JP2008259453A - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】それぞれ目的の核酸配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含む核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合して非酵素的な結合反応を生じさせることを特徴とする核酸の検出方法およびそのためのキット。
【選択図】なし
Description
[1]少なくとも1つの核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合する工程を包含する核酸の検出方法であって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの3’末端が第二の核酸プローブの5’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが3’末端または3’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが5’末端または5’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの3’末端と第二の核酸プローブの5’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
方法;
[2]第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、[1]の核酸の検出方法;
[3]蛍光体基がフルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、ローダミンおよびその誘導体、ROX、Hex、JOE、BODIPY類、Alexa類ならびにBHQ類からなる群より選択される、[2]の核酸の検出方法;
[4]第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、[2]また[3]の核酸の検出方法;
[5]第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、[2]〜[4]のいずれかの核酸の検出方法;
[6]第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、[2]〜[4]のいずれかの核酸の検出方法;
[7]求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、[1]〜[6]のいずれかの核酸の検出方法;
[8]求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、[1]〜[7]のいずれかの核酸の検出方法;
[9]第一の核酸プローブの5’末端及び/又は第二の核酸プローブの3’末端が修飾されている、[1]〜[8]のいずれかの核酸の検出方法;
[10]修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびDNPからなる群より選択される物質での修飾である、[9]の核酸の検出方法;
[11]第一の核酸プローブが5〜20塩基長である、[1]〜[10]のいずれかの核酸の検出方法;
[12]第二の核酸プローブが5〜20塩基長である、[1]〜[11]のいずれかの核酸の検出方法;
[13]目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、[1]〜[12]のいずれかの核酸の検出方法;
[14]少なくとも1つの核酸プローブセットを含む核酸検出用キットであって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの3’末端が第二の核酸プローブの5’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが3’末端または3’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが5’末端または5’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの3’末端と第二の核酸プローブの5’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
キット;
[15]第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、[14]の核酸検出用キット;
[16]蛍光体基がフルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、ローダミンおよびその誘導体、ROX、Hex、JOE、BODIPY類、Alexa類ならびにBHQ類からなる群より選択される、[15]の核酸検出用キット;
[17]第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、[15]または[16]の核酸検出用キット;
[18]第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、[15]〜[17]のいずれかの核酸検出用キット;
[19]第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、[15]〜[17]のいずれかの核酸検出用キット;
[20]求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、[14]〜[19]のいずれかの核酸検出用キット;
[21]求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、[14]〜[20]のいずれかの核酸検出用キット;
[22]第一の核酸プローブの5’末端及び/又は第二の核酸プローブの3’末端が修飾されている、[14]〜[21]のいずれかの核酸検出用キット;
[23]修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびDNPからなる群より選択される物質での修飾である、[22]の核酸検出用キット;
[24]第一の核酸プローブが5〜20塩基長である、[14]〜[23]のいずれかの核酸検出用キット;
[25]第二の核酸プローブが5〜20塩基長である、[14]〜[24]のいずれかの核酸検出用キット;
[26]目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、[14]〜[25]のいずれかの核酸検出用キット。
ホスホロチオエートプローブの合成
表1に示される核酸配列の核酸合成は一般的なホスホロアミダイト法を使用して、0.2μMスケールのカラムにより核酸合成機H−8−SE(ジーンワールド社製)を用いて行った。表1の核酸配列のうちA−1、B−1、C−1、D−1の3’末端のホスホロチオエート化は3’−phoshate CPG 5mgをカラムに装填し、アミダイトモノマーをカップリングした後、アセトニトリスに溶解したSulfurizing reagent(グレンリサーチ社製)を用いて行った。脱保護条件をUltra Mildで行うことから専用のアミダイト(グレンリサーチ社製)を使用し核酸合成を行った。合成条件はグレンリサーチ社製品仕様書記載の方法を参考にした。5’末端へのCy5の導入にはCy5−phosphoramidite(グレンリサーチ社製)を用いて核酸合成機にて核酸に組み込んだ。脱保護反応は0.05M炭酸カリウム(メタノール中)で行い、CPGから核酸の切り出しを行った。その後、HPLC精製を行った。HPLCはJASCO社製MD−2010・PU−2080・C18逆相カラムを使用し、グラジェント条件0−80%アセトニトリル/50mM Triethylammonium acetateで行った。また、MALDI−TOF mass spectrometryにより目的の核酸が合成できているかを確認した。
ヨードアセチルプローブの合成
核酸合成は実施例1のとおり行った。脱保護反応は一般的な方法を使用するため通常のアミダイト(グレンリサーチ社製)を使用した。表1の核酸配列のうちA−2、B−2、C−2、D−2の鎖内へのFITCの導入にはFITC−dT(グレンリサーチ社製)を用いて核酸合成機にて核酸に組み込んだ。5’末端は5’amino modifier(グレンリサーチ社製)を用いてアミノリンカーを付加した。脱保護反応はアンモニア水を用いて行った。MMT脱離には80%酢酸を使用した。得られた核酸を200μM、8mMのヨードスクシイミドと75mM Sodium tetraborate緩衝液中で室温、1.5時間反応させた。その後実施例1記載のHPLC精製(グラジェント条件0−50%アセトニトリル/50mM Triethylammonium acetate)・MALDI−TOF mass spectrometry分析によりヨードアセチルプローブを得た。
化学ライゲーション反応確認
化学ライゲーションの基本的な反応は、表2の組成で示す反応液を用いた。以下の実施例で具体的な記載がなければ表2の反応液組成を使用した。ヨードアセチルプローブについては、同様の塩基配列の核酸プローブでヨードアセチル化していないものをコントロールとして使用した。テンプレートDNAには各核酸プローブ配列と相補的な配列を含む合成オリゴDNA40mer(核酸プローブセットA(ホスホロチオエートプローブA−1(配列番号1)およびヨードアセチルプローブA−2(配列番号5))の場合は配列番号12;核酸プローブセットB(ホスホロチオエートプローブB−1(配列番号2)およびヨードアセチルプローブB−2(配列番号6))の場合は配列番号13)を使用した。それぞれの試薬を混合し、室温5分の反応を行った。その結果を図1に示す。図1において、「−S,I−」はヨードアセチルプローブを使用した場合の結果を、「−S,non」はヨードアセチル化していないコントロールのプローブの場合の結果を示す。また「H2O」はテンプレートの代わりに水を用いたコントロールの場合を、「template」はテンプレートを用いた場合を示す。さらに、核酸プローブセットAを使用した場合の結果を「A」で示し、核酸プローブセットBを使用した場合の結果を「B」で示す。検出は蛍光共鳴エネルギー転移現象による蛍光シグナル(以下蛍光シグナル)の測定で行い、その測定にはHITACHI社製蛍光分光光度計F−7000を使用した。測定条件は波長スペクトル測定モードで励起波長470nm、蛍光波長665nm、その他の条件は初期設定のまま使用した。以下実施例の測定は特に記載がない限りこの条件を用いる。
核酸プローブの長さ及び配列
実施例3に示された同じ条件で核酸プローブの長さのみをそれぞれ7merに変更し、化学ライゲーション反応を行った。詳細には、核酸プローブセットC(ホスホロチオエートプローブC−1(配列番号3)およびヨードアセチルプローブC−2(配列番号7))または核酸プローブセットD(ホスホロチオエートプローブD−1(配列番号4)およびヨードアセチルプローブD−2(配列番号8))をプローブとして使用し、テンプレートDNAとしては核酸プローブセットCの場合は配列番号12の塩基配列を有するものを、核酸プローブセットDの場合は配列番号13の塩基配列を有するものを使用した。その結果を図1に示す。
反応温度
実施例3に示された条件を用いて反応温度を10℃から90℃まで振って化学ライゲーション反応を行った。反応はアプライドバイオシステムズ社製サーマルサイクラーGene Amp system 9700を使用し、温度制御を行った。結果を図5に示す。図5において、核酸プローブセットAの場合の結果を「A」で、核酸プローブセットBの場合の結果を「B」で示す。
核酸プローブの特異性
実施例3に示された条件を用いて核酸プローブの特異性を確認した。常温で5分反応させた。核酸プローブセットとしては、ホスホロチオエートプローブA−1および8merの全体がテンプレートDNAに完全に相補的なヨードアセチルプローブE−2(配列番号9)または8mer中の一塩基が目的の核酸配列と異なっているヨードアセチルプローブF−2(配列番号10)を使用した。またテンプレートDNAとしては配列番号12の塩基配列を有するものを使用した。その結果を図6に示した。図中「H2O」はテンプレートDNAを含まない場合を示す。
一塩基変異検出(1)
実施例3に示された条件を用いて目的の核酸配列に一塩基変異がある核酸配列の検出を試みた。ホスホロチオエートプローブ10mer(B−1)及びヨードアセチルプローブ7mer(D−2)の核酸プローブを使用し、7mer側に一塩基変異がくるように設計した。テンプレートとして用いた合成オリゴDNAはすべて40merの長さに合わせ、一塩基のみ異なる配列を持つ合成オリゴDNAを使用した。すなわち、配列番号13の塩基配列を有するテンプレートDNAでは15〜21位がヨードアセチルプローブD−2の配列と相補的であるのに対して、配列番号14の塩基配列を有するテンプレートDNAではこの領域に1塩基の変異が導入されている。結果を図7に示す。
一塩基変異検出(2)
実施例7同様の条件でヨードアセチルプローブ15mer(表1におけるG−2(配列番号11))をヨードアセチルプローブD−2の代わりに使用した結果を図8に示す。
蛍光シグナルの蓄積
実施例3に示された条件を基本に、核酸プローブセットAを使用し、テンプレートは表2で示された量の1/10の合成オリゴDNA(終濃度0.1μM)を使用した。シグナルを蓄積するために化学ライゲーション反応に、核酸プローブの解離ステップを加えたサイクルを繰り返した。核酸プローブセットAに最適化されたサイクル、60℃10秒、4℃2分を1回のみ行うか(×1)、または20回繰り返した(×20)結果を図9に示す。このサイクル反応にはアプライドバイオシステムズ社製サーマルサイクラーGene Amp system 9700を使用し、温度制御を行った。
ヨードアセチル基のない核酸プローブを使用した場合(non−I)は全く蛍光シグナルが得られなかった。これに対し化学ライゲーション反応が可能な核酸プローブの組み合わせなら20サイクル繰り返した場合で1回のみの場合の約1.5倍の蛍光シグナルの増加が確認できた。
この結果は、化学ライゲーション反応では本実施例におけるようなサイクル反応を行わずに常温5分という迅速な検出が可能であることに加えて、サイクル反応を行うことによって蛍光シグナルの蓄積が可能であることを示唆している。
リアルタイム検出
表2の反応条件から、表1の核酸プローブセットBを使用し、プローブ濃度2倍(終濃度2μM)かつテンプレートは合成オリゴDNAを濃度1/100(終濃度10nM)で使用し、サイクル反応によるシグナルの蓄積をリアルタイムにモニタリングした。リアルタイムPCR装置としてロシュ社製のLight Cycler systemを使用した。測定条件は60℃5秒、35℃2分を20回繰り返したサイクル反応を行い、F3モードの検出シグナルにより測定した。その結果を図10に示す。
SEQ ID NO:2: phosphorothioate group modified probe (B-1)
SEQ ID NO:3: phosphorothioate group modified probe (C-1)
SEQ ID NO:4: phosphorothioate group modified probe (D-1)
SEQ ID NO:5: iodo-acetyl group modified probe (A-2)
SEQ ID NO:6: iodo-acetyl group modified probe (B-2)
SEQ ID NO:7: iodo-acetyl group modified probe (C-2)
SEQ ID NO:8: iodo-acetyl group modified probe (D-2)
SEQ ID NO:9: iodo-acetyl group modified probe (E-2)
SEQ ID NO:10: iodo-acetyl group modified probe (F-2)
SEQ ID NO:11: iodo-acetyl group modified probe (G-2)
SEQ ID NO:12: Synthetic template oligonucleotide having a complementary sequence
SEQ ID NO:13: Synthetic template oligonucleotide having a complementary sequence
SEQ ID NO:14: Synthetic template oligonucleotide having a mutation at position 19
Claims (26)
- 少なくとも1つの核酸プローブセットを目的の核酸を含む試料と混合する工程を包含する核酸の検出方法であって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの3’末端が第二の核酸プローブの5’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが3’末端または3’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが5’末端または5’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの3’末端と第二の核酸プローブの5’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
方法。 - 第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、請求項1記載の核酸の検出方法。
- 蛍光体基がフルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、ローダミンおよびその誘導体、ROX、Hex、JOE、BODIPY類、Alexa類ならびにBHQ類からなる群より選択される、請求項2記載の核酸の検出方法。
- 第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、請求項2または3記載の核酸の検出方法。
- 第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項2〜4のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項2〜4のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、請求項1〜6のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 第一の核酸プローブの5’末端及び/又は第二の核酸プローブの3’末端が修飾されている、請求項1〜8のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびDNPからなる群より選択される物質での修飾である、請求項9記載の核酸の検出方法。
- 第一の核酸プローブが5〜20塩基長である、請求項1〜10のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 第二の核酸プローブが5〜20塩基長である、請求項1〜11のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、請求項1〜12のいずれか1項記載の核酸の検出方法。
- 少なくとも1つの核酸プローブセットを含む核酸検出用キットであって、
核酸プローブセットが、それぞれ目的の核酸の配列に相補的な配列を有する第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブを含み、目的の核酸にハイブリダイズした際に第一の核酸プローブの3’末端が第二の核酸プローブの5’末端に隣接するように第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブの配列が選択され、
第一の核酸プローブが3’末端または3’末端側に求核基を有し、第二の核酸プローブが5’末端または5’末端側に求核基と反応性の基を有し、第一の核酸プローブの3’末端と第二の核酸プローブの5’末端が互いに隣接して配置されると非酵素的な結合反応を生じ、
第一の核酸プローブが第一の標識を有し、第二の核酸プローブが第二の標識を有し、第一の標識および第二の標識が互いに近接して配置されると検出可能な信号を生じる、
キット。 - 第一の標識および第二の標識が異なる蛍光体基である、請求項14記載の核酸検出用キット。
- 蛍光体基がフルオレセイン、TAMRA、Cy3、Cy5、Cy5.5、ローダミンおよびその誘導体、ROX、Hex、JOE、BODIPY類、Alexa類ならびにBHQ類からなる群より選択される、請求項15記載の核酸検出用キット。
- 第一の標識としての蛍光体基と第二の標識としての蛍光体基が互いに近接して配置されると特有の蛍光を発する、請求項15または16記載の核酸検出用キット。
- 第一の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第二の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項15〜17のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 第二の標識としての蛍光体基の蛍光波長が第一の標識としての蛍光体基の励起波長である、請求項15〜17のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 求核基がホスホロチオエートまたはホスホロセレノエートである、請求項14〜19のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 求核基と反応性の基がヨードアセチル基である、請求項14〜20のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 第一の核酸プローブの5’末端及び/又は第二の核酸プローブの3’末端が修飾されている、請求項14〜21のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 修飾がビオチン、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびDNPからなる群より選択される物質での修飾である、請求項22記載の核酸検出用キット。
- 第一の核酸プローブが5〜20塩基長である、請求項14〜23のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 第二の核酸プローブが5〜20塩基長である、請求項14〜24のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
- 目的の核酸が核酸増幅方法により増幅された増幅物である、請求項14〜25のいずれか1項記載の核酸検出用キット。
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