JP2008136404A - Ｄｎａメチル化検出における非メチル化シトシン変換処理後のｄｎａ量の確認方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる試料中の、簡便で正確なＤＮＡ量の確認方法及びＤＮＡの回収率確認方法、並びにこれらの方法に用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【解決手段】本発明の非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法は、生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する工程を含む。
【選択図】図２

Description

本発明は、ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法及びＤＮＡの回収率確認方法に関する。

高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうちＣ（シトシン）の５位がメチル化修飾を受けていることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。例えば、ある遺伝子のＣｐＧを多く含む領域（ＣｐＧアイランド、ＣＧ島）がメチル化されていると、その遺伝子の転写が抑制される。それに対して、ＣｐＧアイランドがメチル化を受けていないと、プロモーター領域に転写因子が結合可能となり、遺伝子が転写可能な状態になる。このように、ＤＮＡのメチル化は、遺伝子発現の制御機構の１つであり、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミング等の様々な生理的、病理的な現象に重要な役割を果たしている。さらに近年、がんやその他の疾病にこのＤＮＡのメチル化が強く関与することが明らかになってきている。

ＤＮＡのメチル化を解析する方法として、一般的にメチル化特異的ＰＣＲ法（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が用いられている（非特許文献１参照）。この方法では、生体試料中のＤＮＡに対して変換処理を施し、メチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）を別の塩基に変換する必要がある。しかし、この変換処理（シトシンを別の塩基に変換する処理（例えば、亜硫酸水素塩などの塩基を変換する試薬（非メチル化シトシン変換剤）とＤＮＡとを接触させる処理））を行った場合、生体試料中のＤＮＡの多くが化学反応により分解してしまうこととが知られている。

生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理した後の試料（非メチル化シトシン変換試料）を得た後、ＤＮＡのメチル化解析に必要な非メチル化シトシン変換試料中のＤＮＡ残存量を、ＤＮＡとハイブリダイズするプライマーやプローブ等のオリゴヌクレオチドを用いて確認を行う場合、非メチル化シトシン変換処理前後で鋳型ＤＮＡの塩基配列が異なるため、同一のプライマーやプローブを用いることができない。そのため、例えばＰＣＲ法を用いて非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡの回収率を確認する際は、処理の前後で異なるプライマーを用い、それぞれのプライマーにおいて検量線を作成する必要があった。このように変換処理前後で異なるプライマーを用いることは、操作を煩雑とし、また結果の正確性を低下させる問題があった。
Ｊａｍｅｓ Ｇ．ＨＥＲＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ法：Ａ ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ法 ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．９３， ｐｐ．９８２１−９８２６， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９６

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ＤＮＡのメチル化を検出するために用いられる、簡便で正確な非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法及びＤＮＡの回収率確認方法、並びにこれらの方法を用いるＤＮＡメチル化検出用キットを提供することを目的とする。

更に本発明は、ＤＮＡのメチル化検出を行うための生体試料の前処理方法を簡素化することにより、解析時間を短縮することができる調整方法で調整された非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法、及びＤＮＡの回収率確認方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、
（１）メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法；
（２）メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、生体試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第１測定結果を得る工程と、前記生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第２測定結果を得る工程と、前記第１測定結果及び第２測定結果を比較する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後におけるＤＮＡの回収率確認方法；
（３）前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び／又はプローブである（１）又は（２）に記載の方法；
（４）メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーを用いて、非メチル化シトシン変換試料のＤＮＡを増幅する工程と、前記増幅の結果から、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法；
（５）メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーを用いて、生体試料を使用しＤＮＡを増幅する工程と、前記増幅の結果から、前記生体試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第１測定結果を得る工程と、前記生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、前記プライマーを用いて、前記非メチル化シトシン変換試料を使用しＤＮＡを増幅する工程と、前記増幅の結果から、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第２測定結果を得る工程と、前記第１測定結果及び第２測定結果を比較する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後におけるＤＮＡの回収率確認方法；
（６）前記ＤＮＡを増幅する工程が、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する工程である、（４）又は（５）に記載の方法；
（７）前記生体試料が、界面活性剤を含む溶液及び細胞を含む検体を混合する工程と、物理的処理により、細胞内のＤＮＡを溶液中に遊離させる工程と、遠心分離によって不溶物を沈殿させる工程と、上澄みを分取する工程、によって得られたものである、（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法；
（８）前記細胞が腫瘍細胞である（７）に記載の方法；
（９）生体試料中のＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、メチル化特異的ＰＣＲ用のプライマーと、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドと、を備えるＤＮＡのメチル化検出用キット；
（１０）前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び／又はプローブである、（９）に記載のメチル化検出用キット；
を提供するものである。

本発明によれば、非メチル化シトシン変換処理後の、ＤＮＡ量の簡便で正確な確認方法及びＤＮＡの回収率確認方法、並びにこれらの方法を用いるＤＮＡメチル化検出用キットを提供することができる。

本発明のＤＮＡ量の確認方法、ＤＮＡの回収率確認方法及びこれらの方法を用いるＤＮＡメチル化検出用キットは、ＤＮＡが精製されておらず、夾雑物のため吸光度によりＤＮＡ量が測定できない状態の生体試料、特に細胞を含む生体試料と、当該細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液とを混合した生体試料に対し有用である。

本実施形態における生体試料としては、ＤＮＡを含むものであれば特に制限されるものではないが、好ましくは生体のゲノムＤＮＡを含むもの、例えば臨床検体が好ましく、より具体的には、血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織などが挙げられ、特に腫瘍細胞を含むものが好ましい。

ゲノムＤＮＡは細胞内に存在するため、細胞からゲノムＤＮＡを溶液中に遊離させることが好ましい。例えば、市販のキットでゲノムＤＮＡの抽出・精製を行うことができる。また、細胞を可溶化する界面活性剤を含む試料処理液と、細胞を含む検体とを混合し、物理的処理（攪拌、ホモジナイズ、超音波処理など）を行うことによって、細胞内のＤＮＡを溶液中に遊離させることができる。この場合、物理的処理の後に細胞の破片を遠心分離によって沈殿させ、ゲノムＤＮＡを含む上清を後の変換処理及びメチル化解析に供することができる。このような試料処理液を用いることにより、上記のようなキットによるゲノムＤＮＡの抽出・精製等が不要となり、簡単な遠心操作のみで短時間且つ簡便に生体試料を得ることができる。ここで用いられる界面活性剤は細胞を可溶化することができるものであれば特に限定されないが、コール酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを好適に用いることができる。

本実施形態において、非メチル化シトシン変換剤とは、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する、即ち、非メチル化シトシンを、シトシン以外の塩基（ウラシル、チミン、アデニン又はグアニン）に変換するものである。このような非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好ましく用いられる。亜硫酸水素塩としては、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを用いることができる。これらのうち何れか１つ以上を用いてＤＮＡを処理すると、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンは脱アミノ化によってウラシルへ変換される。一方、上記のような非メチル化シトシン変換剤はＤＮＡ中のメチル化シトシンには作用せず、変換は起こらない。この非メチル化シトシン変換剤は、溶媒に溶解し、溶液として用いることが好ましい。

非メチル化シトシン変換剤として亜硫酸水素塩を用いる場合、生体試料中のＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば添加量は特に限定されないが、例えば、１Ｍ以上、好ましくは１〜１５Ｍ、より好ましくは３〜１０Ｍである。例えば、生体試料に６Ｍの亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜９０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度（例えば１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液４００μｌ）で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度で変換を行えばよい。非メチル化シトシン変換剤は亜硫酸水素塩に限られるものではなく、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを選択的に他の塩基に変換する他の非メチル化シトシン変換剤を使用することもできる。

本実施形態において、非メチル化シトシン変換試料とは、生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理せしめることで得られた試料を示し、例えば、生体試料から調製したゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩によって処理したもの等が挙げられる。

本実施形態における、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域としては、塩基配列中にシトシンを含まない領域であれば特に制限されるものではないが、
i)１５塩基以上、特に１７塩基以上の領域を有するものが好ましく、
ii)塩基配列に好ましくは３塩基以上、特に４塩基以上の連続したグアニンを含まないものが好ましく、
iii)塩基配列に不明な塩基を含まないものが特に好ましい。

例えば、ヒト１４番染色体上の塩基配列における、具体的なシトシンを含まない領域としては、以下の塩基配列が挙げられる。
配列番号１：TAGAATAGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGTTAGAAGG
配列番号２：ATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGAGAGTTTAGA
配列番号３：AGTGGATTGGATGTGATGTTGGAGAAA
配列番号４：AAAGAGATTGGAGGTAAGAGGGAGA
配列番号５：TAGATTTTGGATGTATGTTTATGTTGAGATGTTGGAG
配列番号６：TGAGATGGAGAAAAGTGATGTTTAGAAGG

尚、ヒト染色体ＤＮＡの塩基配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）等の研究機関のデーターベースで参照することができる。

本実施形態において、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドとは、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と実質的又は完全に相補的なオリゴヌクレオチドを示し、例えば、プライマーやプローブとして用いることができる。

尚、実質的に相補的とは、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上相補的であることを示す。

本実施形態において、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する方法としては、例えばオリゴヌクレオチドをプライマーやプローブとして用いることで、試料中に含まれるＤＮＡ量が測定可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、例えば、公知の方法として、
i)オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、試料中のＤＮＡを増幅し、その増幅結果から、試料に含まれるＤＮＡ量を測定する方法、
ii)オリゴヌクレオチドを標識プローブとして用いることにより、試料中のＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、ＤＮＡとハイブリダイズした標識プローブからのシグナル強度を測定することにより、試料に含まれるＤＮＡ量を測定する方法、
等が挙げられ、特にＤＮＡの増幅結果から試料に含まれるＤＮＡ量を測定する方法が好ましい。

ここで、ハイブリダイゼーションとしては、試料中のＤＮＡと標識プローブをハイブリダイズし、ＤＮＡとハイブリダイズした標識プローブからのシグナル強度を測定することができれば、特に制限されるものではないが、例えば、サザンハイブリダイゼーション、アレイハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等が挙げられ、特にサザンハイブリダイゼーション及びアレイハイブリダイゼーションが好ましい。

また、ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブの標識物質としては、公知の標識物質であれば特に制限されるものではないが、例えば、放射性元素、蛍光物質、化学物質、抗原、抗体及び酵素等が挙げられ、より具体的には３２Ｐ等の放射性元素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）やローダミン等の蛍光物質、ジコキシゲニン等のハプテン、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチン等の生化学物質等が挙げられる。これらの標識物質は、公知の方法でプローブに導入することができ、そのための試薬等も広く市販されている。

本実施形態において、ＤＮＡを増幅する方法としては、プライマーを用いることにより、ＤＮＡを増幅する公知の方法であれば、特に制限されるものではないが、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法又はＴＡＳ法等が挙げられ、特にＰＣＲ法が好ましい。

本実施形態において、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーとしては、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と実質的又は完全に相補的で、ＤＮＡを増幅する工程において、ＤＮＡ伸長反応を開始できるものであればよく、特に制限されるものではないが、例えば、ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する場合のプライマーとしては、
i)プライマー塩基配列中のグアニンの存在比率は、好ましくは３０％〜７０％、特に４０％〜６０％が好ましく、
ii)プライマーの長さは、好ましくは１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ、特に１７ｂｐ〜３０ｂｐが好ましく、
iii)両端のプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは５℃以内、特に２℃以内が好ましく、
iv)プライマーの３’末端側の３ｍｅｒがハイブリダイズする領域と完全に相補的であることが好ましく、特に５ｍｅｒが完全に相補的であることが好ましい。

具体的なプライマーの塩基配列としては、以下の配列番号７及び配列番号８の塩基配列が挙げられる。
配列番号７：AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGT
配列番号８：TCCAACATCACATCCAATCCA
配列番号７及び配列番号８で示されるプライマーは、ヒト１４番染色体の以下の配列番号９で示される１４３ｂｐの領域を増幅する。
配列番号９：AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGTTAGAAGGCTATCATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGA
GAGTTTAGACCAGGGTGATAATGAGTGTGTTGGGAAATAGACGAAGATAGAACAGTGGATTGGATGT
GATGTTGGA

配列番号９から明らかなように、配列番号７及び配列番号８のプライマーがハイブリダイズする領域である、AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGT及びTGGATTGGATGTGATGTTGGAには、シトシンが含まれていない。従って、非メチル化シトシン変換剤により非メチル化シトシンが他の塩基に変換された場合でも、該プライマーがハイブリダイズする領域は影響を受けることがないため、ＤＮＡの非メチル化シトシン変換剤の処理の前後で、同一のプライマーを用いて、ＰＣＲ法が可能となる。

このように、非メチル化シトシン変換剤の処理の前後でプライマーを変更する必要が無く、同一のプライマーを用いることが可能なため、ＤＮＡ量の測定に係る操作が簡便になり、プライマーの取り違い等の誤操作が抑制され、且つ、プライマーの違いによるＤＮＡの増幅効率の変化の無い正確なＤＮＡ量の測定が可能となる。

尚、ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡの全長は、好ましくは６０ｂｐ〜４００ｂｐ、特に６０ｂｐ〜２００ｂｐが、ＰＣＲ法の効率の観点から好ましい。

本実施形態におけるＰＣＲ法としては、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーを用いて、ＤＮＡの増幅が可能なものであれば、特に制限されるものではないが、定量的ＰＣＲ法が好ましく、特に定量的リアルタイムＰＣＲ法が生体試料中のＤＮＡ量を正確に測定する観点から好ましい。

ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅結果からＤＮＡ量を測定する方法としては、公知の方法を利用すれば良く、特に制限されるものではないが、例えば、
i)同一条件でコントロールと生体試料のＰＣＲ法を行った後にアガロース電気泳動を行い、それぞれの増幅されたＤＮＡのバンドのシグナル強度を比較することで、ＤＮＡ量を測定する方法（アガロース電気泳動法）；
ii)ＳＹＢＲグリーン等の二重鎖ＤＮＡと結合した際に蛍光を発するＤＮＡ結合色素を利用し、ＰＣＲ法による蛍光の増加を測定することで、ＤＮＡ量を測定する方法（ＳＹＢＲグリーン法）；
iii) 増幅領域内に相補的に結合するＲＮＡの蛍光標識プローブを用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡが合成される過程で、ＲＮＡの蛍光標識プローブが分解される際に発する蛍光を測定することで、ＤＮＡ量を測定する方法（蛍光標識プローブ法）；
等が挙げられ、これらの方法に使用する試薬や装置等も一般に市販されている。

尚、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅結果からＤＮＡ量を測定する際に、蛍光標識プローブ法を用いる場合、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的な蛍光標識プローブを用いることが好ましい。

この場合、蛍光標識プローブの長さは、１５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒが好ましく、特に２０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒが好ましい。また、蛍光標識プローブとプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは５℃以上１０℃以下、特に８℃以上１０℃以下が好ましい。

具体的な蛍光標識プローブ用の塩基配列としては、以下の配列番号１０が挙げられる。
配列番号１０：ATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGAGAGTTTAGA
配列番号１０で示される蛍光標識プローブ用の塩基配列は、ヒト１４番染色体の、上述の配列番号７及び配列番号８のプライマーで増幅される配列番号９で示される１４３ｂｐの領域にハイブリダイズ可能である。
配列番号９：AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGTTAGAAGGCTATCATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGA
GAGTTTAGACCAGGGTGATAATGAGTGTGTTGGGAAATAGACGAAGATAGAACAGTGGATTGGATGT
GATGTTGGA

また、配列番号９から明らかなように、配列番号１０で示される蛍光標識プローブがハイブリダイズする領域である、ATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGAGAGTTTAGAには、シトシンが含まれていない。従って、非メチル化シトシン変換剤により非メチル化シトシンが他の塩基に変換された場合でも、該蛍光標識プローブがハイブリダイズする領域は影響を受けることがないため、ＤＮＡの非メチル化シトシン変換剤の処理の前後で、同一の蛍光標識プローブを用いて、蛍光標識プローブ法によるＤＮＡ量の測定が可能となる。

ＰＣＲ法以外のＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法又はＴＡＳ法等におけるプライマーの設計及びＤＮＡ量の測定も、上述したＰＣＲ法の技術内容を加味しつつ、各ＤＮＡ増幅法に最適なプライマー及びＤＮＡ測定方法を公知の手法に従い、適宜選択すれば良い。

例えば、ＬＡＭＰ法を用いる場合、プライマーの設計はＬＡＭＰ法専用プライマー設計支援ソフトウエアPriｍｅｒExplorer（栄研化学）を用い、メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的であることを条件にして、目的とするプライマーを設計することができる。更に、ＤＮＡ量の測定は、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学）等を用いて容易に測定することができる。

本実施形態における、非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認は、一部の非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定した結果から、非メチル化シトシン変換試料全体のＤＮＡ量を求めることができれば、特に制限されるものではないが、例えば、ＤＮＡの測定に使用した試料が、該試料全体の１／１０の量であれば、ＤＮＡ量の測定結果を１０倍することで、該試料中のＤＮＡを算出することができる。

本実施形態における、非メチル化シトシン変換処理後におけるＤＮＡの回収率確認は、非メチル化シトシン変換剤による処理前に測定された、生体試料に含まれるＤＮＡ量の測定結果である第１測定結果と、非メチル化シトシン変換剤による処理後に測定された、非メチル化シトシン変換処理試料に含まれるＤＮＡ量の測定結果である第２測定結果から、ＤＮＡの回収率を求めることができれば、特に制限されるものではないが、例えば、第１測定結果及び第２測定結果から、生体試料中のＤＮＡ量と非メチル化シトシン変換試料中のＤＮＡ量を比較することで回収率を計算することができる。

尚、本実施形態において生体試料中のＤＮＡの回収率としては、非メチル化シトシン変換剤を添加前の生体試料中のＤＮＡ量に対する、非メチル化シトシン変換剤を添加後の非メチル化シトシン変換試料中のＤＮＡ量の割合を示すことができれば、特に制限されるものではないが、例えば、生体試料中のＤＮＡ量が２００ｎｇであり、非メチル化シトシン変換試料中のＤＮＡ量が１００ｎｇの場合は、回収率は５０％となる。

本実施形態において、メチル化特異的ＰＣＲ用のプライマーとは、非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤の処理を用いた、ＤＮＡのメチル化または非メチル化を検出する為に使用する特異的プライマーを示す。メチル化特異的ＰＣＲ用のプライマーは公知であり、広く市販もされている。

また、メチル化特異的ＰＣＲ用のプライマーを備える、ＤＮＡのメチル化検出用キットも公知であり、これらのＤＮＡのメチル化検出用キットの構成に、本実施形態のメチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを追加することで、本実施形態のＤＮＡのメチル化検出用キットを構成することもできる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜定量的リアルタイムＰＣＲ法に用いる、プライマー及び蛍光標識プローブの作成＞
１）バイサルファイト溶液処理によるＤＮＡ配列の変換を生じない配列をゲノム配列の選択
約３×１０＾９bpのゲノム配列の中からバイサルファイト処理により変換される塩基（シトシン, C）を含まないＤＮＡ配列を下記の条件を満たすプログラムを作成しコンピュータを用いて解析した。
ヒトゲノムＤＮＡ配列はＮＣＢＩのデータベースより入手した。
条件１：Cと不明な塩基を含まない
条件２：１７塩基以上である
条件３：４塩基以上連続するGを含まない

２）定量的リアルタイムＰＣＲ法を行うプライマーの設計
上記の解析により選択したゲノム配列を基に以下の条件を満たす塩基配列を選択し、定量的リアルタイムＰＣＲ法に最適なプライマー配列を決定した。
条件４：両端のプライマーを含む増幅されるＤＮＡの塩基配列の全長は60〜150bpの範囲である
条件５：両端のプライマーはＴｍ値の差が２度以内である
条件６：蛍光標識プローブのＴｍ値は、プライマーのＴｍ値より８度以上１０度未満高く、何れのＴｍ値も６０℃以上である
条件７：Gの割合は４０〜６０％である
条件８：プライマーは１７〜３０ｍｅｒである
条件９：蛍光標識プローブは２０〜４０ｍｅｒ である

以上の条件を満たす１４番染色体での解析例を以下にしめす。
条件１〜３を満たす１４番染色体上のDNA配列は、配列長が１７〜５３３塩基の５３４８８８配列が存在した。
５３４８８８配列中、Gの割合が３０〜７０％で、且つ
１塩基（３種類）の配列が６文字以上連続
２塩基（６種類）の配列が３回以上連続
３塩基（２４種類）の配列が２回以上連続
４塩基（７８種類）の配列が２回以上連続
するものを除去し、プライマーまたは蛍光標識プローブ配列の候補は５６８４６配列となる。

更に、両端にプライマー配列をもち、そのプライマー配列の間に１つ以上の蛍光標識プローブの配列を有するＤＮＡ配列群のうち、プライマー配列部分を除いたＤＮＡ配列長が２６（＝６０−３４）塩基以上で、且つ１１６（＝１５０−３４）塩基以下のものを検索した。その結果５６８組のＤＮＡ配列を選択した。

選択された５６８組のうちプローブ配列が２０塩基以上（条件９）を満たすのは２６１組であった。更に、プライマー配列は２５塩基以上、蛍光標識プローブ配列は３０塩基以上の制限を条件に加え、表１に示される、２組の候補に絞り込んだ。

この２組の候補からそれぞれについて、上述の条件５〜８を満たす領域のＴｍ値を計算して選択された配列からの条件をみたす配列をプライマーとした。

ヒトゲノム配列に存在する配列かつC(シトシン)を含まない配列で増幅産物が１４３ｂｐになるように以下の配列番号９で示されるＤＮＡ配列を増幅する、配列番号７及び配列番号８で示されるプライマーセットを選定した。また、蛍光標識プローブ法によるＤＮＡ量の確認のため、配列番号１１で示される蛍光標識プローブを選定した。

＜プライマーセット＞
配列番号７：AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGT
配列番号８：TCCAACATCACATCCAATCCA

＜増幅対象のＤＮＡ配列＞
配列番号９：AGGGAGTAGAGAAAAAGTAGGAAGATGAGTTAGAAGGCTATCATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGA
GAGTTTAGACCAGGGTGATAATGAGTGTGTTGGGAAATAGACGAAGATAGAACAGTGGATTGGATGT
GATGTTGGA

＜蛍光標識プローブ＞
配列番号１１：FAM-ATTGGGATGTGTAAGAGATGAAGGAGAGTTTAGA-TAMRA
ここで、ＦＡＭ（５−カルボキシ−フルオレセイン）は蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）はクエンチャー(励起エネルギー吸収剤)を示す。

＜配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ量の測定＞
乳癌細胞株MDA 231cells由来ゲノム（２μg）を用いて、４００μｌの０．３Ｍ ＮａＯＨを加えて１０分間、３７℃でインキュベートした。次に、各チューブに１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム溶液４００μＬを加え、７０℃４０分間インキュベートした（変換処理）。この亜硫酸水素塩処理された溶液に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアゲン社ＱｌＡｑｕｉｋ（商品名））によりＤＮＡを精製し、生体試料を得た。

バイサルファイト処理前サンプル、処理後サンプルを。qＰＣＲ法試薬(ロッシュ社)を用いて、配列番号７及び配列番号８のプライマーセットにより定量的リアルタイムＰＣＲ法(MX3500P：ストラタジーン社)を行なった。定量的リアルタイムＰＣＲ法の条件を以下に示す。
＜ＰＣＲ用溶液＞

＜ＰＣＲ法条件＞

バイサルファイト処理前サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法による検量線の結果を図１に、バイサルファイト処理後サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法による検量線の結果を図２に示す。図１及び図２から明らかなように、バイサルファイト処理の前後いずれにおいても、同一の配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ法が可能である。これにより、バイサルファイト処理前後でプライマーセットを変更すること無く、ＤＮＡ量の確認が可能であることが証明された。

＜配列番号７及び配列番号８のプライマーセット、並びに配列番号１１のプローブを用いた蛍光標識プローブ法を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ量の測定＞
実施例２と同様の方法で調製したバイサルファイト処理前サンプル、処理後サンプルを、qＰＣＲ法試薬(ロッシュ社)を用いて、配列番号７及び配列番号８のプライマーセット、並びに配列番号１１の蛍光標識プローブを用い、定量的リアルタイムＰＣＲ法(MX3500P：ストラタジーン社)を行なった。定量的リアルタイムＰＣＲ法の条件を以下に示す。
＜ＰＣＲ用溶液＞

＜ＰＣＲ法条件＞

バイサルファイト処理前サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法による検量線の結果を図３に、バイサルファイト処理後サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法による検量線の結果を図４に示す。実施例１と同様に、蛍光プローブ法を用いた場合であっても、バイサルファイト処理前後で同一の配列番号７及び配列番号８のプライマーセットで、ＤＮＡ量の確認が可能であることが証明された。

＜配列番号７及び配列番号８のプライマーセット、並びに配列番号１２のプローブを用いた蛍光標識プローブ法を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ量の測定＞
下記の配列番号１２で示される蛍光標識プローブを用い、実施例３と同様の方法で、蛍光標識プローブ法を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法を行った。

＜蛍光標識プローブ＞
配列番号１２：FAM-AGGGTGATAATGAGTGTGTTGGGAAATAGA-TAMRA
ここで、ＦＡＭ（５−カルボキシ−フルオレセイン）は蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）はクエンチャー(励起エネルギー吸収剤)を示す。

図には示さないが、配列番号１２の蛍光標識プローブを用いた場合も、配列番号１１の蛍光標識プローブを用いた場合と同様に、バイサルファイト処理前後のサンプルにおいて、定量的リアルタイムＰＣＲ法による検量線を作成することができた。これにより、シトシンを含まない領域と相補的な蛍光標識プローブであれば、蛍光標識プローブ法を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法において、同一のプライマーセットを用いて、ＤＮＡ量の確認が可能であることが証明された。

配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いたバイサルファイト処理前サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法の検量線の解析を行った結果を示す。 配列番号７及び配列番号８のプライマーセットを用いたバイサルファイト処理後サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法の検量線の解析を行った結果を示す。 配列番号７及び配列番号８のプライマーセット、並びに配列番号１１のプローブを用いた蛍光標識プローブ法を用いたバイサルファイト処理前サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法の検量線の解析を行った結果を示す。 配列番号７及び配列番号８のプライマーセット、並びに配列番号１１のプローブを用いた蛍光標識プローブ法を用いたバイサルファイト処理後サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ法の検量線の解析を行った結果を示す。

Claims (10)

1. 生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、
   メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法。
2. メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、生体試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第１測定結果を得る工程と、
   前記生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、
   前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第２測定結果を得る工程と、
   前記第１測定結果及び第２測定結果を比較する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後におけるＤＮＡの回収率確認方法。
3. 前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び／又はプローブである請求項１又は２に記載の方法。
4. 生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、
   メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーを用いて、非メチル化シトシン変換試料のＤＮＡを増幅する工程と、
   前記増幅の結果から、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡ量の確認方法。
5. メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なプライマーを用いて、生体試料を使用しＤＮＡを増幅する工程と、
   前記増幅の結果から、前記生体試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第１測定結果を得る工程と、
   前記生体試料中のＤＮＡを非メチル化シトシン変換剤で処理し、非メチル化シトシン変換試料を得る工程と、
   前記プライマーを用いて、前記非メチル化シトシン変換試料を使用しＤＮＡを増幅する工程と、
   前記増幅の結果から、前記非メチル化シトシン変換試料に含まれるＤＮＡ量を測定し、第２測定結果を得る工程と、
   前記第１測定結果及び第２測定結果を比較する工程と、を含む非メチル化シトシン変換処理後におけるＤＮＡの回収率確認方法。
6. 前記ＤＮＡを増幅する工程が、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する工程である、請求項４又は５に記載の方法。
7. 前記生体試料が、界面活性剤を含む溶液及び細胞を含む検体を混合する工程と、
   物理的処理により、細胞内のＤＮＡを溶液中に遊離させる工程と、
   遠心分離によって不溶物を沈殿させる工程と、
   上澄みを分取する工程、によって得られたものである、請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
8. 前記細胞が腫瘍細胞である請求項７に記載の方法。
9. 生体試料中のＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
   メチル化特異的ＰＣＲ用のプライマーと、
   メチル化検出の対象となるＤＮＡの塩基配列におけるシトシンを含まない領域と相補的なオリゴヌクレオチドと、を備えるＤＮＡのメチル化検出用キット。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、プライマー及び／又はプローブである、請求項９に記載のメチル化検出用キット。

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