JPWO2010113452A1 - 遺伝子型の識別方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2009年3月31日に日本に出願された特願2009−084967号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、PCR等のプライマーの伸張反応において、一塩基の違いを区別して増幅する方法が開発されている。この方法は、“ARMS(amplification refractory mutation system)”(例えば、非特許文献3参照。)、“ASPCR(allele specific PCR)”(例えば、非特許文献4参照。)等と呼ばれている方法である。この方法は、比較的高感度であり、さらに一般的なPCRの増幅反応以外の操作を必要とせず、反応のすべてを閉鎖系で行うことができ、かつ非常に簡便であり、PCRのキャリーオーバーコンタミネーションのない優れた方法である。しかしながら、一度でも一塩基識別を誤って正常遺伝子を増幅した場合、以後の増幅反応において、変異遺伝子の増幅と同じように正常遺伝子も増幅されてしまうため、擬陽性の危険が高い方法とも言える。この方法を用いる場合、反応条件、すなわち反応温度や塩濃度等を厳密に制御する必要があり、また鋳型量も厳密に同じにする必要があり(例えば、非特許文献5参照。)、不特定多数の検体を検査する臨床検査や、高い精度が要求される上に簡便性も求められる診断方法には不向きである。
また、変異を含む配列をPCRにより増幅し、その生成物の2本鎖DNAの融解曲線を求め、変異遺伝子と正常遺伝子の融解曲線の違いから変異遺伝子の割合を求める方法が開発されている。この方法でも、正常遺伝子に含まれる変異遺伝子を5%程度まで検出できるとされている(例えば、非特許文献7参照。)。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子型の識別をPCR−PHFA法を用いて行う際に、核酸増幅反応液を未精製のまま競合的鎖置換反応の反応液に添加する場合に、競合的鎖置換反応中のポリメラーゼによる伸長反応を阻害することにより、遺伝子型の識別感度を改善できることを見出し、本発明を完成させた。
(1)遺伝子変異における遺伝子型を識別する方法であって、試料に含まれる遺伝子中の変異部位を含む領域を核酸増幅反応により増幅し、試料2本鎖核酸を含有する増幅反応液を得る核酸増幅工程と、前記変異部位が特定の遺伝子型であり、かつ標識物質により標識されている標準2本鎖核酸と、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液とを混合して競合的鎖置換反応を行い、標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸との間で鎖置換が生じた程度を測定することにより、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、を有し、かつ、前記競合的鎖置換反応が、ポリメラーゼによる伸長反応が抑制された条件で行われることを特徴とする遺伝子型の識別方法。
(2)前記競合的鎖置換反応が、伸長反応阻害剤の存在下で行われることを特徴とする前記(1)記載の遺伝子型の識別方法。
(3)前記伸長反応阻害剤がキレート剤であることを特徴とする前記(2)記載の遺伝子型の識別方法。
(4)前記伸長反応阻害剤がEDTAであり、前記競合的鎖置換反応の反応液中のEDTA濃度が15mM以上であることを特徴とする前記(3)記載の遺伝子型の識別方法。
(5)前記伸長反応阻害剤がDNA合成阻害剤であることを特徴とする前記(2)記載の遺伝子型の識別方法。
(6)競合的鎖置換反応前に、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液を熱処理することを特徴とする前記(1)記載の遺伝子型の識別方法。
(7)競合的鎖置換反応前に、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液に、1本鎖核酸分解処理又はヌクレオチド三リン酸分解処理を行うことを特徴とする前記(1)記載の遺伝子型の識別方法。
(9)前記第1標識物質及び前記第2標識物質の少なくとも一方が蛍光物質であり、前記識別工程における競合的鎖置換反応は、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸とを含む反応液の温度を、高温から徐々に低下させることにより行うものであり、かつ、標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸との間で鎖置換が生じた程度の測定を、前記反応液の温度低下による蛍光強度の変化量と、前記試料2本鎖核酸を含まず前記標準2本鎖核酸を含む対照反応液の温度低下による蛍光強度の変化量との比に基づき測定することを特徴とする前記(8)記載の遺伝子型の識別方法。
(10)前記(1)に記載の遺伝子型の識別方法により遺伝子型を識別するために用いられるキットであって、伸長反応阻害剤、1本鎖核酸分解酵素、及びヌクレオチド三リン酸分解酵素からなる群より選択される1以上と、試料2本鎖核酸を調製するための核酸増幅試薬と、一方の標識物質が標準核酸の一方の鎖の5’端部、もう一方の標識物質が標準核酸のもう一方の鎖の3’端部に導入された標準二本鎖核酸と、を具備することを特徴とする遺伝子型識別用キット。
また、本発明の遺伝子型識別用キットを用いることにより、本発明の遺伝子型の識別方法をより簡便に行うことができる。
鋳型を添加せずにPCRを行って得られたPCR反応液をそのまま競合的鎖置換反応に添加し、持ち込まれたPCR反応液の成分が鎖置換反応に及ぼす影響を調べた。
PCR反応液の組成は、250nM KFプライマー、250nM KRプライマー、250μM dNTP、1×PCRバッファー、2.5ユニット Taq DNAポリメラーゼ(Takara Taq Hot Start Version)とし、全体の反応液を100.5μLとした。このPCR反応液を、95℃3分間の処理後、95℃(20秒間)→57℃(30秒間)→72℃(30秒)の変性、アニーリング、伸長反応を、40サイクル行った。使用したKFプライマー及びKRプライマーの塩基配列を表2に示す。表中の右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を示す。
ABI−7900を用いて、これらのPCR−PHFA反応液の温度変化に伴う蛍光変化(蛍光強度変化)を測定した。温度条件は、95℃で5分間変性し、85℃から60℃の間で1℃の降温ごとに5分間ずつその温度を保持しながらゆっくり温度を下げ、最後は35℃まで温度を下げた。
PCR−PHFAに及ぼすPCR反応液の影響をさらに詳しく調べるため、実施例1と同じプライマー、標識DNAを用い、鋳型及びTaq DNAポリメラーゼを加えていないPCR反応液、鋳型及びプライマーを加えていないPCR反応液を調製し、実施例1と同様に温度変化に伴う蛍光変化を測定した。
鋳型及びTaq DNAポリメラーゼを加えていないPCR反応液の組成は、250nM KFプライマー、250nM KRプライマー、250μM dNTP、1×PCRバッファーとし、全体の反応液を100.5μLとした〔標識標準DNA+PCR鋳型(−)、Taq(−)〕。鋳型及びプライマーを加えていないPCR反応液の組成は、250μM dNTP、1×PCRバッファー、2.5ユニット Taq DNAポリメラーゼ(Takara Taq Hot Start Version)とし、全体の反応液を100.5μLとした〔標識標準DNA+PCR鋳型(−)、プライマー(−)〕。これらのPCR反応液を、95℃3分間の処理後、95℃(20秒間)→57℃(30秒間)→72℃(30秒)の変性、アニーリング、伸長反応を、40サイクル行った。得られたPCR反応液を用いて、実施例1と同様に、PCR−PHFA反応液を調製して温度変化に対する蛍光変化を測定した。
添加するPCR反応液を加熱処理し、Taqポリメラーゼを失活させることにより、競合的鎖置換反応における核酸の伸長反応を阻害した。
まず、実施例1と同じ組成のPCR反応液に対して、同じ条件でPCR反応を行った。得られたPCR反応液の一部を99℃で15分間加熱処理し、別の一部を99℃で60分間加熱処理した。これらの加熱処理した反応液と加熱未処理のものを、実施例1と同じ標識標準DNAを用いて、同様にPCR−PHFA反応液を調製し、同様の温度条件で、温度変化に伴う蛍光変化を測定した。また、実施例1と同様にして、PCR反応液を加えないコントロール〔標識標準DNAのみ〕のPCR−PHFA反応液を調製し、同様に蛍光変化を測定した。
PCR−PHFA反応液にEDTAを添加することにより、競合的鎖置換反応における核酸の伸長反応を阻害した。
まず、実施例1と同じ組成のPCR反応液に対して、同じ条件でPCR反応を行った。
得られたPCR反応液(15μL)、500nM G12D−FAM(1μL)、500nM G12D−Alexa(1μL)、2M NaCl(1μL)、H2O(2μL)を混合し、EDTAを含まないPCR−PHFA反応液とした〔標識標準DNA+PCR鋳型(−)〕。また、PCR反応液(15μL)、500nM G12D−FAM(1μL)、500nM G12D−Alexa(1μL)、2M NaCl(1μL)、500mM EDTA(0.6μL)、H2O(1.4μL)を混合し、15mM EDTAを含むPCR−PHFA反応液とした〔15mM EDTA添加標識標準DNA+PCR鋳型(−)〕。同様に、PCR反応液(15μL)、500nM G12D−FAM(1μL)、500nM G12D−Alexa(1μL)、2M NaCl(1μL)、500mM EDTA(2μL)を混合し、50mM EDTAを含むPCR−PHFA反応液とした〔50mM EDTA添加標識標準DNA+PCR鋳型(−)〕。PCR反応液を加えないコントロールとして、500nM G12D−FAM(1μL)、500nM G12D−Alexa(1μL)、2M NaCl(1μL)、10×PCRバッファー(2μL:100mM Tris−HCl(pH8.3),500mM KCl,15mM MgCl2)、H2O(15μL)を混合した〔標識標準DNAのみ〕。実施例1と同様の温度条件で、これらのPCR−PHFA反応液の温度変化に伴う蛍光変化を測定した。
なお、特許文献2に記載されているPCR−PHFAの改良法においても、PCR−PHFA反応液中には1mMのEDTAが含まれている。しかしながら、実施例4ではEDTA15mMでもほとんどTaqポリメラーゼの活性を抑制できていないため、従来の1mM程度のEDTA濃度ではDNAポリメラーゼの活性を抑えるにはまったく効果がなく、PHFAのミスマッチ識別能が低下することが、実施例4の結果からも明らかである。特許文献2ではEDTAは、単にDNAをヌクレアーゼから保護する目的で添加されているに過ぎない。
PCR−PHFA法の反応液に、各種濃度のEDTAを添加し、遺伝子型の識別精度に対する効果を調べた。
遺伝子型の識別対象である遺伝子を含む試料として、がん細胞由来の培養細胞SW403より抽出したゲノムDNAを使用した。なお、SW403は、K−ras遺伝子のコドン12の2番目のグアニンがチミンホモジニアスに変異している(G12V)遺伝子型であることがわかっている細胞である。
また、標識標準DNAとして、遺伝子型が野生型、G12C、G12D、G12S、及びG12Aのものをそれぞれ用いた。
次に、各遺伝子型の標識標準DNAとPCR反応液に加えて各種濃度となるようにEDTAを添加したPCR−PHFA反応液を調製した。具体的には、野生型標識標準DNAを用いる場合には、最初に、500nM Wild−FAM(1μL)及び500nM Wild−Alexa(1μL)をチューブに添加し、乾燥固化した。そこに、PCR反応液(14μL)、2M NaCl(1μL)、500mM EDTA(XμL)、H2O(5−XμL)を加えてPCR−PHFA反応液とした。EDTA無添加の場合には、X=0であり、H2Oを5μL加えた。また、500mM EDTAを1、2、3、又は4μL加えて(X=1、2、3、又は4)、25mM EDTA添加、50mM EDTA添加、75mM EDTA添加又は100mM EDTA添加のPCR−PHFA反応液とした。他の遺伝子型についても同様にしてPCR−PHFA反応液を調製した。
本発明の遺伝子型の識別方法において、前記式(4)で表されるIndex値(%)を用いてバラツキ補正を行った。
遺伝子型の識別対象である遺伝子を含む試料として、野生型のK−ras遺伝子を有することが分かっている培養細胞より抽出したゲノムDNAを使用した。また、標識標準DNAとして、遺伝子型が野生型、G12A、G12C、G12D、G12R、G12V、G12S、及びG13Dのものをそれぞれ用いた。
まず、実施例1に示したプライマーを用い、実施例1と同じ条件で培養細胞より抽出したゲノムDNAを鋳型として野生型の遺伝子を増幅したPCR反応液を得た。
次に、実施例5と同様にして、各遺伝子型の標識標準DNAとPCR反応液を混合した25mM EDTA添加PCR−PHFA反応液を調製した。また、各遺伝子型に対して、PCR反応液に代えて等量の水を添加した25mM EDTA添加対照反応液を調製した。
さらに、これらの25mM EDTA添加PCR−PHFA反応液及び25mM EDTA添加対照反応液それぞれに対して、実施例1と同様の温度条件で競合的鎖置換反応を行い、温度変化に伴う蛍光変化を測定した。
Claims (10)
- 遺伝子変異における遺伝子型を識別する方法であって、
試料に含まれる遺伝子中の変異部位を含む領域を核酸増幅反応により増幅し、試料2本鎖核酸を含有する増幅反応液を得る核酸増幅工程と、
前記変異部位が特定の遺伝子型であり、かつ標識物質により標識されている標準2本鎖核酸と、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液とを混合して競合的鎖置換反応を行い、標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸との間で鎖置換が生じた程度を測定することにより、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、
を有し、かつ、前記競合的鎖置換反応が、ポリメラーゼによる伸長反応が抑制された条件で行われることを特徴とする遺伝子型の識別方法。 - 前記競合的鎖置換反応が、伸長反応阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項1記載の遺伝子型の識別方法。
- 前記伸長反応阻害剤がキレート剤であることを特徴とする請求項2記載の遺伝子型の識別方法。
- 前記伸長反応阻害剤がEDTAであり、前記競合的鎖置換反応の反応液中のEDTA濃度が15mM以上であることを特徴とする請求項3記載の遺伝子型の識別方法。
- 前記伸長反応阻害剤がDNA合成阻害剤であることを特徴とする請求項2記載の遺伝子型の識別方法。
- 競合的鎖置換反応前に、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液を熱処理することを特徴とする請求項1記載の遺伝子型の識別方法。
- 競合的鎖置換反応前に、前記核酸増幅工程で得られた増幅反応液に、1本鎖核酸分解処理又はヌクレオチド三リン酸分解処理を行うことを特徴とする請求項1記載の遺伝子型の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の鎖の3’端部が第1標識物質により、他方の鎖の5’端部が第2標識物質により、それぞれ標識されており、
前記第1標識物質と前記第2標識物質は、互いにエネルギー移動可能な物質であり、
前記第1標識物質及び前記第2標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定することにより、前記識別工程における標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸との間で鎖置換が生じた程度を測定することを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の遺伝子型の識別方法。 - 前記第1標識物質及び前記第2標識物質の少なくとも一方が蛍光物質であり、
前記識別工程における競合的鎖置換反応は、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸とを含む反応液の温度を、高温から徐々に低下させることにより行うものであり、
かつ、標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸との間で鎖置換が生じた程度の測定を、前記反応液の温度低下による蛍光強度の変化量と、前記試料2本鎖核酸を含まず前記標準2本鎖核酸を含む対照反応液の温度低下による蛍光強度の変化量との比に基づき測定することを特徴とする請求項8記載の遺伝子型の識別方法。 - 請求項1に記載の遺伝子型の識別方法により遺伝子型を識別するために用いられるキットであって、
伸長反応阻害剤、1本鎖核酸分解酵素、及びヌクレオチド三リン酸分解酵素からなる群より選択される1以上と、試料2本鎖核酸を調製するための核酸増幅試薬と、一方の標識物質が標準核酸の一方の鎖の5’端部、もう一方の標識物質が標準核酸のもう一方の鎖の3’端部に導入された標準二本鎖核酸と、を具備することを特徴とする遺伝子型識別用キット。
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