JPH09124693A - オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲート - Google Patents
オリゴヌクレオチド−ポリアミド コンジュゲートInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 相補性の標的配列に効率的にハイブリダイズ
し、放射活性ラベルに頼ることなく検出することができ
るオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 式： Ｘ−Ｌ−Ｙ [式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌクレオチ
ドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末端および
オリゴヌクレオチドＹの３'ホスフェート基と共有結合
を形成するリンカーである]で示されるオリゴヌクレオ
チド-ポリアミド コンジュゲート。
し、放射活性ラベルに頼ることなく検出することができ
るオリゴヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 式： Ｘ−Ｌ−Ｙ [式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌクレオチ
ドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末端および
オリゴヌクレオチドＹの３'ホスフェート基と共有結合
を形成するリンカーである]で示されるオリゴヌクレオ
チド-ポリアミド コンジュゲート。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ド-ポリアミド コンジュゲート、その製造方法、および
該コンジュゲートの使用、特に診断および治療薬として
の使用に関する。
ド-ポリアミド コンジュゲート、その製造方法、および
該コンジュゲートの使用、特に診断および治療薬として
の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】合成オリゴヌクレオチドは、分子生物学
の分野において、特にＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出の
ためのハイブリダイゼーション プローブとして広く応
用されることが見い出された。通常、オリゴヌクレオチ
ドはその５'末端に放射ラベルを有しており、ハイブリ
ダイゼーションの検出が可能である。細胞毒性や突然変
異誘発性などの放射ラベルされた物質に通常伴われる問
題は別にすると、放射ラベルされたプローブの検出には
オートラジオグラフィー暴露が必要であり、数日を要す
ることも多い。さらに、放射ラベルが短い半減期を有し
ていることもあり、これにより、その保存性および後の
使用が制限される。
の分野において、特にＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出の
ためのハイブリダイゼーション プローブとして広く応
用されることが見い出された。通常、オリゴヌクレオチ
ドはその５'末端に放射ラベルを有しており、ハイブリ
ダイゼーションの検出が可能である。細胞毒性や突然変
異誘発性などの放射ラベルされた物質に通常伴われる問
題は別にすると、放射ラベルされたプローブの検出には
オートラジオグラフィー暴露が必要であり、数日を要す
ることも多い。さらに、放射ラベルが短い半減期を有し
ていることもあり、これにより、その保存性および後の
使用が制限される。
【０００３】蛍光あるいは酵素リポーターグループなど
の非-放射活性プローブまたはリポーターグループでオ
リゴヌクレオチドをラベルすると、高い安全性、定めの
ない貯蔵寿命および検出の容易性を含む、放射ラベルさ
れたプローブを凌ぐかなりの利点が得られる。
の非-放射活性プローブまたはリポーターグループでオ
リゴヌクレオチドをラベルすると、高い安全性、定めの
ない貯蔵寿命および検出の容易性を含む、放射ラベルさ
れたプローブを凌ぐかなりの利点が得られる。
【０００４】１またはそれ以上のヌクレオチド塩基を用
いて(米国特許 Ｎo.4,669,876 および豪州特許出願公開
Ｎo.16484/85)、または直接リポーターグループをオリ
ゴヌクレオチドの３'もしくは５'末端に結合させること
によって(欧州特許出願公開Ｎo.84101392.3および85102
130.3)、オリゴヌクレオチドを非-放射活性リポーター
グループでラベルすることが提案されていた。このよう
な以前の提案は複雑な合成反応を包含することが多く、
オリゴヌクレオチドの相補性標的配列へのハイブリダイ
ゼーションを遮断することもある。
いて(米国特許 Ｎo.4,669,876 および豪州特許出願公開
Ｎo.16484/85)、または直接リポーターグループをオリ
ゴヌクレオチドの３'もしくは５'末端に結合させること
によって(欧州特許出願公開Ｎo.84101392.3および85102
130.3)、オリゴヌクレオチドを非-放射活性リポーター
グループでラベルすることが提案されていた。このよう
な以前の提案は複雑な合成反応を包含することが多く、
オリゴヌクレオチドの相補性標的配列へのハイブリダイ
ゼーションを遮断することもある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、相補性の標的
配列に効率的にハイブリダイズし、放射活性ラベルに頼
ることなく好都合に検出することができ、そしてさら
に、比較的簡単かつ都合良く製造することができるオリ
ゴヌクレオチドが求められている。
配列に効率的にハイブリダイズし、放射活性ラベルに頼
ることなく好都合に検出することができ、そしてさら
に、比較的簡単かつ都合良く製造することができるオリ
ゴヌクレオチドが求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、式：Ｘ
−Ｌ−Ｙ［式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌ
クレオチドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末
端およびオリゴヌクレオチドＹの３'ホスフェート基と
共有結合を形成するリンカーである］で示されるオリゴ
ヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートが提供され
る。
−Ｌ−Ｙ［式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌ
クレオチドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末
端およびオリゴヌクレオチドＹの３'ホスフェート基と
共有結合を形成するリンカーである］で示されるオリゴ
ヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートが提供され
る。
【０００７】ポリアミドは、アミドまたはいわゆるペプ
チド結合によって結合したリジン、バリン、グリシン、
セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、プロリン
などの天然のアミノ酸[Biochemistry、第２版、Albelt
L.Lehninger、72-77頁]から得ることができる。別法に
よれば、ポリアミドは合成アミノ酸(即ち、天然にはタ
ンパク質中に見い出されないアミノ酸)から、または天
然および合成アミノ酸の組合せによって得ることができ
る。本明細書中で用いる「合成アミノ酸」なる用語は、
一般式：Ｈ2ＮＣＨＲＣＯＯＨ［式中、Ｒはアルキルま
たはシクロアルキルなどのあらゆる有機部分であり、こ
れらは、不飽和もしくは部分的に飽和していてもよく、
そして／または１もしくはそれ以上の異項原子またはそ
のような異項原子を含む基(アミド基など)で遮断されて
いてもよく、そして／またはハロゲン、シアノ、アミノ
もしくは置換もしくは非置換フェニルもしくはベンジル
で置換されていてもよい］で示されるα,ω-アミノカル
ボン酸を指す。
チド結合によって結合したリジン、バリン、グリシン、
セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、プロリン
などの天然のアミノ酸[Biochemistry、第２版、Albelt
L.Lehninger、72-77頁]から得ることができる。別法に
よれば、ポリアミドは合成アミノ酸(即ち、天然にはタ
ンパク質中に見い出されないアミノ酸)から、または天
然および合成アミノ酸の組合せによって得ることができ
る。本明細書中で用いる「合成アミノ酸」なる用語は、
一般式：Ｈ2ＮＣＨＲＣＯＯＨ［式中、Ｒはアルキルま
たはシクロアルキルなどのあらゆる有機部分であり、こ
れらは、不飽和もしくは部分的に飽和していてもよく、
そして／または１もしくはそれ以上の異項原子またはそ
のような異項原子を含む基(アミド基など)で遮断されて
いてもよく、そして／またはハロゲン、シアノ、アミノ
もしくは置換もしくは非置換フェニルもしくはベンジル
で置換されていてもよい］で示されるα,ω-アミノカル
ボン酸を指す。
【０００８】このポリアミドは任意の数のアミノ酸単位
を含んでいてよいが、それがオリゴヌクレオチドとその
標的配列のハイブリダイゼーションを妨害しないもので
あるという条件のもとにあるのは勿論のことである。例
示のために挙げると、ポリアミドは１〜１００のアミノ
酸単位を含んでいよう。
を含んでいてよいが、それがオリゴヌクレオチドとその
標的配列のハイブリダイゼーションを妨害しないもので
あるという条件のもとにあるのは勿論のことである。例
示のために挙げると、ポリアミドは１〜１００のアミノ
酸単位を含んでいよう。
【０００９】このポリアミドは天然のα-アミノ酸を含
有するペプチドを形成することもある。このペプチドの
配列は、オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲー
トのあらゆる望ましい適用に好都合なように設計するこ
とができる。このペプチドは、後記で説明するようにリ
ポーターグループで誘導体化することができる１または
それ以上のリジン残基を含有していてもよい。さらに、
このポリアミドは抗原性であって、従って抗体の結合に
よって検出可能であってもよく、これは例えば抗体結合
の検出を可能にするための適当なリポーターグループを
含んでいてもよい。
有するペプチドを形成することもある。このペプチドの
配列は、オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲー
トのあらゆる望ましい適用に好都合なように設計するこ
とができる。このペプチドは、後記で説明するようにリ
ポーターグループで誘導体化することができる１または
それ以上のリジン残基を含有していてもよい。さらに、
このポリアミドは抗原性であって、従って抗体の結合に
よって検出可能であってもよく、これは例えば抗体結合
の検出を可能にするための適当なリポーターグループを
含んでいてもよい。
【００１０】合成アミノ酸を、例えば、リポーターグル
ープを有するリジンなどのアミノ酸の間のスペーサーと
して用いて、リポーターグループの立体障害もしくは失
活を回避するか、またはオリゴヌクレオチドから大きな
リポーターグループを遠ざけてもよい。有用なアミノ酸
スペーサーの例は６−アミノヘキサン酸(Ａha)である。
ープを有するリジンなどのアミノ酸の間のスペーサーと
して用いて、リポーターグループの立体障害もしくは失
活を回避するか、またはオリゴヌクレオチドから大きな
リポーターグループを遠ざけてもよい。有用なアミノ酸
スペーサーの例は６−アミノヘキサン酸(Ａha)である。
【００１１】本発明で用いることができる合成アミノ酸
には次式で示される化合物が含まれる：
には次式で示される化合物が含まれる：
【化１】 [式中、ＲＯはp-ニトロフェニルオキシ、ペンタフルオ
ロフェニルオキシおよびＮ'-ヒドロキシスクシンイミジ
ルなどの脱離基であるか、またはＲが水素であり；Ｒ2
はフルオレニルメトキシカルボニル(Ｆmoc)またはtert-
ブトキシカルボニル(Ｂoc)などのアミノ保護基であり；
ｎおよびｎ1は０〜３０であってよく；Ｗは
ロフェニルオキシおよびＮ'-ヒドロキシスクシンイミジ
ルなどの脱離基であるか、またはＲが水素であり；Ｒ2
はフルオレニルメトキシカルボニル(Ｆmoc)またはtert-
ブトキシカルボニル(Ｂoc)などのアミノ保護基であり；
ｎおよびｎ1は０〜３０であってよく；Ｗは
【化２】 である(ここで、ｎ2およびｎ3は０〜１００であってよ
い)]。
い)]。
【００１２】ポリアミド合成に有用なアミノ酸単位は、
【化３】 である。
【００１３】ポリアミドを得るために用いることができ
る合成アミノ酸が、いかなる意味においても上に具体的
に例示した化合物に限定されるものではないことを理解
すべきである。
る合成アミノ酸が、いかなる意味においても上に具体的
に例示した化合物に限定されるものではないことを理解
すべきである。
【００１４】ポリアミドＸを、１またはそれ以上のリポ
ーターグループ(検出マーカーとも呼ばれる)、例えばビ
オチン、蛍光団、化学ルミネッセンス部分、酵素または
フェリチンなどのコロイド化合物またはコロイド状の銀
もしくは金でラベルすることができる。
ーターグループ(検出マーカーとも呼ばれる)、例えばビ
オチン、蛍光団、化学ルミネッセンス部分、酵素または
フェリチンなどのコロイド化合物またはコロイド状の銀
もしくは金でラベルすることができる。
【００１５】蛍光団リポーターグループは以下に挙げる
ものから選択してよい：フルオレセイン−５−イソチオ
シアネート、ジアシル(イソブチリル、アセチルまたは
ピバロイルなど)フルオレセイン−５および／または６
−カルボン酸ペンタフルオロフェニル エステル、６−
(ジアシル−５および／または６−カルボキサミド−フ
ルオレセイン)アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニ
ル エステル、テキサス・レッド(Texas Red；Molecular
Probes,Inc.の商標)、テトラメチルローダミン−５(お
よび６)イソチオシアネート、エオシン−イソチオシア
ネート、エリトロシン−５−イソチオシアネート、４−
クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジア
ゾール、４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１,３−ジアゾール、３−(７−ニトロベンズ−２−オ
キサ−１,３−ジアゾール−４−イル)メチルアミノプロ
ピオニトリル、６−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−
１,３−ジアゾール−４−イル)アミノヘキサン酸、スク
シンイミジル １２−(Ｎ−メチル−Ｎ−(７−ニトロベ
ンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)アミ
ノドデカノエート、７−ジエチルアミノ−３−(４'−イ
ソチオシアナトフェニル)−４−メチルクマリン(Ｃ
Ｐ)、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸、７−ジメチ
ルアミノクマリン−４−酢酸、スクシンイミジル ７−
ジメチルアミノクマリン−４−アセテート、７−メトキ
シクマリン−４−酢酸、４-アセトアミド−４'−イソチ
オシアナトスチルベン−２,２'−ジスルホン酸(ＳＩＴ
Ｓ)、９−クロロアクリジン、スクシンイミジル ３−
(９−カルバゾール)プロピオネート、スクシンイミジル
１−ピレンブチレート、スクシンイミジル １−ピレン
ノナノエート、p-ニトロフェニル １−ピレンブチレー
ト、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジル
アントラセン−９−プロピオネート、２−アントラセ
ンスルホニルクロリド、または特定の方法で処理したと
きに蛍光を発する蛍光団前駆体。
ものから選択してよい：フルオレセイン−５−イソチオ
シアネート、ジアシル(イソブチリル、アセチルまたは
ピバロイルなど)フルオレセイン−５および／または６
−カルボン酸ペンタフルオロフェニル エステル、６−
(ジアシル−５および／または６−カルボキサミド−フ
ルオレセイン)アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニ
ル エステル、テキサス・レッド(Texas Red；Molecular
Probes,Inc.の商標)、テトラメチルローダミン−５(お
よび６)イソチオシアネート、エオシン−イソチオシア
ネート、エリトロシン−５−イソチオシアネート、４−
クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジア
ゾール、４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ
−１,３−ジアゾール、３−(７−ニトロベンズ−２−オ
キサ−１,３−ジアゾール−４−イル)メチルアミノプロ
ピオニトリル、６−(７−ニトロベンズ−２−オキサ−
１,３−ジアゾール−４−イル)アミノヘキサン酸、スク
シンイミジル １２−(Ｎ−メチル−Ｎ−(７−ニトロベ
ンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)アミ
ノドデカノエート、７−ジエチルアミノ−３−(４'−イ
ソチオシアナトフェニル)−４−メチルクマリン(Ｃ
Ｐ)、７−ヒドロキシクマリン−４−酢酸、７−ジメチ
ルアミノクマリン−４−酢酸、スクシンイミジル ７−
ジメチルアミノクマリン−４−アセテート、７−メトキ
シクマリン−４−酢酸、４-アセトアミド−４'−イソチ
オシアナトスチルベン−２,２'−ジスルホン酸(ＳＩＴ
Ｓ)、９−クロロアクリジン、スクシンイミジル ３−
(９−カルバゾール)プロピオネート、スクシンイミジル
１−ピレンブチレート、スクシンイミジル １−ピレン
ノナノエート、p-ニトロフェニル １−ピレンブチレー
ト、９−アントラセンプロピオン酸、スクシンイミジル
アントラセン−９−プロピオネート、２−アントラセ
ンスルホニルクロリド、または特定の方法で処理したと
きに蛍光を発する蛍光団前駆体。
【００１６】酵素系のリポーターグループは、β−ガラ
クトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルシ
フェラーゼおよび炭酸脱水酵素から選択してよい。通
常、酵素は１またはそれ以上の基質と反応して、色の変
化、ルミネッセンスまたは沈澱の生成などの検出可能な
シグナルを与えるであろう。
クトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、ルシ
フェラーゼおよび炭酸脱水酵素から選択してよい。通
常、酵素は１またはそれ以上の基質と反応して、色の変
化、ルミネッセンスまたは沈澱の生成などの検出可能な
シグナルを与えるであろう。
【００１７】リポーターグループは、当分野で自体既知
の常法に従ってポリアミドに結合させることができる。
例えば、１級アミン基などのポリアミド上の求核基を蛍
光または酵素リポーターグループと反応させて、それら
の間に共有結合を形成させることができる。別の方法に
よれば、当分野で自体既知の２官能性のカップリング試
薬[例えば、Pierce Cemical Companyのカタログ(1987)
に記載されている試薬]を用いてリポーターグループを
ポリアミドに結合させることができる。
の常法に従ってポリアミドに結合させることができる。
例えば、１級アミン基などのポリアミド上の求核基を蛍
光または酵素リポーターグループと反応させて、それら
の間に共有結合を形成させることができる。別の方法に
よれば、当分野で自体既知の２官能性のカップリング試
薬[例えば、Pierce Cemical Companyのカタログ(1987)
に記載されている試薬]を用いてリポーターグループを
ポリアミドに結合させることができる。
【００１８】ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは
常法によって製造することができる。例えば、誘導体化
されていないビオチンをＢＯＰ結合法［Castro,B. et a
l.,Synthesis,(1976), pp.751-752]を用いてオリゴヌク
レオチドに導入することができる。別法では、ビオチン
をＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステルとして
導入することができる。ビオチンはリポーターグループ
に結合させたアビジンを用いて検出することができる。
例えば、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ
コンジュゲートを用いてビオチンに結合させてよい。ア
ルカリホスファターゼは適当な基質と反応して、視覚的
に検出することが可能な不溶性の染料沈澱を生成するこ
とができる。
常法によって製造することができる。例えば、誘導体化
されていないビオチンをＢＯＰ結合法［Castro,B. et a
l.,Synthesis,(1976), pp.751-752]を用いてオリゴヌク
レオチドに導入することができる。別法では、ビオチン
をＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステルとして
導入することができる。ビオチンはリポーターグループ
に結合させたアビジンを用いて検出することができる。
例えば、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ
コンジュゲートを用いてビオチンに結合させてよい。ア
ルカリホスファターゼは適当な基質と反応して、視覚的
に検出することが可能な不溶性の染料沈澱を生成するこ
とができる。
【００１９】免疫学的な反応によってポリアミドを検出
するのが望ましいときには、当分野で周知の方法[例え
ば、Goding,J.W.,(1986),Monoclonal Antibodies：Prin
ciples and Practice,第２版,Academic Press]に従い、
オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート、ポリ
アミド単独、または担体分子、例えばＫＬＨ[キーホー
ル・ササガイ・ヘモシナニン(key hole limpet haemocy
nanin)]に結合したポリアミドを用いる免疫化によっ
て、適当な宿主動物中にポリアミドに対する抗体を生成
させてよい。
するのが望ましいときには、当分野で周知の方法[例え
ば、Goding,J.W.,(1986),Monoclonal Antibodies：Prin
ciples and Practice,第２版,Academic Press]に従い、
オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート、ポリ
アミド単独、または担体分子、例えばＫＬＨ[キーホー
ル・ササガイ・ヘモシナニン(key hole limpet haemocy
nanin)]に結合したポリアミドを用いる免疫化によっ
て、適当な宿主動物中にポリアミドに対する抗体を生成
させてよい。
【００２０】オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ標的中の相補ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼー
ションが可能なあらゆる所望の配列のものであってよ
い。一般に、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチ
ドの数は、標的配列へのハイブリダイゼーションを可能
にする十分なヌクレオチドが存在している限り重要では
ない。通常、オリゴヌクレオチドは６を越えるヌクレオ
チドを含有しているであろう。このオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことなくイ
ンビボでの半減期を長くするために適切に修飾されてい
てもよい。例えば、Argawal et al.[Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85, pp.7079-7083(1988)]またはSteinおよびCohe
n[Cancer.Res. 48, pp.2659-2688(1988)]の方法に従
い、リン骨格上の１または２個の非-架橋酸素をイオウ
またはアミンに代えることによって、オリゴヌクレオチ
ドを修飾することができる。このような修飾されたオリ
ゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドなる用語の範囲内
である。また、「オリゴヌクレオチド」なる用語には１
個のヌクレオチドが含まれていてよい。
Ａ標的中の相補ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼー
ションが可能なあらゆる所望の配列のものであってよ
い。一般に、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチ
ドの数は、標的配列へのハイブリダイゼーションを可能
にする十分なヌクレオチドが存在している限り重要では
ない。通常、オリゴヌクレオチドは６を越えるヌクレオ
チドを含有しているであろう。このオリゴヌクレオチド
は、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことなくイ
ンビボでの半減期を長くするために適切に修飾されてい
てもよい。例えば、Argawal et al.[Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85, pp.7079-7083(1988)]またはSteinおよびCohe
n[Cancer.Res. 48, pp.2659-2688(1988)]の方法に従
い、リン骨格上の１または２個の非-架橋酸素をイオウ
またはアミンに代えることによって、オリゴヌクレオチ
ドを修飾することができる。このような修飾されたオリ
ゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドなる用語の範囲内
である。また、「オリゴヌクレオチド」なる用語には１
個のヌクレオチドが含まれていてよい。
【００２１】リンカーＬは、２官能性分子 Ｒ'−Ｌ'−
Ｒ''[式中、Ｒ'およびＲ''は同一であるか、または異な
っており、−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＨ、ＯＲ(ここ
で、Ｒはヒドロキシ保護基である)、−ＣＯ2Ｒ(ここ
で、Ｒは２−ヒドロキシピリジン、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニ
ル(Ｐfp)、Ｍeである)または他の活性エステル、アシル
イミダゾール、マレイミド、トリフルオロアセテート、
ジケトン、イミドエステル、スルホネートエステル、イ
ミン、−ＣＨＯ、１,２−シクロヘキサンジオン、グリ
オキサール、スルホニルハライド、α-ハロゲン化ケト
ン、アジドなどの官能基を表し、そしてＬはアルキルま
たは置換アルキル基である]から導かれる部分を意味す
る。アルキル鎖Ｌは、ハロゲン(Ｉ、Ｂr、Ｃｌ、Ｆ)、
ヒドロキシ、シアノ、フェニル、アミノ、カルボキシ、
アルキル、アルコキシなどの通常の置換基で置換するこ
とができる。さらに、リンカーＬのアルキレン鎖は、１
またはそれ以上の２価の基、例えば−Ｏ−、−Ｓ−、−
ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−、フェニル、−Ｓ
Ｏ2−などで遮断することができる。しかし、官能基Ｒ'
は適当な条件のもとでポリアミドのアミノ末端と共有結
合を形成しうるものでなければならず、また、官能基
Ｒ''は適当な条件のもとでヌクレオチドと共有結合を形
成しうるものでなければならない。連結基Ｒ'−Ｌ−
Ｒ''および特定のコンジュゲーションの化学の選択は、
得られるプローブ分子の完全性に必須である他の巨大分
子結合、即ちペプチド、グリコシドおよびホスホジエス
テル結合を保存するという要求を満たすものでなければ
ならないのは明らかである。このリンカーをα,ωヒド
ロキシカルボン酸誘導体から導いてもよい。また、リン
カーＬは結合であってもよいし、また、ブチロラクトン
などのラクトンであってもよい。
Ｒ''[式中、Ｒ'およびＲ''は同一であるか、または異な
っており、−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−ＯＨ、ＯＲ(ここ
で、Ｒはヒドロキシ保護基である)、−ＣＯ2Ｒ(ここ
で、Ｒは２−ヒドロキシピリジン、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニ
ル(Ｐfp)、Ｍeである)または他の活性エステル、アシル
イミダゾール、マレイミド、トリフルオロアセテート、
ジケトン、イミドエステル、スルホネートエステル、イ
ミン、−ＣＨＯ、１,２−シクロヘキサンジオン、グリ
オキサール、スルホニルハライド、α-ハロゲン化ケト
ン、アジドなどの官能基を表し、そしてＬはアルキルま
たは置換アルキル基である]から導かれる部分を意味す
る。アルキル鎖Ｌは、ハロゲン(Ｉ、Ｂr、Ｃｌ、Ｆ)、
ヒドロキシ、シアノ、フェニル、アミノ、カルボキシ、
アルキル、アルコキシなどの通常の置換基で置換するこ
とができる。さらに、リンカーＬのアルキレン鎖は、１
またはそれ以上の２価の基、例えば−Ｏ−、−Ｓ−、−
ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−、フェニル、−Ｓ
Ｏ2−などで遮断することができる。しかし、官能基Ｒ'
は適当な条件のもとでポリアミドのアミノ末端と共有結
合を形成しうるものでなければならず、また、官能基
Ｒ''は適当な条件のもとでヌクレオチドと共有結合を形
成しうるものでなければならない。連結基Ｒ'−Ｌ−
Ｒ''および特定のコンジュゲーションの化学の選択は、
得られるプローブ分子の完全性に必須である他の巨大分
子結合、即ちペプチド、グリコシドおよびホスホジエス
テル結合を保存するという要求を満たすものでなければ
ならないのは明らかである。このリンカーをα,ωヒド
ロキシカルボン酸誘導体から導いてもよい。また、リン
カーＬは結合であってもよいし、また、ブチロラクトン
などのラクトンであってもよい。
【００２２】さらに、本発明はオリゴヌクレオチドの
３'-末端をポリアミドのアミノ末端に連結することから
なるオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの
製造方法を提供するものである。
３'-末端をポリアミドのアミノ末端に連結することから
なるオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの
製造方法を提供するものである。
【００２３】即ち、本方法の１態様によれば、予め調製
しておいたオリゴヌクレオチド部分または予め調製して
おいたポリアミド部分のどちらかに連結基を結合させ、
次いで残りの部分を連結基に結合させることによって、
コンジュゲートを製造することができる。
しておいたオリゴヌクレオチド部分または予め調製して
おいたポリアミド部分のどちらかに連結基を結合させ、
次いで残りの部分を連結基に結合させることによって、
コンジュゲートを製造することができる。
【００２４】別の方法によれば、適当な連結基前駆体
を、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド部分および
予め調製しておいたポリアミド部分に結合させてもよ
い。次いで、２つの前駆体を反応させると、連結基が得
られる。
を、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド部分および
予め調製しておいたポリアミド部分に結合させてもよ
い。次いで、２つの前駆体を反応させると、連結基が得
られる。
【００２５】別の態様によれば、本方法は、予め調製し
ておいたポリアミドに連結基を結合させ、次にこの連結
基にヌクレオチド塩基を結合させ、次いで１またはそれ
以上の別のヌクレオチド塩基を順次付加してオリゴヌク
レオチドを得ることからなる。
ておいたポリアミドに連結基を結合させ、次にこの連結
基にヌクレオチド塩基を結合させ、次いで１またはそれ
以上の別のヌクレオチド塩基を順次付加してオリゴヌク
レオチドを得ることからなる。
【００２６】さらに別の態様では、本方法は、予め調製
しておいたオリゴヌクレオチドに連結基を結合させ、次
にこの連結基にアミノ酸を結合させ、次いで１またはそ
れ以上のアミノ酸を順次付加してポリアミドを得ること
からなる。ポリアミド部分は、固体の支持マトリック
ス、例えば調節された(コントロールされた)多孔ガラス
(ＣＰＧ)などに結合させることもできる。
しておいたオリゴヌクレオチドに連結基を結合させ、次
にこの連結基にアミノ酸を結合させ、次いで１またはそ
れ以上のアミノ酸を順次付加してポリアミドを得ること
からなる。ポリアミド部分は、固体の支持マトリック
ス、例えば調節された(コントロールされた)多孔ガラス
(ＣＰＧ)などに結合させることもできる。
【００２７】本発明の特に好ましい態様によれば、以下
に挙げる工程からなるオリゴヌクレオチド-ポリアミド
コンジュゲートの製造方法が提供される： (a)第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット(アミド結合
によって互いに結合している)のＣ-末端を、支持マトリ
ックスと反応させてそれらを結合させ； (b)次に、この支持マトリックスを、周知の固相ペプチ
ド合成法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸と順次反
応させてポリアミドを得； (c)この支持マトリックス-ポリアミドを、リンカーの第
１の反応性基と反応させてポリアミドのアミノ末端とリ
ンカーを結合させ； (d)工程(c)の生成物を、第１のヌ
クレオチドと反応させてリンカーの第２の反応性基とヌ
クレオチドの３'ホスフェートを結合させ; (e)次い
で、この支持マトリックスを、周知の固相オリゴヌクレ
オチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌクレオチド
と順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；そして (f)所望により、オリゴヌクレオチド-ポリアミド コン
ジュゲートを支持マトリックスから切断し、ポリアミド
またはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合したあらゆ
る保護基を除去し、そして得られたコンジュゲートを精
製する。リンカーＬが結合であるときには、工程(c)を
省略する。
に挙げる工程からなるオリゴヌクレオチド-ポリアミド
コンジュゲートの製造方法が提供される： (a)第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット(アミド結合
によって互いに結合している)のＣ-末端を、支持マトリ
ックスと反応させてそれらを結合させ； (b)次に、この支持マトリックスを、周知の固相ペプチ
ド合成法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸と順次反
応させてポリアミドを得； (c)この支持マトリックス-ポリアミドを、リンカーの第
１の反応性基と反応させてポリアミドのアミノ末端とリ
ンカーを結合させ； (d)工程(c)の生成物を、第１のヌ
クレオチドと反応させてリンカーの第２の反応性基とヌ
クレオチドの３'ホスフェートを結合させ; (e)次い
で、この支持マトリックスを、周知の固相オリゴヌクレ
オチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌクレオチド
と順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；そして (f)所望により、オリゴヌクレオチド-ポリアミド コン
ジュゲートを支持マトリックスから切断し、ポリアミド
またはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合したあらゆ
る保護基を除去し、そして得られたコンジュゲートを精
製する。リンカーＬが結合であるときには、工程(c)を
省略する。
【００２８】ポリアミドは、例えば、固相Ｆmoc法[Athe
rton,R. and Shepard,R.C.,(1985),J.Chem.Soc.Commun,
pp.165-166]または固相Ｂoc法[Barany,G. and Merrifie
ld,R.B.,(1980),"Solid-Phase Peptide Synthesis"；"T
he Peptides", 第２巻, E.Gross & J.Meienhofer編, Ac
ademic Press,New York,pp.1-284 中]を用いて合成する
ことができる。これらの方法においては、アミノ酸を当
分野で自体既知の通常の保護基[例えば、Green,(198
1),"Protective Groups in Organic Synthesis",John W
iley & Sons,Inc.；Atherton and Sheppard,(1985),J.C
hem.Soc.Commun,pp.165-166；Barany and Merrifield,
上記]で保護して反応性部分を保護する。
rton,R. and Shepard,R.C.,(1985),J.Chem.Soc.Commun,
pp.165-166]または固相Ｂoc法[Barany,G. and Merrifie
ld,R.B.,(1980),"Solid-Phase Peptide Synthesis"；"T
he Peptides", 第２巻, E.Gross & J.Meienhofer編, Ac
ademic Press,New York,pp.1-284 中]を用いて合成する
ことができる。これらの方法においては、アミノ酸を当
分野で自体既知の通常の保護基[例えば、Green,(198
1),"Protective Groups in Organic Synthesis",John W
iley & Sons,Inc.；Atherton and Sheppard,(1985),J.C
hem.Soc.Commun,pp.165-166；Barany and Merrifield,
上記]で保護して反応性部分を保護する。
【００２９】オリゴヌクレオチドは、固相ホスホトリエ
ステル法[Sproat and Gait,(1984),"Oligonucleotide S
ynthesis,A Practical Approach",pp.83-116,IRL Pres
s,Oxford]、固相Ｈ-ホスホネート法[Froehler et al.,
(1986),Nucleic Acids Research,14,pp.5399-5407]、ま
たは固相ホスホルアミダイト法[Beaucage and Caruther
s,(1981),Tetrahedron Lett.,22,pp.1859-1862]によっ
て合成することができる。これらの方法のそれぞれにお
いて、ヒドロキシまたはアミノ基などの反応性基は、文
献記載[Green,(1981),"Protective Groups in Organic
Synthesis", JohnWiley & Sons,Inc.；Beaucage,S.L. a
nd Caruthers,M.H.,(1981),TetrahedronLett.,22,pp.18
59-1862；Sproat,S. and Gait,M.J.,(1984),"Oligonucl
eotide Synthesis, A Practical Approach",pp.83-116,
IRL Press,Oxford]のようにして、通常のヒドロキシお
よびアミノ保護基によって保護することができる。オリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの合成が終
わったら、当分野で自体既知の方法に従って脱保護を行
ってよい。
ステル法[Sproat and Gait,(1984),"Oligonucleotide S
ynthesis,A Practical Approach",pp.83-116,IRL Pres
s,Oxford]、固相Ｈ-ホスホネート法[Froehler et al.,
(1986),Nucleic Acids Research,14,pp.5399-5407]、ま
たは固相ホスホルアミダイト法[Beaucage and Caruther
s,(1981),Tetrahedron Lett.,22,pp.1859-1862]によっ
て合成することができる。これらの方法のそれぞれにお
いて、ヒドロキシまたはアミノ基などの反応性基は、文
献記載[Green,(1981),"Protective Groups in Organic
Synthesis", JohnWiley & Sons,Inc.；Beaucage,S.L. a
nd Caruthers,M.H.,(1981),TetrahedronLett.,22,pp.18
59-1862；Sproat,S. and Gait,M.J.,(1984),"Oligonucl
eotide Synthesis, A Practical Approach",pp.83-116,
IRL Press,Oxford]のようにして、通常のヒドロキシお
よびアミノ保護基によって保護することができる。オリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの合成が終
わったら、当分野で自体既知の方法に従って脱保護を行
ってよい。
【００３０】本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミド
コンジュゲートは、完全に保護され、支持マトリックス
に結合しているか、支持マトリックスから除去され保護
された形態であるか、または完全に脱保護された形態で
あってよい。これらの状態のそれぞれが「オリゴヌクレ
オチド-ポリアミド コンジュゲート」なる用語の範囲内
にある。
コンジュゲートは、完全に保護され、支持マトリックス
に結合しているか、支持マトリックスから除去され保護
された形態であるか、または完全に脱保護された形態で
あってよい。これらの状態のそれぞれが「オリゴヌクレ
オチド-ポリアミド コンジュゲート」なる用語の範囲内
にある。
【００３１】支持マトリックスは、例えば、調節された
多孔ガラス[アミノプロピル調節多孔ガラス(ＡＰ−ＣＰ
Ｇ)など]またはポリスチレン樹脂などから選択してよ
い。ポリアミドと結合した支持マトリックスは固体の支
持体を構成し、その上でオリゴヌクレオチド合成が行わ
れる。
多孔ガラス[アミノプロピル調節多孔ガラス(ＡＰ−ＣＰ
Ｇ)など]またはポリスチレン樹脂などから選択してよ
い。ポリアミドと結合した支持マトリックスは固体の支
持体を構成し、その上でオリゴヌクレオチド合成が行わ
れる。
【００３２】本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミド
コンジュゲートの好ましい合成法は、大きなバッチのポ
リアミド(そのＣ-末端で支持マトリックスに結合してい
る)を前もって製造することができ、そして必要なとき
にその一部を所望のオリゴヌクレオチドを組立てるため
に用いることができ、好都合である。さらに、段階的な
合成によって、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド
を予め調製しておいたポリアミドに結合させることによ
って得られる収率よりも高い、優れたオリゴヌクレオチ
ド-ポリアミド コンジュゲートの収率が得られることに
なる。
コンジュゲートの好ましい合成法は、大きなバッチのポ
リアミド(そのＣ-末端で支持マトリックスに結合してい
る)を前もって製造することができ、そして必要なとき
にその一部を所望のオリゴヌクレオチドを組立てるため
に用いることができ、好都合である。さらに、段階的な
合成によって、予め調製しておいたオリゴヌクレオチド
を予め調製しておいたポリアミドに結合させることによ
って得られる収率よりも高い、優れたオリゴヌクレオチ
ド-ポリアミド コンジュゲートの収率が得られることに
なる。
【００３３】ポリアミドは通常の市販のペプチド合成機
[例えば、Applied Biosystems Inc.から入手可能]で合
成してよく、次いでオリゴヌクレオチドの合成のための
通常の市販のオリゴヌクレオチド合成機[例えば、Appli
ed Biosystems Inc.から供給されている合成機]に移し
てよい。
[例えば、Applied Biosystems Inc.から入手可能]で合
成してよく、次いでオリゴヌクレオチドの合成のための
通常の市販のオリゴヌクレオチド合成機[例えば、Appli
ed Biosystems Inc.から供給されている合成機]に移し
てよい。
【００３４】１またはそれ以上のリポーターグループ
を、多くの異なる段階でポリアミドに導入することがで
きる。このリポーターグループはポリアミドの合成前
(段階I)にアミノ酸中に存在することができ；ポリアミ
ドの合成後(段階Ia)に；リンカーの付加後(段階II)に；
支持マトリックス上でのオリゴヌクレオチドの合成後
(段階III)に；または、脱保護および支持マトリックス
からのオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート
の精製後(段階IV)に導入することができる。選択される
方法は選択されるリポーターグループおよび合成方法に
依存するであろう。
を、多くの異なる段階でポリアミドに導入することがで
きる。このリポーターグループはポリアミドの合成前
(段階I)にアミノ酸中に存在することができ；ポリアミ
ドの合成後(段階Ia)に；リンカーの付加後(段階II)に；
支持マトリックス上でのオリゴヌクレオチドの合成後
(段階III)に；または、脱保護および支持マトリックス
からのオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート
の精製後(段階IV)に導入することができる。選択される
方法は選択されるリポーターグループおよび合成方法に
依存するであろう。
【００３５】リポーターグループがペプチドおよびオリ
ゴヌクレオチド合成の両方の条件に安定であるときに
は、これを誘導体化されたアミノ酸としてポリアミド合
成の始めから導入することができる(段階Ia)。ＤＮＡ合
成の条件には安定であるがペプチド合成の条件には安定
ではないときには、これをポリアミドの合成後に導入す
ることができる(段階IまたはII)。リポーターグループ
がペプチドまたはオリゴヌクレオチド鎖の組立のどちら
にも安定ではないが脱保護方法に安定であるときには、
完全に保護されたポリアミド-オリゴヌクレオチド コン
ジュゲートのオリゴヌクレオチド鎖の組立の後に導入す
ることができる(段階III)。これらの方法は、ポリアミ
ド-オリゴヌクレオチド コンジュゲートが固体の支持体
上にあるままでラベルが導入され、従って過剰のリポー
ターグループを用いることができ、反応後に過剰量を簡
単に洗い落とすことができるので好都合である。ラベル
がコンジュゲートの合成に用いるどの条件にも安定では
ないときには、精製され完全に脱保護されたポリアミド
-オリゴヌクレオチド コンジュゲートとの液相反応にお
いて導入することができる(段階IV)。
ゴヌクレオチド合成の両方の条件に安定であるときに
は、これを誘導体化されたアミノ酸としてポリアミド合
成の始めから導入することができる(段階Ia)。ＤＮＡ合
成の条件には安定であるがペプチド合成の条件には安定
ではないときには、これをポリアミドの合成後に導入す
ることができる(段階IまたはII)。リポーターグループ
がペプチドまたはオリゴヌクレオチド鎖の組立のどちら
にも安定ではないが脱保護方法に安定であるときには、
完全に保護されたポリアミド-オリゴヌクレオチド コン
ジュゲートのオリゴヌクレオチド鎖の組立の後に導入す
ることができる(段階III)。これらの方法は、ポリアミ
ド-オリゴヌクレオチド コンジュゲートが固体の支持体
上にあるままでラベルが導入され、従って過剰のリポー
ターグループを用いることができ、反応後に過剰量を簡
単に洗い落とすことができるので好都合である。ラベル
がコンジュゲートの合成に用いるどの条件にも安定では
ないときには、精製され完全に脱保護されたポリアミド
-オリゴヌクレオチド コンジュゲートとの液相反応にお
いて導入することができる(段階IV)。
【００３６】蛍光団は、I〜IVのいずれかの段階でオリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートに導入する
ことができる。これはビオチンの場合も同様である。酵
素、およびコロイド状化合物(コロイド状金、コロイド
銀あるいはフェリチンなど)は段階IVで導入することが
できる。オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲー
トのポリアミド部分は、得られる検出シグナルを増大さ
せ、従って検出を容易にする複数のリポーターグループ
を含んでいてもよい。
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートに導入する
ことができる。これはビオチンの場合も同様である。酵
素、およびコロイド状化合物(コロイド状金、コロイド
銀あるいはフェリチンなど)は段階IVで導入することが
できる。オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲー
トのポリアミド部分は、得られる検出シグナルを増大さ
せ、従って検出を容易にする複数のリポーターグループ
を含んでいてもよい。
【００３７】コンジュゲートのポリアミド部分はリポー
ターグループを結合するための媒体として機能するだけ
でなく、ポリアミドを特定の細胞型、細胞位置に向けさ
せるためのアドレス・マーカーとしても作用するか、ま
たはオリゴヌクレオチドの細胞膜の通過を増強すること
もある。ペプチド配列のアドレス・ラベル活性はよく調
べられている［Verner and Schatz,(1988), Science 24
1, pp.1307-1313；およびGoldfarb et al.,(1986), Nat
ure 322, pp.641-644]。例えば、細胞表面受容体によっ
て認識されるペプチド配列を選択することによって、該
ペプチド配列にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド
を特定の細胞型中に運搬することができ、ここでこれら
は生物学的作用を発揮することができる(例えば、アン
チセンス オリゴヌクレオチドの場合にはウイルス性ま
たは細胞性ＲＮＡの転写をブロックする)。
ターグループを結合するための媒体として機能するだけ
でなく、ポリアミドを特定の細胞型、細胞位置に向けさ
せるためのアドレス・マーカーとしても作用するか、ま
たはオリゴヌクレオチドの細胞膜の通過を増強すること
もある。ペプチド配列のアドレス・ラベル活性はよく調
べられている［Verner and Schatz,(1988), Science 24
1, pp.1307-1313；およびGoldfarb et al.,(1986), Nat
ure 322, pp.641-644]。例えば、細胞表面受容体によっ
て認識されるペプチド配列を選択することによって、該
ペプチド配列にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド
を特定の細胞型中に運搬することができ、ここでこれら
は生物学的作用を発揮することができる(例えば、アン
チセンス オリゴヌクレオチドの場合にはウイルス性ま
たは細胞性ＲＮＡの転写をブロックする)。
【００３８】本発明の別の態様においては、ウイルス
性、細菌性、またはその他の疾病の治療方法であって、
そのような治療を必要としている患者に本発明のオリゴ
ヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの治療学的有
効量を投与することを特徴とし、さらに、このコンジュ
ゲートのオリゴヌクレオチド部分が特定のウイルス性、
細菌性または他のポリヌクレオチドに相補性であるアン
チセンス オリゴヌクレオチドであって特定のポリヌク
レオチドの転写または翻訳をブロックするものであるこ
とを特徴とする方法が提供される。
性、細菌性、またはその他の疾病の治療方法であって、
そのような治療を必要としている患者に本発明のオリゴ
ヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの治療学的有
効量を投与することを特徴とし、さらに、このコンジュ
ゲートのオリゴヌクレオチド部分が特定のウイルス性、
細菌性または他のポリヌクレオチドに相補性であるアン
チセンス オリゴヌクレオチドであって特定のポリヌク
レオチドの転写または翻訳をブロックするものであるこ
とを特徴とする方法が提供される。
【００３９】アンチセンス オリゴヌクレオチドの特定
の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに
よって、ウイルスまたは細菌の完全性または増殖に関係
しているウイルス性または細菌性タンパク質の合成およ
び／または毒素の合成を阻害することができる。
の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに
よって、ウイルスまたは細菌の完全性または増殖に関係
しているウイルス性または細菌性タンパク質の合成およ
び／または毒素の合成を阻害することができる。
【００４０】「他の疾病」と言及したのは、細胞にとっ
て内生の遺伝子の発現による疾病状態に関係している。
例えば、mycタンパク質などの細胞転換を引き起こす
か、またはそれに関与しているタンパク質をコードして
いるmＲＮＡを、適切なアンチセンス オリゴヌクレオチ
ドを有する本発明のポリアミド-オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲートで不活化することができる。
て内生の遺伝子の発現による疾病状態に関係している。
例えば、mycタンパク質などの細胞転換を引き起こす
か、またはそれに関与しているタンパク質をコードして
いるmＲＮＡを、適切なアンチセンス オリゴヌクレオチ
ドを有する本発明のポリアミド-オリゴヌクレオチドコ
ンジュゲートで不活化することができる。
【００４１】オリゴヌクレオチドの治療学的有効量と
は、目的のポリヌクレオチドの転写または翻訳をブロッ
クする量である。この量は、目的のポリヌクレオチドの
量および／またはその合成速度、コンジュゲートの細胞
取込み速度および／またはその安定性、および治療しよ
うとする対象の体重および年齢に応じて変化するであろ
う。それぞれの場合において、治療学的有効量は診断を
行う医師または獣医の決定に基づくであろう。
は、目的のポリヌクレオチドの転写または翻訳をブロッ
クする量である。この量は、目的のポリヌクレオチドの
量および／またはその合成速度、コンジュゲートの細胞
取込み速度および／またはその安定性、および治療しよ
うとする対象の体重および年齢に応じて変化するであろ
う。それぞれの場合において、治療学的有効量は診断を
行う医師または獣医の決定に基づくであろう。
【００４２】また、オリゴヌクレオチド-ポリアミド コ
ンジュゲートのポリアミド部分は、オリゴヌクレオチド
部分を細胞性の分解から安定化するように作用すること
もある[Le Maitre et al.,(1987),Biochemistry 84,pp.
648-652]。さらに、オリゴヌクレオチド部分はポリアミ
ドの性質を高めることもある(例えば、その溶解性を改
善するなど)。
ンジュゲートのポリアミド部分は、オリゴヌクレオチド
部分を細胞性の分解から安定化するように作用すること
もある[Le Maitre et al.,(1987),Biochemistry 84,pp.
648-652]。さらに、オリゴヌクレオチド部分はポリアミ
ドの性質を高めることもある(例えば、その溶解性を改
善するなど)。
【００４３】本発明のさらに別の態様によれば、式：Ｚ
−Ｘ−Ｌ[式中、Ｚは固相マトリックスを表し、Ｘはそ
のＣ-末端で固相マトリックスに結合したポリアミドを
表し、そしてＬはポリアミドのＮ-末端に結合される第
１の反応性基、およびヌクレオチドの３'ホスフェート
と結合することができる第２の反応性基を有する２官能
性のリンカーを表す]で示されるポリアミドが提供され
る。このポリアミドは本発明のコンジュゲートの合成に
おける中間体である。オリゴヌクレオチドを、２官能性
リンカーＬの第２の反応性基上で直接合成することもで
きる。
−Ｘ−Ｌ[式中、Ｚは固相マトリックスを表し、Ｘはそ
のＣ-末端で固相マトリックスに結合したポリアミドを
表し、そしてＬはポリアミドのＮ-末端に結合される第
１の反応性基、およびヌクレオチドの３'ホスフェート
と結合することができる第２の反応性基を有する２官能
性のリンカーを表す]で示されるポリアミドが提供され
る。このポリアミドは本発明のコンジュゲートの合成に
おける中間体である。オリゴヌクレオチドを、２官能性
リンカーＬの第２の反応性基上で直接合成することもで
きる。
【００４４】本発明のコンジュゲートは、標的試料中の
特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出のためのハイブ
リダイゼーションプローブとして重要な用途を有してい
る。オリゴヌクレオチドの標的配列への結合を、ポリア
ミドに結合させたリポーターグループによって、または
ポリアミドに結合している抗体によって検出する。従っ
て、本発明のコンジュゲートは、ウイルス(例えば、Ａ
ＩＤＳウイルスまたは肝炎ウイルスなど)の核酸、細菌
の核酸、または遺伝的障害(例えば、筋ジストロフィー
または嚢性線維症など)に関係しているＤＮＡの検出に
用いることができる。本発明のコンジュゲートを、ニト
ロセルロース、誘導体化した紙またはナイロンメンブラ
ンなどのマトリックスに結合させた標的配列へのハイブ
リダイゼーションに用いることができる。別法では、本
コンジュゲートを組織片へのその場でのハイブリダイゼ
ーションに用いて(「ハイブリダイゼーション組織化
学」としても知られる)、組織片中の標的ポリヌクレオ
チドを検出することができる。
特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出のためのハイブ
リダイゼーションプローブとして重要な用途を有してい
る。オリゴヌクレオチドの標的配列への結合を、ポリア
ミドに結合させたリポーターグループによって、または
ポリアミドに結合している抗体によって検出する。従っ
て、本発明のコンジュゲートは、ウイルス(例えば、Ａ
ＩＤＳウイルスまたは肝炎ウイルスなど)の核酸、細菌
の核酸、または遺伝的障害(例えば、筋ジストロフィー
または嚢性線維症など)に関係しているＤＮＡの検出に
用いることができる。本発明のコンジュゲートを、ニト
ロセルロース、誘導体化した紙またはナイロンメンブラ
ンなどのマトリックスに結合させた標的配列へのハイブ
リダイゼーションに用いることができる。別法では、本
コンジュゲートを組織片へのその場でのハイブリダイゼ
ーションに用いて(「ハイブリダイゼーション組織化
学」としても知られる)、組織片中の標的ポリヌクレオ
チドを検出することができる。
【００４５】本発明の別の態様においては、生物学的試
料中の特定のウイルス性、細菌性またはその他のポリヌ
クレオチドの存在または非存在を検出するための方法で
あって、核酸試料を本発明のオリゴヌクレオチド-ポリ
アミド コンジュゲート(ここで、コンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相
補性である)と接触させ、次いでコンジュゲートのハイ
ブリダイゼーションが起こるかどうかを検出することを
特徴とする方法が提供される。
料中の特定のウイルス性、細菌性またはその他のポリヌ
クレオチドの存在または非存在を検出するための方法で
あって、核酸試料を本発明のオリゴヌクレオチド-ポリ
アミド コンジュゲート(ここで、コンジュゲートのオリ
ゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相
補性である)と接触させ、次いでコンジュゲートのハイ
ブリダイゼーションが起こるかどうかを検出することを
特徴とする方法が提供される。
【００４６】生物学的試料は、生物学的液体(血液また
は血漿など)、細胞(リンパ球など)、または組織バイオ
プシーからなっていてよい。試料からの核酸、即ちＤＮ
ＡまたはＲＮＡは、当分野で自体既知の方法に従って抽
出し、そしてコンジュゲートで検出してよい。コンジュ
ゲートはそれ自体がハイブリダイゼーションの検出用の
リポーターグループでラベルされていてもよく、またそ
れとは異なり、標的ポリヌクレオチドに結合したコンジ
ュゲートを、例えば抗体試薬を用いて適切に検出するこ
ともできる。
は血漿など)、細胞(リンパ球など)、または組織バイオ
プシーからなっていてよい。試料からの核酸、即ちＤＮ
ＡまたはＲＮＡは、当分野で自体既知の方法に従って抽
出し、そしてコンジュゲートで検出してよい。コンジュ
ゲートはそれ自体がハイブリダイゼーションの検出用の
リポーターグループでラベルされていてもよく、またそ
れとは異なり、標的ポリヌクレオチドに結合したコンジ
ュゲートを、例えば抗体試薬を用いて適切に検出するこ
ともできる。
【００４７】本発明のさらに別の態様においては、支持
マトリックスに固定化されたか、または他の方法でそれ
に結合している特定のポリヌクレオチドを検出するため
の方法であって、支持マトリックスを本発明のオリゴヌ
クレオチド-ポリアミド コンジュゲート(ここで、コン
ジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレ
オチドの一部に相補性である)と接触させ、次いでコン
ジュゲートの支持マトリックスへのハイブリダイゼーシ
ョンを検出することを特徴とする方法が提供される。
マトリックスに固定化されたか、または他の方法でそれ
に結合している特定のポリヌクレオチドを検出するため
の方法であって、支持マトリックスを本発明のオリゴヌ
クレオチド-ポリアミド コンジュゲート(ここで、コン
ジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレ
オチドの一部に相補性である)と接触させ、次いでコン
ジュゲートの支持マトリックスへのハイブリダイゼーシ
ョンを検出することを特徴とする方法が提供される。
【００４８】また、本発明の別の態様においては、動物
または植物組織中の特定のポリヌクレオチド群の存在お
よび位置を測定するための方法であって、 (a)被験組織片を調製し； (b)この組織片を本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミ
ド コンジュゲート(ここで、コンジュゲートのオリゴヌ
クレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性
である)とハイブリダイズさせ； (c)組織片からハイブリダイズしていないプローブ物質
を除去し;そして (d)コンジュゲートのハイブリダイゼーションによって
ラベル化された組織片中の位置を検出するか、または同
定すること；を特徴とする方法が提供される。
または植物組織中の特定のポリヌクレオチド群の存在お
よび位置を測定するための方法であって、 (a)被験組織片を調製し； (b)この組織片を本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミ
ド コンジュゲート(ここで、コンジュゲートのオリゴヌ
クレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性
である)とハイブリダイズさせ； (c)組織片からハイブリダイズしていないプローブ物質
を除去し;そして (d)コンジュゲートのハイブリダイゼーションによって
ラベル化された組織片中の位置を検出するか、または同
定すること；を特徴とする方法が提供される。
【００４９】さらに別の本発明の態様においては、目的
のポリヌクレオチドを検出するための診断用キットであ
って、本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジ
ュゲート(ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチ
ド部分は目的のポリヌクレオチドの一部に相補性であ
る)；およびコンジュゲートのハイブリダイゼーション
を検出するための試薬からなるキットが提供される。そ
のような診断用キットは組織片調製のための試薬をさら
に含有していてもよい。そのような試薬の例はホルムア
ルデヒド、グルタルアルデヒドおよび酢酸である。
のポリヌクレオチドを検出するための診断用キットであ
って、本発明のオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジ
ュゲート(ここで、コンジュゲートのオリゴヌクレオチ
ド部分は目的のポリヌクレオチドの一部に相補性であ
る)；およびコンジュゲートのハイブリダイゼーション
を検出するための試薬からなるキットが提供される。そ
のような診断用キットは組織片調製のための試薬をさら
に含有していてもよい。そのような試薬の例はホルムア
ルデヒド、グルタルアルデヒドおよび酢酸である。
【００５０】以下に実施例および図面を挙げて本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。図１は、固相ペプチド合成の反応工程を
示すものである。図２は、オリゴヌクレオチド-ポリア
ミド コンジュゲート製造の反応工程を示すものであ
る。図３は、変性２０％ポリアクリルアミドゲルでの、
32Ｐで末端ラベルした粗製のＫＰＩＢ−(ＡlaＬys)5−
Ａla(レーン１)および正常なＫＰＩＢ(レーン２)の電気
泳動分析を示すものである。図４は、ビオチンラベルし
たポリアミド-オリゴヌクレオチド コンジュゲートを用
いるドットブロット ハイブリダイゼーションを示すも
のである。ＮＣはネガティブ対照を示す。図５は、雄性
マウス顎下腺の６μｍ凍結切片にハイブリダイズするビ
オチンラベルしたポリアミド-カリクレイン オリゴヌク
レオチドを示すものである。暗い領域はコンジュゲート
のハイブリダイゼーションを示す。
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。図１は、固相ペプチド合成の反応工程を
示すものである。図２は、オリゴヌクレオチド-ポリア
ミド コンジュゲート製造の反応工程を示すものであ
る。図３は、変性２０％ポリアクリルアミドゲルでの、
32Ｐで末端ラベルした粗製のＫＰＩＢ−(ＡlaＬys)5−
Ａla(レーン１)および正常なＫＰＩＢ(レーン２)の電気
泳動分析を示すものである。図４は、ビオチンラベルし
たポリアミド-オリゴヌクレオチド コンジュゲートを用
いるドットブロット ハイブリダイゼーションを示すも
のである。ＮＣはネガティブ対照を示す。図５は、雄性
マウス顎下腺の６μｍ凍結切片にハイブリダイズするビ
オチンラベルしたポリアミド-カリクレイン オリゴヌク
レオチドを示すものである。暗い領域はコンジュゲート
のハイブリダイゼーションを示す。
【００５１】
【実施例】実施例１ ：試薬の合成４−(４,４'−ジメトキシトリチルオキシ)酪酸 ４−ニ
トロフェニル (１a) ４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム(１.２６ｇ；１０ｍモ
ル)および４,４'−ジメトキシトリチルクロリド(ＤＭＴ
rＣｌ)(３.３９ｇ；１０ｍモル)をピリジン(３０ｍｌ)
中で１６時間撹拌した。４−ニトロフェノール(１.３０
ｇ；１０ｍモル)およびジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(ＤＣＣ)(２.０６ｇ；１０ｍモル)を加え、さらに２
日間撹拌した。この反応混合物を濾過し、次いで溶液を
濃縮し、２５％ＥtＯＡc／石油エーテルを用いてシリカ
ゲル(７０ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ
淡黄色の油状物を得た(５.０ｇ；９５％)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２.０４(ｍ,２Ｈ,Ｈ3)、２.
７(ｔ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ,Ｈ2)、３.２(ｔ,Ｊ＝５.９Ｈ
z,２Ｈ,Ｈ4)、３.７７(ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3)、６.８−７.
５(ｍ,１５Ｈ,ＡrＨ)、８.２(ｄ,Ｊ＝９.２Ｈz,２Ｈ,Ｐ
hＮＯ2 ｍ-Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.２(Ｃ３)、３１.６
(Ｃ２)、５５.２(ＯＣＨ3)、６２.０(Ｃ４)、８６.０
(ＣＡr3)、１１３.１、１２６.８、１２７.１、１２７.
８、１２７.９、１２８.１、１２９.１、１３０.０、１
３６.２、１４５.０、１５８.４(ＤＭＴr)、１２２.
４、１２５.１、１４５.２、１５５.４(ＰhＮＯ2)、１
７１.１(ＣＯ2)。 この生成物は若干のＥtＯＡc溶媒を含んでいた。
トロフェニル (１a) ４−ヒドロキシ酪酸ナトリウム(１.２６ｇ；１０ｍモ
ル)および４,４'−ジメトキシトリチルクロリド(ＤＭＴ
rＣｌ)(３.３９ｇ；１０ｍモル)をピリジン(３０ｍｌ)
中で１６時間撹拌した。４−ニトロフェノール(１.３０
ｇ；１０ｍモル)およびジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(ＤＣＣ)(２.０６ｇ；１０ｍモル)を加え、さらに２
日間撹拌した。この反応混合物を濾過し、次いで溶液を
濃縮し、２５％ＥtＯＡc／石油エーテルを用いてシリカ
ゲル(７０ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ
淡黄色の油状物を得た(５.０ｇ；９５％)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２.０４(ｍ,２Ｈ,Ｈ3)、２.
７(ｔ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ,Ｈ2)、３.２(ｔ,Ｊ＝５.９Ｈ
z,２Ｈ,Ｈ4)、３.７７(ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3)、６.８−７.
５(ｍ,１５Ｈ,ＡrＨ)、８.２(ｄ,Ｊ＝９.２Ｈz,２Ｈ,Ｐ
hＮＯ2 ｍ-Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.２(Ｃ３)、３１.６
(Ｃ２)、５５.２(ＯＣＨ3)、６２.０(Ｃ４)、８６.０
(ＣＡr3)、１１３.１、１２６.８、１２７.１、１２７.
８、１２７.９、１２８.１、１２９.１、１３０.０、１
３６.２、１４５.０、１５８.４(ＤＭＴr)、１２２.
４、１２５.１、１４５.２、１５５.４(ＰhＮＯ2)、１
７１.１(ＣＯ2)。 この生成物は若干のＥtＯＡc溶媒を含んでいた。
【００５２】４−[(９−フェニル−９−キサンチル)オ
キシ]酪酸 ４−ニトロフェニル (１b) この化合物は、ピキシルクロリド(ＰxＣｌ)をジメトキ
シトリチルクロリドの代わりに用いたことを除き、１a
の合成に用いた方法と同じ方法を用いて合成し、８０％
の収率で１bを得た。 融点：１３０−１３０.５℃(ＥtＯＡc)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.９８(ｍ,２Ｈ,Ｈ３)、
２.７(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,Ｈ２)、３.０(ｔ,Ｊ＝５.
８Ｈz,２Ｈ,Ｈ４)、７.０−７.５(ｍ,１５Ｈ,ＡrＨ)、
８.２(ｄ,Ｊ＝７.１Ｈz,２Ｈ,ＰhＮＯ2 ｍ-Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.０(Ｃ３)、３１.５
(Ｃ２)、６１.８(Ｃ４)、７５.４(ＣＰh3)、１１６.
３、１２３.２、１２３.５、１２６.４、１２６.６、１
２７.９、１２９.１、１２９.４、１４８.９、１５１.
３(Ｐx Ｃ)、１２２.４、１２５.１、１４５.２、１５
５.４(ＰhＮＯ2 Ｃ)、１７１.０(ＣＯ2)。
キシ]酪酸 ４−ニトロフェニル (１b) この化合物は、ピキシルクロリド(ＰxＣｌ)をジメトキ
シトリチルクロリドの代わりに用いたことを除き、１a
の合成に用いた方法と同じ方法を用いて合成し、８０％
の収率で１bを得た。 融点：１３０−１３０.５℃(ＥtＯＡc)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.９８(ｍ,２Ｈ,Ｈ３)、
２.７(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,Ｈ２)、３.０(ｔ,Ｊ＝５.
８Ｈz,２Ｈ,Ｈ４)、７.０−７.５(ｍ,１５Ｈ,ＡrＨ)、
８.２(ｄ,Ｊ＝７.１Ｈz,２Ｈ,ＰhＮＯ2 ｍ-Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.０(Ｃ３)、３１.５
(Ｃ２)、６１.８(Ｃ４)、７５.４(ＣＰh3)、１１６.
３、１２３.２、１２３.５、１２６.４、１２６.６、１
２７.９、１２９.１、１２９.４、１４８.９、１５１.
３(Ｐx Ｃ)、１２２.４、１２５.１、１４５.２、１５
５.４(ＰhＮＯ2 Ｃ)、１７１.０(ＣＯ2)。
【００５３】３−[６−(４,４'−ジメトキシトリチルオ
キシ)ヘキシルカルバモイル]プロパン酸 ４−ニトロフ
ェニル (２) ピリジン(１０ｍｌ)中の無水コハク酸(１.０ｇ；１０ｍ
モル)および６−アミノヘキサノール(１.１７ｇ；１０
ｍモル)を４ｄ撹拌した。次いで、ＤＭＴrＣｌ(３.３９
ｇ；１０ｍモル)を加えてさらに４時間撹拌し、続いてp
-ニトロフェノール(１.３９ｇ；１０ｍモル)およびＤＣ
Ｃ(２.０６ｇ；１０ｍモル)を加え、この混合物をさら
に２ｄ撹拌した。反応混合物を濾過し、溶液を濃縮し、
５０％ＥtＯＡc／石油エーテルを用いてシリカゲル(１
００ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ淡黄
色の油状物を得た(４.０９ｇ；６４％)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.２−１.７(ｍ,８Ｈ,ＣＨ
2)、２.５(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、２.９３(ｔ,
Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、３.０１(ｔ,Ｊ＝６.４Ｈz,
２Ｈ,ＣＨ2)、３.２(ｔ,Ｊ＝６.４Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、
３.７６(ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3)、６.８−７.５(ｍ,１５Ｈ,
ＡrＨ)、８.２(ｄ,Ｊ＝９.２Ｈz,２Ｈ,ＰＨＮＯ2 ｍ-
Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.８３、２６.６９、２
９.５３、２９.８７、３０.５５(ＣＨ2)、３９.６８(Ｃ
Ｈ2ＮＨＣＯ)、５５.１４(ＯＣＨ3)、６３.１６(ＤＭＴ
rＯＣＨ2)、８５.６０(ＣＡr3)、１１２.９１、１２６.
５３、１２７.６４、１２７.７０、１２７.７９、１２
８.１０、１２９.０７、１２９.９５、１３６.６０、１
４５.３２、１５８.２６(ＤＭＴr Ｃ)、１２２.４、１
２５.１、１４５.３１、１５５.８(ＰhＮＯ2 Ｃ)、１７
０.４９、１７０.７５(Ｃ＝Ｏ)。 この化合物は容易に除去することができないＥtＯＡc溶
媒を若干含んでいた。
キシ)ヘキシルカルバモイル]プロパン酸 ４−ニトロフ
ェニル (２) ピリジン(１０ｍｌ)中の無水コハク酸(１.０ｇ；１０ｍ
モル)および６−アミノヘキサノール(１.１７ｇ；１０
ｍモル)を４ｄ撹拌した。次いで、ＤＭＴrＣｌ(３.３９
ｇ；１０ｍモル)を加えてさらに４時間撹拌し、続いてp
-ニトロフェノール(１.３９ｇ；１０ｍモル)およびＤＣ
Ｃ(２.０６ｇ；１０ｍモル)を加え、この混合物をさら
に２ｄ撹拌した。反応混合物を濾過し、溶液を濃縮し、
５０％ＥtＯＡc／石油エーテルを用いてシリカゲル(１
００ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーにかけ淡黄
色の油状物を得た(４.０９ｇ；６４％)。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.２−１.７(ｍ,８Ｈ,ＣＨ
2)、２.５(ｔ,Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、２.９３(ｔ,
Ｊ＝６.５Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、３.０１(ｔ,Ｊ＝６.４Ｈz,
２Ｈ,ＣＨ2)、３.２(ｔ,Ｊ＝６.４Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2)、
３.７６(ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ3)、６.８−７.５(ｍ,１５Ｈ,
ＡrＨ)、８.２(ｄ,Ｊ＝９.２Ｈz,２Ｈ,ＰＨＮＯ2 ｍ-
Ｈ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２５.８３、２６.６９、２
９.５３、２９.８７、３０.５５(ＣＨ2)、３９.６８(Ｃ
Ｈ2ＮＨＣＯ)、５５.１４(ＯＣＨ3)、６３.１６(ＤＭＴ
rＯＣＨ2)、８５.６０(ＣＡr3)、１１２.９１、１２６.
５３、１２７.６４、１２７.７０、１２７.７９、１２
８.１０、１２９.０７、１２９.９５、１３６.６０、１
４５.３２、１５８.２６(ＤＭＴr Ｃ)、１２２.４、１
２５.１、１４５.３１、１５５.８(ＰhＮＯ2 Ｃ)、１７
０.４９、１７０.７５(Ｃ＝Ｏ)。 この化合物は容易に除去することができないＥtＯＡc溶
媒を若干含んでいた。
【００５４】Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−６
−アミノヘキサン酸 ペンタフルオロフェニル (ＦmocＡ
haＯＰfp；３) ６−アミノヘキサン酸(２.６２ｇ；２０ｍモル)および
Ｎa2ＣＯ3(５.３０ｇ；５０ｍモル)をＨ2Ｏ(６０ｍｌ)
に溶解し、次いでジオキサン(２５ｍｌ)を加え、続いて
Ｎ−(フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシン
イミド(Ｆmoc-ＮＨＳ)(６.７５ｇ；２０ｍモル)を加え
た。この混合物を１６時間激しく撹拌した。次いで、こ
の濁った反応混合物をＨ2Ｏ(１.２ｌ)に注ぎ、透明な溶
液を得た。この溶液をＥtＯＡc(２ｘ３００ｍｌ)で抽出
し、水層を濃ＨＣｌ(約１０ｍｌ)でpＨ３まで酸性化し
て多量の沈澱を得た。これを１６時間、４℃に保ち、次
いで濾過して６.０５ｇ(８６％)のＦmocＡhaＯＨを得
た。
−アミノヘキサン酸 ペンタフルオロフェニル (ＦmocＡ
haＯＰfp；３) ６−アミノヘキサン酸(２.６２ｇ；２０ｍモル)および
Ｎa2ＣＯ3(５.３０ｇ；５０ｍモル)をＨ2Ｏ(６０ｍｌ)
に溶解し、次いでジオキサン(２５ｍｌ)を加え、続いて
Ｎ−(フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)スクシン
イミド(Ｆmoc-ＮＨＳ)(６.７５ｇ；２０ｍモル)を加え
た。この混合物を１６時間激しく撹拌した。次いで、こ
の濁った反応混合物をＨ2Ｏ(１.２ｌ)に注ぎ、透明な溶
液を得た。この溶液をＥtＯＡc(２ｘ３００ｍｌ)で抽出
し、水層を濃ＨＣｌ(約１０ｍｌ)でpＨ３まで酸性化し
て多量の沈澱を得た。これを１６時間、４℃に保ち、次
いで濾過して６.０５ｇ(８６％)のＦmocＡhaＯＨを得
た。
【００５５】ＤＭＦ(８ｍｌ)中のＦmocＡhaＯＨ(１.７
７ｇ；５ｍモル)およびペンタフルオロフェノール(Ｐf
p；１.０１ｇ；５.５ｍモル)の溶液に、ＤＭＦ(２ｍｌ)
中のＤＣＣ(１.０３ｇ；５ｍモル)の溶液を加えた。こ
の溶液を１６時間撹拌し、濾過し、濾液を真空下で蒸発
乾固させて粗製のエステルを得、これを９５％ＥtＯＨ
／１％ＡcＯＨ(約１０ｍｌ)から再結晶して２.４１ｇ
(９３％)の白色針状結晶を得た。 融点：１２８−１２９℃ 。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.４−１.８(ｍ,６Ｈ,ＣＨ
2)、２.７(ｔ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2)、３.２
(ｍ,２Ｈ,ＮＨＣＨ 2)、４.２(５,Ｊ＝６.７Ｈz,１Ｈ,Ｆ
moc ＣＨ)、４.４(ｄ,Ｊ＝６.８Ｈz,２Ｈ,Ｆmoc Ｃ
Ｈ2)、７.３−７.８(ｍ,８Ｈ,Ｆmoc ＡrＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３６(Ｃ４)、２５.９
３(Ｃ３)、２９.６２(Ｃ５)、３３.１８(Ｃ２)、４０.
７３(Ｃ６)、４７.３１(Ｆmoc Ｃ)、６６.５４(Ｆmoc
ＣＨ2)、１１９.９８、１２５.００、１２７.０２、１
２７.６７(Ｆmoc芳香族ＣＨ)、１４１.３４、１４３.９
９(Ｆmoc 芳香族Ｃ)、１５６.４６(ＦmocＣ＝Ｏ)、１６
９.３６(エステル ＣＯ2)。
７ｇ；５ｍモル)およびペンタフルオロフェノール(Ｐf
p；１.０１ｇ；５.５ｍモル)の溶液に、ＤＭＦ(２ｍｌ)
中のＤＣＣ(１.０３ｇ；５ｍモル)の溶液を加えた。こ
の溶液を１６時間撹拌し、濾過し、濾液を真空下で蒸発
乾固させて粗製のエステルを得、これを９５％ＥtＯＨ
／１％ＡcＯＨ(約１０ｍｌ)から再結晶して２.４１ｇ
(９３％)の白色針状結晶を得た。 融点：１２８−１２９℃ 。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.４−１.８(ｍ,６Ｈ,ＣＨ
2)、２.７(ｔ,Ｊ＝７.２Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2)、３.２
(ｍ,２Ｈ,ＮＨＣＨ 2)、４.２(５,Ｊ＝６.７Ｈz,１Ｈ,Ｆ
moc ＣＨ)、４.４(ｄ,Ｊ＝６.８Ｈz,２Ｈ,Ｆmoc Ｃ
Ｈ2)、７.３−７.８(ｍ,８Ｈ,Ｆmoc ＡrＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３６(Ｃ４)、２５.９
３(Ｃ３)、２９.６２(Ｃ５)、３３.１８(Ｃ２)、４０.
７３(Ｃ６)、４７.３１(Ｆmoc Ｃ)、６６.５４(Ｆmoc
ＣＨ2)、１１９.９８、１２５.００、１２７.０２、１
２７.６７(Ｆmoc芳香族ＣＨ)、１４１.３４、１４３.９
９(Ｆmoc 芳香族Ｃ)、１５６.４６(ＦmocＣ＝Ｏ)、１６
９.３６(エステル ＣＯ2)。
【００５６】Ｎ−(Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニ
ル−６−アミノヘキサノイル)−６−アミノヘキサン酸
(ＦmocＡha2ＯＨ；６) ＤＭＦ(８ｍｌ)中のＦmocＡhaＯＨ(上記のようにして調
製；１.７７ｇ；５ｍモル)およびＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド(０.５７５ｇ；５ｍモル)の溶液に、ＤＭＦ(２
ｍｌ)中のＤＣＣ(１.０３ｇ；５ｍモル)の溶液を加え
た。これを１６時間撹拌し、濾過し、そして濾液を真空
下で蒸発させてシロップを得た。これをイソプロパノー
ル(〜１０ｍｌ)から再結晶して１.９４ｇ(８６％)の５
を得た。
ル−６−アミノヘキサノイル)−６−アミノヘキサン酸
(ＦmocＡha2ＯＨ；６) ＤＭＦ(８ｍｌ)中のＦmocＡhaＯＨ(上記のようにして調
製；１.７７ｇ；５ｍモル)およびＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド(０.５７５ｇ；５ｍモル)の溶液に、ＤＭＦ(２
ｍｌ)中のＤＣＣ(１.０３ｇ；５ｍモル)の溶液を加え
た。これを１６時間撹拌し、濾過し、そして濾液を真空
下で蒸発させてシロップを得た。これをイソプロパノー
ル(〜１０ｍｌ)から再結晶して１.９４ｇ(８６％)の５
を得た。
【００５７】ジオキサン(１０ｍｌ)中の５(０.９１２
ｇ；２ｍモル)の溶液に、Ｈ2Ｏ(１０ｍｌ)中の６−アミ
ノヘキサン酸(０.５２４ｇ；４ｍモル)およびＮa2ＣＯ3
(０.４２４ｇ；４ｍモル)を滴下した。得られた懸濁液
を４８時間激しく撹拌し、次いでＨ2Ｏ(１００ｍｌ)中
に注ぎ、透明な溶液を得た。この激しく撹拌している溶
液のpＨを１Ｍ ＫＨＳＯ4(１０ｍｌ)の滴下によって３
まで下げた。多量の沈澱が生成し、これを２４時間、４
℃に保ち、次いで濾過して定量的収率の酸を得た。この
粗製の生成物をＥtＯＡcから再結晶して０.６７９ｇ(７
３％)の白色粉末を得た。 融点：１０６.５−１０７℃ 。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)：δ１.３−１.７(ｍ,１２Ｈ,内
部ＣＨ2)、２.１(ｔ,Ｊ＝７.４Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯＮ
Ｈ)、２.３(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2Ｈ)、３.
０-３.２(ｍ,４Ｈ,ＦmocＮＨＣＨ2およびＣＨ2ＣＯＮＨ
ＣＨ2)、４.２(ｔ,Ｊ＝６.８Ｈz,１Ｈ,Ｆmoc ＣＨ)、
４.３(ｄ,Ｊ＝６.８Ｈz,２Ｈ,Ｆmoc ＣＨ2)、７.２−
７.８(ｍ,８Ｈ,Ｆmoc ＡrＨ)。
ｇ；２ｍモル)の溶液に、Ｈ2Ｏ(１０ｍｌ)中の６−アミ
ノヘキサン酸(０.５２４ｇ；４ｍモル)およびＮa2ＣＯ3
(０.４２４ｇ；４ｍモル)を滴下した。得られた懸濁液
を４８時間激しく撹拌し、次いでＨ2Ｏ(１００ｍｌ)中
に注ぎ、透明な溶液を得た。この激しく撹拌している溶
液のpＨを１Ｍ ＫＨＳＯ4(１０ｍｌ)の滴下によって３
まで下げた。多量の沈澱が生成し、これを２４時間、４
℃に保ち、次いで濾過して定量的収率の酸を得た。この
粗製の生成物をＥtＯＡcから再結晶して０.６７９ｇ(７
３％)の白色粉末を得た。 融点：１０６.５−１０７℃ 。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤ3ＯＤ)：δ１.３−１.７(ｍ,１２Ｈ,内
部ＣＨ2)、２.１(ｔ,Ｊ＝７.４Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯＮ
Ｈ)、２.３(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2Ｈ)、３.
０-３.２(ｍ,４Ｈ,ＦmocＮＨＣＨ2およびＣＨ2ＣＯＮＨ
ＣＨ2)、４.２(ｔ,Ｊ＝６.８Ｈz,１Ｈ,Ｆmoc ＣＨ)、
４.３(ｄ,Ｊ＝６.８Ｈz,２Ｈ,Ｆmoc ＣＨ2)、７.２−
７.８(ｍ,８Ｈ,Ｆmoc ＡrＨ)。
【００５８】Ｎ−（Ｎ-フルオレニルメトキシカルボニ
ル-６-アミノヘキサノイル)アミノヘキサン酸 ペンタフ
ルオロフェニル (ＦmocＡha2ＯＰfp；４) ＤＭＦ(１ｍｌ)中の６(２３３ｍｇ；０.５ｍモル)およ
びペンタフルオロフェノール(１０１ｍｇ；０.５５ｍモ
ル)の溶液に、ＤＣＣ(１０３ｍｇ；０.５ｍモル)を加え
た。これを２ｄ撹拌し、次いで濾過した。濾液を真空下
で蒸発させてクリーム状の固体とし、これを９５％ＥＴ
ＯＨ／１％ＡcＯＨ(１ｍｌ)から再結晶して１８０ｍｇ
(５７％)の純粋な４を得た。 融点：１２６−１２７℃。
ル-６-アミノヘキサノイル)アミノヘキサン酸 ペンタフ
ルオロフェニル (ＦmocＡha2ＯＰfp；４) ＤＭＦ(１ｍｌ)中の６(２３３ｍｇ；０.５ｍモル)およ
びペンタフルオロフェノール(１０１ｍｇ；０.５５ｍモ
ル)の溶液に、ＤＣＣ(１０３ｍｇ；０.５ｍモル)を加え
た。これを２ｄ撹拌し、次いで濾過した。濾液を真空下
で蒸発させてクリーム状の固体とし、これを９５％ＥＴ
ＯＨ／１％ＡcＯＨ(１ｍｌ)から再結晶して１８０ｍｇ
(５７％)の純粋な４を得た。 融点：１２６−１２７℃。
【００５９】Ｎ−tert-ブトキシカルボニル−６−アミ
ノヘキサン酸 ペンタフルオロフェニル(８) ＥtＯＡc(５０ｍｌ)中のＮ−Ｂoc−６−アミノヘキサン
酸(４.７８ｇ；２０.８ｍモル)およびペンタフルオロフ
ェノール(３.６８ｇ；２０ｍモル)の溶液にＤＣＣ(４.
１２ｇ；２０ｍモル)を加えた。これを１６時間撹拌
し、次いで濾過し、濾液を真空下で蒸発させてシロップ
にした。これを放置しておくと結晶化して７.４６ｇ(９
４％)のエステルが得られた。イソプロパノール／１％
酢酸から再結晶して６.２６ｇの白色針状結晶を得た。 融点：８１−８３℃。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.４−１.６(ｍ,１５Ｈ,Ｂ
oc ＣＨ3および内部ＣＨ2)、１.８(ｍ,２Ｈ,ＣＨ 2ＣＨ2
ＣＯ2)、２.６７(５,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2)、
３.１(ｍ,２Ｈ,ＮＨＣＨ 2)、４.５(ｂ,１Ｈ,ＮＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３８(Ｃ４)、２６.０
０(Ｃ３)、２８.３９(Ｂoc ＣＨ3)、２９.７０(Ｃ５)、
３３.２０(Ｃ２)、４０.２８(Ｃ６)、７９(Ｂoc Ｃ)、
１５６(Ｂoc Ｃ＝Ｏ)、１６９(Ｃ１)。
ノヘキサン酸 ペンタフルオロフェニル(８) ＥtＯＡc(５０ｍｌ)中のＮ−Ｂoc−６−アミノヘキサン
酸(４.７８ｇ；２０.８ｍモル)およびペンタフルオロフ
ェノール(３.６８ｇ；２０ｍモル)の溶液にＤＣＣ(４.
１２ｇ；２０ｍモル)を加えた。これを１６時間撹拌
し、次いで濾過し、濾液を真空下で蒸発させてシロップ
にした。これを放置しておくと結晶化して７.４６ｇ(９
４％)のエステルが得られた。イソプロパノール／１％
酢酸から再結晶して６.２６ｇの白色針状結晶を得た。 融点：８１−８３℃。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.４−１.６(ｍ,１５Ｈ,Ｂ
oc ＣＨ3および内部ＣＨ2)、１.８(ｍ,２Ｈ,ＣＨ 2ＣＨ2
ＣＯ2)、２.６７(５,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2ＣＯ2)、
３.１(ｍ,２Ｈ,ＮＨＣＨ 2)、４.５(ｂ,１Ｈ,ＮＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３８(Ｃ４)、２６.０
０(Ｃ３)、２８.３９(Ｂoc ＣＨ3)、２９.７０(Ｃ５)、
３３.２０(Ｃ２)、４０.２８(Ｃ６)、７９(Ｂoc Ｃ)、
１５６(Ｂoc Ｃ＝Ｏ)、１６９(Ｃ１)。
【００６０】Ｎ−（Ｎ−tert-ブトキシカルボニル−６
−アミノヘキサノイル)−６−アミノヘキサン酸 ペンタ
フルオロフェニル (ＢocＡha2ＯＰfp；９) １Ｍ ＮaＯＨ(５ｍｌ；５ｍモル)およびＨ2Ｏ(５ｍｌ)
中の６−アミノヘキサン酸(１.３１ｇ；１０ｍモル)の
溶液に、ジオキサン(１０ｍｌ)中の８(１.９９ｇ；５ｍ
モル)の溶液を加えた。得られた微細な懸濁液を激しく
３ｄ撹拌すると透明になった。この溶液をＨ2Ｏ(２００
ｍｌ)に加え、１ＭのＫＨＳＯ4(約１０ｍｌ)の滴下によ
ってそのpＨを３.５まで下げ、得られた溶液をＥtＯＡc
(３ｘ１００ｍｌ)で抽出し、乾燥し(Ｎa2ＣＯ4)、そし
て真空下で３ｍｌになるまで濃縮した。次いで、さらに
ＥtＯＡc(１０ｍｌ)を加え、続いてＤＣＣ(１.０３ｇ；
５ｍモル)を加えた。これを１６時間撹拌し、濾過し、
濾液を真空下で蒸発乾固し、生成物を１％ＡcＯＨ含有
のＥtＯＨ／Ｈ2Ｏ(約１０ｍｌ)から再結晶して１.７５
ｇ(６７％)の白色針状結晶を得た。 融点：８８−８９℃。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.３−１.９（ｍ,２Ｈ,Ｃ
Ｈ2およびＢoc ＣＨ3)、２.２(ｔ,Ｊ＝７.５Ｈz,２Ｈ,
ＣＨ 2ＣＯＮＨ)、２.７(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2Ｃ
Ｏ2)、３.１(ｍ,２Ｈ,Ｂoc ＮＨＣＨ 2)、３.３(ｍ,２
Ｈ,ＣＯＮＨＣＨ 2)、４.６(bs,１Ｈ,Ｂoc ＮＨ)、５.６
(bs,１Ｈ,ＣＯＮＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３５、２５.３１、２
６.１０、２６.４１、２９.３１、２９.８３、３３.１
７、３６.６２、３９.１４、４０.３５（ＣＨ2)、２８.
４４（Ｂoc ＣＨ3)、７９.１２ (Ｂoc 中心Ｃ)、１５６.０５(Ｂoc Ｃ＝Ｏ)、１６９.３
９(エステル Ｃ＝Ｏ)、１７２.８４(アミド Ｃ＝Ｏ)。
−アミノヘキサノイル)−６−アミノヘキサン酸 ペンタ
フルオロフェニル (ＢocＡha2ＯＰfp；９) １Ｍ ＮaＯＨ(５ｍｌ；５ｍモル)およびＨ2Ｏ(５ｍｌ)
中の６−アミノヘキサン酸(１.３１ｇ；１０ｍモル)の
溶液に、ジオキサン(１０ｍｌ)中の８(１.９９ｇ；５ｍ
モル)の溶液を加えた。得られた微細な懸濁液を激しく
３ｄ撹拌すると透明になった。この溶液をＨ2Ｏ(２００
ｍｌ)に加え、１ＭのＫＨＳＯ4(約１０ｍｌ)の滴下によ
ってそのpＨを３.５まで下げ、得られた溶液をＥtＯＡc
(３ｘ１００ｍｌ)で抽出し、乾燥し(Ｎa2ＣＯ4)、そし
て真空下で３ｍｌになるまで濃縮した。次いで、さらに
ＥtＯＡc(１０ｍｌ)を加え、続いてＤＣＣ(１.０３ｇ；
５ｍモル)を加えた。これを１６時間撹拌し、濾過し、
濾液を真空下で蒸発乾固し、生成物を１％ＡcＯＨ含有
のＥtＯＨ／Ｈ2Ｏ(約１０ｍｌ)から再結晶して１.７５
ｇ(６７％)の白色針状結晶を得た。 融点：８８−８９℃。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.３−１.９（ｍ,２Ｈ,Ｃ
Ｈ2およびＢoc ＣＨ3)、２.２(ｔ,Ｊ＝７.５Ｈz,２Ｈ,
ＣＨ 2ＣＯＮＨ)、２.７(ｔ,Ｊ＝７.３Ｈz,２Ｈ,ＣＨ2Ｃ
Ｏ2)、３.１(ｍ,２Ｈ,Ｂoc ＮＨＣＨ 2)、３.３(ｍ,２
Ｈ,ＣＯＮＨＣＨ 2)、４.６(bs,１Ｈ,Ｂoc ＮＨ)、５.６
(bs,１Ｈ,ＣＯＮＨ)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ２４.３５、２５.３１、２
６.１０、２６.４１、２９.３１、２９.８３、３３.１
７、３６.６２、３９.１４、４０.３５（ＣＨ2)、２８.
４４（Ｂoc ＣＨ3)、７９.１２ (Ｂoc 中心Ｃ)、１５６.０５(Ｂoc Ｃ＝Ｏ)、１６９.３
９(エステル Ｃ＝Ｏ)、１７２.８４(アミド Ｃ＝Ｏ)。
【００６１】ジイソブチリル−５(および６)−カルボキ
シフルオレセイン，ペンタフルオロフェニル エステル
(７) 無水トリメリト酸(９.６ｇ；０.０５モル)およびレゾル
シノール(１１ｇ；０.１１モル)を十分に混合し、１９
０℃の油浴に１時間入れた。次いで、温度を２１０℃ま
で上げ、その温度に５時間保つと、溶融物が暗赤色の固
体に固化した。次に、これを冷却し、ＤＭＦ(５０ｍｌ)
に溶解した。この溶液にピリジン(１００ｍｌ)および塩
化イソブチリル(１５.４ｍｌ；０.１５モル)を加え、こ
れを２４時間撹拌した。濾過した後、得られた濃厚なシ
ロップをＥtＯＡc(４０ｍｌ)に再溶解し、１Ｍ Ｈ2ＳＯ
4(２ｘ３００ｍｌ)およびＨ2Ｏ(１ｘ３００ｍｌ)で洗浄
し、乾燥し(Ｎa2ＳＯ4)、そしてもう一度濃縮してシロ
ップにした。これをＣＨ2Ｃｌ2に再溶解し、シリカゲル
カラム(１７０ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーに
かけ、最初はＣＨ2Ｃｌ2(８００ｍｌ)で、次いで２％Ｍ
eＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2で溶離した。生成物を含む分画を集
め、溶媒を真空下で除去すると１２.４５ｇ(４８％)の
粗製のジイソブチリル−５(および６)−カルボキシフル
オレセインが得られた。
シフルオレセイン，ペンタフルオロフェニル エステル
(７) 無水トリメリト酸(９.６ｇ；０.０５モル)およびレゾル
シノール(１１ｇ；０.１１モル)を十分に混合し、１９
０℃の油浴に１時間入れた。次いで、温度を２１０℃ま
で上げ、その温度に５時間保つと、溶融物が暗赤色の固
体に固化した。次に、これを冷却し、ＤＭＦ(５０ｍｌ)
に溶解した。この溶液にピリジン(１００ｍｌ)および塩
化イソブチリル(１５.４ｍｌ；０.１５モル)を加え、こ
れを２４時間撹拌した。濾過した後、得られた濃厚なシ
ロップをＥtＯＡc(４０ｍｌ)に再溶解し、１Ｍ Ｈ2ＳＯ
4(２ｘ３００ｍｌ)およびＨ2Ｏ(１ｘ３００ｍｌ)で洗浄
し、乾燥し(Ｎa2ＳＯ4)、そしてもう一度濃縮してシロ
ップにした。これをＣＨ2Ｃｌ2に再溶解し、シリカゲル
カラム(１７０ｇ)のフラッシュ・クロマトグラフィーに
かけ、最初はＣＨ2Ｃｌ2(８００ｍｌ)で、次いで２％Ｍ
eＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2で溶離した。生成物を含む分画を集
め、溶媒を真空下で除去すると１２.４５ｇ(４８％)の
粗製のジイソブチリル−５(および６)−カルボキシフル
オレセインが得られた。
【００６２】この物質(５.７７ｇ；１１ｍモル)および
ペンタフルオロフェノール(２.３２ｇ；２１.１ｍモル)
を１／１のＥtＯＡc／ＣＨ2Ｃｌ2(１２５ｍｌ)に溶解し
た。この溶液を４℃まで冷却し、ＤＣＣ(２.５ｇ；１
２.１ｍモル)を滴下した。これを２時間撹拌し、次いで
濾過し、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これを一
晩、−２０℃にして固化させた。これをＣＨ2Ｃｌ2(５
０ｍｌ)に再溶解し、シリカゲル(１５０ｇ)のフラッシ
ュ・クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ2Ｃｌ2で溶離し
た。生成物を含む分画を集め、溶媒を真空下で除去し、
生成物を９５％ＥtＯＨ／２％酢酸から再結晶すると３.
６８ｇ(５９％)の白色針状結晶が得られた。 融点：１８４−１８８℃。 tlc(ＣＨ2Ｃｌ2)にかけると、この物質は、２つの異性
体に対応するＲf ０.５８および０.６３の２つの近接し
て移動するスポットを与えた。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.３１（ｄ,Ｊ＝６.９Ｈz,
１２Ｈ,ＣＨ3)、２.８(septet,Ｊ＝７.０Ｈz,２Ｈ,ＣＨ
(ＣＨ3)2 )、６.８３(ｓ,４Ｈ,Ｈ1'およびＨ2')、７.１
１(ｓ,２Ｈ,Ｈ4')、７.３８(ｄ,Ｊ＝８.０Ｈz,０.５Ｈ,
５−異性体のＨ 7)、７.９６(ｓ,０.５Ｈ,６−異性体の
Ｈ7)、８.２０(ｄ,Ｊ＝８.０Ｈz,０.５Ｈ,５−異性体の
Ｈ6)、８.５(ｍ,１Ｈ,６−異性体のＨ4およびＨ5)、８.
８７(ｓ,０.５Ｈ,５−異性体のＨ4)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１８.８２、３４.１８、８
２.１１、８２.２４、１１０.６１、１１５.０７、１１
５.１１、１１８.００、１２５.０１、１２５.８９、１
２６．３６、１２７.０５、１２８．０８、１２８.７
１、１２９.２８、１３０.９２、１３２.２３、１３３.
３０、１３６.３２、１３７.０５、１３８.２、１３９.
６２、１４１.８、１４２.８４、１５１.４６、１５１.
５１、１５２.６６、１５３.４１、１５８.２１、１６
１.０６、１６７.５０、１７４.９４。
ペンタフルオロフェノール(２.３２ｇ；２１.１ｍモル)
を１／１のＥtＯＡc／ＣＨ2Ｃｌ2(１２５ｍｌ)に溶解し
た。この溶液を４℃まで冷却し、ＤＣＣ(２.５ｇ；１
２.１ｍモル)を滴下した。これを２時間撹拌し、次いで
濾過し、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これを一
晩、−２０℃にして固化させた。これをＣＨ2Ｃｌ2(５
０ｍｌ)に再溶解し、シリカゲル(１５０ｇ)のフラッシ
ュ・クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ2Ｃｌ2で溶離し
た。生成物を含む分画を集め、溶媒を真空下で除去し、
生成物を９５％ＥtＯＨ／２％酢酸から再結晶すると３.
６８ｇ(５９％)の白色針状結晶が得られた。 融点：１８４−１８８℃。 tlc(ＣＨ2Ｃｌ2)にかけると、この物質は、２つの異性
体に対応するＲf ０.５８および０.６３の２つの近接し
て移動するスポットを与えた。1 Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１.３１（ｄ,Ｊ＝６.９Ｈz,
１２Ｈ,ＣＨ3)、２.８(septet,Ｊ＝７.０Ｈz,２Ｈ,ＣＨ
(ＣＨ3)2 )、６.８３(ｓ,４Ｈ,Ｈ1'およびＨ2')、７.１
１(ｓ,２Ｈ,Ｈ4')、７.３８(ｄ,Ｊ＝８.０Ｈz,０.５Ｈ,
５−異性体のＨ 7)、７.９６(ｓ,０.５Ｈ,６−異性体の
Ｈ7)、８.２０(ｄ,Ｊ＝８.０Ｈz,０.５Ｈ,５−異性体の
Ｈ6)、８.５(ｍ,１Ｈ,６−異性体のＨ4およびＨ5)、８.
８７(ｓ,０.５Ｈ,５−異性体のＨ4)。13 Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3)：δ１８.８２、３４.１８、８
２.１１、８２.２４、１１０.６１、１１５.０７、１１
５.１１、１１８.００、１２５.０１、１２５.８９、１
２６．３６、１２７.０５、１２８．０８、１２８.７
１、１２９.２８、１３０.９２、１３２.２３、１３３.
３０、１３６.３２、１３７.０５、１３８.２、１３９.
６２、１４１.８、１４２.８４、１５１.４６、１５１.
５１、１５２.６６、１５３.４１、１５８.２１、１６
１.０６、１６７.５０、１７４.９４。
【００６３】この物質は分析的に純粋であり、フルオレ
セインラベル化実験で用いる物質なので、これを用いて
カルボキシフルオレセイン(ＣＦ)のスペクトル特性を測
定した。０.１Ｍ ＮＨ4ＯＡc(pＨ９.０)中の７の１μＭ
溶液を３ｄの間放置して７をＣＦ核に分解し、スペクト
ルの測定を行った。４９５および４９６nmでのこの溶液
の消衰係数７５０００Ｍ-1であり、２６０nmでは２３０
００Ｍ-1であった。２６０nmでの同じ溶液中の放出ペン
タフルオロフェノキシドの消衰係数は極めて低く(１７
０Ｍ-1)、上記の吸収係数の誤差範囲内であったので、
考慮に入れなかった。また、この溶液をフルオレセイン
含有のポリアミド-オリゴヌクレオチド ハイブリッドの
蛍光収率のための標準対照として用いた。
セインラベル化実験で用いる物質なので、これを用いて
カルボキシフルオレセイン(ＣＦ)のスペクトル特性を測
定した。０.１Ｍ ＮＨ4ＯＡc(pＨ９.０)中の７の１μＭ
溶液を３ｄの間放置して７をＣＦ核に分解し、スペクト
ルの測定を行った。４９５および４９６nmでのこの溶液
の消衰係数７５０００Ｍ-1であり、２６０nmでは２３０
００Ｍ-1であった。２６０nmでの同じ溶液中の放出ペン
タフルオロフェノキシドの消衰係数は極めて低く(１７
０Ｍ-1)、上記の吸収係数の誤差範囲内であったので、
考慮に入れなかった。また、この溶液をフルオレセイン
含有のポリアミド-オリゴヌクレオチド ハイブリッドの
蛍光収率のための標準対照として用いた。
【００６４】1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、内部
対照としてテトラメチルシランを用い、それぞれ３００
および７５ＭＨzのＢruker ＡＭ３００で記録した。ジ
メチルホルムアミド(ＤＭＦ)を減圧下で蒸留し、１〜２
日以内に用いた。ピリジンは水酸化カリウムから蒸留
し、５Ａのモレキュラー・シーブ上で保存した。融点
は、Ｅlectrothermal Ｍelting Ｐoint Ａpparatusを用
い、一方が開いたキャピラリー中で測定した。フラッシ
ュ・クロマトグラフィーはＭerck Ｋieselgel ＃９３８
５を用いて行った。
対照としてテトラメチルシランを用い、それぞれ３００
および７５ＭＨzのＢruker ＡＭ３００で記録した。ジ
メチルホルムアミド(ＤＭＦ)を減圧下で蒸留し、１〜２
日以内に用いた。ピリジンは水酸化カリウムから蒸留
し、５Ａのモレキュラー・シーブ上で保存した。融点
は、Ｅlectrothermal Ｍelting Ｐoint Ａpparatusを用
い、一方が開いたキャピラリー中で測定した。フラッシ
ュ・クロマトグラフィーはＭerck Ｋieselgel ＃９３８
５を用いて行った。
【００６５】実施例２：ペプチド合成 Ｆmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)ペプチド合成
法を用いて、複数のリジン残基(後に、非-放射活性ラベ
ルの結合部位として用いることができる)およびアラニ
ン残基(リジン残基の間のスペーサーとして働く)を含有
するペプチドを合成した。このペプチドは配列(ＡlaＬy
s)5Ａlaを有している。調整された多孔ガラス(ＣＰＧ)
をペプチド合成のための固体支持マトリックスとして用
いた(この支持体はペプチド合成には普通ではないが、
オリゴヌクレオチド合成に選択した支持体であるの
で)。
法を用いて、複数のリジン残基(後に、非-放射活性ラベ
ルの結合部位として用いることができる)およびアラニ
ン残基(リジン残基の間のスペーサーとして働く)を含有
するペプチドを合成した。このペプチドは配列(ＡlaＬy
s)5Ａlaを有している。調整された多孔ガラス(ＣＰＧ)
をペプチド合成のための固体支持マトリックスとして用
いた(この支持体はペプチド合成には普通ではないが、
オリゴヌクレオチド合成に選択した支持体であるの
で)。
【００６６】第１図に示すように、アミノプロピルＣＰ
Ｇ(ＡＰ−ＣＰＧ)を誘導体化して、この固体支持マトリ
ックスに結合した遊離のヒドロキシ基を得た。ＡＰ−Ｃ
ＰＧ(Ｆluka、孔の大きさ５００Ａ、０.５ｇ、２０μモ
ルのアミノ基)に、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２ｍ
ｌ)中のジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)(３０.５ｍ
ｇ；２５０μモル)およびα,ω−ヒドロキシカルボン酸
誘導体１a、１bまたは２(２５０μモル)を加えた。これ
を３時間振盪するか、または１６時間放置した。次い
で、このＣＰＧを洗浄し、そして乾燥した。官能基化の
程度を、少量のＣＰＧの酸処理によって放出されるジメ
トキシトリチル(λ＝５０７nm、ε＝６６５００Ｍ-1)ま
たはピキシル(λ＝４４５nm、ε＝４７７０Ｍ-1)の分光
光度検定により定量する。次いで、残存のアミノ基(約
１０〜２０％)を、ピリジン(２ｍｌ)中で１５分間、Ｃ
ＰＧを無水酢酸(Ａc2Ｏ)(０.５ｍｌ；２.５ｍモル)およ
びＤＭＡＰ(５０ｍｇ；０.４ｍモル)で処理することに
よってアセチル化する。残存する有意なアミノ基は検出
されなかった。次いで、ＣＰＧをＣＨ2Ｃｌ2中の３％ジ
クロロ酢酸(２ｘ５分)で処理し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し
た。
Ｇ(ＡＰ−ＣＰＧ)を誘導体化して、この固体支持マトリ
ックスに結合した遊離のヒドロキシ基を得た。ＡＰ−Ｃ
ＰＧ(Ｆluka、孔の大きさ５００Ａ、０.５ｇ、２０μモ
ルのアミノ基)に、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)(２ｍ
ｌ)中のジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)(３０.５ｍ
ｇ；２５０μモル)およびα,ω−ヒドロキシカルボン酸
誘導体１a、１bまたは２(２５０μモル)を加えた。これ
を３時間振盪するか、または１６時間放置した。次い
で、このＣＰＧを洗浄し、そして乾燥した。官能基化の
程度を、少量のＣＰＧの酸処理によって放出されるジメ
トキシトリチル(λ＝５０７nm、ε＝６６５００Ｍ-1)ま
たはピキシル(λ＝４４５nm、ε＝４７７０Ｍ-1)の分光
光度検定により定量する。次いで、残存のアミノ基(約
１０〜２０％)を、ピリジン(２ｍｌ)中で１５分間、Ｃ
ＰＧを無水酢酸(Ａc2Ｏ)(０.５ｍｌ；２.５ｍモル)およ
びＤＭＡＰ(５０ｍｇ；０.４ｍモル)で処理することに
よってアセチル化する。残存する有意なアミノ基は検出
されなかった。次いで、ＣＰＧをＣＨ2Ｃｌ2中の３％ジ
クロロ酢酸(２ｘ５分)で処理し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し
た。
【００６７】別法では、γ-ブチロラクトンを用いてＣ
ＰＧを誘導体化した。この場合、ＣＰＧ(０.５ｇ)およ
びγ-ブチロラクトン(３ｍｌ)を７日間、６０℃のオー
ブン中に置いた。
ＰＧを誘導体化した。この場合、ＣＰＧ(０.５ｇ)およ
びγ-ブチロラクトン(３ｍｌ)を７日間、６０℃のオー
ブン中に置いた。
【００６８】次に、この修飾した固体支持体をペプチド
合成に用いた。最初のアミノ酸を結合させるために(エ
ステル結合の生成)、高濃度の活性アミノ酸を用いた。
即ち、誘導体化したＣＰＧ(１００ｍｇ；２.７μモルの
ヒドロキシ官能基を含む)を、ＤＭＦ(２ｍｌ)中のＮ−
ＢＯＣ−アラニン対称無水物およびＤＭＡＰ(それぞれ
０.２Ｍ)の溶液と２０時間反応させた。上述のようにＡ
c2Ｏ／ＤＭＡＰを用いて残存のヒドロキシ基をアセチル
化し、アラニンを脱保護して遊離のアミノ基を得た(２
５μモル／ｇ)。９０％ トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／Ｈ
2Ｏで処理し(３０分)、続いて洗浄し(ＣＨ2Ｃｌ2)、中
和し(２０％トリエチルアミン／ＣＨ2Ｃｌ2)、洗浄し
(ＣＨ2Ｃｌ2)、そして乾燥することによって最初のアミ
ノ酸からＢoc基を除去した。次いで、ＤＭＦ中、４倍モ
ル過剰のＦmoc-アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステ
ルおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢt)
を用い、通常のＦmocの化学を用いて、手動のＣＲＢペ
プチド合成機でさらにペプチド合成を行った。簡単に言
うと、ＣＰＧ基質を、ＨＯＢtの存在下で３０分間、Ｄ
ＭＦ(２ｍｌ)中でＮ−α−ＦＭＯＣ−Ｎ−ε−ＢＯＣ−
Ｌys ペンタフルオロフェニルエステルと反応させた。
この反応はニンヒドリン検定によると定量的であった。
次いで、ＦＭＯＣ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジン(１
ｘ３分、１ｘ７分)で除去した。リジン残基とアラニン
(ＦＭＯＣ−Ａla ペンタフルオロフェニルエステルを用
いる)を交互に変え、同じ方法で次の結合を行って(Ａla
Ｌys)5Ａlaを合成した。
合成に用いた。最初のアミノ酸を結合させるために(エ
ステル結合の生成)、高濃度の活性アミノ酸を用いた。
即ち、誘導体化したＣＰＧ(１００ｍｇ；２.７μモルの
ヒドロキシ官能基を含む)を、ＤＭＦ(２ｍｌ)中のＮ−
ＢＯＣ−アラニン対称無水物およびＤＭＡＰ(それぞれ
０.２Ｍ)の溶液と２０時間反応させた。上述のようにＡ
c2Ｏ／ＤＭＡＰを用いて残存のヒドロキシ基をアセチル
化し、アラニンを脱保護して遊離のアミノ基を得た(２
５μモル／ｇ)。９０％ トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／Ｈ
2Ｏで処理し(３０分)、続いて洗浄し(ＣＨ2Ｃｌ2)、中
和し(２０％トリエチルアミン／ＣＨ2Ｃｌ2)、洗浄し
(ＣＨ2Ｃｌ2)、そして乾燥することによって最初のアミ
ノ酸からＢoc基を除去した。次いで、ＤＭＦ中、４倍モ
ル過剰のＦmoc-アミノ酸ペンタフルオロフェニルエステ
ルおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢt)
を用い、通常のＦmocの化学を用いて、手動のＣＲＢペ
プチド合成機でさらにペプチド合成を行った。簡単に言
うと、ＣＰＧ基質を、ＨＯＢtの存在下で３０分間、Ｄ
ＭＦ(２ｍｌ)中でＮ−α−ＦＭＯＣ−Ｎ−ε−ＢＯＣ−
Ｌys ペンタフルオロフェニルエステルと反応させた。
この反応はニンヒドリン検定によると定量的であった。
次いで、ＦＭＯＣ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジン(１
ｘ３分、１ｘ７分)で除去した。リジン残基とアラニン
(ＦＭＯＣ−Ａla ペンタフルオロフェニルエステルを用
いる)を交互に変え、同じ方法で次の結合を行って(Ａla
Ｌys)5Ａlaを合成した。
【００６９】実施例３：オリゴヌクレオチド-ペプチド
コンジュゲートの合成 実施例２に従って合成したペプ
チドをオリゴヌクレオチド合成の出発原料として用い
た。ペプチドの末端アミノ基を２０％ピペリジン／ＤＭ
Ｆで脱保護し、ＣＰＧをＤＭＦ(０.５ｍｌ)中で１６時
間、α,ω-ヒドロキシカルボン酸リンカー１a、１bまた
は２(０.２ｍモル)および１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール(０.２ｍモル)と反応させた(第２図参照)。残存
するアミノ基をアセチル化し、このＣＰＧを、Ａpplied
Ｂiosystems ３８０Ａ 自動ＤＮＡ合成機によるＤＮＡ
合成に用いた。別法では、γ-ブチロラクトンを１a、１
bまたは２の代わりにリンカーとして用いた。この場合
には、ＣＰＧ(１００ｍｇ)を６０℃で７日間、γ-ブチ
ロラクトン(２ｍｌ)と反応させた。
コンジュゲートの合成 実施例２に従って合成したペプ
チドをオリゴヌクレオチド合成の出発原料として用い
た。ペプチドの末端アミノ基を２０％ピペリジン／ＤＭ
Ｆで脱保護し、ＣＰＧをＤＭＦ(０.５ｍｌ)中で１６時
間、α,ω-ヒドロキシカルボン酸リンカー１a、１bまた
は２(０.２ｍモル)および１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール(０.２ｍモル)と反応させた(第２図参照)。残存
するアミノ基をアセチル化し、このＣＰＧを、Ａpplied
Ｂiosystems ３８０Ａ 自動ＤＮＡ合成機によるＤＮＡ
合成に用いた。別法では、γ-ブチロラクトンを１a、１
bまたは２の代わりにリンカーとして用いた。この場合
には、ＣＰＧ(１００ｍｇ)を６０℃で７日間、γ-ブチ
ロラクトン(２ｍｌ)と反応させた。
【００７０】ＤＭＴrまたはＰx保護基をリンカー基から
除去し、メチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルヌクレオシド
ホスホルアミダイト(BeaucageおよびCaruthers；上記)
を用いてオリゴヌクレオチド合成を始めた。簡単に説明
すると、ホスホルアミダイトを乾燥アセトニトリル中の
０.１Ｍ溶液とし、０.５Ｍテトラゾールの存在下で結合
させる。これに続いて、未反応のヒドロキシ基のアセチ
ル化(Ａc2Ｏ／ＤＭＡＰ)、ホスファイトトリエステルの
ホスフェートへの酸化(Ｉ2／Ｈ2Ｏ)、次のヌクレオシド
ホスホルアミダイトの結合の前の脱トリチル化(ＤＣｌ
／ＣＨ2Ｃｌ2)を行う。最初のホスホルアミダイトを末
端の脂肪族ヒドロキシ基に結合させた。オリゴヌクレオ
チドの合成を続け、マウスのカリクレインをコードして
いるmＲＮＡの一部に相補性である３０merのオリゴデオ
キシリボヌクレオチドd(GGGCTTCACAACATCTGTGATGTCAGCA
GG)(ＫＰＩＢ)をこの固体支持体上で合成した。トリチ
ル検定による平均の結合収率は９９％を越えていた。
除去し、メチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルヌクレオシド
ホスホルアミダイト(BeaucageおよびCaruthers；上記)
を用いてオリゴヌクレオチド合成を始めた。簡単に説明
すると、ホスホルアミダイトを乾燥アセトニトリル中の
０.１Ｍ溶液とし、０.５Ｍテトラゾールの存在下で結合
させる。これに続いて、未反応のヒドロキシ基のアセチ
ル化(Ａc2Ｏ／ＤＭＡＰ)、ホスファイトトリエステルの
ホスフェートへの酸化(Ｉ2／Ｈ2Ｏ)、次のヌクレオシド
ホスホルアミダイトの結合の前の脱トリチル化(ＤＣｌ
／ＣＨ2Ｃｌ2)を行う。最初のホスホルアミダイトを末
端の脂肪族ヒドロキシ基に結合させた。オリゴヌクレオ
チドの合成を続け、マウスのカリクレインをコードして
いるmＲＮＡの一部に相補性である３０merのオリゴデオ
キシリボヌクレオチドd(GGGCTTCACAACATCTGTGATGTCAGCA
GG)(ＫＰＩＢ)をこの固体支持体上で合成した。トリチ
ル検定による平均の結合収率は９９％を越えていた。
【００７１】コンジュゲートを脱保護するため、固体支
持体を自動合成機から取り、ＰhＳＨ／Ｅt3Ｎ／ＣＨ3Ｃ
Ｎ １:１:２で２時間処理してホスホトリエステル上の
メチル保護基を除去した。リジン残基上のＢＯＣ保護基
(および５'-ＤＭＴr基も)は、９０％トリフルオロ酢酸
／１０％エタンジチオールによる５分間の処理、それに
続く２０％Ｅt3Ｎ／ＣＨ2Ｃｌ2による中和によって除去
した。次いで、Ｃ-末端アミノ酸を固体支持体に結合さ
せているエステル基を濃ＮＨ3水溶液で切断し(４時
間)、この溶液を５５℃でさらに１６時間加熱してヌク
レオシドのアミノ保護基を除去した。
持体を自動合成機から取り、ＰhＳＨ／Ｅt3Ｎ／ＣＨ3Ｃ
Ｎ １:１:２で２時間処理してホスホトリエステル上の
メチル保護基を除去した。リジン残基上のＢＯＣ保護基
(および５'-ＤＭＴr基も)は、９０％トリフルオロ酢酸
／１０％エタンジチオールによる５分間の処理、それに
続く２０％Ｅt3Ｎ／ＣＨ2Ｃｌ2による中和によって除去
した。次いで、Ｃ-末端アミノ酸を固体支持体に結合さ
せているエステル基を濃ＮＨ3水溶液で切断し(４時
間)、この溶液を５５℃でさらに１６時間加熱してヌク
レオシドのアミノ保護基を除去した。
【００７２】第３図は、ポリヌクレオチドキナーゼを用
いる[γ-32Ｐ]-ＡＴＰによる粗製の生成物の５'-32Ｐ末
端ラベル化、および７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリル
アミドゲルでの電気泳動の後に得られるパターンを示す
ものである。オリゴヌクレオチド-ペプチド ハイブリッ
ドは通常のＫＰＩＢよりも遅く移動し、生成混合物の主
成分である。未ラベルの反応液を移動させ、ＵＶで陰を
つけることによってＤＮＡをゲル上で可視化したときに
同様のパターンが観察される。純粋なハイブリッド生成
物は、１０％ゲルでのプレパラティブゲル電気泳動によ
って、またはＨＰＬＣによって得た。
いる[γ-32Ｐ]-ＡＴＰによる粗製の生成物の５'-32Ｐ末
端ラベル化、および７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリル
アミドゲルでの電気泳動の後に得られるパターンを示す
ものである。オリゴヌクレオチド-ペプチド ハイブリッ
ドは通常のＫＰＩＢよりも遅く移動し、生成混合物の主
成分である。未ラベルの反応液を移動させ、ＵＶで陰を
つけることによってＤＮＡをゲル上で可視化したときに
同様のパターンが観察される。純粋なハイブリッド生成
物は、１０％ゲルでのプレパラティブゲル電気泳動によ
って、またはＨＰＬＣによって得た。
【００７３】生成物のアミノ酸分析は６Ａla：５Ｌysの
予想比を与え、１モルのＫＰＩＢあたりに１モルの(Ａl
aＬys)5Ａlaポリアミドを有していた。この生成物はヘ
ビ毒ホスホジエステラーゼに対して耐性であり(３'-末
端をブロック)、脾ホスホジエステラーゼによって一部
だけが消化された(５'-末端から１０ヌクレオチド)(消
化物のＨＰＬＣ分析によって評価)。３'-末端の正に荷
電したポリアミドの存在は分子のこの領域のホスホジエ
ステラーゼ消化を阻害するようである。Ｐ1ヌクレアー
ゼはこのコンジュゲートをその成分であるヌクレオシド
およびヌクレオチドに消化した。
予想比を与え、１モルのＫＰＩＢあたりに１モルの(Ａl
aＬys)5Ａlaポリアミドを有していた。この生成物はヘ
ビ毒ホスホジエステラーゼに対して耐性であり(３'-末
端をブロック)、脾ホスホジエステラーゼによって一部
だけが消化された(５'-末端から１０ヌクレオチド)(消
化物のＨＰＬＣ分析によって評価)。３'-末端の正に荷
電したポリアミドの存在は分子のこの領域のホスホジエ
ステラーゼ消化を阻害するようである。Ｐ1ヌクレアー
ゼはこのコンジュゲートをその成分であるヌクレオシド
およびヌクレオチドに消化した。
【００７４】ＤＮＡ合成は、常法[Beaucage and Caruth
ers,(1981),Tetrahedron Lett.,22,pp.1859-1862]に従
い、メチルおよびシアノエチルの両保護ヌクレオシドホ
スホルアミダイトを用いて行った。これらの合成法にお
いては、それぞれのヌクレオシドホスホルアミダイトを
支持マトリックスに付加した後に、ＤＭＡＰ／Ａc2Ｏに
よる６０〜１２０秒のキャッピング(capping)工程を用
いた。
ers,(1981),Tetrahedron Lett.,22,pp.1859-1862]に従
い、メチルおよびシアノエチルの両保護ヌクレオシドホ
スホルアミダイトを用いて行った。これらの合成法にお
いては、それぞれのヌクレオシドホスホルアミダイトを
支持マトリックスに付加した後に、ＤＭＡＰ／Ａc2Ｏに
よる６０〜１２０秒のキャッピング(capping)工程を用
いた。
【００７５】アミノ酸分析はＢeckman Ｓystem 6300 ア
ミノ酸分析機で行った。蛍光分光光度計による測定はＰ
erkin-Ｅlmer ＬＳ-５ ルミネセンス光度計で行った。
ＨＰＬＣはＶydac Ｃ18 ５μ ２５ｃｍｘ４.６ｍｍカラ
ムを用い、Ａltexシステムで行った。用いた緩衝液は、
Ａ：０.１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム(pＨ７.０)、
およびＢ：４５％ＣＨ3ＣＮ含有の０.１Ｍ酢酸トリエチ
ルアンモニウム(pＨ７.０)であった。
ミノ酸分析機で行った。蛍光分光光度計による測定はＰ
erkin-Ｅlmer ＬＳ-５ ルミネセンス光度計で行った。
ＨＰＬＣはＶydac Ｃ18 ５μ ２５ｃｍｘ４.６ｍｍカラ
ムを用い、Ａltexシステムで行った。用いた緩衝液は、
Ａ：０.１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム(pＨ７.０)、
およびＢ：４５％ＣＨ3ＣＮ含有の０.１Ｍ酢酸トリエチ
ルアンモニウム(pＨ７.０)であった。
【００７６】実施例４：合成アミノ酸を含むポリアミド
の合成 非-ペプチドアミノ酸の使用は、ポリアミドの分子構造
の設計に尚一層の柔軟性を導入する。あらゆるα,ω-ア
ミノカルボン酸を天然アミノ酸の間のスペーサーとして
働かせることができる。容易に入手することができる６
−アミノヘキサン酸(ＨＡhaＯＨ)を標準的な単位として
選択するが、その他のあらゆる類似のアミノカルボン酸
を用いることもできる。始めに、Ｎ−Ｆmoc ペンタフル
オロフェニル活性エステル誘導体３および４を合成し、
通常のＦmocペプチド合成法において用いた。ダイマー
４は、モノマー５および６−アミノヘキサン酸から好収
率で調製することができる。また、酸６は、ＢＯＰ[ベ
ンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−(ジメチ
ルアミノ)−ホスホニウム ヘキサフルオロボレート]法
(Castro；上記)を用いて固相合成において直接用いた。
この合成においては、４倍モル過剰の６、ＢＯＰ試薬、
Ｎ−メチルモルホリンおよびＨＯＢtをＤＭＦ中で用い
た。この方法は、活性エステルを調製することなくこの
スペーサーを導入する極めて効率的な方法であることが
わかった。
の合成 非-ペプチドアミノ酸の使用は、ポリアミドの分子構造
の設計に尚一層の柔軟性を導入する。あらゆるα,ω-ア
ミノカルボン酸を天然アミノ酸の間のスペーサーとして
働かせることができる。容易に入手することができる６
−アミノヘキサン酸(ＨＡhaＯＨ)を標準的な単位として
選択するが、その他のあらゆる類似のアミノカルボン酸
を用いることもできる。始めに、Ｎ−Ｆmoc ペンタフル
オロフェニル活性エステル誘導体３および４を合成し、
通常のＦmocペプチド合成法において用いた。ダイマー
４は、モノマー５および６−アミノヘキサン酸から好収
率で調製することができる。また、酸６は、ＢＯＰ[ベ
ンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−(ジメチ
ルアミノ)−ホスホニウム ヘキサフルオロボレート]法
(Castro；上記)を用いて固相合成において直接用いた。
この合成においては、４倍モル過剰の６、ＢＯＰ試薬、
Ｎ−メチルモルホリンおよびＨＯＢtをＤＭＦ中で用い
た。この方法は、活性エステルを調製することなくこの
スペーサーを導入する極めて効率的な方法であることが
わかった。
【００７７】オリゴヌクレオチド部分から十分に離れた
１個の１級脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの
合成を説明するために、４当量のＮ−Ｆmocアミノ酸活
性エステル４を用いたこと以外は実施例２に記載の方法
を用い、そしてオリゴヌクレオチドからの隔離のために
活性エステル４の２つのカップリングを用いて、ポリア
ミドＡha4Ｌys(Ｂoc)Ａlaを合成した。次いで、実施例
３の方法に従ってリンカー２を付加した後、マウスカリ
クレインmＲＮＡ(ＫＰＩＢ)の一部に相補性である３０m
erのオリゴヌクレオチドを合成した。このコンジュゲー
トを上記のようにして脱保護した。別の方法において
は、Ｂoc化学をポリアミドの合成に用いた。我々はリジ
ン誘導体としてα−Ｂoc−ε−ＦmocＬysＯＰfp(また
は、ＢＯＰ法による対応するカルボン酸)を、そしてス
ペーサーとしてＢocＡha2ＯＰfpを用いた。４倍モル過
剰の活性アミノ酸およびＨＯＢtをＤＭＦ中で０.５時間
用いた。保護されたポリアミド-オリゴヌクレオチド ハ
イブリッドを通常のオリゴヌクレオチドと全く同じ方法
で脱保護し、上記と同一の産物を得た。この場合、リジ
ン残基上のＦmoc保護基はアンモニア脱保護工程の間に
切断される。
１個の１級脂肪族アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの
合成を説明するために、４当量のＮ−Ｆmocアミノ酸活
性エステル４を用いたこと以外は実施例２に記載の方法
を用い、そしてオリゴヌクレオチドからの隔離のために
活性エステル４の２つのカップリングを用いて、ポリア
ミドＡha4Ｌys(Ｂoc)Ａlaを合成した。次いで、実施例
３の方法に従ってリンカー２を付加した後、マウスカリ
クレインmＲＮＡ(ＫＰＩＢ)の一部に相補性である３０m
erのオリゴヌクレオチドを合成した。このコンジュゲー
トを上記のようにして脱保護した。別の方法において
は、Ｂoc化学をポリアミドの合成に用いた。我々はリジ
ン誘導体としてα−Ｂoc−ε−ＦmocＬysＯＰfp(また
は、ＢＯＰ法による対応するカルボン酸)を、そしてス
ペーサーとしてＢocＡha2ＯＰfpを用いた。４倍モル過
剰の活性アミノ酸およびＨＯＢtをＤＭＦ中で０.５時間
用いた。保護されたポリアミド-オリゴヌクレオチド ハ
イブリッドを通常のオリゴヌクレオチドと全く同じ方法
で脱保護し、上記と同一の産物を得た。この場合、リジ
ン残基上のＦmoc保護基はアンモニア脱保護工程の間に
切断される。
【００７８】また、このＦmoc法を用いて１０個のリジ
ン残基を含むもっと長いポリアミドを合成した。これは
Ａla(ＬysＡha4)9ＬysＡlaであり、手動のペプチド合成
機を用い、Ａha4ＬysＡlaと同じ方法(Ｆmoc法)で合成し
た。この基質上でのＫＰＩＢの合成に続く通常の脱保護
プロトコール(実施例３を参照)により、ＰＡＧＥ分析で
ＫＰＩＢよりもゆっくり移動する主バンドを与える産物
が得られた。このバンドのＰＡＧＥ精製によって良好な
アミノ酸分析結果を有する産物が得られた。
ン残基を含むもっと長いポリアミドを合成した。これは
Ａla(ＬysＡha4)9ＬysＡlaであり、手動のペプチド合成
機を用い、Ａha4ＬysＡlaと同じ方法(Ｆmoc法)で合成し
た。この基質上でのＫＰＩＢの合成に続く通常の脱保護
プロトコール(実施例３を参照)により、ＰＡＧＥ分析で
ＫＰＩＢよりもゆっくり移動する主バンドを与える産物
が得られた。このバンドのＰＡＧＥ精製によって良好な
アミノ酸分析結果を有する産物が得られた。
【００７９】実施例５：ラベルされたコンジュゲートの
製造 ４種類の別の段階でリポーターグループを導入した：即
ち、(I)ポリアミド合成の後；(II)連結シンソンの付加
の後；(III)オリゴヌクレオチド合成の後；および(IV)
ハイブリッドの脱保護および精製の後である。 (I)リジン側鎖上のＢoc保護基の除去の後、この段階で
ビオチンおよびフルオレセイン シンソンを結合させ
た。ビオチンは、ＤＭＦ中のビオチン、ＢＯＰ試薬、Ｈ
ＯＢtおよびＮ−メチルモルホリンのそれぞれ０.２Ｍ溶
液を用いて３０分間結合させた。また、この結合は、そ
れぞれのＬys(Ｂoc)残基を付加した後のポリアミド合成
の間に行うこともできる。別法では、ビオチンを例えば
スクシンイミドエステルなどの活性エステルとして付加
することができる。フルオレセインは、この段階で、Ｄ
ＭＦ中の７およびＨＯＢtの０.３Ｍ溶液との３ｄの反応
によって結合させた。残存するアミノ基はアセチル化し
た。後に行うピペリジン処理はフルオレセイン上のイソ
ブチリル保護基を除去するので、ピリジン中のＤＭＡＰ
／無水イソ酪酸で１６時間再アシル化した。 (II)リジン側鎖の保護基がＦmocであり、ポリアミド合
成にＢoc法を用いたときには、この段階でラベルの結合
を行うことができる。ε-Ｆmoc基の除去の後に、ビオチ
ンまたはフルオレセインを段階(I)での方法と同じ方法
で付加する。 (III)リジン側鎖のＢoc保護基を上記のように除去し(ハ
イブリッドの脱保護)、ラベルを結合させた。ＤＭＦ
(０.５ｍｌ)中のビオチン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル活性エステル(２０当量)およびＨＯＢt(２０当量)
との１６時間の反応によってビオチンを付加する。フル
オレセインは段階(I)でのようにして付加するが、フル
オレセインの再アシル化は必要ではない。 (IV)常法によって１個のリジンを含有しているハイブリ
ッドにビオチンを付加した。フルオレセインはフルオレ
セインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を用いて付加する
こともできる。
製造 ４種類の別の段階でリポーターグループを導入した：即
ち、(I)ポリアミド合成の後；(II)連結シンソンの付加
の後；(III)オリゴヌクレオチド合成の後；および(IV)
ハイブリッドの脱保護および精製の後である。 (I)リジン側鎖上のＢoc保護基の除去の後、この段階で
ビオチンおよびフルオレセイン シンソンを結合させ
た。ビオチンは、ＤＭＦ中のビオチン、ＢＯＰ試薬、Ｈ
ＯＢtおよびＮ−メチルモルホリンのそれぞれ０.２Ｍ溶
液を用いて３０分間結合させた。また、この結合は、そ
れぞれのＬys(Ｂoc)残基を付加した後のポリアミド合成
の間に行うこともできる。別法では、ビオチンを例えば
スクシンイミドエステルなどの活性エステルとして付加
することができる。フルオレセインは、この段階で、Ｄ
ＭＦ中の７およびＨＯＢtの０.３Ｍ溶液との３ｄの反応
によって結合させた。残存するアミノ基はアセチル化し
た。後に行うピペリジン処理はフルオレセイン上のイソ
ブチリル保護基を除去するので、ピリジン中のＤＭＡＰ
／無水イソ酪酸で１６時間再アシル化した。 (II)リジン側鎖の保護基がＦmocであり、ポリアミド合
成にＢoc法を用いたときには、この段階でラベルの結合
を行うことができる。ε-Ｆmoc基の除去の後に、ビオチ
ンまたはフルオレセインを段階(I)での方法と同じ方法
で付加する。 (III)リジン側鎖のＢoc保護基を上記のように除去し(ハ
イブリッドの脱保護)、ラベルを結合させた。ＤＭＦ
(０.５ｍｌ)中のビオチン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル活性エステル(２０当量)およびＨＯＢt(２０当量)
との１６時間の反応によってビオチンを付加する。フル
オレセインは段階(I)でのようにして付加するが、フル
オレセインの再アシル化は必要ではない。 (IV)常法によって１個のリジンを含有しているハイブリ
ッドにビオチンを付加した。フルオレセインはフルオレ
セインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)を用いて付加する
こともできる。
【００８０】実施例６：オリゴヌクレオチド-ポリアミ
ド コンジュゲートへの蛍光団のコンジュゲート 下式で示される完全に保護されたオリゴヌクレオチド-
ポリアミド コンジュゲート： ＣＰＧ-ＳＬ-Ａla]Ｌys(Ｂoc)Ａha]9Ｌys(Ｂoc)Ａla-Ｓ
Ｌ-ＫＰＩＢ [式中、Ａhaは６−アミノヘキサン酸残基
ド コンジュゲートへの蛍光団のコンジュゲート 下式で示される完全に保護されたオリゴヌクレオチド-
ポリアミド コンジュゲート： ＣＰＧ-ＳＬ-Ａla]Ｌys(Ｂoc)Ａha]9Ｌys(Ｂoc)Ａla-Ｓ
Ｌ-ＫＰＩＢ [式中、Ａhaは６−アミノヘキサン酸残基
【化４】 であり、ＳＬはリンカー１a、１bおよび から導かれる
結合であり、そしてＫＰＩＢはその配列を上に示したオ
リゴヌクレオチドである]を実施例４に従い、３０ｍｇ
のＣＰＧで合成した。始めに、Ｌys側鎖のＢoc保護基を
除去するため、コンジュゲートを９０％トリフルオロ酢
酸／１０％エタンジチオールで５分間処理し、次いで２
０％トリエチルアミン／ＣＨ2Ｃｌ2で処理して生成した
１級アミノ基を中和した。次いで、このコンジュゲート
を、ＤＭＦ(０.５ｍｌ)中で３日間、４０倍過剰のジイ
ソブチリルカルボキシ フルオレセイン ペンタフルオロ
フェニル エステル(１０７ｍｇ)および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(２６ｍｇ)と反応させた。次に、こ
のラベルされた化合物を脱保護した。ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけると、このラベルされた化合物は
キシレンシアノール染料と同じ位置に移動する強い蛍光
バンドを与えた。このバンドを切り出し、精製してフル
オレセインラベルされたオリゴヌクレオチド-ポリアミ
ド コンジュゲートを得た。
結合であり、そしてＫＰＩＢはその配列を上に示したオ
リゴヌクレオチドである]を実施例４に従い、３０ｍｇ
のＣＰＧで合成した。始めに、Ｌys側鎖のＢoc保護基を
除去するため、コンジュゲートを９０％トリフルオロ酢
酸／１０％エタンジチオールで５分間処理し、次いで２
０％トリエチルアミン／ＣＨ2Ｃｌ2で処理して生成した
１級アミノ基を中和した。次いで、このコンジュゲート
を、ＤＭＦ(０.５ｍｌ)中で３日間、４０倍過剰のジイ
ソブチリルカルボキシ フルオレセイン ペンタフルオロ
フェニル エステル(１０７ｍｇ)および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(２６ｍｇ)と反応させた。次に、こ
のラベルされた化合物を脱保護した。ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけると、このラベルされた化合物は
キシレンシアノール染料と同じ位置に移動する強い蛍光
バンドを与えた。このバンドを切り出し、精製してフル
オレセインラベルされたオリゴヌクレオチド-ポリアミ
ド コンジュゲートを得た。
【００８１】また、コンジュゲートＣＰＧ-ＳＬ-ＡlaＬ
ys(Ｂoc)Ａha4-ＳＬ-ＫＰＩＢを実施例４の方法に従っ
て合成し、実施例５の段階３に従ってフルオレセインで
ラベルした。次いで、このラベルしたコンジュゲートを
当分野で自体既知の方法に従いゲル電気泳動によって精
製した。
ys(Ｂoc)Ａha4-ＳＬ-ＫＰＩＢを実施例４の方法に従っ
て合成し、実施例５の段階３に従ってフルオレセインで
ラベルした。次いで、このラベルしたコンジュゲートを
当分野で自体既知の方法に従いゲル電気泳動によって精
製した。
【００８２】実施例７：コンジュゲートの精製 ラベルした、およびラベルしていないハイブリッドのほ
とんどの精製は、１０％ゲルを用いるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)によって行った。Ｂocの化学
によって調製した１個のリジンを含有するハイブリッド
の精製はＶydacＣ18 カラムによる逆相ＨＰＬＣで行う
のが好都合であるが、これは、このハイブリッドの５'-
ＤＭＴr基が無傷であるためである。このＤＭＴr含有の
ハイブリッドを始めに次の条件を用いて精製した：３
３.３％のＢでイソクラティックに２０分間、次いで６
６.６％のＢまでの勾配で３０分間。ＤＭＴr−ＫＰＩＢ
−ＳＬ−Ａha4ＬysＡlaは４４.０分で溶出する。溶出物
の脱トリチル化(等容量の酢酸、１５分)および０〜６
６.６％のＢの勾配で３０分間の再クロマトグラフィー
により、２６.０分で溶出する純粋な生成物が得られ
た。フルオレセイン含有のハイブリッドを、Ｈ2Ｏ中で
Ｓephadex Ｇ-２５ Ｆine(２ｇ)のカラムに通すことに
よって部分的に精製し、すべての遊離のフルオレセイン
およびその他の低分子量の物質を主に除去することもで
きる。ボイドボリュームで溶出する高分子量の分画(０.
５ｍｌ)を集め、Ｈ2Ｏに対して徹底的に透析した。
とんどの精製は、１０％ゲルを用いるポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)によって行った。Ｂocの化学
によって調製した１個のリジンを含有するハイブリッド
の精製はＶydacＣ18 カラムによる逆相ＨＰＬＣで行う
のが好都合であるが、これは、このハイブリッドの５'-
ＤＭＴr基が無傷であるためである。このＤＭＴr含有の
ハイブリッドを始めに次の条件を用いて精製した：３
３.３％のＢでイソクラティックに２０分間、次いで６
６.６％のＢまでの勾配で３０分間。ＤＭＴr−ＫＰＩＢ
−ＳＬ−Ａha4ＬysＡlaは４４.０分で溶出する。溶出物
の脱トリチル化(等容量の酢酸、１５分)および０〜６
６.６％のＢの勾配で３０分間の再クロマトグラフィー
により、２６.０分で溶出する純粋な生成物が得られ
た。フルオレセイン含有のハイブリッドを、Ｈ2Ｏ中で
Ｓephadex Ｇ-２５ Ｆine(２ｇ)のカラムに通すことに
よって部分的に精製し、すべての遊離のフルオレセイン
およびその他の低分子量の物質を主に除去することもで
きる。ボイドボリュームで溶出する高分子量の分画(０.
５ｍｌ)を集め、Ｈ2Ｏに対して徹底的に透析した。
【００８３】実施例８：標的配列へのコンジュゲートの
ハイブリダイゼーション 以下のビオチン化したコンジュゲートを実施例６の方法
に従って調製した： Ａ．ＫＰＩＢ-ＬＬ-Ａha4Ｌys(ビオチン)Ａla (段階IV
でラベル) Ｂ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[Ａha2Ｌys(ビオチン)]
Ａla (段階II) Ｃ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[ＡhaＬys(ビオチン)]10Ａla (段階
III) Ｄ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[Ａha2Ｌys(ビオチン)]10Ａla (段
階III) [ここで、ＬＬおよびＳＬはそれぞれリンカー２および
１から導かれる連結を表す]。
ハイブリダイゼーション 以下のビオチン化したコンジュゲートを実施例６の方法
に従って調製した： Ａ．ＫＰＩＢ-ＬＬ-Ａha4Ｌys(ビオチン)Ａla (段階IV
でラベル) Ｂ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[Ａha2Ｌys(ビオチン)]
Ａla (段階II) Ｃ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[ＡhaＬys(ビオチン)]10Ａla (段階
III) Ｄ．ＫＰＩＢ-ＳＬ-[Ａha2Ｌys(ビオチン)]10Ａla (段
階III) [ここで、ＬＬおよびＳＬはそれぞれリンカー２および
１から導かれる連結を表す]。
【００８４】第４図は、コンジュゲートＡ〜Ｄ(レーン
Ａ〜Ｄに対応)を用いて、マウスのカリクレインcＤＮＡ
挿入体を含むpＵＣプラスミドを含有するドットブロッ
トにハイブリダイズさせたときに得られる結果を示すも
のである。このドットブロットは、１kbのマウス腎カリ
クレインcＤＮＡ挿入体を含有し、pＵＣから導かれる
３.７kbプラスミドを含有していた。ネガティブ対照(Ｎ
Ｃ)は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ(ＣＡＴ)構造遺伝子を継ぎ合わせたメタロチオネイ
ンIIA遺伝子プロモーターを含有する類似のpＵＣプラス
ミドであった。このニトロセルロースフィルターを、４
２℃で６.５時間、ハイブリダイゼーション緩衝液［０.
７５Ｍ ＮaＣｌ、０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム、２
５mＭ ＮaＨ2ＰＯ4、２５mＭ Ｎa2ＨＰＯ4、１０mＭ ピ
ロリン酸四ナトリウム、０.１mＭ アデノシン三リン酸
二ナトリウム、２５ｍｇ／ｌ サケ精子ＤＮＡ、０.０１
％ w／v Ｆicoll、０.０１％ ポリビニルピロリドン、
０.０１％ウシ血清アルブミン、２０％ ホルムアミド]
(１０ｍｌ)中でプレハイブリダイズさせ、次いでプロー
ブ(１００nｇ)を加え、これを４２℃で一晩ハイブリダ
イズさせた。次いで、このフィルターを、０.２ｘＳＳ
Ｃ[０.０３Ｍ ＮaＣｌ、０.００３Ｍ クエン酸ナトリウ
ム]中、４２℃で４回(それぞれ１０分間)洗浄した。Ｂ
ＲＬ(Bethesda Research Labs)ＢluＧＥＮＥキット(ビ
オチンに結合するストレプトアビジン-アルカリホスフ
ァターゼ コンジュゲートを使用)、およびそれに続く現
像反応[酵素が基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(Ｎ
ＢＴ)および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル
ホスフェート(ＢＣＩＰ)に作用して不溶性の染料沈澱を
生成する]によってシグナルを検出した。
Ａ〜Ｄに対応)を用いて、マウスのカリクレインcＤＮＡ
挿入体を含むpＵＣプラスミドを含有するドットブロッ
トにハイブリダイズさせたときに得られる結果を示すも
のである。このドットブロットは、１kbのマウス腎カリ
クレインcＤＮＡ挿入体を含有し、pＵＣから導かれる
３.７kbプラスミドを含有していた。ネガティブ対照(Ｎ
Ｃ)は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ(ＣＡＴ)構造遺伝子を継ぎ合わせたメタロチオネイ
ンIIA遺伝子プロモーターを含有する類似のpＵＣプラス
ミドであった。このニトロセルロースフィルターを、４
２℃で６.５時間、ハイブリダイゼーション緩衝液［０.
７５Ｍ ＮaＣｌ、０.０７５Ｍ クエン酸ナトリウム、２
５mＭ ＮaＨ2ＰＯ4、２５mＭ Ｎa2ＨＰＯ4、１０mＭ ピ
ロリン酸四ナトリウム、０.１mＭ アデノシン三リン酸
二ナトリウム、２５ｍｇ／ｌ サケ精子ＤＮＡ、０.０１
％ w／v Ｆicoll、０.０１％ ポリビニルピロリドン、
０.０１％ウシ血清アルブミン、２０％ ホルムアミド]
(１０ｍｌ)中でプレハイブリダイズさせ、次いでプロー
ブ(１００nｇ)を加え、これを４２℃で一晩ハイブリダ
イズさせた。次いで、このフィルターを、０.２ｘＳＳ
Ｃ[０.０３Ｍ ＮaＣｌ、０.００３Ｍ クエン酸ナトリウ
ム]中、４２℃で４回(それぞれ１０分間)洗浄した。Ｂ
ＲＬ(Bethesda Research Labs)ＢluＧＥＮＥキット(ビ
オチンに結合するストレプトアビジン-アルカリホスフ
ァターゼ コンジュゲートを使用)、およびそれに続く現
像反応[酵素が基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム(Ｎ
ＢＴ)および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル
ホスフェート(ＢＣＩＰ)に作用して不溶性の染料沈澱を
生成する]によってシグナルを検出した。
【００８５】段階(IV)(レーンＡ)または段階(II)(レー
ンＢ)のどちらかでビオチンを結合させたハイブリッド
の間には、シグナルの有意の差が存在しないことが明ら
かである。これは、オリゴヌクレオチド合成の条件が、
ストレプトアビジン コンジュゲートに結合することが
できなくなるようにはビオチン残基に悪影響を及ぼさな
いことを示すものである。さらに、段階(III)で導入し
た１０個のビオチン残基を含有するハイブリッド(レー
ンＣおよびＤ)は、１個のラベルのハイブリッドのシグ
ナルよりも約１０倍強いシグナルを与える。ラベル間に
１個のＡhaスペーサー(レーンＣ)または２個のＡhaスペ
ーサー(レーンＤ)を有する複数ラベルのハイブリッドの
ストレプトアビジン結合親和性には有意差は存在しない
ようである。従って、ビオチン残基の相対的な近接度
は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ コン
プレックスが有意な程度にビオチン残基に結合する能力
に影響を及ぼさないようである。ネガティブ対照(ＮＣ)
(無関係の挿入体を有するpＵＣ)を考慮に入れると、こ
のドットブロット法による１個のラベルのプローブの感
受性は０.５nｇ(２２０aモル)であり、複数ラベルのプ
ローブは０.０５nｇ(２２aモル)である。また、これら
のビオチン化したプローブを用いて組織片にハイブリダ
イズさせた。
ンＢ)のどちらかでビオチンを結合させたハイブリッド
の間には、シグナルの有意の差が存在しないことが明ら
かである。これは、オリゴヌクレオチド合成の条件が、
ストレプトアビジン コンジュゲートに結合することが
できなくなるようにはビオチン残基に悪影響を及ぼさな
いことを示すものである。さらに、段階(III)で導入し
た１０個のビオチン残基を含有するハイブリッド(レー
ンＣおよびＤ)は、１個のラベルのハイブリッドのシグ
ナルよりも約１０倍強いシグナルを与える。ラベル間に
１個のＡhaスペーサー(レーンＣ)または２個のＡhaスペ
ーサー(レーンＤ)を有する複数ラベルのハイブリッドの
ストレプトアビジン結合親和性には有意差は存在しない
ようである。従って、ビオチン残基の相対的な近接度
は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ コン
プレックスが有意な程度にビオチン残基に結合する能力
に影響を及ぼさないようである。ネガティブ対照(ＮＣ)
(無関係の挿入体を有するpＵＣ)を考慮に入れると、こ
のドットブロット法による１個のラベルのプローブの感
受性は０.５nｇ(２２０aモル)であり、複数ラベルのプ
ローブは０.０５nｇ(２２aモル)である。また、これら
のビオチン化したプローブを用いて組織片にハイブリダ
イズさせた。
【００８６】ハイブリダイゼイションの組織化学分析は
Ｃoghlan,J.P.等[Anal.Biochem.,149,pp.1-28 (1985)]
の方法に従って行った。簡単に説明すると、６μｍの凍
結切片を０.１Ｍリン酸塩(pＨ７.２)中で５分間、４％
ホルムアルデヒドで固定し、１０分間プレハイブリダイ
ズさせた[５０mＭ リン酸ナトリウム(pＨ７.０)、５.０
mＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ ficoll、０.０２％ ウシ血清
アルブミン、０.０２％ ポリビニルピロリドン、および
０.０１％ ニシン精子ＤＮＡ中で]。次いで、ラベルさ
れたコンジュゲートを０.８nｇ／μｌの濃度で加えた。
ハイブリダイゼイションを４０℃で３日間行った。次
に、この切片(顕微鏡スライドガラスに付着させた)を、
４ｘＳＳＣ[保存溶液ｘ２０は、蒸留水中の３Ｍ 塩化ナ
トリウム、０.３Ｍ クエン酸ナトリウム]中ですすい
だ。次いで、コンジュゲートのハイブリダイゼイション
を光学顕微鏡下で発色させて可視化した。
Ｃoghlan,J.P.等[Anal.Biochem.,149,pp.1-28 (1985)]
の方法に従って行った。簡単に説明すると、６μｍの凍
結切片を０.１Ｍリン酸塩(pＨ７.２)中で５分間、４％
ホルムアルデヒドで固定し、１０分間プレハイブリダイ
ズさせた[５０mＭ リン酸ナトリウム(pＨ７.０)、５.０
mＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ ficoll、０.０２％ ウシ血清
アルブミン、０.０２％ ポリビニルピロリドン、および
０.０１％ ニシン精子ＤＮＡ中で]。次いで、ラベルさ
れたコンジュゲートを０.８nｇ／μｌの濃度で加えた。
ハイブリダイゼイションを４０℃で３日間行った。次
に、この切片(顕微鏡スライドガラスに付着させた)を、
４ｘＳＳＣ[保存溶液ｘ２０は、蒸留水中の３Ｍ 塩化ナ
トリウム、０.３Ｍ クエン酸ナトリウム]中ですすい
だ。次いで、コンジュゲートのハイブリダイゼイション
を光学顕微鏡下で発色させて可視化した。
【００８７】１０個のビオチン残基を含むプローブＤを
用いて、マウス顎下腺の６μｍ切片中のカリクレインm
ＲＮＡを検出した。第５図に示すように、プローブＤ
は、顎下腺の複雑な細管に一致する、マウスカリクレイ
ン遺伝子の大部分の発現部位である腺の別個の領域を強
くラベルした(光学顕微鏡で検出)。
用いて、マウス顎下腺の６μｍ切片中のカリクレインm
ＲＮＡを検出した。第５図に示すように、プローブＤ
は、顎下腺の複雑な細管に一致する、マウスカリクレイ
ン遺伝子の大部分の発現部位である腺の別個の領域を強
くラベルした(光学顕微鏡で検出)。
【００８８】実施例９：反応性の３'ヒドロキシ基を有
するポリアミド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの
合成 式：
するポリアミド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの
合成 式：
【化５】 [式中、Ｒはアルキルまたは置換アルキルである]で示さ
れるウリジン誘導体を、本出願人の同時係属豪州出願Ｎ
o.ＰＩ２６６６／８７の方法に従って合成することがで
きる。次いで、このような化合物を、
れるウリジン誘導体を、本出願人の同時係属豪州出願Ｎ
o.ＰＩ２６６６／８７の方法に従って合成することがで
きる。次いで、このような化合物を、
【化６】 (ここにスペーサー、例えばポリアミドが存在していて
もよい)とＤＣＣの存在下で反応させて、
もよい)とＤＣＣの存在下で反応させて、
【化７】 を得ることができる。次いで、延長ポリアミドをＣ-５
アーム上で合成することができ、これに続いてオリゴヌ
クレオチドをヌクレオシドの５'-ヒドロキシ基上で合成
することができる。これらのウリジン誘導体類は、３'
ＯＨへの延長が必要とされる状況下で、例えばＤＮＡの
配列決定において有用である。そのような状況下におい
て、ヌクレオシドをＣＰＧに結合させているエステル基
を都合よく切断することができる。
アーム上で合成することができ、これに続いてオリゴヌ
クレオチドをヌクレオシドの５'-ヒドロキシ基上で合成
することができる。これらのウリジン誘導体類は、３'
ＯＨへの延長が必要とされる状況下で、例えばＤＮＡの
配列決定において有用である。そのような状況下におい
て、ヌクレオシドをＣＰＧに結合させているエステル基
を都合よく切断することができる。
【図１】 固相ペプチド合成の反応工程を示す。
【図２】 オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲ
ート製造の反応工程を示す。
ート製造の反応工程を示す。
【図３】 変性２０％ポリアクリルアミドゲルでの、32
Ｐで末端ラベルした粗製のＫＰＩＢ−(ＡlaＬys)5−Ａl
a(レーン１)および正常なＫＰＩＢ(レーン２)の電気泳
動分析を示す。
Ｐで末端ラベルした粗製のＫＰＩＢ−(ＡlaＬys)5−Ａl
a(レーン１)および正常なＫＰＩＢ(レーン２)の電気泳
動分析を示す。
【図４】 ビオチンラベルしたポリアミド-オリゴヌク
レオチド コンジュゲートを用いるドットブロット ハイ
ブリダイゼーションを示すクロマトグラフィーである。
レオチド コンジュゲートを用いるドットブロット ハイ
ブリダイゼーションを示すクロマトグラフィーである。
【図５】 雄性マウス顎下腺の６μｍ凍結切片にハイブ
リダイズするビオチンラベルしたポリアミド-カリクレ
イン オリゴヌクレオチドを示す顕微鏡写真である。
リダイズするビオチンラベルしたポリアミド-カリクレ
イン オリゴヌクレオチドを示す顕微鏡写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年８月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/08 Ｃ０８Ｇ 69/42 ＮＳＮ Ｃ０８Ｇ 69/08 ＮＲＨ Ｇ０１Ｎ 33/566 69/42 ＮＳＮ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ 33/569 ＡＤＺ (72)発明者 ジム・ハララムビディス オーストラリア国、ビクトリア3128ボック ス・ヒル・サウス、エルガー・ロード156 番 (72)発明者 ジェフリー・ウィリアム・トリーギアー オーストラリア国、ビクトリア3122、ホー ソーン、ホーソーン・グローブ62番
Claims (18)
- 【請求項１】 式： Ｘ−Ｌ−Ｙ [式中、Ｘはポリアミドであり、Ｙはオリゴヌクレオチ
ドであり、そしてＬはポリアミドＸのアミノ末端および
オリゴヌクレオチドＹの３'ホスフェート基と共有結合
を形成するリンカーである]で示されるオリゴヌクレオ
チド-ポリアミド コンジュゲート。 - 【請求項２】 リンカーＬが、ポリアミドのアミノ末端
と結合を形成する第１の反応性基、およびオリゴヌクレ
オチドの３'ホスフェートと結合を形成する第２の反応
性基を有する２官能性のリンカーである請求項１記載の
コンジュゲート。 - 【請求項３】 ポリアミドＸが天然アミノ酸で構成され
ているペプチドである請求項１または請求項２記載のコ
ンジュゲート。 - 【請求項４】 ポリアミドが合成α,ωアミノカルボン
酸、または天然アミノ酸と合成α,ωアミノカルボン酸
の組合せで構成されている請求項１〜３のいずれかに記
載のコンジュゲート。 - 【請求項５】 ポリアミドが１またはそれ以上のリポー
ターグループを含んでいる請求項１〜４のいずれかに記
載のコンジュゲート。 - 【請求項６】 リポーターグループが蛍光団、ビオチ
ン、酵素、またはコロイド状化合物から選ばれる請求項
５記載のコンジュゲート。 - 【請求項７】 リポーターグループがフルオレセイン、
テトラメチルローダミン、テキサス・レッド、クマリ
ン、炭酸脱水酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、デヒドロゲナーゼ、および／またはコロイド状
の金または銀から選ばれる請求項６記載のコンジュゲー
ト。 - 【請求項８】 ポリアミドが抗原性であり、それに結合
する抗体によって検出することができる請求項１〜４の
いずれかに記載のコンジュゲート。 - 【請求項９】 式： Ｚ−Ｘ−Ｌ [式中、Ｚは固相マトリックスを表し、Ｘは該固相マト
リックスにそのＣ-末端で結合しているポリアミドを表
し、そしてＬはポリアミドのＮ-末端に結合している第
１の反応性基、およびヌクレオチドの３'ホスフェート
と結合を形成することができる第２の反応性基を有する
２官能性のリンカーを表す]で示されるポリアミド。 - 【請求項１０】 請求項６または７記載のリポーターグ
ループを１またはそれ以上含んでいる請求項９記載のポ
リアミド。 - 【請求項１１】 予め調製したオリゴヌクレオチドまた
はヌクレオチドの３'末端ホスフェートを、予め調製し
たポリアミドのアミノ末端に結合させる工程を包含する
オリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの製造
方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートの合成方法
であって、 (a)第１のアミノ酸またはアミノ酸ユニット(アミド結合
によって互いに結合している)のＣ-末端を支持マトリッ
クスと反応させて、それらの間に結合を形成させ； (b)次いで、この支持マトリックスを、周知の固相ペプ
チド合成法に従い、１またはそれ以上のアミノ酸と順次
反応させてポリアミドを得； (c)この支持マトリックス-ポリアミドをリンカーの第１
の反応性基と反応させて、ポリアミドのアミノ末端とリ
ンカーを結合させ； (d)工程(c)の生成物を第１のヌク
レオチドと反応させて、リンカーの第２の反応性基とヌ
クレオチドの３'ホスフェートを結合させ; (e)次い
で、この支持マトリックスを、周知の固相オリゴヌクレ
オチド合成法に従い、１またはそれ以上のヌクレオチド
と順次反応させてオリゴヌクレオチドを得；そして (f)所望により、支持マトリックスからオリゴヌクレオ
チド-ポリアミド コンジュゲートを切断し、ポリアミド
またはオリゴヌクレオチドの反応性基に結合しているす
べての保護基を除去し、そして得られたコンジュゲート
を精製すること；を特徴とする方法。 - 【請求項１３】 動物または植物組織における特定のポ
リヌクレオチド群の存在およびその位置の測定方法であ
って、 (a)被験組織片を調製し； (b)この組織片を請求項１〜８のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート(ここで、
このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は標的ポ
リヌクレオチドの一部に相補性である)とハイブリダイ
ズさせ； (c)組織片からハイブリダイズしていないプローブ物質
を除去し;そして (d)コンジュゲートのハイブリダイゼーションによって
ラベル化された組織片中の位置を検出するか、または同
定すること；を特徴とする方法。 - 【請求項１４】 支持マトリックスに固定化されたか、
またはその他の方法でそれに結合している特定のポリヌ
クレオチドの検出方法であって、支持マトリックスを請
求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド-ポ
リアミド コンジュゲート(ここで、このコンジュゲート
のオリゴヌクレオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一
部に相補性である)と接触させ、次いでコンジュゲート
の支持マトリックスへのハイブリダイゼーションを検出
することを特徴とする方法。 - 【請求項１５】 生物学的試料中の特定のウイルス性、
細菌性またはその他のポリヌクレオチドの存在または非
存在の検出方法であって、試料の核酸を請求項１〜８の
いずれかに記載のオリゴヌクレオチド-ポリアミド コン
ジュゲート(ここで、このコンジュゲートのオリゴヌク
レオチド部分は標的ポリヌクレオチドの一部に相補性で
ある)と接触させ、次いでコンジュゲートのハイブリダ
イゼーションが起こるか否かを検出することを特徴とす
る方法。 - 【請求項１６】 ウイルス性、細菌性またはその他の疾
病の治療方法であって、そのような治療を必要としてい
る患者に治療学的有効量の請求項１〜８のいずれかに記
載のオリゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲートを
投与することを特徴とし、さらに、このコンジュゲート
のオリゴヌクレオチド部分がアンチセンス オリゴヌク
レオチドであって特定のウイルス性、細菌性またはその
他のポリヌクレオチドに相補性であり、従って特定のポ
リヌクレオチドの転写または翻訳をブロックするもので
あることを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 請求項１〜８のいずれかに記載のオリ
ゴヌクレオチド-ポリアミド コンジュゲート(ここで、
このコンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分は所望の
ポリヌクレオチドの一部に相補性である)；およびコン
ジュゲートのハイブリダイゼーションを検出するための
試薬；からなる所望のポリヌクレオチドを検出するため
の診断キット。 - 【請求項１８】 組織片調製のための試薬をさらに含有
し、動物または植物組織中の特定のポリヌクレオチド群
の存在およびその位置の測定に用いる請求項１７記載の
診断キット。
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