Sau3AI, Alul, NIalll, Hael- II, Bfal, Tsp509I, BstUI oder Mbol.
Die Amplifikate werden nach der chemischen Behandlung durch Bindung an eine Festphase oder an ein Gel und Waschschritte von den Reagenzien und anderen Bestandteilen des Reakionsgemisches abgetrennt.
Die Reagenzien und die anderen Bestandteile des Reakionsgemisches werden bevorzugt derart verdünnt, dass sie in der nachfolgenden Amplifikation nicht mehr hinderlich sind, jedoch die Konzentration des behandelten Amplifika- tes nach wie vor für die zweite Amplifikation ausreicht.
Besonders bevorzugt wird die hergestellte demethylierte Referenz-DNA auf die gleiche Weise analysiert wie eine zu untersuchende Proben-DNA. Diese Referenz-DNA liefert in der Analyse den Vergleichswert für einen Methylie- rungsgrad von 0%. Vorzugsweise wird zusätzlich eine enzy- matisch aufmethylierte DNA, die im folgenden gleichermaßen wie die Proben-DNA behandelt wurde, als Referenz für einen Methylierungsgrad von 100% dient.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel la: Herstellung einer demethylierten Referenz- DNA mittels Multiplex-PCR
Das folgende Beispiel bezieht sich auf die Herstellung einer runtermethylierten DNA- Probe, die als Referenz im Vergleich zu einer unbekannt methylierten DNA dient. Man setzt eine genomische DNA-Probe ein, die in diesem Fall mit dem Restriktionsenzym, Mssl, verdaut wurde. Dann werden (1-40 ng) der geschnittenen DNA durch eine Vorampli- fikation vervielfältigt, indem eine DOP-PCR (degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction) nach der Methode von Nelson (V. G. Cheung, S. F. Nelson, PNAS 93, 1476-1479, 1996) mit dem genomischen Primeroligo- nukleotid 5 ' -CCGACTCGAGNNNNNNATGTG G-3 ' durchgeführt wird. Die Methode dient vor allem dazu, sehr kleine Men- gen an genomischer DNA vorzuamplifizieren, um dann aus 2- 15 μg (200-1000 bp) eine vielfache genetische Analyse zu erlauben. Bei der Amplifikation werden sämtliche Methyl- cytosine als Cytosinbasen behandelt.
Reaktionsansatz (50 μl) :
1 μl (1-40 ng) DNA
2 μl (2 μM) DOP Primer (5 ' -CCGACTCGAGNNNNNNATGTG G-3') 5 μl (200 μM) dNTP's (Fermentas)
5 μl PCR Puffer (10 x, 15 mM MgC12) (Qiagen) 0,5 μl (2,5 U ) Taq Polymerase (HotstarTaq, Qiagen) 36,5 μl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
Die PCR-Reaktion wird im Master Cycler Gradient (Eppen- dorf, Hamburg) mit folgendem Programm durchgeführt.
15 min 96 °C
Halt bei 4 °C
Die PCR Probe wird mit Wasser verdünnt (1:10-1:100) und 1 μl der Verdünnung werden mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) chemisch umgewandelt. Die DNA wird zuerst thermisch denaturiert und anschließend mit Hydrogensulfit (=Bisulfit, Difulfit) , einem Radikalfänger und einem denaturierenden Reagenz versetzt und längere Zeit bei erhöhter Temperatur inkubiert. Die Bisulfit Reaktion führt zur Umwandlung aller Cytosinbasen in Uracil. Zur Reini- gung der bisulfitierten DNA wird diese auf eine Reversed Phase C18 Festphase gebunden und durch Waschen mit einer geeigneten Pufferlösung von Chemikalien befreit. Anschließend wird die DNA mit einem polaren Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril oder Wasser eluiert und auf ein kleineres Volumen konzentriert. Die alkalische Hydrolyse der mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) behandelten Fragmente erfolgt für 20 min bei 96 °C unter basischen Bedingungen unmittelbar vor der spezifischen Amplifikation. In dieser werden vorzugsweise zwischen 1-500 ver- schiedene Primeroligonukleotide, die keine Wobble-
Basenpaarungen enthalten, eingesetzt. In diesem Beispiel wird die spezifische Amplifikation mit 128 Primeroligonukleotiden durchgeführt, wobei mindestens 64 Primeroligonukleotide mit Cy5 (Amersham Pharmacia) markiert sind. Dabei handelt es sich um je ein Primeroligonukleotid eines Primerpaares.
Reaktionsansatz Multiplex PCR (25 μl)
1 μl Hydrogensulfit behandelte DNA 2,5 μl PCR buffer (lOx, Qiagen)
0,6 μl Primeroligonukleotidmischung (128 Primeroligonukleotide, 64 davon sind Cy5 markiert, 0,78 pmol/ul von jedem)
0,8 μl dNTPs (25 mM pro dNTP, Gibco-BRL) 3 μl MgC12 (15 mM )
4,5 μl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
12,5 μl Tris-HCl (pH 9,5; 100 mM)
0,2 μl Polymerase (1 unit) (HotstarTaq, Qiagen)
Die PCR-Reaktion wird im Master Cycler Gradient (Eppen- dorf, Hamburg) mit folgendem Programm durchgeführt. 15 min 95 °C
10 min 65 °C Halt bei 4 °C
Die erzeugten PCR-A plifikate wurden durch Agarosegel- Elektrophorese (1,5 % Agarose in 0, 5xTBE-Puffer, Sambrook et al . ) analysiert. Hierfür werden 4 μl des PCR-Ansatzes der Gelelektrophorese unterzogen. Unter den angegeben Bedingungen werden 64 Gene gleichzeitig erfolgreich amplifiziert.
Beispiel Ib: Herstellung einer unbekannt methylierten DNA Probe mittels Multiplex-PCR
Das folgende Beispiel Ib bezieht sich auf die Herstellung einer unbekannt methylierten DNA- Probe, die mit der run- termethylierten Referenz DNA aus Beispiel la verglichen wird. Man setzt eine genomische DNA-Probe ein, die in diesem Fall mit dem Restriktionsenzym Mssl gespalten wurde. Die Probe wird anschließend mit Hydrogensulfit (- Bisulfit, Disulfit) umgsetzt. Dabei kann man nach 2 verschiedenen Methoden vorgehen. Die erste Methode (Olek et al., Nucl. Acids . Res. 1996, 24, 5064-5066) ist eine Umsetzung mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger, wobei die DNA in Agarose eingebettet ist. Die Desulfonierung der DNA erfolgt ebenfalls in Agarose. Die DNA wird in diesem Fall ohne weitere Reinigungsoperationen in eine Preamplifikation (PEP = primer extension preamplificati- on) eingesetzt. Alternativ wird die DNA ohne Agarose- matrix ebenfalls mit Hydrogensulfit (= Bisulfit, Disulfit) und einem Radikalfänger bei erhöhter Temperatur chemisch umgewandelt. Ein organisches Reagenz, welches die Denaturierung unterstützt, wird zugesetzt und der Ansatz bei erhöhter Temperatur inkubiert. Durch die Behandlung mit Hydrogensulfit werden in beiden Methoden alle Cyto- sin-Basen zu Uracil umgesetzt wobei Methylcytosine erhalten bleiben. Zur Reinigung der ohne Agarosematrix bisul- fitierten DNA wird diese auf eine Reversed Phase C18 Festphase gebunden und durch Waschen mit einer geeigneten Pufferlösung von Chemikalien befreit. Anschließend wird die DNA mit einem polaren Lösungsmittel wie z. B. Aceto- nitril und Wasser eluiert und auf ein kleineres Volumen konzentriert. Die Preamplifikation der mit Hydrogensulfit behandelten DNA wird mit degenerierten Primeroligonukleotiden (5 ' -TTATAATGTTTT und 5 ' -TAATATACTAAT) durchgeführt.
Reaktionsansatz (20 ul) :
1 μl Bisulphit-DNA (0.2-1 ng) 2 μl Reaktions-Puffer (lOx, Qiagen)
2 μl dNTP's (lOmM pro dNTP, Fermentas) 1 μl Primer (TTATAATGTTTT) 25 pmol
1 μl Primer (TAATATACTAAT) 25 pmol 0,2 μl Polymerase (1 unit) (HotstarTaq, Qiagen) 12,8 μl Wasser (für die Molekularbiologie, Fluka)
Die nachfolgende Amplifikation mit Cy5-gelabelten Bisul- fit-spezifischen Primeroligonukleotiden erfolgt mit den im Beispiel la beschriebenen 128 Primeroligonukleotiden, wobei das gleiche Primeroligonukleotid Cy5-gelabelt ist. Die Amplifikate werden zur Analyse ebenfalls einer Agaro- segel-Elektrophorese unterzogen.
Beispiel lc: Vergleich der unbekannt methylierten DNA Probe mit der runtermethylierten Referenz-DNA
Der Vergleich der unbekannt methylierten DNA Probe mit der runtermethylierten Referenz DNA erfolgt vorzugsweise durch Hybridisierung auf ein Oligonukleotidarray. Entsprechend der Position auf dem Array ist sind fluoreszie- rende Punkte sichtbar. Es fällt auf, dass bestimmte Punkte auf dem Array relativ zu den anderen und zur Referenz- DNA eine deutlich erhöhte oder verminderte Fluoreszenz zeigen, sofern die Amplifikate in den einzelnen zu untersuchenden Proben in vergleichbarer Konzentration vorliegen. Es werden die Intensitäten des Fluorszenzfarbstoffes Cy5 (635 nm) in den einzelnen Amplifikaten gemessen. Die Art und Weise der Auswertung von Fluoreszenzmessungen sind dem Fachmann bekannt.
Beispiel 2: Herstellung demethylierter Referenz-DNA Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz durch Zugabe eines Restriktionsenzyms, hier Nlalll (Fermentas), welches die Sequenz CATG erkennt, nach Herstellerangaben enzymatisch gespalten. Dabei werden Fragmente von durchschnittlich 400 bp Größe erzeugt. Die gespaltenen Frag- mente weisen 3' überhängende CATG-Enden auf und werden mit dem Oligomer mit der genomischen Sequenz TGTCATCCTGTTGTCATG unter Zugabe von T4-DNA Ligase gemäß Standardbedingungen (Fermentas) an die Sequenzabschnitte ligiert und nicht ligierte Adaptoren nach Standardbedin- gungen mit einem Reinigungskit (Qiaquick PCR Purification Kit, Qiagen) entfernt. Anschließend werden mit Klenow Enzym (DNA Polymerase I, Röche Molecular Biochemicals) und dNTP's die einzelsträngigen Enden zum Doppelstrang ergänzt (Fig la) . Soll eine Referenz DNA hergestellt werden, so ist wie folgt zu verfahren: Es werden in dem nun folgenden Schritt die ligierten Sequenzabschnitte in einer PCR- Reaktion unter Zugabe von Primeroligonukleotiden mit der Sequenz TGTCATCCTGTTGTCATG und mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase amplifiziert. Die PCR-Reaktion wird im
Master Cycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96 °C, die folgenden Zyklen werden 45 mal wiederholt: 60 Sekunden (sec) bei 96 °C, 45 sec bei 51 °C, 60 sec bei 72 °C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72 °C. Im nächsten Schritt wird die DNA unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cyto- sine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Ba- senpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion 1.7 M Bisulfitlösung verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Re- agenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im letzten Verfahrensschritt ver- dünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine De- sulfonierung der DNA (20 min, 96 °C) bei pH 9 durchgeführt. Im letzten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe mit den nun zu der Bisulfit behandelten DNA komplementären Primern wiederum in einer Polymerasekettenreaktion. Die PCR-Reaktion wird im Master Cycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96 °C, die folgenden Zyklen werden 45 mal wiederholt: 60 Sekun- den (sec) bei 96 °C, 45 sec bei 42 °C, 60 sec bei 72 °C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72 °C (Fig. Ib) .
Soll eine DNA mit unbekanntem Methylierungsstatus untersucht werden (Fig 2), so ist die geschnittene und mit A- daptoren ligierte DNA (Fig la) mit Bisulfit zu behandeln. Nach der Bisulfitbehandlung erfolgt eine PCR, wobei die Primeroligonukleotide mit den Sequenzen TGTTATTTTGTT- GTTTAG und TATCATCCTATTATGATA verwendet werden. Die PCR- Reaktion wird im Master Cycler Gradient (Eppendorf, Ham- bürg) mit folgenden Parametern durchgeführt: Denaturierung: 15 Minuten (min) bei 96 °C, die folgenden Zyklen werden 45 mal wiederholt: 60 Sekunden (sec) bei 96 °C, 45 sec bei 42 °C, 60 sec bei 72 °C und anschliessende Inkubation für 10 Minuten bei 72 °C.
Sowohl im Fall der runtermethylierten Referenz DNA als auch im Fall einer DNA mit unbekanntem Methylierungssta- tus beruht der Nachweis des Hybridisierungsprodukts auf Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisie- rungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleo- tid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisie- rungsprodukt .
Legenden zu den folgenden Figuren:
Figur la a. Restriktionsenzym, Nlalll b. Adaptor 1 5 ' -TGTCATCCTGTTGT, Ligase z.B. T4-DNA c. Klenow Enzym (DNA Polymerase I), dNTP's, Puffer d. Reinigung (Qiaquick Reinigungskit)
Figur Ib e. PCR, Primer 5 ' -TGTCATCCTGTTGTCATG, dNTP's, Puffer, TAQ f. Reaktion mit Hydrogensulfit g. PCR, Primer 1 5 ' -TGTTATTTTGTTGTTATG, Primer 2 5'- TATCATCCTATTATCATA
Figur 2 a. Reaktion mit Hydrogensulfit b. PCR, Primer 1 5 ' -TGTTATTTTGTTGTTATG, Primer 2 5'- TATCATCCTATTATCATA

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Bereitstellung von demethylierter DNA als Referenzmaterial für die Analyse von Cytosin- Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
a) eine genomische DNA-Probe wird amplifiziert, wobei entweder sehr kurze oder degenerierte Oligonukleotide oder zu Adaptoren komplementäre Oligonukleotide jeweils als Primer verwendet werden, in letzterem Fall wird die genomische DNA vor der Amplifikation mit einem Restriktionsenzym geschnitten und die Adaptoren an die Enden der entstandenen DNA Fragmente ligiert;
b) die Amplifikate werden chemisch derart behandelt, dass nicht methylierte Cytosinbasen in Uracil oder in eine andere im Hybridisierungsverhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5- Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben;
c) die chemisch vorbehandelten Amplifikate werden wiederum amplifiziert, wobei entweder mehrere spezifisch hybridisierende Oligonukleotide oder aber zu den A- daptoren komplementäre Oligonukleotide jeweils als Primer verwendet werden, im letzteren Fall werden die Adaptoren gemäß den Regeln des Schrittes lb ebenfalls umgewandelt .
2. Verfahren zur Analyse von Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben unter Verwendung komplexer Amplifikationen mittels Adaptoren, dadurch gekenn- zeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
a) eine zu untersuchende genomische DNA-Probe wird mit- tels eines Restriktionsenzyms geschnitten;
b) an die Enden der DNA-Fragmente werden Adaptoren li- giert und die Probe nachfolgend geteilt, der erste Teil der Probe wird mittels zu den Adaptoren komple- mentären Oligonukleotiden als Primer amplifiziert, wohingegen der zweite Teil der Probe nicht amplifiziert wird;
c) die beiden Teile der Probe werden chemisch separat derart behandelt, dass nicht methylierte Cytosinbasen in Uracil oder in eine andere im Hybridisierungs- verhalten dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden, während die 5-Methylcytosinbasen im wesentlichen unverändert bleiben;
d) die chemisch behandelten beiden Teile der Probe werden amplifiziert, wobei zu den Adaptoren nach der chemischen Behandlung komplementäre Oligonukleotide als Primer verwendet werden;
e) beide Teile der Probe werden analysiert, wobei der erste Teil der Probe den Referenzwert für einen Mety- lierungsgrad von 0% liefert und der zweite Teil der Probe den Messwert, der dem Methylierungsgrad in der ursprünglichen genomischen DNA-Probe im wesentlichen entspricht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass für die Amplifikation eine PCR (Poly- merasekettenreaktion) eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Polymerasekettenreaktion eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwendet wird.
5 Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung mit Natrium- bisulfit (=Hydrogensulfit, Disulfit) durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate nach der chemischen Behandlung durch Bindung an eine Festphase oder ein Gel und Waschschritte von den Reagenzien und anderen Bestandteilen des Reaktionsgemisches abgetrennt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass nach der chemischen Behandlung die Reagenzien und die anderen Bestandteile des Rea- kionsgemisches derart verdünnt werden, dass sie in der nachfolgenden Amplifikation nicht mehr hinderlich sind, jedoch die Konzentration des behandelten A pli- fikates nach wie vor für die zweite Amplifikation ausreicht.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine der folgenden Restriktionsendonukleasen verwendet wird: Rsal, Dpnl, Dpnll, Msel, Sau3AI, Alul, Nlalll, Haelll, Bfal, Tsp509I, Bstül oder Mbol.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte demethylierte Referenz-DNA auf die gleiche Weise analysiert wird wie eine zu untersuchende Proben-DNA und in der Analyse den Vergleichswert für einen Methylierungsgrad von 0% liefert.
11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich eine enzyma- tisch aufmethylierte DNA, die im folgenden gleichermaßen wie die Proben-DNA behandelt wurde, als Referenz für einen Methylierungsgrad von 100% verwendet wird.
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