JPH03500773A - オリゴヌクレオチド‐ポリアミド　コンジュゲート - Google Patents

オリゴヌクレオチド‐ポリアミド　コンジュゲート

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート本発明は、オリゴヌクレオチド −ポリアミドコンジュゲート、その製造方法、および該フンシュゲートの使用、 特に診断および治療薬としての使用に関する。
合成オリゴヌクレオチドは、分子生物学の分野において、特にＤＮＡまたはＲＮ Ａ配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして広く応用されるこ とが見い出された。通常、オリゴヌクレオチドはその５′末端に放射ラベルを有 しており、ハイブリダイゼーションの検出が可能である。細胞毒性や突然変異誘 発性などの放射ラベルされた物質に通常伴われる問題は別にすると、放射ラベル されたプローブの検出にはオートラジオグラフィー暴露が必要であり、数日を要 することも多い。さらに、放射ラベルが短い半減期を有していることもあり、こ れにより、その保存性および後の使用が制限される。
蛍光あるいは酵素リポータ−グループなどの非−放射活性プローブまたはリポー タ−グループでオリゴヌクレオチドをラベルすると、高い安全性、定めのない貯 蔵寿命および検出の容易性を含む、放射ラベルされたプローブを凌ぐかなりの利 点が得られる。
１または斥れ以上のヌクレオチド塩基を用いて（米国特許Ｎｏ、４゜６６９、８ ７６および豪州特許出願公開Ｎｏ、　１６４８４／８５）、または直接リポータ −グループをオリゴヌクレオチドの３′もしくは５″末端に結合させることによ って（欧州特許出願公開Ｎｏ、　８４１０１３９２．３および８５１０２１３０ 、３）、オリゴヌクレオチドを非−放射活性リポータ−グループでラベルするこ とが提案されていた。このような以前の提案は複雑な合成反応を包含することが 多く、オリゴヌクレオチドの相補性標的配列へのハイブリダイゼーションを遮断 することもある。
従って、相補性の標的配列に効率的にハイブリダイズし、放射活性ラベルに頼る ことなく好都合に検出することができ、そしてさらに、比較的簡単かつ都合良く 製造することができるオリゴヌクレオチドがめられている。
本発明によれば、式：Ｘ−Ｌ−Ｙ　［式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴ ヌクレオチドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末端およびオリゴヌクレ オチドＹの３゛ホスフエート基と共有結合を形成するリンカ−であるコで示され るオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートが提供される。
ポリアミドは、アミドまたはいわゆるペプチド結合によって結合したリジン、バ リン、グリシノ、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、プロリンなどの 天然のアミノ酸［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ａｌｂｅｌｔ　Ｌ、Ｌｅ ｈｎｉｎｇｅｒ、７２−７７頁］から得ることができる。別法によれば、ポリア ミドは合成アミノ酸（即ち、天然にはタンパク質中に見い出されないアミノ酸） から、または天然および合成アミノ酸の組合せによって得ることができる。本明 細書中で用いる「合成アミノ酸」なる用語は、一般式：　Ｈ，ＮＣＨＲＣＯＯＨ ［式中、Ｒはアルキルまたはシクロアルキルなどのあらゆる有機部分であり、こ れらは、不飽和もしくは部分的に飽和していてもよく、そして／または１もしく はそれ以上の異項原子またはそのような異項原子を含む基（アミド基など）で遮 断されていてもよく、モして／またはハロゲン、シアノ、アミンもしくは置換も しくは非置換フェニルもしくはベンジルで置換されていてもよいコで示されるα 、ω−アミンカルボン酸を指す。
このポリアミドは任意の数のアミノ酸単位を含んでいてよいが、それがオリゴヌ クレオチドとその標的配列のハイブリダイゼーションを妨害しないものであると いう条件のもとにあるのは勿論のことである。例示のために挙げると、ポリアミ ドは１〜１００のアミノ酸単位を含んでいよう。
このポリアミドは天然のα−アミノ酸を含有するペプチドを形成することもある 。このペプチドの配列は、オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートのあ らゆる望ましい適用に好都合なように設計することができる。このペプチドは、 後記で説明するようにリポータ−グループで誘導体化することができる１または それ以上のりジン残基を含有していてもよい。さらに、このポリアミドは抗原性 であって、従って抗体の結合によって検出可能であってもよく、これは例えば抗 体結合の検出を可能にするための適当なリポータ−グループを含んでいてもよい 。
合成アミノ酸を、例えば、リポータ−グループを有するリジンなどのアミノ酸の 間のスペーサーとして用いて、リポータ−グループの立体障害もしくは失活を回 避するか、またはオリゴヌクレオチドから大きなリポータ−グループを遠ざけて もよい。有用なアミノ酸スペーサーの例は６−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）であ る。
本発明で用いることができる合成アミノ酸には次式で示される化合物が含まれる ： ＲＯＣ（ＣＨａ）ｎＷ（ＣＨ２）ｎｌＮＨＲ”［式中、Ｒｏはｐ−ニトロフェニ ルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシおよびＮ゛−ヒドロキシスクシンイミ ジルなどの脱離基であるか、またはＲが水素であり： Ｒ′はフルオレニルメトキンカルボニル（Ｆ　ｍｏｃ）またはｔｅｒｔ−ブトキ シカルボニル（Ｂｏｃ）などのアミノ保護基であり；１００であってよい）］。
ポリアミド合成に有用なアミノ酸単位は、ポリアミドを得るために用いることが できる合成アミノ酸が、いかなる意味においても上に具体的に例示した化合物に 限定されるものではないことを理解すべきである。
ポリアミドＸを、１またはそれ以上のリポータ−グループ（検出マーカーとも呼 ばれる）、例えばビオチン、蛍光団、化学ルミネッセンス部分、酵素またはフェ リチンなどのコロイド化合物またはコロイド状の銀もしくは金でラベルすること ができる。
蛍光団リポータ−グループは以下に挙げるものから選択してよい：フルオレセイ ンー５−イソチオシアネート、ジアシル（インブチリル、アセチルまたはピバロ イルなど）フルオレセイン−５および／または６−カルボン酸ペンタフルオロフ ェニルエステル、６−（ジアシル−５および／または６−カルボキサミド−フル オレセイン）アミンへキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル、テキサス・レ ッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｉｎｃ 、の商標）、テトラメチルローダミン−５（および６）インチオシアネート、エ オシン−イソチオシアネート、エリトロ７ンー５−イソチオシアネート、４−ク ロロ−７−ニドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール、４−フルオロ−７ −ニドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール、３−（７−ニドロベンズー ２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）メチルアミノプロピオニトリル、 ６−（７−ニドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミン へキサン酸、スクシンイミジル　１２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニドロベンズ ー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノドデカノエート、７−ジ ニチルアミノー３−（４″−インチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン （ＣＰ）、７−ヒトロキンクマリンー４−酢酸、７−ジメチルアミノクマリン− ４〜酢酸、スクシンイミジル７−シメチルアミノクマリンー４−アセテート、７ −メドキシクマリンー４−酢酸、４−アセトアミド−４′−インチオシアナトス チルベン−２，２゜−ジスルホン酸（Ｓ　ＩＴＳ）、９−タロロアクリジン、ス クシンイミジル３−（９−カルバゾール １−ピレンブチレート、スクシンイミジル　１−ピレンブチレート、ｐ−ニトロ フェニル　１−ピレンブチレート、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイ ミジルアントラセン−９−プロピオネート、２−アントラセンスルホニルクロリ ド、または特定の方法で処理したときに蛍光を発する蛍光団前駆体。
酵素系のリポータ−グループは、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシ ダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルシフェラ ーゼおよび炭酸脱水酵素から選択してよい。通常、酵素は１またはそれ以上の基 質と反応して、色の変化、ルミネッセンスまたは沈澱の生成などの検出可能なシ グナルを与えるであろう。
リポータ−グループは、当分野で自体既知の常法に従ってポリアミドに結合させ ることができる。例えば、１級アミン基などのポリアミド上の核基を蛍光または 酵素リポータ−グループと反応させて、それらの間に共有結合を形成させること ができる。別の方法によれば、当分野で自体既知の２官能性のカップリング試薬 ［例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ（１９８ ７）に記載されている試薬コを用いてリポータ−グループをポリアミドに結合さ せることができる。
ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは常法によって製造することができる。
例えば、誘導体化されていないビオチンをＢＯＰ結合法［Ｃａｓｔｒｏ，Ｂ．　 ｅｔ　ａｌ．、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９７６）、　ｐｐ．７５１−７５２］ を用いてオリゴヌクレオチドに導入することができる。別法では、ビオチンをＮ −ヒドロキシスクシンイミジル活性エステルとして導入することができる。ビオ チンはリポータ−グループに結合させたアビジンを用いて検出することができる 。例えば、ストレプトアビジンーアルカリホスファターゼコンンユゲートを用い てビオチンに結合させてよい。アルカリホスファターゼは適当な基質と反応して 、視覚的に検出することが可能な不溶性の染料沈澱を生成することができる。
免疫学的な反応によってポリアミドを検出するのが望ましいときには、当分野で 周知の方法［例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，　Ｊ．　Ｌ，　（１９８６）、　Ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐ ｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ］に従い、オリゴヌク レオチド−ポリアミドフンシュゲート、ポリアミド単独、または担体分子、例え ばＫＬＨ［キーホール・ササガイ・ヘモシナフン（ｋｅｙ　ｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐ ｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙｎａｎｉｎ）］に結合したポリアミドを用いる免疫化によ って、適当な宿主動物中にポリアミドに対する抗体を生成させてよい。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的中の相補ヌクレオチド配列への ハイブリダイゼーションが可能なあらゆる所望の配クレオチドの数は、標的配列 へのハイブリダイゼーションを可能にする十分なヌクレオチドか存在している限 り重要ではない。通常、オリゴヌクレオチドは６を越えるヌクレオチドを含有し ているであろう。このオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに影響を 及ぼすことなくインビボでの半減期を長くするために適切に修飾されていてもよ い。例えば、Ａｒｇａｗａｌ　ｅｔ　ａｌ．　［Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ ａｄ．　Ｓｃｉ。
個の非−架橋酸素をイオウまたはアミンに代えることによって、オリゴヌクレオ チドを修飾することができる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドはオリ ゴヌクレオチドなる用語の範囲内である。
また、「オリゴヌクレオチド」なる用語には１個のヌクレオチドが含まれていて よい。
リンカ−しは、２官能性分子Ｒ”Ｌ”−Ｒｏｏ［式中、Ｒ′およびＲ”は同一で あるか、または異なっており、−ＮＨ，、−ＣＯ，Ｈ。
−ＯＨ１０Ｒ（ここで、Ｒはヒドロキシ保護基である）、−ＣＯ，Ｒ＜ここで、 Ｒは２−ヒドロキシピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェ ニル、ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）、Ｍｅである）または他の活性エステ ル、アシルイミダゾール、マレイミド、トリフルオロアセテート、ジケトン、イ ミドエステル、スルホネートエステル、イミン、−ＣＨ○、１．２−シクロヘキ サンジオン、グリオキサール、スルホニルハライド、α−ハロゲン化ケトン、ア ジドなどの官能基を表し、そしてＬはアルキルまたは置換アルキル基であるコか ら導かれる部分を意味する。アルキル鎖りは、ハロゲン（■、Ｂｒ、ＣＱ、Ｆ） 、ヒドロキシ、シアン、フェニル、アミノ、カルボキシ、アルキル、アルコキシ などの通常の置換基で置換することができる。さらに、リンカ−Ｌのアルキレン 鎖は、１またはそれ以上の２価の基、例えば−〇−１−Ｓ−１−ＮＨ−１−ＣＨ ＝ＣＨ−１−Ｃ＝Ｃ−、フェニル、−ＳＯ，−などで遮断することができる。し かし、官能基Ｒ′は適当な条件のもとでポリアミドのアミン末端と共有結合を形 成しつるものでなければならず、また、官能基Ｒ′″は適当な条件のもとてヌク レオチドと共有結合を形成しうるちのでなければならない。連結基Ｒ’−Ｌ−Ｒ ’″および特定のコンジュゲーフヨンの化学の選択は、得られるプローブ分子の 完全性に必須である他の巨大分子結合、即ちペプチド、グリフシトおよびホスホ ジエステル結合を保存するという要求を満たすものでなければならないのは明ら かである。
このリンカ−をα、ωヒドロキシカルボン酸誘導体から導いてもよい。
また、リンカ−しは結合であってもよいし、また、ブチロラクトンなどのラクト ンであってもよい。
さらに、本発明はオリゴヌクレオチドの３″−末端をポリアミドのアミノ末端に 連結することからなるオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートの製造方 法を提供するものである。
即ち、本方法の１態様によれば、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド部分ま たは予め調製しておいたポリアミド部分のどちらかに連結基を結合させ、次いで 残りの部分を連結基に結合させることによって、コンジュゲートを製造すること ができる。
別の方法によれば、適当な連結基前駆体を、予め調製しておいたオリゴヌクレオ チド部分および予め調製しておいたポリアミド部分に結合させてもよい。次いで 、２つの前駆体を反応させると、連結基が得られる。
別の態様によれば、本方法は、予め調製しておいたポリアミドに連結基を結合さ せ、次にこの連結基にヌクレオチド塩基を結合させ、次いで１またはそれ以上の 別のヌクレオチド塩基を順次付加してオリゴヌクレオチドを得ることからなる。
さらに別、の態様では、本方法は、予め調製しておいたオリゴヌクレオチドに連 結基を結合させ、次にこの連結基にアミノ酸を結合させ、次いで１またはそれ以 上のアミノ酸を順次付加してポリアミドを得ることからなる。
ポリアミド部分は、固体の支持マトリックス、例えば調節された（コントロール された）多孔ガラス（ＣＰＧ）などに結合させることもできる。
本発明の特に好ましい態様によれば、以下に挙げる工程からなるオリゴヌクレオ チド−ポリアミドコンジュゲートの製造方法カ提供される： （ａ）第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット（アミド結合によって互いに結合 している）のＣ−末端を、支持マトリックスと反応させてそれらを結合させ； （ｂ）次に、この支持マトリックスを、周知の固相ペプチド合成法に従い、１ま たはそれ以上のアミノ酸と順次反応させてポリアミドを得； ゛（Ｃ）この支持マトリックス−ポリアミドを、リンカ−の第１の反応性基と反 応させてポリアミドのアミノ末端とリンカ−を結合させ；（ｄ）工程（ｃ）の生 成物を、第１のヌクレオチドと反応させてリンカ−の第２の反応性基とヌクレオ チドの３°ホスフエートを結合させ；（ｅ）次いで、この支持マトリックスを、 周知の固相オリゴヌクレオチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌクレオチド と順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；そして（ｆ）所望により、オリゴヌ クレオチド−ポリアミドコンジュゲートを支持マトリックスから切断し、ポリア ミドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合したあらゆる保護基を除去し、 そして得られたフンシュゲートを精製する。
リンカ−Ｌが結合であるときには、工程（ｃ）を省略する。
ポリアミドは、例えば、固相Ｆ　ｍｏｃ法［Ａｔｈｅｒｔｏｎ、Ｒ，ａｎｄ　５ ｈｅｐａｒｄ。
Ｒ，Ｃ，、（１９８５）、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　ｐ ｐ、　１６５−１６６］または固相Ｂｏｃ法［Ｂａｒａｎｙ、　Ｇ、　ａｎｄ　 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　、　（１９８０）、　”５ｏｌｉｄ−Ｐｈ ａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙ獅■ ｈｅｓｉｓ”；”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″、第２巻、　Ｅ、Ｇｒｏｓｓ　＆ 　Ｊ、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編＋Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　ｐＰ、　１−２８４中］を用いて合成することができる°。これらの 方法においては、アミノ酸を当分野で自体既知の通常の保護基［例えば、Ｇｒｅ ｅｎ、　（１９８１）、　”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒ ｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｙｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　 Ｉｎｃ、　；　Ａｔｈｅｒｔｏｎ　ａｎｄ　５ｈｅｐｐａｒｄ、　（１X ８５）、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　ｐｐ、　１６５−１ ６６　；　Ｂａｒａｎｙ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄA上記］ で保護して反応性部分を保護する。
オリゴヌクレオチドは、固相ホスホトリエステル法［５ｐｒｏａｔ　ａｎｄＧａ ｉｔ、　（１９８４）、Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ 、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ″。
ｐｐ、　８３−１１６．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ］、固相Ｈ−ホ スホネート法［Ｐｒｏｅｈｌｅｒｅｔ　ａｌ、　＋　（１９８６）、　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４．　ｐｐ、　５３９９−５４０ ７］、または固相ホスホルアミダイト法［Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕ ｔｈｅｒｓ、　（１９８１）、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ、ｔ、　、　 ２２．　ｐｐ、　１８５９−１８６２］によって合成することができる。
これらの方法のそれぞれにおいて、ヒドロキシまたはアミ７基などの反応性基は 、文献記載［Ｇｒｅｅｎ、　（１９８１）、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕ ｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、　；　Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、　ａｎｄＣａｒ ｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｈ，、（１９８１）、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔ、　、　２２．　ｐｐ、　１８５９−１８６２　G　５ｐｒ ｏａｔ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｇａ１ｔ、　Ｍ、　Ｊ、　、　（１９８４）、　”Ｏ ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ａ@Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ″、　ｐｐ、　８３−１１６．　ＩＲＬ　Ｐ ｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ］のようにして、通常のヒドロキシおよびアミン保護 基によって保護することができる。
オリゴヌクレオチド−ポリアミドフンシュゲートの合成が終わったら、当分野で 自体既知の方法に従って脱保護を行ってよい。
本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートは、完全に保護され、 支持マトリックスに結合しているが、支持マトリックスから除去され保護された 形態であるか、または完全に脱保護された形態であってよい。これらの状態のそ れぞれが「オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート」なる用語の範囲内 にある。
支持マトリックスは、例えば、調節された多孔ガラス［アミノプロピル調節多孔 ガラス（ＡＰ−ＣＰＧ）など］またはポリスチレン樹脂などから選択してよい。
ポリアミドと結合した支持マトリックスは固体の支持体を構成し、その上でオリ ゴヌクレオチド合成が行われる。
本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートの好ましい合成法は、 大きなバッチのポリアミド（そのＣ−末端で支持マトリックスに結合している） を前もって製造することができ、そして必要なときにその一部を所望のオリゴヌ クレオチドを組立てるために用いることができ、好都合である。さらに、段階的 な合成によって、予め調製しておいたオリゴヌクレオチドを予め調製しておいた ポリアミドに結合させることによって得られる収率よりも高い、優れたオリゴヌ クレオチド−ポリアミドコンジュゲートの収率が得られることになる。
ポリアミドは通常の市販のペプチド合成機［例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。
ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、から入手可能］で合成してよ（、次いでオリゴヌクレ オチドの合成のための通常の市販のオリゴヌクレオチド合成機「例えば、Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、から供給されている合成機コに移し てよい。
１またはそれ以上のリポータ−グループを、多くの異なる段階でポリアミドに導 入することができる。このリポータ−グループはポリアミドの合成前（段階Ｉ） にアミノ酸中に存在することができ；ポリアミドの合成後（段階１ａ）に；リン カ−の付加後（段階■）に；支持マトリックス上でのオリゴヌクレオチドの合成 後（段階ＩＩＩ）に；または、脱保護および支持マトリックスからのオリゴヌク レオチド−ポリアミドコンジュゲートの精製後（段階■）に導入することができ る。選択される方法は選択されるリポータ−グループおよび合成方法に依存する であろう。
リポータ−グループがペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成の両方の条件に安 定であるときには、これを誘導体化されたアミノ酸としてポリアミド合成の始め から導入することができる（段階１ａ）。
ＤＮＡ合成の条件には安定であるがペプチド合成の条件には安定ではないときに は、これをポリアミドの合成後に導入することができる（段階Ｉまたは■）。リ ポータ−グループがペプチドまたはオリゴヌクレオチド鎖の組立のどちらにも安 定ではないが脱保護方法に安定であるときには、完全に保護されたポリアミド− オリゴヌクレオチドコンジュゲートのオリゴヌクレオチド鎖の組立の後に導入す ることができる（段階■）。これらの方法は、ポリアミド−オリゴヌクしオチド フンジーゲートが固体の支持体上にあるままでラベルが導入され、従って過剰の リポータ−グループを用いることができ、反応後に過剰量を簡単に洗い落とすこ とができるので好都合である。
ラベルがフンシュゲートの合成に用いるどの条件にも安定ではないときには、精 製され完全に脱保護されたポリアミド−オリゴヌクレオチドフンシュゲートとの 液相反応において導入することができる（段階■）。
蛍光団は、Ｉ〜■のいずれかの段階でオリゴヌクレオチドーボリアミドコンンユ ゲートに導入することができる。これはビオチンの場合も同様である。
酵素、およびコロイド状化合物（コロイド状金、コロイド銀あるいはフェリチン など）は段階■で導入することができる。
オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートのポリアミド部分は、得られる 検出シグナルを増大させ、従って検出を容易にする複数のリポータ−グループを 含んでいてもよい。
コンジュゲートのポリアミド部分はリポータ−グループを結合するための媒体と して機能するだけでなく、ポリアミドを特定の細胞型、細胞位置に向けさせるた めのアドレス・マーカーとしても作用するか、またはオリゴヌクレオチドの細胞 膜の通過を増強することもある。ペプチド配列のアドレス・ラベル活性はよく調 べられている［Ｖｅｒｎｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈａｔｚ、（１９８Ｂ）、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４１．１）ｌ）、１３０７−１３１３；およびＧｏｌｄｆａｒｂ　 ｅｔ　ａｌ、、（１’９８６）、　Ｎａｔｕｒｅ　３２２．　ｐｐ、６４１−６ ４４］。例えば、細胞表面受容体によって認識されるペプチド配列を選択するこ とによって、該ペプチド配列にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを特定の 細胞型中に運搬することができ、ここでこれらは生物学的作用を発揮することが できる（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合にはウィルス性または 細胞性ＲＮＡの転写をブロックする）。
本発明の別の態様においては、ウィルス性、細菌性、またはその他の疾病の治療 方法であって、そのような治療を必要としている患者に本発明のオリゴヌクレオ チド−ポリアミドコンジュゲートの治療学的有効量を投与することを特徴とし、 さらに、このフンシュゲートのオリゴヌクレオチド部分が特定のウィルス性、細 菌性または他のポリヌクレオチドに相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチ ドであって特定のポリヌクレオチドの転写または翻訳をブロックするものである ことを特徴°とする方法が提供される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダ イゼーションによって、ウィルスまたは細菌の完全性または増殖に関係している ウィルス性または細菌性タンパク質の合成および／または毒素の合成を阻害する ことができる。
「他の疾病」と言及したのは、細胞にとって内生の遺伝子の発現による疾病状態 に関係している。例えば、ｍｙｃタンパク質などの細胞転換を引き起こすか、ま たはそれに関与しているタンパク質をコードしているｍＲＮＡを、適切なアンチ センスオリゴヌクレオチドを有する本発明のポリアミド−オリゴヌクレオチドフ ンシュゲートで不活化することができる。
オリゴヌクレオチドの治療学的有効量とは、目的のポリヌクレオチドの転写また は翻訳をブロックする量である。この量は、目的のポリスクレオチドの量および ／またはその合成速度、コンジュゲートの細胞取込み速度および／またはその安 定性、および治療しようとする対象の体重および年齢に応じて変化するであろう 。それぞれの場合において、治療学的有効量は診断を行う医師または獣医の決定 に基づくであろう。
また、オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートのポリアミド部分は、オ リゴヌクレオチド部分を細胞性の分解から安定化するように作用することもある ［Ｌｅ　Ｍａｉｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　（１９８７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　８４．ｐｐ、６４１−６５２コ。
さらに、オリゴヌクレオチド部分はポリアミドの性質を高めることもある（例え ば、その溶解性を改善するなど）。
本発明のさらに別の態様によれば、式：　Ｚ−Ｘ−Ｌ［式中、Ｚは固相マトリッ クスを表し、ＸはそのＣ−末端で固相マトリックスに結合したポリアミドを表し 、そしてＬはポリアミドのＮ−末端に結合される第１の反応性基、およびヌクレ オチドの３”ホスフェートと結合することができる第２の反応性基を有する２官 能性のリンカ−を表す］で示されるポリアミドが提供される。
このポリアミドは本発明のフンシュゲートの合成における中間体である。オリゴ ヌクレオチドを、２官能性リンカ−Ｌの第２の反応性基上で直接合成することも できる。
本発明のフンシュゲートは、標的試料中の特異的なりＮＡまたはＲＮＡ配列の検 出のためのハイブリダイゼーションプローブとして重要な用途を有している。オ リゴヌクレオチドの標的配列への結合を、ポリアミドに結合させたリポータ−グ ループによって、またはポリアミドに結合している抗体によって検出する。従っ て、本発明のコンジュゲートは、ウィルス（例えば、ＡＩＤＳウィルスまたは肝 炎ウイ、ルスなど）の核酸、細菌の核酸、または遺伝的障害（例えば、筋ジスト ロフィーまたは資性線維症など）に関係しているＤＮＡの検出に用いることがで きる。本発明のコンジュゲートを、ニトロセルロース、誘導体化した紙またはナ イロンメンプランなどのマトリックスに結合させた標的配列への／％／ｌ’ブリ ダイゼーションに用いることができる。別法では、本フンシュゲートを組織片へ のその場でのハイブリダイゼーションに用いて（「ハイブリダイゼーション組織 化学」としても知られる）、組織片中の標的ポリヌクレオチドを検出することが できる。
一本発明の別の態様においては、生物学的試料中の特定のウィルス性、細菌性ま たはその他のポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するための方法であっ て、核酸試料を本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート（ここ で、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に 相補性である）と接触させ、次いでフンシュゲートのハイブリダイゼーションが 起こるかどうかを検出することを特徴とする方法が提供される。
生物学的試料は、生物学的液体（血液または血漿など）、細胞（リンパ球など） 、または組織バイオプシーからなっていてよい。試料からの核酸、即ちＤＮＡま たはＲＮＡは、当分野で自体既知の方法に従って抽出し、そしてフンシュゲート で検出してよい。コンジュゲートはそれ自体がハイブリダイゼーションの検出用 のリポータ−グループでラベルされていてもよく、またそれとは異なり、標的ポ リヌクレオチドに結合したコンジュゲートを、例えば抗体試薬を用いて適切に検 出することもできる。
本発明のさらに別の態様においては、支持マトリックスに固定化されたか、また は他の方法でそれに結合している特定のポリヌクレオチドを検出するための方法 であって、支持マトリックスを本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジ ュゲート（ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレ オチドの一部に相補性である）と接触させ、次いでコンジュゲートの支持マトリ ックスへのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする方法が提供され る。
また、本発明の別の態様においては、動物または植物組織中の特定のポリヌクレ オチド群の存在および位置を測定するための方法であって、 （ａ）被験組織片を調製し； （ｂ）この組織片を本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート（ ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一 部に相補性である）とハイブリダイズさせ； （ｃ）組織片からハイブリダイズしていないプローブ物質を除去し；そして （ｄ）フンシュゲートのハイブリダイゼーションによってラベル化された組織片 中の位置を検出するか、または同定すること；を特徴とする方法が提供される。
さらに別の本発明の態様においては、目的のポリヌクレオチドを検出するための 診断用キットであって、本発明のオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲー ト（ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は目的のポリヌクレオチ ドの一部に相補性である）；およびコンジュゲートのハイブリダイゼーションを 検出するための試薬からなるキットが提供される。
そのような診断用キットは組織片調製のための試薬をさらに含有していてもよい 。そのような試薬の例はホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよび酢酸であ る。
以下に実施例および図面を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこ れらに限定されるものではない。
第１図は、固相ペプチド合成の反応工程を示すものである。
第２図は、オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲート製造の反応工程を示 すものである。
第３図は、変性２０％ポリアクリルアミドゲルでの、３″Ｐで末端ラベルした粗 製のＫ　Ｐ　Ｔ　Ｂ　−（Ａ　Ｉ’ａＬ　ｙｓ）、　−Ａ　ｌａ（レーン１）お よび正常なＫＰ　Ｉ　Ｂ（レーン２）の電気泳動分析を示すものである。
第４図は、ビオチンラベルしたポリアミド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート を用いるドントブロソトハイブリダイゼーションを示すものである。ＮＣはネガ ティブ対照を示す。
第５図は、雄性マウス顎下腺の６μＭ凍結切片にハイブリダイズするビオチンラ ベルしたポリアミド−カリクレインオリゴヌクレオチドを示すものである。暗い 領域はフンシュゲートのハイブリダイズ（以下、余白） 実施例１：試薬の合成 ４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム（１，２６ｇ：　１Ｏｘモル）および４゜４°− ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣ（り（３−３９９：　ｌ　Ｏｘモル） をピリジン（３０１ｇ）中で１６時間撹拌した。４−ニトロフェノール（１，３ ０９；　１　Ｏｘモル）およびジシクロへキシル力ルポジイミ）’（ＤＣＣ）（ ２，０６ｇ；　１０ｊＩ−Ｅル）を加え、さらに２日間撹拌した。この反応混合 物を濾過し、次いで溶液を濃縮し、２５％ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを用いてシ リカゲル（７０ｇ）のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ淡黄色の油状物を 得た（５．０９；９５％）。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＱＪ：δ２．０４　（ｍ、　２　Ｈ，Ｈ３）、２．７（ｔ、 Ｊ＝７　、２　Ｈｚ、２　Ｈ、Ｈｔ　）、３．２　（ｔ　、Ｊ　＝　５　、９　 Ｈｚ、２　Ｈ、Ｈ４）、３．７７（ｓ、６Ｈ，ＯＣＨ，）、６．８　７．５（ｍ 、１５Ｈ，ＡｒＨ）、８．２（ｄ。
Ｊ＝９．２Ｈｚ、２Ｈ，ＰｈＮ０．ｍ−Ｈ）。
”ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１２−）：δ２５．２（Ｏ３）、３１．６（Ｃ２）、５５． ２（ＯＣＨ，）、６２．０（Ｃ４）、８６．０　（ＣＡｒ５）、１１３．１．１ ２６．８．１２７．１．１２７．８．１２７．９．１’２８．１．１２９．１． １３０．０．１３６．２．１４５．０．１５８．４’　（ＤＭＴｒ）、１２２． ４．１２５．１．１４５．２．１５５．４（ＰｈＮＯ２）、１７１゜１（Ｃｏ、 ）。
この生成物は若干のＥｔＯＡｃ溶媒を含んでいた。
この化合物は、ピキシルクロリド（ＰｘＣのをジメトキシトリチル融点：１３０ −１３０．５°Ｃ（ＥｔＯＡｃ）。
’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃｆ２Ｊ　：δ１．９８（ｍ、２Ｈ，Ｈ３）、２．７ （ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ，Ｈ２）、３．０（ｔ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、２Ｈ，Ｈ ４）、７゜０　７．５（ｍ、１５Ｈ，ＡｒＨ）、８．２（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、 ２Ｈ，ＰｈＮ０．ｍ−Ｈ）。
Ｉ３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＱ３＞：６２５．０（Ｃ３）、３１．．５（Ｃ２）、６１ ．８（Ｃ４）、７５．４　（Ｃｐｈ、）、１１６．３．１２３．２．１２３．５ ．１２６．４．１２６．６．１２７．９．１２９．１．１２９．４．１．４８． ９．１５１．３（ＰＸ　Ｃ）、１２２４．１２５．−１．１４５゜２．１５５． ４（ＰｈＮＯ，ｃ）、１７１．０（Ｃｏ、）。
元素分析値（Ｃ，，８，３ＮＯ，とじて）：ＨＮ 計算値：　７２．３　４．８　２．９ 実測値：　７２．０　４．４　３．２　。
３−［６−（４，４°−ジメトキシトリチルオキシ）へキシルカルバモイル］フ ロパン酸４−ニトロフェニル（２）ピッジン（１０村）中の無水フハク酸（１， ０９；　１０ｘモル）および６−アミノヘキサノール（１，１７ｉｉ；　１０ｘ モル）を４ｄ撹拌した。
次いで、ＤＭＴｒＣ（（３，３９ｇ；　１０ｘモル）を加えてさらに４時間撹拌 し、続いてｐ−二トロフェノール（１，３９ｇ：　１０ｘモル）およびＤＣＣ（ ２，０６１ｊ：　１０＋モル）を加え、この混合物をさらに２ｄ撹拌した。反応 混合物を濾過し、溶液を濃縮し、５０％ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを用いてシリ カゲル（１００ｇ）のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ淡黄色の油状物を 得た（４．０９９；　６４％）。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｅ３）：６１．２　１．７（ｍ、８Ｈ，ＣＨｔ）、２．５（ ｔ、　Ｊ　＝６．５Ｈｚ、　２Ｈ，ＣＨ，）、２．９３（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、 ２Ｈ’。
ＣＨ，）、３．０１（ｔ、Ｊ＝６−４Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨ２）、３．２（ｔ、Ｊ＝ ６゜４Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨＪ、３．７６（ｓ、６Ｈ，ＯＣＨ３）、６．８−７．５ （ｍ。
１５Ｈ，ＡｒＨ）、８．２（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、２Ｈ，ＰＨＮＯｔ　ｍ−Ｈ） 。
１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｆ２３）：δ２５．８３．２６．６９．２９．５３．２９ ．８７．３０．５５（ＣＨ，）、３９．６８（ＣＨ，ＮＨＣＯ’）、５５゜１４ （ＯＣＨ３）、６３．１６（ＤＭＴｒＯＣＨ，）、８５．６０（ＣＡｒ３）、１ １２．９１．１２６．５３．１２７．６４．１２７．７０，１２７゜７９．１２ ８．１０．１２９．０７．１２９．’９５．１３６．６０．１４５．３２．１５ ８．２６（ＤＭＴｒ　Ｃ）、１２２．４．１２５．１．１４５．３１．１５５． ８（ＰｈＮＯ，Ｃ）、１７０．４９．１７０．７５（Ｃ＝○）。
この化合物は容易に除去することができないＥｔＯＡｃ溶媒を若干含んでいた。
Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−６−アミノへ牛すン酸ペンタフルオロフ ェニル（ＦｍｏｃＡｈａＯＰｆＰ：　３）６−アミノヘキサン酸（２，６２９； 　２０３ｊモル）およびＮａ、Ｃｏ３（５，３０９；５０ｘモル）をＨ，０（６ ０ｉのに溶解し、次いでジオキサン（２５ＲＱ＞を加え、続いてｒｌ−（フルオ レニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＮＨ３）（６， ７５ｇ：　２０ｘモル）を加えた。
この混合物を１６時間激しく撹拌した。次いで、この濁った反応混合物をＨ，０ （１，２１２）に注ぎ、透明な溶液を得た。この溶液をＥｔＯＡｃ（２ｘ　３０ ０ｘ（りで抽出し、水層を濃ＨＣＩ！（約１０ＲのでｐＨ３まで酸性化して多量 の沈澱を得た。これを１６時間、４°Ｃに保ち、次いで濾過して６．０５ｇ（８ ６％）のＦ　ｍｏｃＡ　ｈａｏ　Ｈを得た。
ＤＭＦ（８３１＋２）中のＦｍｏｃＡｈａＯＨ（１，７７９；５ｘモル）および ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ：　１．０１ｇ；　５．５ｘモル）の溶液に 、ＤＭＦ（２好）中のＤＣＣ（１，０３９；　５ｘモル）の溶液を加えた。この 溶液を１６時間撹拌し、濾過し、濾液を真空下で蒸発乾固させて粗製のエステル を得、これを９５％ＥｔＯＨ／１％Ａｃ０Ｈ（約ｌＯπＱ）から再結晶して２． ４１９（９３％）の白色針状結晶を得た。
融点＋１２８−１２９°Ｃ０ ’ＨＮＭＲ（ＣＤ　Ｃ（！ｓ）　：δ１．４−１．８（ｍ、６Ｈ，ＣＨ，）、２ ．７（ｔ　、　Ｊ　＝　７　、２　Ｈｚ、２　Ｈ、ＣＨｔ　ＣＯ−）、３．２（ ’ｍ、２Ｈ，ＮＨＣＨ，）、４．２（５，Ｊ　＝６．７Ｈｚ、　Ｉ　Ｈ，Ｆｍｏ ｃ　ＣＨ）、４．．４（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈ２，２Ｈ，Ｆｍｏｃ　ＣＨｔ）、７． ．３　７．８（ｍ、８Ｈ，Ｆｍｏｃ　ＡｒＨ）。
”ＣＮＭＲ（ＣＤＣｅ、）：δ２４．３６（Ｃ４）、２５．９３（Ｃ３）、２９ ．６２（Ｃ５）、３３．１８（Ｃ２）、４０．７３（Ｃ６）、４７．３１（Ｆｍ ｏｃＣ）、６６．５４（Ｆｍｏｃ　ＣＨ，）、１１９．９８．１２５．００゜１ ２７．０２．１２７．６７（Ｆｍｏｃ芳香族ＣＨ）、１４１．３４．１４３．９ ９（Ｆｍｏｃ芳香族Ｃ）、１５６．４６（Ｆｍｏｃ　Ｃ＝Ｏ）、１６９゜３６（ エステルＣ０２）。
元素分析値（Ｃ，、Ｈ，、ＮＯ，Ｆ５として）：ＣＨＮ 計算値：　６３．８　２．２　２．８ 実測値：　６３．９　１．８　３．２゜Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボ ニル−６−アミノヘキサノイル）−６−アミノヘキサン酸（Ｆ　ｍｏｃＡｈａ、 ＯＨ；　６）ＤＭＦ（８ｘｇ）中のＦ　ｍｏｃＡ　ｈａｏ　Ｈ（上記のようにし て調製；１，７７９；　５ａモル）オよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０゜ ５７５９；５Ｈモル）の溶液に、ＤＭＦ（２ＲＩ２）中のＤＣＣＣｌ、０３９： 　５３１モル）の溶液を加えた。これを１６時間撹拌し、濾過し、そして濾液を 真空下で蒸発させてシロップを得た。これをイソプロパツール（〜１０　ＭＱ＞ から再結晶して１．９４ｉｉ（８６％）の５を得た。
ジオキサン（ＩＭ）中の５（０，９１２ｉｉ；　２ｘモル）の溶液に、Ｈ２Ｏ（ １０ｘ１２）中の６−アミノヘキサン酸（０，５２４９；４３１モル）およびＮ ａｚＣＯｓ（０，４２４９；　１モル）を滴下した。得られた懸濁液を４８時間 激しく撹拌し、次いでＨ，０（１００Ｒの中に注ぎ、透明な溶液を得た。この激 しく撹拌している溶液のｐＨを１Ｍ　ＫＨ３Ｏ，（１０Ｒのの滴下によって３ま で下げた。多量の沈澱が生成し、これを２４時間、４°Ｃに保ち、次いで濾過し て定量的収率の酸を得た。この粗製の生成物をＥｔＯＡｃから再結晶して０．６ ７９９（７３％）の白色粉末を得た。
融点：１０６．５−１０７°Ｃ０ ’ＨＮＭＲ（ＣＤｓＯＤ）　：　６１．３　１　、７　（ｍ、１２　Ｈ１内部Ｃ Ｈ，）、２．１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨ，Ｃ０ＮＨ）、２．３（ｔ； Ｊ＝７゜３　Ｈｚ、　２　Ｈ、ＣＨｚ　Ｃ○、Ｈ）、３．０−３．２（ｍ、４Ｈ ，ＦｒｎｏｃＮＨＣＨ。
およびＣＨ，Ｃ０ＮＨＣＨ，）、４．２（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、ＬＨ，Ｆｍｏｃ ＣＨ）、４．３（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ，Ｆｍｏｃ　ＣＨ，）、７．２−７ ．８（ｍ、　８　Ｈ，Ｆ　ｍｏｃ　ＡｒＨ）。
元素分析値（ＣｚｔＨｓ−Ｎ　ｔｏ　ｓとして）：Ｃ’ＨＮ 計算値：　６９．５　７．４　６．０ 実測値：　６９．２　７．３　５．８゜Ｎ−（Ｎ−フルオレニルメトキシカルボ ニル−６−アミンヘキサノイル）アミノへキサン酸ペンタフルオロフェニル（Ｆ 　ｍｏｃＡｈａ、ＯＰ　ｆｐ　；０７ｚ／−ル（ｌ　Ｑ　ｌａ９；　０．５５Ｈ モル）の溶液に、ＤＣＣ（１０３３１液を真空下で蒸発させてクリーム状の固体 とし、これを９５％ＥＴＯＨ／１％ＡＣＯＨ（ＩＪＩのから再結晶して１８０１ Ｒｇ（５７％）の純粋な土を得た。
融点：１２６−１２７℃。
Ｎ　−ｔｅｒｔ〜ブト牛ジカルポジカルボニルミンへキサン酸ペンタフルオロフ ェニル（影） ＥｔＯＡｃ（５０１り中のＮ−Ｂｏａ−６−アミノへキサン酸（４，７８９；２ ０．８１１１％ル）およびペンタフルオロフェノール（３，６８ｙ；２０１モル ）の溶液にＤＣＣ（４，１２ｇ；２ｏｊ１モル）を加えた。コレラ１６時間撹拌 し、次いで濾過し、濾液を真空下で蒸発させてシロップにした。これを放置して おくと結晶化して７．４６９（９４％）のエステルが得られた。インプロパ／− ル／１％酢酸がら再結晶して６゜２６ｇの白色針状結晶を得た。
融点：８１−８３°Ｃ０ ’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ＣＣ３）：δ１．４　１．６（ｍ、１５Ｈ２ＢｏｃＣ Ｈｓ５（ｂ、ＬＨ，ＮＨ）。
Ｉ３ＣＮＭＲ（ＣＤＣρ３）：δ２４．３８（Ｃ４）、２６．００（Ｃ３）、２ ８．３９（Ｂｏｃ　ＣＨ３）、２９．７０（Ｃ５）、３３．２０（Ｃ２）、４０ ．２８（Ｃ６）、７９（ＢｏｃＣ）、１５６（Ｂｏｃ　Ｃ＝Ｏ）、１６９　（Ｃ Ｉ）。
元素分析値（Ｃ、、Ｈ、。Ｎ　Ｏ−Ｆ　ｓとして）：ＣＨＮ 計算値：　５１．４　５．１　３．５ 実測値：　５１．５　５．０　３．４　。
Ｎ　（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキ／カルボニル−６−アミンヘキサノイル）−６−ア ミノへキサン酸ペンタフルオロフェニル（ＢｏｃＡｈａｔＯＰ　ｆｐニジ） ＩＭ　Ｎａ０Ｈ（５ｘ＋２；　５１モル）およびＨ，０（Ｓｆｆ□中の６−アミ ンへキサン酸（１，３１９；　１０ｍモル）ノ溶液に、ジオキサ７（１０ｄり中 の８（１，９９ｇ；　５３１モル）の溶液を加えた。得られた微細な懸濁液を激 しく３ｄ撹拌すると透明になった。この溶液をＨ，０（２００＝ｆ２）ニ加え、 ＩＭのＫＨ８Ｏ，（約１．０　ｘのの滴下によってそのｐＨを３．５まで下げ、 得られた溶液をＥ　ｔｏ　Ａｃ（３ｘ　１　ｏＯｘｆ２）で抽出し、乾燥しくＮ ａｖＣＯ４）、そして真空下で３１１２になるまで濃縮した。次いで、さらにＥ ｔＯＡｃ（１，０ｚ（りを加え、続いてＤＣＣ（１，０３９；５Ｈモル）を加え た。これを１６時間撹拌し、濾過し、濾液を真空下で蒸発乾固し、生成物を１％ ＡｃＯＨ含有のＥｔＯＨ／Ｈ，Ｏ（約１０１のから再結晶して１．７５９（６７ ％）の白色針状結晶を得た。
融点：８８−．８９°Ｃ０ ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１２３）：δ１．３　１．９　（ｍ、２Ｈ，ＣＨ，およびＢ 　ｏｃ　ＣＨ３）、２．２（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨ，ＣＱＮ、Ｈ）、 ２゜７（ｔ、Ｊ＝＝７．３Ｈ２，２Ｈ，ＣＨ，Ｃｏ、）、３．１　（ｍ、　２　 ＨｌＢｏｃ　Ｎ　Ｈ郊、）、３．３（ｍ、２Ｈ，Ｃ０ＮＨＣＨ２）、４．６（ｂ ｓ、　１．Ｈ，Ｂｏｃ　ＮＨ）、５．６　（ｂｓ、　Ｌ　Ｈ，ＣＯＮ、Ｈ）。
”ＣＮＭＲ（ＣＤＣρ３）：δ２４．３５．２５．３１．２６．１０．２６．４ １．２９．３１．２９．８３．３３．１７．３６．６２．３９゜１４．４０．３ ５　（ＣＨ，）、２８．４４．　（Ｂｏｃ　ＣＨ，）、７９．１２（Ｂｏｃ中心 Ｃ）、１５６．０５（Ｂｏｃ　Ｃ＝○）、１６９．３９（エステルＣ−０）、１ ７２．８４（アミドＣ−〇）。
元素分析値（ＣｚａＨｓ＋Ｎｔ○ｓＦｓとして）：ＨＮ 計算値：　５４．１　６．１　５．５ 実測値：　５３．９　５．９　５．８　。
ジイソブチリル−５（および６）−カルボキシフルオレセイン、ペンタフルオロ フェニルエステル（７） 無水トリメリド酸（９，６ｇ；　０．０５モル）およびレゾルシノール（１１９ ；　０．１１モル）を十分に混合し、１９０’Ｃの浦浴に１時間入れた。次いで 、温度を２１０°Ｃまで上げ、その温度に５時間保つと、溶融物が暗赤色の固体 に固化した。次に、これを冷却し、ＤＭＦ（５Ｃ）ｍρ）に溶解した。この溶液 にピリジン（１００ｚ（りおよび塩化インブチリル（１５，４ｘＱ：　０．１５ モル）を加え、これを２４時間撹拌した。濾過した後、得られた濃厚なシロップ をＥｔＯＡｃ（４０ＲＱ）に再溶解し、ＩＭ　Ｈ，ＳＱ、（２ｘ３００ｘのおよ びＨ，Ｏ（１ｘ　３００ｍので洗浄し、乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、そしてもう一 度濃縮してシロップにした。これをＣＨｔＣＩ２．に再溶解し、シリカゲルカラ ム（１７０ｇ）のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ、最初はＣＨ，ＣＱｔ （８００１ので、次いで２％Ｍ　ｅ　ＯＨ／　ＣＨｔ　ＣＱ　！で溶離した。生 成物を含む分画を集め、溶媒を真空下で除去すると１２．４５９（４，８％）の 粗製のジイソブチリル−５（および６）−カルボキシフルオレセインが得られた 。
この物１ｔ（５，７７ｆｌ：　１１ｍモル）およびペンタフルオロフェノール（ ２，３２９；　２１．１ｍモル）を１／１のＥ　ｔ　ＯＡ　ｃ／　ＣＨｔ　ＣＱ 　ｔ　（１２５ｉｃ）に溶解した。この溶液を４℃まで冷却し、ＤＣＣ（２，５ ９；　１２．１ｍ１モル）を滴下した。これを２時間撹拌し、次いで濾過し、溶 媒を真空下で除去して油状物を得、これを−晩、−２０’Ｃにして固化させた。
これをＣＨ！　ＣＱ　−（５０ｍのに再溶解し、シリカゲル（１５０９）のフラ ッシュ・クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ７ＣＱ２で溶離した。生成物を含む分 画を集め、溶媒を真空下で除去し、生成物を９５％ＥｔＯＨ／２％酢酸から再結 晶すると３．６８９（５９％）の白色針状結晶が得られた。
融点：、１８４−１８８℃。
ｔｉｅ（ＣＨｔＣσ、）にかけると、この物質は、２つの異性体に対応するＲｆ ｏ、５８および０．６３の２つの近接して移動するスポットを与えた。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｆｆ３）：δ１．３１　（ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１２Ｈ，Ｃ Ｈ３）、２．８（ｓｅｐｔｅｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨ（ＣＨａ）ｔ　） 、６．８３（ｓ＋４Ｈ＋１４＋’およびＨ！′）、７．１１（ｓ、２Ｈ，Ｈａｏ ）、７．３８（ｄ。
Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｑ、５Ｈ９５−異性体のＨ７）、７．９６（Ｓ、０．５Ｈ，６ −異性体のＨ，）、８．２０（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、０．５Ｈ，５−異性体のＨ ，）、８．５（ｍ、　Ｉ　Ｈ，６−異性体のＨ４およびＨ，）、８．８７（ｓ、 ０゜５Ｈ２５−異性体のＨ，）。
Ｉ３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＱ、）：δ１８．８２．３４．１８．８２．１１．８２． ２４．１１０．６１．１１５．０７．１１５．１１．１１８．００．１２５．０ １．１２５．８９．１２６．３６．１２７．０５．１２８．０８．１２８．７１ ．１２９．２８．１３０．９２．１３２．２３．１３３．３０．１３６．３２． １３７．０５．１３８．２．１３９゜６２．１４１．８．１４２．８４．１５１ ．４６．１５１．５１．１５２．６６．１５３．４１．１５８．２１．１６１． ０６．１６７．５０．１７４．９４゜ 元素分析値（Ｃａ、Ｈｔ−Ｆ　ｓＯ−として）：ＣＨ 計算値：　６１．６　３．４ 実測値：　６１．５．　３．０　。
この物質は分析的に純粋であり、フルオレセインラベル化実Ｍで用いる物質なの で、これを用いてカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）のスペクトル特性を測定し た。０、ＬＭ　ＮＨ，○Ａｃ（ｐＨ９，０）中の入の１ＭＭ溶液を３ｄの間装置 してムをＣＦ核に分解し、スペクトルの測定を行った。４９５および４９６ｎｍ でのこの溶液の消衰係数７５０００Ｍ−’であり、２６０ｎｍでは２３０００Ｍ −’であった。２６０ｎｍでの同じ溶液中の放出ペンタフルオロフェノキシドの 消衰係数は極めて低く　（１７０Ｍ−′）、上記の吸収係数の誤差範囲内であっ たので、考慮に入れなかった。また、この溶液をフルオレセイン含有のポリアミ ド−オリゴヌクレオチドハイブリッドの蛍光収率のための標準対照として用いた 。
ＩＨおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、内部対照としてテトラメチルシランを用 い、それぞれ３００および７５ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ　ＡＭ３００で記録した。
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を減圧下で蒸留し、１〜２日以内に用いた。ピ リジンは水酸化カリウムから蒸留し、５Ａのモレキュラー・シーブ上で保存した 。融点は、Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ　Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｐｏ１ｎｔ　Ａ ｐｐａｒａｔｕｓを用い、一方が開いたキャピラリー中で測定した。フラッシュ ・クロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ　Ｋｉｅｓｅ１ｇｅｌ＃９３８５を用いて行 った。
実施例２：ペプチド合成 Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）ペプチド合成法を用いて、複数の りジン残基（後に、非−放射活性ラベルの結合部位として用いることができる） およびアラニン残基（リジン残基の間のスペーサーとして働く）を含有するペプ チドを合成した。このペプチドは配列（Ａ］ａＬｙｓ）ｓＡｌａを有している。
調整された多孔ガラス（ＣＰＧ）をペプチド合成のための固体支持マトリックス として用いた（この支持体はペプチド合成には普通ではないが、オリゴヌクレオ チド合成に選択した支持体であるので）。
第１図に示すように、アミンプロピルＣＰＧ（ＡＰ−ＣＰＧ）をＡＩＮ導体化し て、この固体支持マトリックスに結合した遊離のヒドロキシ基を得た。ＡＰ　Ｃ ＰＧ（Ｆｌｕｋａ、孔の大きさ５００Ａ、０．５１ｉ１．２０ｕモルのアミノ基 ）に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２ｆｆ１２）中のジメチルアミノピリ ジン（ＤＭＡｐ＞＜３０．５η；２５０μモル）およびα、ω−ヒドロキシカル ボン酸誘導体旦、旦まタハλく２５０μモル）を加えた。これを３時間振盪する か、または１６時間放置した。次いで、このＣＰＧを洗浄し、そして乾燥した。
官能基化の程度を、少量のＣＰＧの酸処理によって放出されるジメトキシトリチ ル（λ−５０７ｎｍ、ε−６６５００Ｍ−’）またはビキシル（λ−４４５ｎｍ 、ε−４７７０Ｍ−りの分光光度検定により定量する。次いで、残存のアミ７基 （約１０〜２０％）を、ピリジン（２村）中で１５分間、ＣＰＧを無水酢酸（Ａ ｃ、０）（０，５ｘ（！；　２．５ｘモル）およびＤ　Ｍ　Ａ　Ｐ　（５０ｕ： ０．４ｘモル）で処理することによってアセチル化する。残存する有意なアミン 基は検出されなかった。次いで、ＣＰＧをＣＨ。
ＣＱ、中の３％ジクロロ酢酸（２ｘ５分）で処理し、ＣＨ，Ｃ１２２で洗浄した 。
別法では、γ−ブチロラクトンを用いてＣＰＧを誘導体化した。
この場合、ＣＰＧ（０，５９）およびγ−ブチロラクトン（：Ｍ）を７日間、６ ０’Ｃのオーブン中に置いた。
次に、この修飾した固体支持体をペプチド合成に用いた。最初のアミノ酸を結合 させるために（エステル結合の生成）、高濃度の活性アミノ酸を用いた。即ち、 誘導体化したＣＰＧ（１００π９：２．７μモルのヒドロキシ官能基を含む）を 、ＤＭＦ（２Ｊ！（り中のＮ−ＢＯＣ−アラニン対称無水物およびＤＭＡＰ（そ れぞれ０．２Ｍ）の溶液と２０時間反応させた。上述のようにＡｃ、Ｏ／ＤＭＡ Ｐを用いて残存のヒドロキシ基をアセチル化し、アラニンを脱保護して遊離のア ミン基を得た（２５μモル／ｇ）。９０％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ， Ｏで処理しく３０分）、続イテ洗浄しくＣＨ−Ｃｉ！Ｊ、中和しく２０％トリエ チルアミン／ＣＨ、Ｃａ、）、洗浄しくＣＨｚＣ（！２）、そして乾燥すること によって最初のアミノ酸からＢｏｃ基を除去した。次いで、ＤＭＦ中、４倍モル 過剰のＦｌｌｏｃ−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルおよび１−ヒドロ キシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ　ｔ）を用い、通常のＦ　ｍＯｃの化学を用い て、手動のＣＲＢペプチド合成機でさらにペプチド合成を行った。簡単に言うと 、ＣＰＧ基質を、Ｈ○Ｂｔの存在下で３０分間、ＤＭＦ（２１の中テＮ　−ａ− Ｆ　Ｍ　ＯＣ−Ｎ−ε−ＢＯＣ−Ｌｙｓペンタフルオロフェニルエステルと反応 させた。この反応はニンヒドリン検定によると定量的であった。次いで、ＦＭＯ Ｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジン（ＩＸ３分、ＩＸ７分）で除去した。リジン 残基とアラニン（ＦＭＯＣ−Ａｈａペンタフルオロフェニルエステルを用いる） を交互に変え、同じ方法で次の結合を行って（Ａ　ｌａＬ　ｙＳ）ｓＡ　ｌａを 合成した。
実施例３：オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートの合成実施例２に従っ て合成したペプチドをオリゴヌクレオチド合成の出発原料として用いた。
ペプチドの末端アミ７基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで脱保護し、ＣＰＧをＤＭ Ｆ（０，５ｆｆの中で１６時間、α、ω−ヒドロキシカルボン酸リンカ−１ａ、 １ｂまたは２（０，２１モル）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０， ２Ｊ！モル）と反応させた（第２図参照）。残存するアミノ基をアセチル化し、 このＣＰＧを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ａ　自動ＤＮＡ合 成機によるＤＮＡ合成に用いた。
別法では、γ−ブチロラクトンを口、ｉｂｔたはＡの代わりにリンカ−として用 いた。この場合には、ＣＰＧ（１００１１９）を６０℃で７日間、γ−ブチロラ クトン（２靜）と反応させた。
Ｄ　Ｍ　Ｔ　ｒまたはＰｘ保護基をリンカ−基から除去し、メチルＮ、Ｎ−ジイ ソプロピルヌクレオシドホスホルアミダイト（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕ ｔｈｅｒｓ　：上記）を用いてオリゴヌクレオチド合成を始めた。簡単に説明す ると、ホスホルアミダイトを乾燥アセトニトリル中の０゜１Ｍ溶液とし、０．５ Ｍテトラゾールの存在下で結合させる。これに続いて、未反応のヒドロキシ基の アセチル化（Ａｃ２０／ＤＭＡＰ）、ホスファイトトリエステルのホスフェート への酸化（Ｉ、／Ｈ，Ｏ）、次のヌクレオシドホスホルアミダイトの結合の前の 脱トリチル化（ＤＣＱ／ＣＨ、ＣＱ、）を行う。最初のホスホルアミダイトを末 端の脂肪族ヒドロキシ基に結合させた。オリゴヌクレオチドの合成を続け、マウ スのカリクレインをコードしているｍＲＮＡの一部に相補性であル３０　ｍｅｒ （７）ｔ　リゴテオキシソボヌクレオｆ　トｄ（ＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＡＣＡＴ ＣＴＧＴＧＡＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧ）（Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ）をこの固体支持体上で 合成した。トリチル検定による平均の結合収率は９９％を越えていた。
コンジュゲートを脱保護するため、固体支持体を自動合成機から取り、Ｐｈ５Ｈ ／Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ３ＣＮ　１：１２で２時間処理してホスホトリエステル上のメ チル保護基を除去した。リジン残基上のＢＯＣ保護基（および５°−ＤＭＴｒ基 も）は、９０％トリフルオロ酢酸／１０％エタンジチオールによる５分間の処理 、それに続＜２０％Ｅ　ｔ　３　Ｎ　／　ｃ　Ｈｔ　ｃ　ａ　ｔによる中和によ って除去した。次いで、Ｃ−末端アミノ酸を固体支持体に結合させているエステ ル基を濃ＮＨ，水溶液で切断しく４時間）、この溶液を５５°Ｃでさらに１６時 間加熱してヌクレオシドのアミノ保護基を除去した。
第３図は、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる［γ−”Ｐ］−ＡＴＰによる粗製 の生成物の５’−”Ｐ末端ラベル化、および７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリル アミドゲルでの電気泳動の後に得られるパターンを示すものである。オリゴヌク レオチド−ペプチドハイブリッドは通常のＫＰＩＢよりも遅く移動し、生成混合 物の主成分である。
未ラベルの反応液を移動させ、ＵＶで陰をつけることによってＤＮＡをゲル上で 可視化したときに同様のパターンが観察される。純粋なハイブリッド生成物は、 １０％ゲルでのプレバラティブゲル電気泳動ニーよって、またはｆｆＰＬＣによ って得た。
生成物のアミノ酸分析は６ＡＩａ：５Ｌｙｓの予想比を与え、１モルのＫＰＩＢ あたりに１モルの（Ａ　ＩａＬ　ｙｓ）ｓＡ　ｌａポリアミドを有していた。こ の生成物はヘビ毒ホスホジェステラーゼに対して耐性であり（３”−末端をブロ ック）、牌ホスホジェステラーゼによって一部だけが消化された（５′−末端か ら１０ヌクレオチド）（消化物のＨＰＬＣ分析によって評価）。３°−末端の正 に荷電したポリアミドの存在は分子のこの領域のホスホジェステラーゼ消化を阻 害するようである。Ｐ１ヌクレアーゼはこのコンジュゲートをその成分であるヌ クレオシドおよびヌクレオチドに消化した。
ＤＮＡ合成は、常法［Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　（１ ９８１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　２２．１）ｌ）、　１８ ５９−１８６２］に従い、メチルおよびシアノエチルの両保護ヌクレオシドホス ホルアミダイトを用いて行った。これらの合成法においては、それぞれのヌクレ オシドホスホルアミダイトを支持マトリックスに付加した後に、Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ 　／　Ａ　ｃｔｏによる６０〜１２０秒のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）工程 を用いた。
アミノ酸分析はＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　６３００アミノ酸分析機で行っ た。
蛍光分光光度計による測定はＰ　ｅｒｋｉｎ−Ｅ　１ｍｅｒ　Ｌ　Ｓ　−５ルミ ネセンス光度計で行った。ＨＰＬＣはＶｙｄａｃ　Ｃ＋ａ　５ｕ　２５ｃｘｘ　 ４．６ｘｘカラムを用い、ＡＩＬｅｘシステムで行った。用いた緩衝液は、Ａ　 ：　０゜１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，０）、およヒＢ　：　４５ ％ＣＨｓ　ＣＮ含有の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，０）で非 −ペプチドアミノ酸の使用は、ポリアミドの分子構造の設計に尚一層の柔軟性を 導入する。あらゆるα、ω−アミノカルボン酸を天然アミノ酸の間のスペーサー として働かせることができる。容易に入手することができる６−アミノへ牛サン 酸（ＨＡｈａＯＨ）を標準的な単位として選択するが、その他のあらゆる類似の アミノカルボン酸を用いることもできる。始めに、Ｎ−Ｆｍｏｃペンタフルオロ フェニル活性エステル誘導体這およびＡを合成し、通常のＦ　ｍｏｃペプチド合 成法において用いた。ダイマー先は、モノマーｉおよび６−アミノへ牛サン酸か ら好収率で調製することができる。また、酸６は、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール −１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムへ牛すフルオロ ボレート〕法（Ｃａｓｔｒｏ　；上記）を用いて同相合成において直接用いた。
この合成においては、４倍モル過剰の６、ＢＯＰ試薬、Ｎ−メチルモルホリンお よびＨＯＢｔをＤＭＦ中で用いた。この方法は、活性エステルを調製することな くこのスペーサーを導入する極めて効率的な方法であることがわかった。
オリゴヌクレオチド部分から十分に離れた１個の１級脂肪族アミン基を含むオリ ゴヌクレオチドの合成を説明するために、４当量のＮ　−Ｆ　ｎ＋Ｏｃアミノ酸 活性エステル先を用いたこと以外は実施例２に記載の方法を用い、そしてオリゴ ヌクレオチドからの隔離のために活性エステルＡの２つのカップリングを用いて 、ポリアミドＡ　ｈａ。
Ｌｙｓ（Ｂｏａ）Ａｌａを合成した。次いで、実施例３の方法に従ってリンカ− λを付加した後、マウスカリクレインｍＲＮＡ（ＫＰ　Ｉ　Ｂ）の一部に相補性 である３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。このコンジュゲートを上記 のようにして脱保護した。別の方法においては、Ｂｏｃ化学をポリアミドの合成 に用いた。我々はリジン誘導体としてａ　−Ｂｏｃ−ｅ　−Ｆ　ｍｏｃＬｙｓｏ 　Ｐ　ｆｐ（または、ＢＯＰ法による対応するカルボン酸）を、そしてスペーサ ーとしてＢ　ｏｃＡ　ｈａｔｏ　Ｐ　ｆｐを用いた。４倍モル過剰の活性アミノ 酸およびＨＯＢｔをＤＭＦ中で０゜５時間用いた。保護されたポリアミド−オリ ゴヌクレオチドハイブリッドを通常のオリゴヌクレオチドと全く同じ方法で脱保 護し、上記と同一の産物を得た。この場合、リジン残基上のＦ　ｍｏｃ保護基は アンモニア脱保護工程の間に切断される。
また、このＦ　ｍｏｃ法を用いて１０個のりジン残基を含むもっと長いポリアミ ドを合成した。これはＡｌａ（ＬｙｓＡｈａ４）＋＋ＬｙｓＡｌａであり、手動 のペプチド合成機を用い、Ａｈａ４ＬｙｓＡ１ａと同じ方法（Ｆｍｏｃ法）で合 成した。この基質上でのＫＰＩＢの合成に続く通常の脱保護プロトコール（実施 例３を参照）により、ＰＡＣ，Ｅ分析でＫＰＩＢよりもゆっくり移動する主バン ドを与える産物が得られた。このバンドのＰＡＧＥ精製によって良好なアミノ酸 分析結果を有する産物が得られた。
４種類の別の段階でリポータ−グループを導入した：即ち、（１）ポリアミド合 成の後；（■）連結シンフンの付加の後；（■）オリゴヌクレオチド合成の後； および（ＩＶ）ハイブリッドの脱保護および精製の後である。
（Ｉ）リジン側鎖上のＢｏｃ保護基の除去の後、この段階でビオチンおよびフル オレセインラベルンを結合させた。ビオチンは、ＤＭＦ中のビオチン、ＢＯＰ試 薬、ＨＯＢｔおよびＮ−メチルモルホリンのそれぞれ０．２Ｍ溶液を用いて３０ 分間結合させた。また、この結合は、それぞれのＬｙｓ（Ｂｏｃ）残基を付加し た後のポリアミド合成の間に行うこともできる。別法では、ビオチンを例えばス クシンイミドエステルなどの活性エステルとして付加することができる。フルオ レセインは、この段階で、ＤＭＦ中のＬおよびＨＯＢｔの０．３Ｍ溶液との３ｄ の反応によって結合させた。残存するアミ７基はアセチル化シた。後に行うピペ リジン処理はフルオレセイン上のインブチリル保護基を除去するので、ピリジン 中のＤＭＡＰ／無水イソ酪酸で１６時間再アシル化した。
（ＩＩ）リジン側鎖の保護基がＦ　ｍｏｃであり、ポリアミド合成にＢｏａ法を 用いたときには、この段階でラベルの結合を行うことができる。ε−Ｆ　ｍｏｃ 基の除去の後に、ビオチンまたはフルオレセインを段階（１）での方法と同じ方 法で付加する。
（ＩＩＩ）リジン側鎖のＢｏａ保護基を上記のように除去しくハイブリッドの脱 保護）、ラベルを結合させた。ＤＭＦ（０，５１Ｃ）中のビオチンＮ−ヒドロキ シスクシンイミジル活性エステル（２０当量）およびＨＯＢｔ（２０当Ｍ）との １６時間の反応によってビオチンを付加する。フルオレセインは段階（１）での ようにして付加するが、フルオレセインの再アシル化は必要ではない。
（ＴＶ）常法によって１個のリジンを含有しているハイブリッドにビオチンを付 加した。フルオレセインはフルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用 いて付加することもできる。
実施例６：オリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲートへの蛍光団のコンジ ュゲート 下式で示される完全に保護されたオリゴヌクレオチド−ポリアミドコンジュゲー ト； ＣＰ　Ｇ−３Ｌ−Ａ　Ｉａ］　Ｌｙｓ（Ｂｏａ）Ａｈａ］ｅＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ａ 　Ｉａ−３Ｌ−Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ［式中、Ａｈａは６−アミノへ牛サン酸残基（Ｃ （ＣＨＪ５　ＮＨ）であり、ＳＬはリンカ−」」、」」およびがら導がれる結合 であり、そしてＫＰＩＢはその配列を上に示したオリゴヌクレオチドであるコを 実施例４に従い、３０ｊ！ｙのＣＰＧで合成した。始めに、Ｌｙｓ側鎖のＢｏｃ 保護基を除去するため、コンジュゲートを９０％トリフルオロ酢酸／１０％エタ ンジチオールで５分間処理し、次いで２０％トリエチルアミン／ＣＨ，Ｏｆｆ、 で処理して生成した１級アミン基を中和した。次いで、このコンジュゲートを、 ＤＭＦ（０，５好）中で３日間、４０倍過剰のジイソブチリルカルボキシフルオ レセインペンタフルオロフェニルエステル（１’０７ｘｇ）および１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール（２６ｊＩ９）と反応させた。次に、このラベルされた化 合物を脱保護した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、このラベルさ れた化合物はキシレンシアツール染料と同じ位置に移動する強い蛍光バンドを与 えた。このバンドを切り出し、精製してフルオレセインラベルされたオリゴヌク レオチド−ボリアミドコンジュゲートを得た。
また、フンシュゲートＣＰＧ−３Ｌ−ＡｌａＬｙｓ（Ｂｏｃ）Ａｈａ、−３Ｌ− ＫＰＩＢを実施例４の方法に従って合成し、実施例５の段階３に従ってフルオレ セインでラベルした。次いで、このラベルしたコンジュゲートを当分筒で自体既 知の方法に従いゲル電気泳動によって精製した。
実施例７：コンジュゲートの精製 ラベルした、およびラベルしていないハイブリッドのほとんどの精製は、１０％ ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ、）によって行った。
Ｂｏｃの化学によって調製した１個のりジンを含有するハイブリッドの精製はＶ ｙｄａｃＣ＋ｓカラムによる逆相ＨＰＬＣで行うのが好都合であるが、これは、 このハイプリ、ドの５’−ＤＭＴｒ基が無傷であるためである。このＤ　Ｍ　Ｔ 　ｒ含有のハイブリッドを始めに次の条件を用いて精製した：３３．３％のＢで インクラティックに２０分間、次いで６６．６％のＢまての勾配で３０分間。Ｄ ＭＴｒ−ＫＰＩＢ−３Ｌ−Ａｈａ、ＬｙｓＡｌａは４４．０分で溶出する。溶出 物の脱トリチル化（等容量の酢酸、１５分）およびＯ〜６６．６％のＢの勾配で ３０分間の再クロマトグラフィーにより、２６．０分で溶出する純粋な生成物が 得られた。フルオレセイン含有のハイブリッドを、Ｈ，Ｏ中でＳ　ｅｐｈａｄｅ ｘ　Ｇ−２５Ｆ　１ｎｅ（２９）のカラムに通すことによって部分的に精製し、 すべての遊離のフルオレセインおよびその他の低分子量の物質を主に除去するこ ともできる。ボイドボリュームで溶出する高分子量の分画（０，５ｘのを集め、 Ｈ，０に対して徹底的に透析した。
実施例８：標的配列へのフンシュゲートのハイブリダイゼーション 以下のビオチン化したフンシュゲートを実施例６の方法に従って調製した： Ａ、Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ−Ｌ　Ｌ−Ａｈａ、Ｌｙｓ（ビオチン）Ａｈａ（段階■でラ ベル）Ｂ、Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ”Ｓ　Ｌ−［Ａｈａ、Ｌｙｓ（ビオチン）］Ａｌａ（ 段階■）Ｃ，Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ−３Ｌ−［ＡｈａＬｙｓ（ビオチン）］１ｏＡｌａ （段階■）Ｄ、Ｋ　Ｐ　Ｉ　Ｂ−３Ｌ−［Ａｈａ、Ｌｙｓ（ビオチン）コ、、Ａ ｌａ　（段階■）［ここで、ＬＬおよびＳＬはそれぞれリンカ−えおよび七から 導かれる連結を表す］。
第４図は、フンシュゲートＡ〜Ｄ（レーンＡ−Ｄに対応）を用いて、マウスのカ リクレインｃＤＮＡ挿入体を含むｐＵＣプラスミドを含有するドツトプロットに ハイブリダイズさせたときに得られる結果を示すものである。このドツトプロッ トは、１ｋｂのマウス腎カリクレインｃＤＮＡ挿入体を含有し、ｐＵｃから導か れる３、７ｋｂプラスミドを含有していた。ネガティブ対照（ＮＣ）は、クロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）構造遺伝子を継ぎ合わせ たメタロチオネイン■９遺伝子プロモーターを含有する類似のｐＵＣプラスミド であった。このニトロセルロースフィルターを、４２°Ｃて６．５時間、ハイブ リダイゼーション緩衝液［０，７５Ｍ　ＮａＣ（！、０．０７５Ｍクエン酸ナト リウム、２５ｍＭ　ＮａＨｔＰＯ，，２５ｍＭＮａｔＨＰ○４．１０＋ｎＭ　ピ ロリン酸四ナトリウム、Ｏ，１ｍＭ　アデノシン三リン酸二ナトリウム、２５ｘ ｙ／Ｃサケ精子ＤＮＡ、０．０１％ｗ／ｖ　Ｆ　１ｃｏｌＬ　０．０１％ポリビ ニルピロリドン、０．０１％ウシ血清アルブミン、２０％ホルムアミド］（１０ Ｉｌ＋７り中でプレハイブリダイズさせ、次いでプローブ（１００ｎｙ）を加え 、これを４２°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。次いで、このフィルターを、０ ．２ｘｓｓｃ［ｏ、０３Ｍ　ＮａＣＱ、０．００３Ｍ　クエン酸ナトリウム］中 、４２℃で４回（それぞれ１０分間）洗浄した。Ｂ　ＲＬ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）　Ｂ　ＩｕＧ　Ｅ　Ｎ　Ｅキット（ビオチンに 結合するストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用） 、およびそれに続く現像反応［酵素が基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（Ｎ ＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート（ＢＣＩＰ ）に作用して不溶性の染料沈澱を生成する］によってシグナルを検出した。
段階（■）（レーンＡ）または段階（Ｈ）（レーンＢ）のどちらかでビオチンを 結合させたハイブリッドの間には、シグナルの有意の差が存在しないことが明ら かである。これは、オリゴヌクレオチド合成の条件が、ストレプトアビジンコン ジュゲートに結合することができなくなるようにはビオチン残基に悪影響を及ぼ さないことを示すものである。さらに、段階（ｎＩ）で導入した１０個のビオチ ン残基を含有するハイブリッド（レーンＣおよびＤ）は、１個のラベルのハイブ リツドのシグナルよりも約１０倍強いシグナルを与える。ラベル間に１個のＡｈ ａスペーサー（レーンＣ）または２個のＡｈａスペーサー（レーンＤ）を有する 複数ラベルのハイブリッドのストレプトアビジン結合親和性には有意差は存在し ないよってある。従って、ビオチン残基の相対的な近接度は、ストレブトアビジ ンーアルカリホスファターゼコンブレノクスが有意な程度にビオチン残基に結合 する能力に影響を及ぼさないようである。ネガティブ対照（ＮＣ”ｌ（無関係の 挿入体を有するｐＵｃ）を考慮に入れると、このドツトプロ・ソト法による１個 のラベルのプローブの感受性は０．５ｎｇ（２２０ａモル）であり、複数ラベル のプローブは０．０５ｎ９（２２ａモル）である。
また、これらのビオチン化したプローブを用いて組織片にハイブリダイズさせた 。
ハイブリダイゼイションの組織化学分析はＣｏｇｈｌａｎ、　Ｊ、　Ｐ、等［Ａ ｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１４９．　ｐｐ、　１−２８　（１９８５）］の方法に 従って行った。簡単に説明すると、６μｌの凍結切片を０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ ７，２）中で５分間、４％ホルムアルデヒドで固定し、１０分間フッ／％イブリ ダイズさせた［５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、５．０ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、Ｑ。
０２％ｆｉｃｏ１１．０．０２％ウシ血清アルブミン、０．０２％ポリビニルピ ロリドン、および０．０１％ニシン精子ＤＮＡ中で］。次いで、ラベルされたコ ンジュゲートを０　、８　ｎｇ／μＱの濃度で加えた。
ハイブリダイゼイションを４０℃で３日間行った。次に、この切片（顕微鏡スラ イドガラスに付着させた）を、４ｘＳＳＣ［保存溶液Ｘ２０は、蒸留水中の３Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム］中ですすいだ。次いで、コンジ ュゲートのハイブリダイゼイションを光学顕微鏡下で発色させて可視化した。
１０個のビオチン残基を含むプローブＤを用いて、マウス顎下腺の６μ窺切片中 のカリクレインｍＲＮＡを検出した。第５図に示すように、プローブＤは、顎下 腺の複雑な細管に一致する、マウスカリクレイン遺伝子の大部分の発現部位であ る腺の別個の領域を強くラベルした（光学顕微鏡で検出）。
実施例９：反応性の３′ヒドロキシ基を有するポリアミド−オリゴヌクレオチド コンジュゲートの合成 式： ［式中、Ｒはアルキルまたは置換アルキルである］で示されるウリジン誘導体を 、本出願人の同時係属豪州出願Ｎｏ、Ｐ１２６６６／８７の方法に従って合成す ることができる。
次いで、このような化合物を、 （くこにスペーサー、例えばポリアミドが存在していてもよい）とＤＣＣの存在 下で反応させて、 を得ることができる。
次いで、延長ポリアミドをＣ−５アーム上で合成することができ、これに続いて オリゴヌクレオチドをヌクレオシドの５゛−ヒドロキシ基土で合成することがで きる。
これらのウリジン誘導体類は、３°ＯＨへの延長が必要とされる状況下で、例え ばＤＮＡの配列決定において有用である。そのような状況下において、ヌクレオ シドをＣＰＧに結合させているエステル基を都合よ（切断することができる。
Ｒσ、／ ＦＩＧ、Ｊ。
Ｐ工ＧＵＲＥ　４ Ａ　ＢＣＤ Ｆ工ＧＷ　５ 国際調査報告 １−＋１＝ＩＩＩＡ、画一１−−−−．　ＰＣＴ／ＡＵ　８８１００４１７、、 、、積、、、、−、、、、、−、、、、−、ＰＣＴ７ＡＵ８８１００４１７［Ｔ ｏ　’１３１Ｅ　［α！　！　ＲＥＰＣＲｌｒ　ＯＮｒ佇ジ引にｎα！　ＡＰＰ ＬＩＣＡＴＩＣＮ　Ｎｏ、　Ｋ？ｒ　ＡＵ　８８００４１７トラリア国、ビクト リア３１２２、ホーソーン、ホーソーン・グ６２番

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. １．式： Ｘ−Ｌ−Ｙ ［式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌクレオチドであり、そしてＬはポ リアミドＸのアミノ末端およびオリゴヌクレオチドＹの３′ホスフェート基と共 有結合を形成するリンカーである］で示されるオリゴヌクレオチドーポリアミド コンシエゲート。
  2. ２．リンカーしが、ポリアミドのアミノ末端と結合を形成する第１の反応性基、 およびオリゴヌクレオチドの３′ホスフェートと結合を形成する第２の反応性基 を有する２官能性のリンカーである請求項１記載のコンジュゲート。
  3. ３．ポリアミドＸが天然アミノ酸で構成されているペプチドである請求項１また は請求項２記載のコンジュゲート。
  4. ４．ポリアミドが合成α，ωアミノカルボン酸、または天然アミノ酸と合成α， ωアミノカルボン酸の組合せで構成されている前記請求項のいずれかに記載のコ ンジュゲート。
  5. ５．ポリアミドが１またはそれ以上のリポーターグループを含んでいる前記請求 項のいずれかに記載のコンジュゲート。
  6. ６．リポーターグループが蛍光団、ビオチン、酵素、またはコロイド状化合物か ら選ばれる請求項５記載のコンジュゲート。
  7. ７．リポーターグルーブがフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサス ・レッド、クマリン、炭酸脱水酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ 、デヒドロゲナーゼ、および／またはコロイド状の金または銀から選ばれる請求 項６記載のコンジュゲート。
  8. ８．ポリアミドが抗原性であり、それに結合する抗体によって検出することがで きる請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲート。
  9. ９．式： Ｚ−Ｘ−Ｌ ［式中、Ｚは固相マトリックスを表し、Ｘは該固相マトリックスにそのＣ−末端 で結合しているポリアミドを表し、そしてＬはポリアミドのＮ−末端に結合して いる第１の反応性基、およびヌクレオチドの３′ホスフェートと結合を形成する ことができる第２の反応性基を有する２官能性のリンカーを表す］で示されるポ リアミド。
  10. １０．請求項６または７記載のリポーターグループを１またはそれ以上含んでい る請求項９記載のポリアミド。
  11. １１．予め調製したオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドの３′末端ホスフェ ートを、予め調製したポリアミドのアミノ末端に結合させる工程を包含するオリ ゴヌクレオチドーポリアミドコンジュゲートの製造方法。
  12. １２．請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドーポリアミト′コン ジュゲートの合成方法であって、（ａ）第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット （アミド結合によって互いに結合している）のＣ−末端を支持マトリックスと反 応させて、それらの間に結合を形成させ； （ｂ）次いで、この支持マトリックスを、周知の固相ペプチド合成法に従い、１ またはそれ以上のアミノ酸と順次反応させてポリアミドを得； （ｃ）この支持マトリックスーポリアミドをリンカーの第１の反応性基と反応さ せて、ポリアミドのアミノ末端とリンカーを結合させ；（ｄ）工程（ｃ）の生成 物を第１のヌクレオチドと反応させて、リンカーの第２の反応性基とヌクレオチ ドの３′ホスフェートを結合させ；（ｅ）次いで、この支持マトリックスを、周 知の固相オリゴヌクレオチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌクレオチドと 順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；そして（ｆ）所望により、支持マトリ ックスからオリゴヌクレオチドーポリアミドコンジュゲートを切断し、ポリアミ ドまたはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合しているすべての保護基を除去し 、そして得られたコンジュゲートを精製すること；を特徴とする方法。
  13. １３．動物または植物組織における特定のポリヌクレオチド群の存在およびその 位置の測定方法であって、（ａ）被験組織片を調製し； （ｂ）この組織片を請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドーポリ アミドコンジュゲート（ここで、このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分 は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性である）とハイブリダイズさせ； （ｃ）組織片からハイブリダイズしていないプローブ物質を除去し；そして （ｄ）コンジュゲートのハイブリダイゼーションによってラベル化された組織片 中の位置を検出するか、または同定すること；を特徴とする方法。
  14. １４．支持マトリックスに固定化されたか、またはその他の方法でそれに結合し ている特定のポリヌクレオチドの検出方法であって、支持マトリックスを請求項 １〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドーポリアミドコンジュゲート（こ こで、このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの 一部に相補性である）と接触させ、次いでコンジュゲートの支持マトリックスヘ のハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする方法。
  15. １５．生物学的試料中の特定のウイルス性、細菌性またはその他のポリヌクレオ チドの存在または非存在の検出方法であって、試料の核酸を請求項１〜８のいず れかに記載のオリゴヌクレオチドーポリアミドコンジュゲート（ここで、このコ ンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性 である）と接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダイゼーションが起こる か否かを検出することを特徴とする方法。
  16. １６．ウイルス性、細菌性またはその他の疾病の治療方法であって、そのような 治療を必要としている患者に治療学的有効量の請求項１〜８のいずれかに記載の オリゴヌクレオチドーポリアミドコンジュゲートを投与することを特徴とし、さ らに、このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分がアンチセンスオリゴヌク レオチドであって特定のウイルス性、細菌性またはその他のポリヌクレオチドに 相補性であり、従って特定のポリヌクレオチドの転写または翻訳をプロックする ものであることを特徴とする方法。
  17. １７．請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドーポリアミドコンジ ュゲート（ここで、このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は所望のポリ ヌクレオチドの一部に相補性である）；およびコンジュゲートのハイブリダイゼ ーションを検出するための試薬；からなる所望のポリヌクレオチドを検出するた めの診断キット。
  18. １８．組織片調製のための試薬をさらに含有し、動物または植物組織中の特定の ポリヌクレオチド群の存在およびその位置の測定に用いる請求項１７記載の診断 キット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004501211A (ja) * 2000-04-18 2004-01-15 アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ポリアミド核酸誘導体および薬剤、ならびにその調製方法
JP2005518431A (ja) * 2002-02-01 2005-06-23 アボット・ラボラトリーズ 高分子コンジュゲート及びその製造方法

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965349A (en) * 1987-12-24 1990-10-23 Applied Biosystems, Inc. Method of synthesizing oligonucleotides labeled with ammonia-labile groups on solid phase supports
US5948634A (en) * 1988-12-21 1999-09-07 The General Hospital Coporation Neural thread protein gene expression and detection of alzheimer's disease
EP0418076A3 (en) * 1989-09-14 1991-05-08 Tosoh Corporation Oligonucleotide derivative and process for producing the same
AT394852B (de) * 1990-04-10 1992-07-10 Chemie Linz Gmbh Verfahren zur herstellung von n-succinimidylcarbonaten
JP3256539B2 (ja) * 1990-08-28 2002-02-12 エポック・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 連結分子を介する３’―尾分子付オリゴヌクレオチドの固体支持体合成
CA2095212A1 (en) * 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
FR2679255B1 (fr) * 1991-07-17 1993-10-22 Bio Merieux Procede d'immobilisation d'un fragment nucleique par fixation passive sur un support solide, support solide ainsi obtenu et son utilisation.
US5495006A (en) * 1991-09-27 1996-02-27 Allelix Biopharmaceuticals, Inc. Antiviral polynucleotide conjugates
WO1993020090A1 (en) * 1992-04-06 1993-10-14 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Paired-ion oligonucleotides and methods for preparing same
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US6919441B2 (en) 1994-03-14 2005-07-19 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Polyamide-oligonucleotide derivatives, their preparation and use
DE4408528A1 (de) * 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
FR2746413B1 (fr) * 1996-03-19 1998-04-24 Bio Merieux Detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal
US7226730B1 (en) 1997-02-26 2007-06-05 The General Hospital Corporation Transgenic animals and cell lines for screening drugs effective for the treatment or prevention of Alzheimer's Disease
CA2282729A1 (en) 1997-02-26 1998-09-03 The General Hospital Corporation Transgenic animals and cell lines for screening drugs effective for the treatment or prevention of alzheimer's disease
US8637650B2 (en) 2003-11-05 2014-01-28 Genovoxx Gmbh Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same
US8435800B2 (en) 2004-11-22 2013-05-07 Biosight Ltd. Activated labeling reagents and methods for preparing and using the same
US7459529B2 (en) 2004-11-24 2008-12-02 Seoul National University Industry Foundation AIMP2-DX2 and its uses
US9944713B2 (en) 2004-11-24 2018-04-17 Medicinal Bioconvergence Research Center Antibody specific to the AIMP2-DX2
US9315860B2 (en) 2009-10-26 2016-04-19 Genovoxx Gmbh Conjugates of nucleotides and method for the application thereof
EP2702171A1 (de) 2011-04-27 2014-03-05 Cherkasov, Dmitry Methoden und komponenten zur detektion von nukleinsäureketten
GB2574525B (en) * 2015-12-21 2020-09-02 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
GB2545898B (en) * 2015-12-21 2019-10-09 Sutura Therapeutics Ltd Improved drug delivery by conjugating oligonucleotides to stitched/stapled peptides
WO2024069229A2 (en) 2022-08-03 2024-04-04 Sutura Therapeutics Ltd Biologically active compounds

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59148798A (ja) * 1983-02-14 1984-08-25 Wakunaga Seiyaku Kk ビオチンヌクレオチド誘導体
JPS59204200A (ja) * 1983-04-28 1984-11-19 Wakunaga Seiyaku Kk ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4388306A (en) * 1980-06-04 1983-06-14 Merck & Co., Inc. Pharmaceutical composition comprising modified polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, for induction of interferon in primates
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
CA1309672C (en) * 1983-01-27 1992-11-03 Jannis G. Stavrianopoulos Methods and structures employing non-radioactive chemically-labeled polynucleotide probes
DE3310337A1 (de) * 1983-03-22 1984-09-27 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL), 6900 Heidelberg Verfahren zur durchfuehrung von hybridisierungsreaktionen
US4569967A (en) * 1983-10-24 1986-02-11 The Salk Institute For Biological Studies Synthesis of N-substituted peptide amides
US4701499A (en) * 1983-10-24 1987-10-20 The Salk Institute For Biological Studies Synthesis of N-substituted peptide amides
US4748111A (en) * 1984-03-12 1988-05-31 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay
DE3431536A1 (de) * 1984-08-28 1986-03-13 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren
DE3568063D1 (en) * 1985-01-10 1989-03-09 Molecular Diagnostics Inc Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays
FR2582653B1 (fr) * 1985-05-30 1987-08-14 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes de couplage, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59148798A (ja) * 1983-02-14 1984-08-25 Wakunaga Seiyaku Kk ビオチンヌクレオチド誘導体
JPS59204200A (ja) * 1983-04-28 1984-11-19 Wakunaga Seiyaku Kk ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004501211A (ja) * 2000-04-18 2004-01-15 アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ポリアミド核酸誘導体および薬剤、ならびにその調製方法
JP2005518431A (ja) * 2002-02-01 2005-06-23 アボット・ラボラトリーズ 高分子コンジュゲート及びその製造方法

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Publication number Publication date
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CA1339205C (en) 1997-08-05
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EP0383803A1 (en) 1990-08-29
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ATE192465T1 (de) 2000-05-15
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