JPS59148798A - ビオチンヌクレオチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、ビオチンヌクレオチド誘導体に関す
る。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの塩基
以外の部分にビオチンを結合させてなるビオチンヌクレ
オチド誘導体に関する。本発明は、捷た、このようなビ
オチンヌクレオチド誘導体の製造法にも関する。 先行技術 ビオチンはビタミンＢ複合体の一つであってビタミンＨ
とも呼ばれ、多くの動植物の生育に必要な物質である。 一方、ビオチンは卵白中のアビジンと強力に相互作用を
行なうことが知られており、その点に着目してビオチン
をその誘導体の形で利用するものとしてたとえばビオチ
ン−アビジン試薬がある。これは、細胞あたりの抗原密
度の測定、ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイム
ノアツセイ等の生化学試薬として応用されている。また
、ビオチンと核酸とを結合させた、感染および遺伝疾患
の診断用ＤＮＡプローブが開発され（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｊ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８．６６３３
−６６３７（１９８１）　　）　、市販化されるに至っ
ている。このＤＮＡゾローブにおける、ビオチンヌクレ
オチド誘導体の製造は、シチジントリホスフェート（ｄ
ＣＴＰ）のビオチン誘導体をシチジントリホスフェート
の代わりに使用して酵素的にＤＮＡあるいはＲＮＡを鋳
型にして行なったものである。 しかし、本発明省らの昶るところによれば、このように
して製造されるビオチンヌクレオチド誘導体には下記の
ような問題点がある。 イ、ヌクレオチｉ″の塩基部分にビオチンを含有するた
め１史用オリゴヌクレオチド固有の融解温度（Ｔｍ値）
に変化を生じる。 口、シトシン誘導体の合成が困難である（上記文献より
）。 ノ＼　任意でかつ定められた塩基配列をもつＤＮＡの合
成が困難である。 これらの理由によって、現段階でのビオチン−ヌクレオ
チド銹導体は、その応用範囲が狭く、有用性が限定され
ているのが現状である。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、特定
のオリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオチド塩基
以外の特定部位にビオチンを結合させてなるビオチンヌ
クレオチド誘導体によってこの目的を達成しようとする
ものである。 従って、本発明によるビオチンヌクレオチド誘導体は下
式〔ν旧で示されるピオチンーオリゴデオキシリボヌク
レオテト°であること、を特徴とするものである。 また、本発明によるビオチンヌクレオチド誘導体の製造
法は、下式［ＶＤで示されるオリゴヌクレオチド誘導体
の末端アミン基にビオチンを結合させて下式〔■〕で示
されるビオチン−オリゴデオキシリボヌクレオチドを得
ること、を特徴とするものである。 ／′″＼ 〔■〕 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり、Ｒ１は２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である（Ｂが
複数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよ
い）。〕 効果 本発明者らの合成したビオチン−オリゴデオキシリボヌ
クレオチドは、前記核酸用非放射性アフイニテイプロー
プの短所を回避することができて、下記のような長所を
もつものである。 イ、ヌクレオチドの塩基部分にビオチンを含有しないの
で融解温度（Ｔｍ値）に変化を生じることがなくて安定
である。 口、いかなる塩基配列をもつビオチン−オリゴヌクレオ
チドも合成可能である。 ハ、プローブとして短鎖オリゴマーで十分である。 二、合成が非常に簡単であって、大量合成が可能である
。 ホ、ゾライマ−（鋳型合成の際のＤＮＡ断片）としても
利用できる。 このような長所があるところから、本発明によればビオ
チンヌクレオチド誘導体の利用方法の拡大も考えられる
。すなわち、例えば、ビオチン−オリゴヌクレオチドは
非放射性核酸用アフイニテイゾローズとして、あるいは
ゾライマーとして利用可能であることは前記したところ
であ７つて、そり検出方法も抗体による沈降、酵素の活
性測定、アビジン−セファロースによるアフイニテイカ
ラム螢光性染色体による可視化等々、多様であり、また
放射性プローブ（３２ｐ）に比べて被曝の危険、コスト
、廃棄物の処理および保存性等の点で有利である。 ビオチンヌク−レオチド誘導体（Ｖｌｌ）本発明による
ビオチンヌクレオチド誘導体は、前記の式（ｕＴＩ’）
で示されるものである。 シＰの３′−および５′−水酸基を除いたデオキシリポ
ヌクレオシド残基を示すのに慣用されているものであっ
て、具体的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示じぐｉＡ常
はアデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。 化合物ＩＪＩＩ：］中にＢが複数個存在するときは、そ
れらは同一でも異なってもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０または自然数を示す。 本発明ピオチンオリゴヌクレオチＰ誘導体の重合度がｍ
＋ｎで表示されているのは、本発明の好ましい製造法で
重合度がそ几ぞれｍおよびｎのフラクションを縮合させ
ていることによるものである（詳細後記）。その場合の
ｍは実用的には０〜６、特に１〜４、ｎは実用的にはＯ
〜４０、特にＯ−加、である。 基Ｒ１は、化合物［￥ｆＤの核酸部分とビオチン部分と
を連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基であ
る。これは、特に炭素数２〜２０程度の直鎖または分岐
鎖のアルキレン基が適当である。好祉しいＲ１は、炭素
数２〜６のアルキレン基である。 化合物い’１０の合成 一般的説咀 化合物［ＶＩｌ）、すなわち本発明によるビオチンヌク
レオチド誘導体、は合目的的な任意の方法によって合成
することができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔ν１〕のオリゴヌク
レオチ）４誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチ
ドの５′−末端リン酸基に基＆１を介して一級アミン基
が導入されたもの、のアミノ基にピオチ／を結合させる
ことからなるものである。 一方、式［ＶＩ）の化合物は、オリゴヌクレオチｒの合
成および生成オリゴヌクレオチドの５′−水酸基延長上
での一級アミン基の導入からなる方法で合成することが
できる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は、下記の意味を
持つ（その意義ないし詳細は、後記した通りである）。 ＲＯリン酸基を保護する置換基であって、通常オルトク
ロロフェニル基が用いラレる。 Ｒ１二価の炭化水素残基である。 Ｒ２５′−末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる＋を換基で
あって、通常シアノエチル基が用いられる。 Ｒ４アミノ基の保険基であって、通常トリフルオロアセ
チル基が用いられる。 ｑｎより小さい任意の自然数。 ｍ　　Ｏ’ｊたけ任意の自然数。 ｎ　ｏおよび任意の自然数。 Ｂ　塩基を示す。 Ｂ′　保険された塩基を示すが、通常はＲ６−ベンゾイ
ルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、Ｒ６−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン（すなわち、保護不要）より
選択される。 〆〜［Ｆ］スペーサーを介）また担体であって、通常は
下記のものである。 ） ＣＨ２Ｎ）（ＣＯＣＨ２ＣＨ２− ＢＩＯＴ’ビメチン活性エステル 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に固相法によるオリゴヌク
レオＭ立しており、化合物〔■〕の合成には本発明者ら
の下記の方法が好ましい。 ＴｅｔｒＡｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９７９＋
３６３５（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ　８＋　５４７３（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　８＋　５４９１
（１９８０）Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒ
ｃｈ　８＋　５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｓｙｒｎｐｏｓｉｕｍ　５
ｅｒｉｅｓ７、　２８１（１９８０） １だ、上記で合成したオリゴヌクレオチドの５′−水酸
基にリン酸基を介して一級アミン基を導入する方法すな
わち、化合物［ＶＤの合成法としては、たとえば本発明
者らの％願昭５７−１３８’１３６号明細畳記載の方法
がある。 化合物〔■〕の合成法をその一実施態様について示せば
、下記のＡＩ）である。すなわち、第１図に示したよう
に、化合物ＣＤの保護基Ｒ３を除去したものと化合物〔
Ｉ〕の保険基Ｒ２を除去したものとを縮合させ、これら
の操作をくり返すととによって、化合物［１１Ｄ’ｒ合
成する。オリゴヌクレオチド化合物［１１Ｄの合成法は
、上記の通り公知である。 一方、本発明者らの方法（特願昭５７−１．３８１３６
号明細書参照）に従って、式〔■〕の化合物を合成する
。すなわち、化合物〔Ｉ〕のＲ２を除去して５′−水酸
基化合物とし、これにリン酸化剤（たとえば、ホスホジ
トリアゾリド、ホスホジクロリドまたはホスホジベンゾ
トリアシリｒ等）を作用させてリン酸化し、ついでアミ
ン基が保護されているアミノアルコール化合物Ｒ２−Ｎ
Ｈ−Ｒ−ＯＨ［この化合物はオメガ−アミノアルコール
（ＮＨ２−Ｒ１−０Ｈ）のアミノ基をＲ２で保険するこ
とにより得ることができる〕を縮合させることにより、
化合物ＣＩＶＩを得ることができる（詳細は該明細書参
照）。 この化合物〔■〕の保護基Ｒ３を除去し、化合物（ｌｌ
ｌ）の保護基Ｒ２を除去したものと４＝編合させて、化
合物〔ｖ、ｌを合成する。縮合は、化合物〔■〕の合成
の際の縮合と本質的には変らない方法で行なうことがで
きる。 このようにして合成された化合物〔■〕の保護基をすべ
て除去すれば、化合物〔臂〕が得られる。保護基Ｃ０Ｒ
４基、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフェニル
基および塩基部分のアシル基は、０．５Ｍのテトルメチ
ルグアニジンービリジン−２＝カルボアルドキシムのジ
オキザンー水（９：　１゜（ｖ／／ｖ））溶液で処理後
、アルカリ処理（濃アンモニア水）を行なうことより除
去される。Ｒ４がトリフルオロアセチル基の場合は、ア
ンモニア処理により充分脱離されるが、オルトニトロフ
ェニルスルフェニル基である場合はメルカゾトエタノー
ル処理が必要である。Ｒ４として他の保護基を用いた場
合は、オリゴヌクレオチ１部分が安定な条件で、さらに
別の処理を加えることも可能である。 なお、デオキシオリゴリボヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基のイＪ姓類およびそ
の導入ないし除去ならひに縮合その他について上記以外
の詳細は核酸の化学合成に関する成肯や総説たとえば「
ヌクレオシド・ヌクレオチドの合成」　（丸善１９７７
年）、「核酸有機化学」（化学同人１９７９年）、「核
酸」（朝食書店１９７９年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
１井、３１４３　（１９７８）、有合化、３４．７２３
　（１９７８）および化学の領域、３３．５６６　（１
９７９）等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 ビオチン−オリゴデオキシリボヌクレオチド（化合物［
’ｖｌｌ〕）は、上記化合物〔〜ＩＩ）の５′−末端延
長上の一級アミノ基にビオチンを結合させることによっ
て得ることができる。 両者の結合はビオチンのカルボキシル基と化合物〔■〕
のアミン基との間の脱水によるアミド結合の形成を実現
することのできる任意の方法によって行なうことができ
る。化合物［Ｖｌ〕中にビオチンのカルボキシル基との
反応が可能なアミノ基または水改基が存在するときは、
それらを適当に保穫した状態でこの反応を行なうことが
できる。従って、本発明で「式い１〕で示されるオリゴ
ヌクレオチド誘導体の末端アミン基にビオチンを結合さ
せて式〔■〕で示されるビオチン−オリゴヌクレオチド
を得る」という表現は、化合物〔■〕がこのように保護
されている場合をも包含するものである。 １だ、この表現は、ビオチンがその機能的誘導体の形に
ある場合をも包含するものである。ビオチンの機能的誘
導体の具体例は、その酸ハライドまたはその活性エステ
ルである。 このようｌ−に味でのアミン基とビオチンとの結合を行
なわせる一つの好ましい方法は、アミノ基とビオチン活
性エステルとの反応によることからなるものである。ビ
オチン活性エステルが好ましいのは、一般に、オリゴヌ
クレオチドの塩基部分のアミン基とは反応しないで５′
−水酸基末端延長上の一級アミノ基とのみ選択的に反応
し、しかも反応操作が簡便だからである。「ビオチン活
性エステル」とは他の官能基（通常アミノ基）と反応し
やすいエステル結合を持つビオチン誘導体を意味し、具
体的にはスクシンイミド−、バラニトロフェニル−、ペ
ンシトリアゾリド−１２，４，５−トリクロロフェニル
−エステル等がある。前二者が好ましい。 アミノ基とビオチンとの結合全行なわせる他の好ましい
方法の一つは、両者の結合を縮合剤の存在下に行なうこ
とからなるものである。縮合剤とし−ご適当なものの例
を挙げれば、ジシクロヘキシカルボジイミド、カルボニ
ルイミダシーツへ　ウッドワード試薬１１　Ｋ”等があ
る。ジシクロへキシルカルボジイミドが好せしい。 いずれの方法による場合にも、反応方法は合目的的な任
意のものでありうる。所与の反応系に対する具体的な反
応方法は、後記実験例および各種の成沓、たとえば、「
ペゾチド合成」　（丸善１９７５年）および［タン・ξ
り質の化学ＩＶＪ　　（１９７７年）を参照して適当に
定めればよい。 実験例 １）フローチャート 第２図のフローチャートに従って、本発明化合物（同図
の化合物（１０）を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 Ｂ′　ベンゾイル化アデニ／ Ｂ　アデニン ＤＭＴｒ　ジメトキシトリチル ＣＨ２−ＮＨＣＯＣＨ２Ｃ）Ｉ２− ＲＯオルトクロロフェニル Ｅｔ　　　エチル ＣＥ−シアンエチル ２ ｎ′２ 　１２ ２）化合物〔■〕（第２図の［相］）の合盛実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂（Ｃり　’］（樹
脂は相体に過ぎないが、樹脂に担持された目的化合物は
外観的には）射面そのものと変らないので、樹脂に相持
された当該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことに
する）　３００ｍｇ　（０，０３３ｍｍｏｌ）をインプ
ロノぞノール−塩化メチレン（１５：　８５、Ｖ／’Ｖ
）　ｇ液１０ｍ１で３回洗浄後、臭化亜鉛の１９、ＯＭ
のインクロパノールー塩化メチレン溶液８ｍｌで５分間
ずつ４回反応（脱トリチル化）させて樹脂［（’２））
を得る。樹脂Ｃ＜Ｑ）３をイソプロノミノール−塩化メ
チレン溶液１０ｍ１で３回洗浄し、これにジヌクレオチ
ド［（、Ｊ）：］１１５０ｍｇ（０，１ｍｍｏｌ）のピ
リジン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メシチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド（以下ＭＳ　ＮＴと
記す）　１５０ｍｇ　（０，５ｍｍｏｌ）と無水ピリジ
ン２ｍｌとを添加して９０分間反応（縮合）させる。反
応後、♂リジンｌｏｍｌで３回洗浄し、触媒液（約１０
ｍｇ）のジメチルアミノピリジン（以下ＤＭＡＰ　）を
含む無水酢酸−ビリジ７（１：９、ｆｆ／Ｖ））溶液１
０ｍ１ヲ添加し１０分間反応させて未反応５′−水酸基
をアセチル化して保画し、これをピリジンで洗浄して、
化合物〔■’］（ｎ＝２）を得る。以上のような操作を
６回くり返して、化合物〔（、す］（ｎ＝１２）を得る
。 一方、５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔（５）〕８
８００ｍｇ（０，７１ｍｍｏ　ｆ）とオルトクロｏ　７
１　二）Ｌｚホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサ
ン溶液（１，０ｍｍｏｌ、　６ｍ１）中で２時間反応さ
せ、続いてトリフルオロアセチル−６−アミンヘキサノ
ール３００ｍｇ　（１，４ｍｍｏｌ）および１−メチル
−イミダゾール１１５ｍｇ　（１，４ｍｍｏｌ）を加え
てさらに２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去し
、残漬をクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍリン
酸三水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５％の塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロロホルム層を
濃縮後、シリカゲルカラムで精製（溶出液として０〜４
％のメタノール含有クロロホルムを使用）シ、溶出液を
濃縮後インタン中に滴下し粉末状の化合物［（６））を
得る。 上記で合成した化合物〔（す：］　（ｎ　＝　１２　）
　ｉ１５ｍＬ（３，４５μｍｏ、ｌ）を前述と同様の方
法で脱トリチル化したもの〔■〕に、化合物（（，６）
）　６０ｍｇ　（０，０４ｒｎ　ｍｏ　ｌ　）をトリエ
チルアミン−ピリジン−水（１：３：１、Ｖ／Ｖ　）溶
液３ｍｌで処理（脱シアノエチル化）した化合物［（８
））を加え、無水にしたのち、ＭＳＮＴ５０ｍｇ（０，
２ｍｍｏｌ）およびピリジン１ｍｌを加え９０分間反応
（縮合）させ、反応終了後ピリジンおよびメタノールで
洗浄し、乾燥して、完全に保護されたオリゴヌクレオチ
ド誘導体〔■〕を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔（す）　１５　ｍｇ　ｆ：
０．５Ｍテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カル
ボアルドキシメイトのジオキサン−水（９：１、（Ｖ／
Ｖ）溶液２００μｌを加え、遠沈管中、室温−？ｌ’２
４時間反応させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ
１）を加えて密閉し、５０′Ｃで一夜反応させる。 反応終了後、ｆＶ５過し、Ｐ液を濃縮後、水に溶解させ
てからエーテルで抽出を行なう。水１＠を濃縮後、セフ
ァデックスＧ−５０（φ１．５ＸＩ２０ｃｍ、溶出液は
０．０５Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液ｐＨ
７，５）で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔θ
ψ〕を得た。 また同様の方法で実験１−２．１−３および１−４のよ
うなオリゴヌクレオチド誘導体を得た。 以上で合成した化合物を第１表に示す。 第１表 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニ／、Ｃはシトシンを示す。 これら４ＭｍＱ化合物の高速液体クロマトグラフィーの
結果を第３図に示す。Ａ−Ｄは、それぞれ実験１−１〜
１−４の化合物についての図である。 ３）ビオチン−ペンタデカアデニル酸〔（す〕の製造実
験２−１ 上記実験１−１で合成したペンタデカアデニル酸誘導体
〔（ゆ〕約１．００Ｄを０．１Ｍ炭１＃水素ナトリウム
水浴液（ｐＨ８，３）　１０μｌに溶解し、ビオチンス
クシンイくドエステルのジメチルホルムアミド溶液１０
　ｔｉ　１　（数百倍過剰に相当）を加えて４℃で一夜
または室温で４時間反応させて、ビオチン−ペンタデカ
アデニル酸

〔０〕を合成する。 反応の確認は、高速液体クロマトグラフィーおよび２０
チポリアクリルアミドゲル電気泳動で行なった。またそ
の際、反応性の比較のため上記で合成したオリゴヌクレ
オチド〔■〕を脱保護して得た５′−水酸基をもつ化合
物〔◇多〕も同様にビオチンスクシンイミドエステルと
反応させる。 上記実験１−２．１−３および１−４で合成した化合物
〔［相］〕についても実験２−１と同様な操作を行なっ
て各々について化合物〔（Ｄ〕を製造する。 寸た、反応の比較のため５′−水酸基をもつ化合物〔（
多〕をも製造し、化合物〔θ秒〕とビオチン活性エステ
ルとを各々反応させる。このときの実験全各々実験２−
２．２−３および２−４とした。 実験２で製造した化合物を第２表に示す。 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 以上の結果を第４および５図（高速液体クロマトグラフ
ィーの結果）および嬉６および７図（電気泳動の結果）
に示す。 第４図は高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを
示すものである。図中１は何れも反応前の化合物そのも
のの、２は何れもビオチンと化合物を振付したものの、
３は倒れも化合物とビオチン活性エステルとを反応させ
たもののクロマトグラムである。イは実験２−１で式〔
（多コの化合物、口は実験１−１で式〔（ゆ〕である化
合物、ハは実験２−２で式

〔０〕である化合物、二は実
験１−２で式〔ｑ＠〕である化合物について上記のよう
な操作を行なった際のクロマトグラムを示す。なおピー
ク上の数値は保持時間を示す。 第５図は高速液体クロマトグラフィーの浴出ノミターン
を示すものである。図中の１は倒れも反応前の化合物そ
のものの、２は何れもビオチンと化合物を混合したもの
の、３は何れも化合物とビオチン活性エステルとを反応
させたもののクロマトグラムである。ホは実験２−・３
で式〔（オ〕の化合物、へは実験１−３で式〔［相］〕
である化合や、トは実験２−４で式〔（！恥の化合物の
、チは実験１−４で式〔◇φ〕の化合物について上記の
ような操作を行なった際のクロマトグラムを示す。なお
、ピーク上の数値は保持時間を示す。 第６図は電気泳動の結果を示すものである。（ａ）、＜
Ｃ）、（ｅ）および（ｇ）は、各々実験２−２の〔０抄
〕、１−２の〔（１−９〕、２−１の〔Ｑ３）〕および
１−１の〔（１ψ〕の化合物の結果を示す。１だ、（ｂ
）、（ｄ）、（ｆ）および（ｈ）は各々実験２−２の〔
Ｏ■〕、１−２の〔（Φ〕、２−１の〔０多〕および１
−１の〔（ユ〕の各々の化合物とビオチン活性エステル
とを反応させた後の結果を示す、。 ＸＣはキシレンシアツールの、ＢＰＢｉｉ；’ロモフェ
ノールズルーのバンドをそれぞれ示し、ともに電気泳動
の標識として用いるものである。なお図中で上がマイナ
ス側、下がプラス側を示す。 第７図は′「ｄ気泳動の結果を示すものである。（ｊ）
。 （１）、（ｎ）および＜ｐ）は各々実験１−４の〔［相
］〕、２−４の〔＠〕、１−３の〔［相］〕お工び２−
３の

〔０〕の化合物の結果を示す。また、（ｉ）、（ｋ
）、（ｍ）および（０）は各々実験１−４の〔σ◇〕、
２−４の〔σ多〕、１−３の〔［相］〕および２−３の
〔（の〕の各々の化合物とビオチン活性エステルとを反
応させた後の結果を示す。 ＢＰＢは上記と同じ意味、また図中で上がマイナス側Ｊ
がプラス側を示す。 高速液体クロマトグラフィーによる結果（第４図および
５図）からみれば、弐６つで示される５′−水酸基をも
つ化合物（第４図イー１、第４図）・−１、第５図示−
１および第４図イー１）はビオチンと反応せず（第４図
イ”−３、第４図バー３、第５図ホー３、および第４図
イー１）、終始単一ピークのｔ’ｔである。それに対し
てオリゴヌクレオチド誘導体〔式［相］〕はビオチンと
反応させると、高速液体クロマトグラフィーの溶出パタ
ーンに変化が生じて、原料のピーク（第４図ローＬｉ４
図ニー１、第５図へ−１および第５図チー１）はなくな
っており、ビオチン活性エステルと反応して新しい化合
物（第４図ロー３、第４図ニー３、第５図へ−３および
第５図チー３）ができていることがわかる。な廿、第４
〜５し１０、二、へおよびチの２はビオチン活性エステ
ルと化合物〔αΦ〕とを混合し、第４〜５図イ、ハ、ホ
およびトの２はビオチン活性エステルと５′−水酸４ｆ
：もつ化合物〔（ｌ珍〕とを混合して実際に行なった反
応の前後の溶出ノミターンと対比させたものであるが、
これらを見比べてみても一級アミン基を有する化合物〔
（ゆ〕はビオチン活性エステルと選択的に反応し、５′
−水酸基をもつ化合物〔（呻〕とは反応していないこと
がわかる。 一方第６図および第７図の′電気泳動の結果から、５′
−水酸基化合物とビオチン活性エステルとの反応を見る
と（（ａ）　・（ｂ）、（ｅ）　・（ｆ）、（ｋ）’−
（１）および（０）・（ｐ）参照）、反応前（（ａ）、
（、）、＜１）および（ｐ））の・々ンドの位置と反応
後（ｂ）、（ｆ）、（ｋ）および（０））の・ぐンドの
位置に相違が見られないことより、ビオチンとの反応は
生じていないことがわかる。また、−級アミン基を有す
るオリゴヌクレオチド（（Ｃ）・（ｄ）、（ｇ）・（ｈ
）、（ｉ）・（ｊ）および（ハ）・（ｎ）参照）とビオ
チン活性エステルとの反応を見ると、反応前（（Ｃ）、
（ｇ）、（ｊ）および（ｎ））のバンドの位置と反応後
（（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）および（１１１））のバンド
の位１６とが異なっており、ビオチンと反応しているこ
とがわかる。 以上の結果より、上記で合成した一級アミン基を有する
化合物は、ビオチン活性エステルと選択的に反応してい
るこ／とがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第２図は、実験例で示した本発明化合物の製造法のフロ
ーチャートである。 第５図示−１は、実験例で示した化合物［ＶＤの高速液
体クロマトグラフィーの結果を示す図である。 第４〜５図は、いずれも高速液体クロマトグラフィーの
溶出）ξターンを示す図である。 第６〜７図は、いずれも電気泳動の結果を示す図である
。 ５３　図 う氷　↑矛　Ｂ１　間（イδ（） ５４　図 仔、衿晴間Ｃ今） ６５　図 −１へ−１トー１　　　　　　　ナー１−２ ５ ２ ５１０　　５＋０　　　５　　　Ｊ： 吸　　　　　−２へ−２ト　２　　　　　　　　　　２
左　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７２及
　　０ ８．６ ε 寸 起 く ５１０　　５１０　　　５　　１匹 Ｆ−３−３トー３　　　　　　　　　　ナー３９．２　
　　　　１１．０ ２ ５６　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １下式［：ＶＩＤで示されるビオチンーオリゴデオキシ
   リポヌクレオチＰであることを特徴とする、ビオチンヌ
   クレオチド誘導体。 １ 〔〜ｌ■〕 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０また・は任意の自然
   数であり、Ｒ１は２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残
   基であシ、ＢはヌクレオチＰを構成する塩基である（Ｂ
   が複数個存在するときは、それらは同一でも異なっても
   よい）。〕・２塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンお
   よびグアニンからなる群より選ばれたものである、特許
   請求の範囲第１項記載のとオリゴヌクレオチド誘導体。 ３Ｒ１が炭素数２〜２０のぼ鎖または分岐鎖のアルキレ
   ン基である、特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   ビオチンヌクレオチド誘導体。 ４　ｍがＯまたは６までの自然数、ｎが０筐たは４０ま
   での自然数である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か一項に記載のビオチンヌクレオチド誘導体。 ５下式［ＶＤで示されるオリゴヌクレオチド誘導体の末
   端アミン基にビオチンを結合させて下式〔■〕で示され
   るビオチンーオリゴデオキシリポヌクオチＰを得ること
   を特徴とする、ビオチンヌクレオチド誘導体の製造法。 ／−＼ ＨＮ　　　ＮＨ Ｉ 〔Ｖ旧 ６；アミノ基とビオチンとの結合をアミノ基とビオチン
   活性エステルとの反応によって行なう、特許請求の範囲
   第５項記載の方法。 ７、ビオチン活性エステルがビオチンスクシンイミトマ
   たハヒオチンー）ぞラニトロフェニルエステルである、
   特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、アミン基とビオチンとの結合を縮合剤の作用下に行
   なう、特許請求の範囲第５項記載の製造法。 ９、縮合剤がジシクロへキシルカルボジイミドである、
   特許請求の範囲第８項記載の＃進法。