JPWO2006061994A1 - 遺伝子配列検査法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.特定の配列を含む標的核酸を、該標的核酸から少なくとも一つ以上の塩基の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して定量的に検出する均一測定系であって、以下の工程からなる方法;
I)標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的DNAにハイブリダイズさせる工程、
II)ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドプローブを二本鎖DNA特異的5´→3´エキソヌクレアーゼまたは3´→5´エキソヌクレアーゼで消化する工程、
III)該オリゴヌクレオチドプローブの消化によってオリゴヌクレオチドプローブから少なくともひとつの標識物質が遊離した結果発せられるシグナルを検出する工程。
2.標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における塩基の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、5´→3´エキソヌクレアーゼまたは3´→5´エキソヌクレアーゼによる消化によってオリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出する、ことからなる上記1に記載の方法。
3.エキソヌクレアーゼが5´→3´エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの3´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1または2に記載の方法。
4.エキソヌクレアーゼが3´→5´エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの5´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1または2に記載の方法。
5.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の3´側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
6.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の3´側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
7.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の5´側に標識された上記4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
8.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の5´側に標識された上記4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
9.標識物質が標的DNA中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン−クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである上記3または4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
10.蛍光性ヌクレオチドアナログが2−アミノプリンである上記9に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
11.5´→3´エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはT7 Gene6 エキソヌクレアーゼである上記3に記載の方法。
12.3´→5´エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである上記4に記載の方法。
13.エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記1から4のいずれか1に記載の方法。
14.耐熱性酵素がArchaeoglobus fulgidusに由来する上記13に記載の方法。
15.RNAより逆転写反応により合成したcDNA、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法(PCR法)または逆転写PCR法にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる上記1または2に記載の方法。
16.オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも一つ以上の塩基の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる上記5から10のいずれか1に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した上記1から4及び11から15のいずれか1に記載の方法
17.上記1〜16のいずれか1に記載の方法に使用する測定試薬またはキット、
からなる。
(1)標的核酸の調製
ヒトゲノムDNAからK−ras遺伝子の一部をPCRにて増幅した産物を標的核酸とした。上流及び下流プライマーの配列は以下の通りである。なお、以下に示す全てのオリゴマーDNAの合成は、日本バイオサービスに依頼した。
配列番号2:CCTCTATTGTTGGATCATATTC
PCRの条件は、1.25UのEx Taq DNA Polymerase(宝バイオ)、1X Ex Taq緩衝液(宝バイオ)、200μMの各dNTP、200nMの各プライマー、10〜100ngのヒトゲノムDNAを含む50μlの反応液を調製し、94℃/20秒、55℃/20秒、72℃/20秒のサイクル反応を40回行った。また、ヒトゲノムDNAを含まない反応液で同様にサイクル反応を行い、陰性コントロールとした。
5´末端にDabcyl、鎖内にFITCを標識したプローブの配列は、ヒトK−ras遺伝子の一部の塩基配列を有しており、以下の通りである。ただし、配列中の“Z”はFITC標識デオキシチミジン(FITC−dT)を表す。
上記(1)のK−ras遺伝子の増幅産物をPicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probe社)で定量した後、陰性コントロールで2倍段階希釈を行った。この2倍希釈系列及び陰性検体を、配列番号3によって示された配列を有し、5´末端にDabcylが標識されたプローブを用いてエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法で測定を行った。すなわち、2X エキソヌクレアーゼIII Buffer(宝バイオ)、75mM NaCl、750nMプローブDNA、2μlの検体DNA(PCR産物)を含む10μlの反応液を調製し、Mastercycler ep(エッペンドルフ社)を用いて95℃で2分間加熱した後、37℃で5秒間加温した。直ちに10μlの1.35U/μl エキソヌクレアーゼIIIを添加して37℃にてさらに30分間保温した。次いで70℃にて10分間加温して酵素を失活させた後、30μlのTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8.0)を加え、全量を蛍光測定用の96穴マイクロプレート(Corning社)に移し、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定した。
(1)変性操作工程の有無
上記実施例1(3)で示した方法では、エキソヌクレアーゼの添加の前に、標的二本鎖DNAの熱変性の工程が含まれている。この工程が必須であるか検証するため、上記実施例1(1)で調製した170fmolのK−ras PCR産物と陰性検体を上記実施例1(3)の熱変性の工程を含む方法と熱変性の工程を含まない方法とで比較した。熱変性の工程を含まない方法は、1X Exonuclease III Buffer(宝バイオ)、37.5mM NaCl、375nMプローブ、2μlの検体DNA(170fmolのPCR反応液)及び0.675U/μlのエキソヌクレアーゼIIIを含む20μlの反応液を調製し、37℃にて30分間保温した後、さらに70℃で10分間加温して酵素を失活させ、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定することによって実施した。その結果、図3に示した通り、熱変性の工程を含まない方法では、標的核酸を含まないPCR反応液のシグナル及び170fmolの標的配列を含むPCR反応液のシグナルともに、熱変性の工程を含む方法によるシグナルとほぼ同程度であった。このことから、熱変性の工程は必須でないことが分かった。
(1)合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基の置換を識別する能力を検証するため、標的核酸として13種の化学合成DNAを用いた。各化学合成標的DNAの塩基配列は以下の通りである。
配列番号5:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTTGTAGTTGGAGCTTGT
配列番号6:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGTTAGTTGGAGCTTGT
配列番号7:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGCAGTTGGAGCTTGT
配列番号8:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTCGTTGGAGCTTGT
配列番号9:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTATTTGGAGCTTGT
配列番号10:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGCTGGAGCTTGT
配列番号11:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTCGGAGCTTGT
配列番号12:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTTGAGCTTGT
配列番号13:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGTAGCTTGT
配列番号14:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGCGCTTGT
配列番号15:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGATCTTGT
配列番号16:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATTGT
本発明による一塩基ミスマッチの識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、1X Exonuclease III Buffer(宝バイオ)、37.5mM NaCl、375nMプローブDNA、0.675U/μl エキソヌクレアーゼIII(宝バイオ)、100fmol合成標的DNAまたはその代わりに精製水を含む20μlの反応液をPCR反応チューブに調製し、Mastercycler ep(エッペンドルフ社)を用いて直ちに37℃または41℃にて30分間加温した。酵素を失活させるため70℃にて10分間加熱した後、30μlのTE緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の96穴マイクロプレート(Corning社)に移し、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度(RFU)から精製水をサンプルとして測定したときのRFUを減じた値(ΔRFU)を求めた。
(1)合成標的核酸
エキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法の一塩基以上の挿入又は欠損配列を識別する能力を検証するため、標的核酸として4種の化学合成DNAを用いた。各化学合成標的DNAの塩基配列は以下の通りである。
配列番号18:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGGAGCTTGT
配列番号19:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTGTGGAGCTTGT
配列番号20:5´−GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTGAATGGAGCTTGT
本発明による挿入及び欠損配列の識別能力を、合成標的核酸を用いて検証するため、以下のような条件でエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイを実施した。すなわち、1X Exonuclease III Buffer(宝バイオ)、37.5mM NaCl、375nMプローブDNA、0.675U/μl エキソヌクレアーゼIII(宝バイオ)、300fmol合成標的DNAまたは精製水を含む20μlの反応液を蛍光測定用PCRプレートに調製し、Mastercycler ep(エッペンドルフ社)を用いて直ちに41℃にて30分間加温した。酵素を失活させるため70℃にて10分間加熱した後、30μlのTE緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の96穴マイクロプレート(Corning社)に移し、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定し、各合成標的核酸をサンプルとしたときの相対蛍光強度(RFU)から精製水をサンプルとして測定したときのRFUを減じた値(ΔRFU)を求めた。
(1)ヒトアルデヒド脱水素酵素2遺伝子のPCR
化学合成したDNAを標的核酸とした場合のみならず、実際の生体試料の多型解析が可能であることを示すため、ヒトのアルデヒド脱水素酵素2(ALDH2)遺伝子の多型検出系を構築した。ALDH2遺伝子のエクソン12には正常型の「G」と変異型「A」の一塩基多型が存在する。この多型をエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイ法によって識別するため、ALDH2の遺伝子型が既知の検体DNAから、PCRによってこの多型部位を含む領域を増幅した。PCRに用いたプライマーの配列は以下の通りである。
配列番号22:GCCCCCAACAGACCCCAATC
1X Exonuclease III Buffer(宝バイオ)、40mM NaCl、150nMプローブDNA、0.4U/μl エキソヌクレアーゼIII(宝バイオ)、5μlの上記PCR反応液または精製水を含む20μlの反応液をPCR反応チューブに調製し、Mastercycler ep(エッペンドルフ社)を用いて直ちに37℃にて30分間加温した。酵素を失活させるため70℃にて10分間加熱した後、30μlのTE緩衝液を加え、全量を蛍光測定用の96穴マイクロプレート(Corning社)に移し、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定した。このときに用いたプローブDNAは正常型の「G」を有する標的核酸と完全マッチする配列からなり、その配列は以下の通りである。
(1)人為的ミスマッチを導入したプローブ
ミスマッチ塩基対のうちでも、G/GやG/T塩基対は比較的水素結合が強く、そのため通常のハイブリダイゼーション法では、他のミスマッチ塩基対に比べて完全マッチの塩基対と区別して検出することは比較的困難である。本発明においても同様の傾向があるが、プローブ配列の一部を意図的に置換し、標的配列との間でミスマッチを形成するようにすることで、この問題を回避することができる。その一例を示すために変異型ALDH2に含まれる「A」と野生型に含まれる「G」を識別して検出するための2種のプローブを以下に示す通り設計した。
配列番号25:CACTTTAGTGZATGTCTGCAGCCCGTA
配列番号27:GAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGT
これらのDNAを用いて、1X Exonuclease III Buffer(宝バイオ)、40mM NaCl、250nMプローブDNA、0.05U/μlエキソヌクレアーゼIII(宝バイオ)、100fmolの合成標的DNAを含む20μlの反応液を96穴の蛍光測定用PCRプレートに調製し、Mastercycler ep(エッペンドルフ社)を用いて直ちに37℃にて30分間加温し、次いで酵素を失活させるため70℃にて5分間加熱した後、プレートリーダーWallac Arvo HTS 1420 Multilabel Counter(パーキンエルマーライフサイエンス社)にて励起波長485nm、蛍光波長535nmで蛍光を測定した。また、盲検として標的DNAを添加せずに反応及び蛍光測定を行った。
(1)生体試料のALDH2遺伝子型判定
ALDH2遺伝子の野生型及び変異型をそれぞれ特異的に検出するためのプローブのデザインを最適化し、それらを用いたエキソヌクレアーゼサイクリングアッセイによる測定条件を至適化して、ヒト由来サンプルのALDH2遺伝子の遺伝子型判定を試みた。
(1)混合試料のアレル含有率の定量
ALDH2の遺伝子型がG/GホモのゲノムDNA及びA/AホモのゲノムDNAを混合し、G/GホモのゲノムDNAの含有率が100%、75%、50%、25%、0%となるように試料を調製した。これらの混合試料10ngを請求項5と同じ方法でPCRを行った。それらのPCR産物5μlを実施例7と同じ方法でALDH2遺伝子の野生型検出系及び変異型検出系を用いて2回ずつアッセイした。
15塩基程度に短くなったときのミスマッチの有無によって生じるTmの差(ΔTm)を利用しているため、全体のTmに占めるΔTmの割合が大きくなり、従来のより長いプローブを用いたハイブリダイゼーション法に比べて、多型識別の感度と特異性がともに高いことが特徴である。
[0012]
また、本発明は、操作が簡便で、従来のハイブリダイゼーション法のように標的核酸とのミスマッチを有するプローブ、またはプローブとのミスマッチを有する標的核酸を除くための洗浄操作、いわゆるB/F分離の操作を必要としない。また、本発明は、遺伝子増幅法で増幅した産物を精製することなく、直ちにエキソムクレアーゼサイクリングアッセイに用いることができ、二本鎖DNAを披検資料としたときも変性操作を必要とせず、極めて迅速性と簡便性に優れる。さらに、本発明に必要な試薬は全て商業的に安価に入手可能なものであり、遺伝子解析で最も一般的に用いられる器具及び装置のみを必要とするため、極めて経済性と汎用性に優れるものである。
[0013]
すなわち本発明は、以下よりなる。
1.標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で完全に相補的な塩基対を形成するときは、該オリゴヌクレオチドプローブが5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化を受けるため、標識物質を含むモノヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドプローブから遊離して、その結果有意なシグナルの上昇が起こることを検出すること、および、標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における1塩基以上の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしないため5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、ハイブリダイズした後5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化によって該オリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出することにより、標的核酸を、該標的核酸とは1塩基以上の置換または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して検出
する方法。
2.エキソヌクレアーゼが5’→3’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの3’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1に記載の方法。
3.エキソヌクレアーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの5’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1に記載の方法。
4.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の3’側に標識された上記2に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
5.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の3’側に標識された上記2に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
6.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の5’側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
7.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の5’側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
8.標識物質が標的DNA中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン−クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである上記2または3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
9.蛍光性ヌクレオチドアナログが2−アミノプリンである上記8に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
10.5’→3’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはT7 Gene6エキソヌクレアーゼである上記2に記載の方法。
11.3’→5’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである上記3に記載の方法。
12.エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記1から3のいずれか1に記載の方法。
13.耐熱性酵素がArchaeoglobus fulgidusに由来する上記12に記載の方法。
14.RNAより逆転写反応により合成したcDNA、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法(PCR法)または逆転写PCR法(RT−PCR法)にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる上記1から3のいずれか1に記載の方法。
15.オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも1塩基以上の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる上記4から9のいずれか1に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した上記1から3及び10から14のいずれか1に記載の方法。
16.上記1から3及び10から15のいずれか1に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
【発明の効果】
[0014]
本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸を、その標的核酸とは一塩基以上の置換、挿入あるいは欠損配列を有する核酸と区別して定量的に検出することが可能である。また、高価な試薬原料を必要としないためランニングコストが安価である。さらに、操作は極めて簡便で、PCR反応後の産物の精製および変性操作も不要であり、シグナルのリアルタイム測定も可能であり、極めて迅速な検査方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
[0015]
本発明は標的核酸配列を定量的に測定し、さらに標的核酸配列中の多型または変異を識別するための方法である。本発明は、標識物質を結合させたオリゴヌクレオチドプローブ(以下「プローブ」という)を標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションさせて、標的核酸配列中の多型部位または変異部位周辺の配列が、原則としてプローブ配列と完全に相補的である場合のみに、標的核酸に結合したプローブから
15塩基程度に短くなったときのミスマッチの有無によって生じるTmの差(ΔTm)を利用しているため、全体のTmに占めるΔTmの割合が大きくなり、従来のより長いプローブを用いたハイブリダイゼーション法に比べて、多型識別の感度と特異性がともに高いことが特徴である。
[0012]
また、本発明は、操作が簡便で、従来のハイブリダイゼーション法のように標的核酸とのミスマッチを有するプローブ、またはプローブとのミスマッチを有する標的核酸を除くための洗浄操作、いわゆるB/F分離の操作を必要としない。また、本発明は、遺伝子増幅法で増幅した産物を精製することなく、直ちにエキソムクレアーゼサイクリングアッセイに用いることができ、二本鎖DNAを披検資料としたときも変性操作を必要とせず、極めて迅速性と簡便性に優れる。さらに、本発明に必要な試薬は全て商業的に安価に入手可能なものであり、遺伝子解析で最も一般的に用いられる器具及び装置のみを必要とするため、極めて経済性と汎用性に優れるものである。
[0013]
すなわち本発明は、以下よりなる。
1.標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で完全に相補的な塩基対を形成するときは、該オリゴヌクレオチドプローブが5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化を受けるため、標識物質を含むモノヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドプローブから遊離して、その結果有意なシグナルの上昇が起こることを検出すること、および、標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における1塩基以上の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしないため5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、ハイブリダイズした後5’→3’エキソヌクレアーゼまたは3’→5’エキソヌクレアーゼによる消化によって該オリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出することにより、標的核酸を、該標的核酸とは1塩基以上の置換または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して検出
する方法。
2.エキソヌクレアーゼが5’→3’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの3’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1に記載の方法。
3.エキソヌクレアーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の所定の部位との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの5’末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された上記1に記載の方法。
4.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の3’側に標識された上記2に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
5.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の3’側に標識された上記2に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
6.標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の5’側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
7.標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の5’側に標識された上記3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
8.標識物質が標的DNA中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン―クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである上記2または3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
9.蛍光性ヌクレオチドアナログが2−アミノプリンである上記8に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
10.5’→3’エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはT7 Gene6エキソヌクレアーゼである上記2に記載の方法。
11.3’→5’エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである上記3に記載の方法。
12.エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である上記1から3のいずれか1に記載の方法。
13.耐熱性酵素がArchaeoglobus fulgidusに由来する上記12に記載の方法。
14.RNAより逆転写反応により合成したcDNA、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法(PCR法)または逆転写PCR法(RT−PCR法)にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる上記1から3のいずれか1に記載の方法。
15.オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも1塩基以上の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる上記4から9のいずれか1に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した上記1から3及び10から14のいずれか1に記載の方法。
16.上記1から3及び10から15のいずれか1に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
[発明の効果]
[0014]
本発明によれば、特定の塩基配列を有する標的核酸を、その標的核酸とは一塩基以上の置換、挿入あるいは欠損配列を有する核酸と区別して定量的に検出することが可能である。また、高価な試薬原料を必要としないためランニングコストが安価である。さらに、操作は極めて簡便で、PCR反応後の産物の精製および変性操作も不要であり、シグナルのリアルタイム測定も可能であり、極めて迅速な検査方法を提供することができる。
[発明を実施するための最良の形態]
[0015]
本発明は標的核酸配列を定量的に測定し、さらに標的核酸配列中の多型または変異を識別するための方法である。本発明は、標識物質を結合させたオリゴヌクレオチドプローブ(以下「プローブ」という)を標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションさせて、標的核酸配列中の多型部位または変異部位周辺の配列が、原則としてプローブ配列と完全に相補的である場合のみに、標的核酸に結合したプローブから
Claims (17)
- 特定の配列を含む標的核酸を、該標的核酸から少なくとも一つ以上の塩基の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸と区別して定量的に検出する均一測定系であって、以下の工程からなる方法;
I)標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブを標的DNAにハイブリダイズさせる工程、
II)ハイブリダイズした該オリゴヌクレオチドプローブを二本鎖DNA特異的5´→3´エキソヌクレアーゼまたは3´→5´エキソヌクレアーゼで消化する工程、
III)該オリゴヌクレオチドプローブの消化によってオリゴヌクレオチドプローブから少なくとも一つの標識物質が遊離した結果発せられるシグナルを検出する工程。 - 標識物質を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対を形成するとき、あるいは標的核酸における塩基の挿入または欠損によってオリゴヌクレオチドプローブとの間でループ構造を形成するときに、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸とハイブリダイズしないため5´→3´エキソヌクレアーゼまたは3´→5´エキソヌクレアーゼによる消化を受けないか、5´→3´エキソヌクレアーゼまたは3´→5´エキソヌクレアーゼによる消化によってオリゴヌクレオチドプローブに含まれる標識物質が遊離する前に、該オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸から離脱するために標識物質の遊離が起こらず、その結果有意なシグナルの上昇が起こらないことを検出する、ことからなる請求項1に記載の方法。
- エキソヌクレアーゼが5´→3´エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの3´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された請求項1または2に記載の方法。
- エキソヌクレアーゼが3´→5´エキソヌクレアーゼであって、オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸との間で形成し得る少なくとも1塩基以上の相補的でない塩基対部分またはループ構造部分がオリゴヌクレオチドプローブの5´末端と標識物質が標識された部位との間に位置するように設計された請求項1または2に記載の方法。
- 標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の3´側に標識された請求項3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
- 標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の3´側に標識された請求項3に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
- 標識物質が蛍光物質であって、該蛍光物質が発する蛍光を有効に減弱する効果を有するクエンチング物質が蛍光物質の5´側に標識された請求項4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
- 標識物質がクエンチング物質であって、該クエンチング物質によって有効に蛍光が減弱され得る蛍光物質がクエンチング物質の5´側に標識された請求項4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
- 標識物質が標的DNA中のグアニン、アデニン、チミン、シトシンのいずれかとワトソン−クリックの法則に従った塩基対を形成し得る蛍光性ヌクレオチドアナログである請求項3または4に記載の方法に使用するオリゴヌクレオチドプローブ。
- 蛍光性ヌクレオチドアナログが2−アミノプリンである請求項9に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 5´→3´エキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼまたはT7 Gene6 エキソヌクレアーゼである請求項3に記載の方法。
- 3´→5´エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIである請求項4に記載の方法。
- エキソヌクレアーゼが耐熱性酵素である請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 耐熱性酵素がArchaeoglobus fulgidusに由来する請求項13に記載の方法。
- RNAより逆転写反応により合成したcDNA、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法(PCR法)または逆転写PCR(RT−PCR)法にて増幅した産物を精製することなく被検試料として用いる請求項1または2に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間に相補的でない塩基対またはループ構造を形成させるために、一つ以上の塩基の置換、挿入または欠損を意図的に導入することによって、該標的核酸と、該標的核酸とは少なくとも一つ以上の塩基の置換を含む核酸、または1塩基以上の挿入あるいは欠損を含む核酸との識別能力を向上させることのできる請求項5から10のいずれか1に記載のオリゴヌクレオチドプローブを利用した請求項1から4及び11から15のいずれか1に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法に使用する測定試薬またはキット。
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