JPS59204200A - 2,4―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 - Google Patents
2,4―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体Info
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- JPS59204200A JPS59204200A JP7587883A JP7587883A JPS59204200A JP S59204200 A JPS59204200 A JP S59204200A JP 7587883 A JP7587883 A JP 7587883A JP 7587883 A JP7587883 A JP 7587883A JP S59204200 A JPS59204200 A JP S59204200A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の背f。
技術分野
本発明は、一般に、2,4−ジニトロフェニルヌクレオ
チド誘導体に関する。さらに具体的には。 本発明は、ヌクレオチFの塩基以外の部分に2゜4−ジ
ニトロベンゼンを結合させてなる2、4−ジ−40フエ
ニルヌクレオチ)’ rDj 4’; 体に閏スル。 本発明は、また、このような2,4−ジニトロフェニル
ヌクレオチP誘導体の製造法にも関する。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素によって検
出することができる、ポリあるいはオリゴヌクレオチド
誘導体は、核酸用アフイニテイーゾローブとして興味が
持たれている。 近年、Vincentらによって、2.4−ノニトロフ
ェニル(以下DNPと略す)基を核酸に結合させた、D
NAプローブが開発されている( Nucl、 Ac1
dsIζes、 、川、6787−6796 (198
2) )。彼らは、アデノシントリリン酸(ATP)の
DNP誘導体”7 DNA’1に取り込ませ、相補的塩
基配列を持つDNAにハイブリダイズさせたのち、DN
Pに対するウサギ抗血清および・ぐ−オギシダーゼで標
識したウサギ免疫グロブリンG型(IgG)に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的DNA ’f検出している
。ここで用いたDNA鎖は、天然から取り出したフラグ
メントである。 しかし、本発明者らの知るところ罠まれヲ」:、このよ
うにして製造されるDNP−ヌクレオチド誘導体には下
記のような問題点がある。 (イ)ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有すりため
、使用オリゴヌクレオチド固有の融屏温ムL(Tm値)
に変化を生じる。 (cff)任意でかつ定められた塩基配列をもつDNA
の合成が固持である。 これらの理由によって、現段階でのDNP−ヌクレオチ
ド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用性が限定されて
いるのが現状である。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えること7目的とし、特定
のオリゴデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチド塩基
以外の特定部位に2,4−ジニトロベンゼン乞結合させ
てなるDNP−ヌクレオチド誘導体によってこの目的ヲ
4成しようとするものである。 従って、本発明によるDNP−ヌクレオチl−′誘層体
は下式[vn〕で示されるDNP−オリゴデオキシリゼ
ヌクレオチドであること、を特徴と1−るものである。 また、本発明によるDNP−ヌクレオチド1透導体の製
造法は、下式[Vl ]で示されるオリゴヌクレオチド
誘導体の末端アミン基に2,4−ジニトロベンゼンを結
合させて下式〔■〕で示されるDNP−オリゴデオキシ
リゼヌクレオチドを得ること、ヲ特徴とするものである
。 〔ただし5mおよび+1はそれぞれ0または任意の自然
数であり、Rは2価の直鎖または分岐鎖の炭化氷菓tM
基であり、Bはヌクレオチド誘導体1−る塩基である(
Bが複数個存在するときは、それらは同一でも異なって
もよい)。〕 効果 本発明者らの合成したDNP−オリゴデオギシリン」?
ヌクレオチドは%前記核酸用非放射1J二T 7 イ=
テイフロープの短所を回避することができて、下6己の
ような艮Hiヲもつものである。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有しない
ので、融解温度(Tm値)に変化を生じることがなくて
安定である。 (ロ)いかなる塩基配列をもつDNP−オリゴヌクレオ
チドも合成可能である。 (ハ) プローブとして短鎖オリゴマーで十分である。 に)合成が非常に簡単でちって大量合成が可能であり、
また長期保存もpJi止である。 (ホ)プライマー(鋳型合成の隙のDNA 119r片
)としても利用できる。 最近、板金らは、鎖長19の合成オリゴヌクレオチドを
用いてβ−グロビンの遺伝子病の診LliY行なってお
り(proc、 Natl 、 Acad、 Sci、
USA ; 80.278−282 (1983)
、遺伝子中のわずか一つの塩基配列の違いも検出できる
合成オリゴヌクレオチドが各種遺伝予病解析に有用であ
ること乞示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの放射性lnJ位元素(
32P)を使用したが、代わりに本発明者もが開発した
DNP−ヌクレオチド誌導体ビ用いることができれば、
非常に有用なことは明白であろう。 このような長所があるところから、本発明のDNP−ヌ
クレオチド誘導体の利用方法の拡大も考えられろ。 1−なわち、たとえば、 DNP−オリゴヌクレオチ1
:′は、非放射性核酸用アフィニティープローブとしで
、あるいはプライマーとして、利用T0J能であること
は前記したところであって、その検出力法は抗体による
沈降、酵累免疫活性測定、螢光性染色体による可視化等
々、多様であり、また本発明のDNI)−ヌクレオチド
誘導体は放射性プローブC32P)vc比べて被曝の危
険、コスト、廃棄物の処理および保存性の点でも有利で
ある。 なお、DNP基は、市販のウサギ抗血清(たとえばMi
les Laboratories、 Cocle N
o、 61−006−1 ) ”?、た(′;l1、D
NPに対づ−るモノクローナル抗体によってb′易に検
出することができる。 本発明によるDNPヌクレオチー躊体は、前記の式〔■
〕で示されるものである。 式中、記号 Bは、2′−デオキシリセックレオ上 シトの3′−および5′−水(:r* 4を除いたデオ
キシリゾヌクレオシド残卆を示すのに慣用されているも
のであって、具体的には下記の構造のものである。 置換基Bはヌクレオチド馨構成するI昇基乞下し。 通常はアデニン、チミン、シトシンまたf”Lグアニン
である。化合物〔■1〕中にBがを数II/!l存在す
るときは、それらは同一でも異なってもよい。 mおよびnは、それぞれ0またば自公会:独を示す。 本発明DNPオリゴヌクレオチド誘ハ月本の5f合度が
m−1−nで表示されているのは、本発明の好ましい製
造法で重合間がそわ、ぞれIIIおよび口のフラクショ
ンを縮合させていることによΦもので・ある(詳にI1
1後記)。その場合のInは実用的に+4二〇−6,特
に1〜4、nは実用的に(工0\40.特に0〜ム)、
である。 41Rは、化合物〔■1〕の核酸部分とDNP部分とを
連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である
。これは、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖
のアルキレン基が適当である。好ましいRは、炭素数2
〜60アルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明によるDNP−ヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によって合成する
ことができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔■〕のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
5′〜末端リン酸基に基R’Y介して一般アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基にDNPを結合させることか
らなるものである。 一方、式[Vl]の化合物は、オリゴヌクレオチドの合
成および生成オリv%ヌクレオチPの5′−水酸基延長
上での一般アミン基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は。 下記の意味を持つ(その意義ないし詳細は、後「記した
通りである)。 R0リン酸基乞保護する置換基であって1通常オルトク
ロロフェニル基が用いられる。 R1二価の炭化水垢残基である。 R25′〜末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 R3他のすべその保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステル乞与えることができる置換基であ
って、通常シアノエチル基が用いられる。 Rアζノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセチ
ル基が用いられる。 qnより小さい任意の自然数。 m Oまたは任意の自然数。 nQおよび任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はR6−ペンゾイ
ルアデニ/、N−イソブチリルグアニン、R6−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン(すなわち。 保護不要)より選択される。 一〜■ スペーサーを介した担体であって、通常は下記
のものである。 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物[Vl]の合
成には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters 1979,
3635(1979)Nucleic Ac1ds R
e5earch 8,5473(1980)Nucle
ic Ac1ds Re5earch 8,5491(
1980)Nucleic Ac1ds Re5ear
clx 8,5507(1980)Nucleic A
c1ds R,esearcb Symposium
5eries7.281(1980) また、上記で合成したオリザックレオチドリ5′−水酸
基にリン酸基を介して一敵アミノ基を尋人する方法、す
なわち化合物[VJ)の合成法としては。 たとえば本発明者らの特願昭57−138136号明細
書記載の方法がある。 化合物[VJ]の合成法をその一実施態様について示せ
ば、下記の通りである。すなわち、第1図に示したよう
に、化合物[1)の保護基R3Y除去したものと化合物
[]T]の保踵基R’&除去したものとを縮合させ、こ
れらの操作乞くり返づ−ことによって、化合物〔■〕を
合成する。オリゴヌクレオチド化合物〔■〕の合成法は
、上記の通り公知である。 一方、本発明者らの方法(特願昭57−138136号
明細書参照)に従って、式〔1v〕の化合物を合成する
。すなわち、化合物[1]のR2を除去して5′−水酸
基化合物とし、これにリン酸化11J (たとえば、ホ
スホジトリアゾリド、ホスホジクロリrまたはホスホジ
ペンゾトリアゾリド等)を作用させてリン酸化し、つい
でアミン基が保護、されているアミノアルコール化合物
R2−Nf(−R1−OH[この化合4勿ハオメi −
7ミ/ フルコール(NH2−R’−0H)ノアミノ基
をRで保護することにより得ることができる〕を縮合さ
せることにより、化合!吻[IV]を得ることができる
(詳細は該明細書参照)。 この化合物[IV]の保護基R3を除去し、化合物〔1
■〕の保護基R2w除去したものと縮合させて。 化合物[V]を合成する。縮合は、化合物[111]の
合成の際の縮合と本質的には変らない方法で行なうこと
ができる。 このようにして合成された化合物〔ル〕の保詠苓をすべ
て除去すれば、化合物[Vl]が得られる。保% 基C
o−A−■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフ
ェニル基および塩基部分のアシル基は。 0.5Mのテトラメチルグ゛アニジンービリジン−2−
カルゼアルドキシムのジオキサン−水(9:1゜(v/
v))i液で処理後、アルカリ処理(濃アンモニア水)
を行なうことより除去される。R4がトリフルオロアセ
チル基の場合は、アンモニア処理により充分脱離される
が、オルトニトロフェニルスルフェニル基である場合は
メルカプトエタノール処理が必要である。Rとして他の
保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチP部分が簀定
な条件で、さらに別の処理?加えることも可能である。 なお、デオキシオリゴリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」 「丸首1977年)
、「核敗有機化学」(化学同人1979年)、「核ν」
(朝食書店1979年) 、 Tetrahedron
、:(4,3143(1978) 、有合化、ヱ、7
23 (1978)および化学の領域、盃、566(1
979)等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 りNP−オリビデオキシリゼヌクレオチ)4(化合物〔
■〕)は、上記化合物〔v1〕の5′−末端延長上の一
般アミノ基に2,4−ジニトロベンゼンを結合させるこ
とによって得ることができる。 両者の結合は、2,4−ジニトロベンゼンの1−位と化
合物〔■〕のアミノ基との間のC−N結合の形成を実現
することのできる任意の方法によって行なうことができ
る。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわちDNP
−X (Xは1−置換基)とアミン基との間の脱H−
X縮合によることがふつうである。Xと゛しては、ハロ
ゲンが好ましい。Xがハロゲンである誘導体、すなわち
I−ハロゲノ−2,4−uニトロベンゼンが好ましいの
は、一般に、オリコヌクレオチrの塩基部分のアミノ基
とは反応しないで5′−水酸基末端延長上の一般アミノ
基とのみ選択的に反応し、しかも反応操作が簡便だから
である。とりわけ、■−フルオロー2.4−ジニトロベ
ンゼンは市販され容易に入手でき、穂かな反応条件で化
合物[VI]のアミノ基との反応が進行する。 ■−ハロゲノー2,4−ジニトロベンゼンと化合物[V
X]との反応は、両者の均一溶液中(溶媒は、たとえば
含水アルコール)あるいは不拘−済液中(溶媒は、たと
えば水)、ノ・ロゲン化水素捕捉剤(たとえば、炭酸氷
菓ナトリウム、トリエチルアミン、水酸化カリウム等)
の存在下に、【0〜50℃程度の温度で実施することが
できる。目的生成物は、たとえば抽出によって回収すれ
ばよい。なおりNP化に関しては、適当な総説、たとえ
ば[実験化学講座1.蛋白質の化学iI、第118頁」
(1976年(丸首(V発行)等を参照することができ
る。 実施例 1)フローチャート 第2図のフローチャートに従って、本発明化合物(同図
の化合物0)を製造した。 第2図で、記号は次の意味7持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMT r ジメトキシトリチル ROオルトクロロフェニル F2t エチル CF] −シアノエチル n 2 L 2 12 2)化合物〔■〕(第2図の■)の合成実験1−1 ノメトキシトリチルアデノシン/・1五1月旨〔■〕(
樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目的化合物
は外観的VCは樹脂そのものと変らないので、樹脂に相
持された当該化合物を以下にliiいて単ニ樹脂と呼ぶ
ことにする) 300mg(0,033mmol)をイ
ソプロノミノール−塩化メチレン(15: )i5、V
/V)i液10 m lで3回洗浄後、臭化亜鉛の1.
0Mのイソプロ・ξノールー塩化メチレン溶g 3 r
nlで5外間ずつ4回反応(脱トリチル化)させて厨脂
〔■〕を得る。耐詣〔■〕をイノプロ・ξノールシー塩
化メチレン溶液10m1 で3回洗浄し、これにジヌク
レオチド[■] 150mg (0、1mmol)のピ
リジン溶液を添加後、共沸させて糸乞領水とし、メシチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド(以下MSNTと記
す) 150mg (0,5mmol )と無水ピリジ
ン2ml とを添加して90分間反応(縮合)させる
。 反応後、ピリジン10m1 で3回洗浄し、触媒量(約
10mg)のジメチルアミノピリジン(以下DMAP)
を含む無水酢酸〜ピリジン(1:9.(V/V))溶液
10m、17添加し10分間反尾、させて未反応5′−
水ra基ケアセチル化して保原し、これをピリジンで洗
浄して、化合物〔■’](n=2)を得る。 以上のような操作乞6回くり返して、化合物〔■〕(n
=12)ケ得る。 一方、 5’−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕8
00mgC帆71mmof)とオルトクロロフェニルホ
スホジトリアゾリドと2後者のジオギサン浴液(1,0
mmol、 6m1)中で2時間反応させ、−t’jc
いてトリフルオロアセチル−6−アミンヘキサノール3
00 mg (1、4m mol )および1−メチル
−イミダゾール115mg(1,4mmol ) f加
えてさらに2時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去
し、残液をクロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリ
ン酸二水素す) IJウム水溶液、飽和炭酸水素す)
iJウム水溶液および5%の塩化ナトリウム水浴液でそ
れぞれ洗浄し、無水硫酸す) リウムで乾燥¥る。 クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製(溶
出液として0〜4%のメタノール含有クロロホルムを使
用)シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化
合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物〔■](n=12) 115mg
。 (3,45μmof) を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔■〕に、化合物〔0360mg (0,
04mmol )をトリエチルアミン−ピリジン−水(
1:3:1、V/V)溶液3ml で処理(脱シアノ
エチル化)した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち。 MSNT50mg (0、2mmol )およびビリジ
71 rnl ’a?加え□□□分間反応(縮合)させ
、反応終了後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥
して、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔■
〕ビ得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔0315mg Y o、!
5 Mテトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルゼ
アルドギシメイトのジオキサン−水(9:1゜CV/V
)溶液200μmを加え、遠沈管中、室温で胴時間反応
させる。反応後、濃アンモニア水(2,5m1)を加え
て密閉し、50℃で一枢反応させる。反応終了後、Pフ
のし、流液を濃縮後、水に居解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層を濃縮後。 セファデック、x、 G −50(φ] 、5 X 1
20 cm、 @出液は0.05Mの重炭俊トリエチル
アンモニウム緩衝液pH7,5)で脱塩精製しペンタデ
カアデニル酸誘縛体〔Q′3を得た。 また同様の方法で実験1−2.1−3および1−4のよ
うなオリゴヌクレオチド鋳心体を得た。 以上で合成した化合物f;r:第1表に示す。 第1表 ただし、この表でAはアデニン、Tはチミン、Gはグア
ニン、Cはシトシンを示す。 これら4種の化合物の高速液体クロマトグラフィーの結
果を第3図に示す。A〜Dは、それぞれ実験1.−1〜
1−4の化合物についての図である。 3)2.4−ジニトロフェニル−ペンタデカアデニル酸
チド誘導体に関する。さらに具体的には。 本発明は、ヌクレオチFの塩基以外の部分に2゜4−ジ
ニトロベンゼンを結合させてなる2、4−ジ−40フエ
ニルヌクレオチ)’ rDj 4’; 体に閏スル。 本発明は、また、このような2,4−ジニトロフェニル
ヌクレオチP誘導体の製造法にも関する。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素によって検
出することができる、ポリあるいはオリゴヌクレオチド
誘導体は、核酸用アフイニテイーゾローブとして興味が
持たれている。 近年、Vincentらによって、2.4−ノニトロフ
ェニル(以下DNPと略す)基を核酸に結合させた、D
NAプローブが開発されている( Nucl、 Ac1
dsIζes、 、川、6787−6796 (198
2) )。彼らは、アデノシントリリン酸(ATP)の
DNP誘導体”7 DNA’1に取り込ませ、相補的塩
基配列を持つDNAにハイブリダイズさせたのち、DN
Pに対するウサギ抗血清および・ぐ−オギシダーゼで標
識したウサギ免疫グロブリンG型(IgG)に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的DNA ’f検出している
。ここで用いたDNA鎖は、天然から取り出したフラグ
メントである。 しかし、本発明者らの知るところ罠まれヲ」:、このよ
うにして製造されるDNP−ヌクレオチド誘導体には下
記のような問題点がある。 (イ)ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有すりため
、使用オリゴヌクレオチド固有の融屏温ムL(Tm値)
に変化を生じる。 (cff)任意でかつ定められた塩基配列をもつDNA
の合成が固持である。 これらの理由によって、現段階でのDNP−ヌクレオチ
ド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用性が限定されて
いるのが現状である。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えること7目的とし、特定
のオリゴデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチド塩基
以外の特定部位に2,4−ジニトロベンゼン乞結合させ
てなるDNP−ヌクレオチド誘導体によってこの目的ヲ
4成しようとするものである。 従って、本発明によるDNP−ヌクレオチl−′誘層体
は下式[vn〕で示されるDNP−オリゴデオキシリゼ
ヌクレオチドであること、を特徴と1−るものである。 また、本発明によるDNP−ヌクレオチド1透導体の製
造法は、下式[Vl ]で示されるオリゴヌクレオチド
誘導体の末端アミン基に2,4−ジニトロベンゼンを結
合させて下式〔■〕で示されるDNP−オリゴデオキシ
リゼヌクレオチドを得ること、ヲ特徴とするものである
。 〔ただし5mおよび+1はそれぞれ0または任意の自然
数であり、Rは2価の直鎖または分岐鎖の炭化氷菓tM
基であり、Bはヌクレオチド誘導体1−る塩基である(
Bが複数個存在するときは、それらは同一でも異なって
もよい)。〕 効果 本発明者らの合成したDNP−オリゴデオギシリン」?
ヌクレオチドは%前記核酸用非放射1J二T 7 イ=
テイフロープの短所を回避することができて、下6己の
ような艮Hiヲもつものである。 (イ) ヌクレオチドの塩基部分にDNPを含有しない
ので、融解温度(Tm値)に変化を生じることがなくて
安定である。 (ロ)いかなる塩基配列をもつDNP−オリゴヌクレオ
チドも合成可能である。 (ハ) プローブとして短鎖オリゴマーで十分である。 に)合成が非常に簡単でちって大量合成が可能であり、
また長期保存もpJi止である。 (ホ)プライマー(鋳型合成の隙のDNA 119r片
)としても利用できる。 最近、板金らは、鎖長19の合成オリゴヌクレオチドを
用いてβ−グロビンの遺伝子病の診LliY行なってお
り(proc、 Natl 、 Acad、 Sci、
USA ; 80.278−282 (1983)
、遺伝子中のわずか一つの塩基配列の違いも検出できる
合成オリゴヌクレオチドが各種遺伝予病解析に有用であ
ること乞示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの放射性lnJ位元素(
32P)を使用したが、代わりに本発明者もが開発した
DNP−ヌクレオチド誌導体ビ用いることができれば、
非常に有用なことは明白であろう。 このような長所があるところから、本発明のDNP−ヌ
クレオチド誘導体の利用方法の拡大も考えられろ。 1−なわち、たとえば、 DNP−オリゴヌクレオチ1
:′は、非放射性核酸用アフィニティープローブとしで
、あるいはプライマーとして、利用T0J能であること
は前記したところであって、その検出力法は抗体による
沈降、酵累免疫活性測定、螢光性染色体による可視化等
々、多様であり、また本発明のDNI)−ヌクレオチド
誘導体は放射性プローブC32P)vc比べて被曝の危
険、コスト、廃棄物の処理および保存性の点でも有利で
ある。 なお、DNP基は、市販のウサギ抗血清(たとえばMi
les Laboratories、 Cocle N
o、 61−006−1 ) ”?、た(′;l1、D
NPに対づ−るモノクローナル抗体によってb′易に検
出することができる。 本発明によるDNPヌクレオチー躊体は、前記の式〔■
〕で示されるものである。 式中、記号 Bは、2′−デオキシリセックレオ上 シトの3′−および5′−水(:r* 4を除いたデオ
キシリゾヌクレオシド残卆を示すのに慣用されているも
のであって、具体的には下記の構造のものである。 置換基Bはヌクレオチド馨構成するI昇基乞下し。 通常はアデニン、チミン、シトシンまたf”Lグアニン
である。化合物〔■1〕中にBがを数II/!l存在す
るときは、それらは同一でも異なってもよい。 mおよびnは、それぞれ0またば自公会:独を示す。 本発明DNPオリゴヌクレオチド誘ハ月本の5f合度が
m−1−nで表示されているのは、本発明の好ましい製
造法で重合間がそわ、ぞれIIIおよび口のフラクショ
ンを縮合させていることによΦもので・ある(詳にI1
1後記)。その場合のInは実用的に+4二〇−6,特
に1〜4、nは実用的に(工0\40.特に0〜ム)、
である。 41Rは、化合物〔■1〕の核酸部分とDNP部分とを
連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である
。これは、特に炭素数2〜20程度の直鎖または分岐鎖
のアルキレン基が適当である。好ましいRは、炭素数2
〜60アルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明によるDNP−ヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によって合成する
ことができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔■〕のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
5′〜末端リン酸基に基R’Y介して一般アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基にDNPを結合させることか
らなるものである。 一方、式[Vl]の化合物は、オリゴヌクレオチドの合
成および生成オリv%ヌクレオチPの5′−水酸基延長
上での一般アミン基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 第1図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は。 下記の意味を持つ(その意義ないし詳細は、後「記した
通りである)。 R0リン酸基乞保護する置換基であって1通常オルトク
ロロフェニル基が用いられる。 R1二価の炭化水垢残基である。 R25′〜末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 R3他のすべその保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステル乞与えることができる置換基であ
って、通常シアノエチル基が用いられる。 Rアζノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセチ
ル基が用いられる。 qnより小さい任意の自然数。 m Oまたは任意の自然数。 nQおよび任意の自然数。 B 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はR6−ペンゾイ
ルアデニ/、N−イソブチリルグアニン、R6−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン(すなわち。 保護不要)より選択される。 一〜■ スペーサーを介した担体であって、通常は下記
のものである。 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物[Vl]の合
成には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Tetrahedron Letters 1979,
3635(1979)Nucleic Ac1ds R
e5earch 8,5473(1980)Nucle
ic Ac1ds Re5earch 8,5491(
1980)Nucleic Ac1ds Re5ear
clx 8,5507(1980)Nucleic A
c1ds R,esearcb Symposium
5eries7.281(1980) また、上記で合成したオリザックレオチドリ5′−水酸
基にリン酸基を介して一敵アミノ基を尋人する方法、す
なわち化合物[VJ)の合成法としては。 たとえば本発明者らの特願昭57−138136号明細
書記載の方法がある。 化合物[VJ]の合成法をその一実施態様について示せ
ば、下記の通りである。すなわち、第1図に示したよう
に、化合物[1)の保護基R3Y除去したものと化合物
[]T]の保踵基R’&除去したものとを縮合させ、こ
れらの操作乞くり返づ−ことによって、化合物〔■〕を
合成する。オリゴヌクレオチド化合物〔■〕の合成法は
、上記の通り公知である。 一方、本発明者らの方法(特願昭57−138136号
明細書参照)に従って、式〔1v〕の化合物を合成する
。すなわち、化合物[1]のR2を除去して5′−水酸
基化合物とし、これにリン酸化11J (たとえば、ホ
スホジトリアゾリド、ホスホジクロリrまたはホスホジ
ペンゾトリアゾリド等)を作用させてリン酸化し、つい
でアミン基が保護、されているアミノアルコール化合物
R2−Nf(−R1−OH[この化合4勿ハオメi −
7ミ/ フルコール(NH2−R’−0H)ノアミノ基
をRで保護することにより得ることができる〕を縮合さ
せることにより、化合!吻[IV]を得ることができる
(詳細は該明細書参照)。 この化合物[IV]の保護基R3を除去し、化合物〔1
■〕の保護基R2w除去したものと縮合させて。 化合物[V]を合成する。縮合は、化合物[111]の
合成の際の縮合と本質的には変らない方法で行なうこと
ができる。 このようにして合成された化合物〔ル〕の保詠苓をすべ
て除去すれば、化合物[Vl]が得られる。保% 基C
o−A−■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフ
ェニル基および塩基部分のアシル基は。 0.5Mのテトラメチルグ゛アニジンービリジン−2−
カルゼアルドキシムのジオキサン−水(9:1゜(v/
v))i液で処理後、アルカリ処理(濃アンモニア水)
を行なうことより除去される。R4がトリフルオロアセ
チル基の場合は、アンモニア処理により充分脱離される
が、オルトニトロフェニルスルフェニル基である場合は
メルカプトエタノール処理が必要である。Rとして他の
保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチP部分が簀定
な条件で、さらに別の処理?加えることも可能である。 なお、デオキシオリゴリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」 「丸首1977年)
、「核敗有機化学」(化学同人1979年)、「核ν」
(朝食書店1979年) 、 Tetrahedron
、:(4,3143(1978) 、有合化、ヱ、7
23 (1978)および化学の領域、盃、566(1
979)等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 りNP−オリビデオキシリゼヌクレオチ)4(化合物〔
■〕)は、上記化合物〔v1〕の5′−末端延長上の一
般アミノ基に2,4−ジニトロベンゼンを結合させるこ
とによって得ることができる。 両者の結合は、2,4−ジニトロベンゼンの1−位と化
合物〔■〕のアミノ基との間のC−N結合の形成を実現
することのできる任意の方法によって行なうことができ
る。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわちDNP
−X (Xは1−置換基)とアミン基との間の脱H−
X縮合によることがふつうである。Xと゛しては、ハロ
ゲンが好ましい。Xがハロゲンである誘導体、すなわち
I−ハロゲノ−2,4−uニトロベンゼンが好ましいの
は、一般に、オリコヌクレオチrの塩基部分のアミノ基
とは反応しないで5′−水酸基末端延長上の一般アミノ
基とのみ選択的に反応し、しかも反応操作が簡便だから
である。とりわけ、■−フルオロー2.4−ジニトロベ
ンゼンは市販され容易に入手でき、穂かな反応条件で化
合物[VI]のアミノ基との反応が進行する。 ■−ハロゲノー2,4−ジニトロベンゼンと化合物[V
X]との反応は、両者の均一溶液中(溶媒は、たとえば
含水アルコール)あるいは不拘−済液中(溶媒は、たと
えば水)、ノ・ロゲン化水素捕捉剤(たとえば、炭酸氷
菓ナトリウム、トリエチルアミン、水酸化カリウム等)
の存在下に、【0〜50℃程度の温度で実施することが
できる。目的生成物は、たとえば抽出によって回収すれ
ばよい。なおりNP化に関しては、適当な総説、たとえ
ば[実験化学講座1.蛋白質の化学iI、第118頁」
(1976年(丸首(V発行)等を参照することができ
る。 実施例 1)フローチャート 第2図のフローチャートに従って、本発明化合物(同図
の化合物0)を製造した。 第2図で、記号は次の意味7持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン B アデニン DMT r ジメトキシトリチル ROオルトクロロフェニル F2t エチル CF] −シアノエチル n 2 L 2 12 2)化合物〔■〕(第2図の■)の合成実験1−1 ノメトキシトリチルアデノシン/・1五1月旨〔■〕(
樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目的化合物
は外観的VCは樹脂そのものと変らないので、樹脂に相
持された当該化合物を以下にliiいて単ニ樹脂と呼ぶ
ことにする) 300mg(0,033mmol)をイ
ソプロノミノール−塩化メチレン(15: )i5、V
/V)i液10 m lで3回洗浄後、臭化亜鉛の1.
0Mのイソプロ・ξノールー塩化メチレン溶g 3 r
nlで5外間ずつ4回反応(脱トリチル化)させて厨脂
〔■〕を得る。耐詣〔■〕をイノプロ・ξノールシー塩
化メチレン溶液10m1 で3回洗浄し、これにジヌク
レオチド[■] 150mg (0、1mmol)のピ
リジン溶液を添加後、共沸させて糸乞領水とし、メシチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド(以下MSNTと記
す) 150mg (0,5mmol )と無水ピリジ
ン2ml とを添加して90分間反応(縮合)させる
。 反応後、ピリジン10m1 で3回洗浄し、触媒量(約
10mg)のジメチルアミノピリジン(以下DMAP)
を含む無水酢酸〜ピリジン(1:9.(V/V))溶液
10m、17添加し10分間反尾、させて未反応5′−
水ra基ケアセチル化して保原し、これをピリジンで洗
浄して、化合物〔■’](n=2)を得る。 以上のような操作乞6回くり返して、化合物〔■〕(n
=12)ケ得る。 一方、 5’−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕8
00mgC帆71mmof)とオルトクロロフェニルホ
スホジトリアゾリドと2後者のジオギサン浴液(1,0
mmol、 6m1)中で2時間反応させ、−t’jc
いてトリフルオロアセチル−6−アミンヘキサノール3
00 mg (1、4m mol )および1−メチル
−イミダゾール115mg(1,4mmol ) f加
えてさらに2時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去
し、残液をクロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリ
ン酸二水素す) IJウム水溶液、飽和炭酸水素す)
iJウム水溶液および5%の塩化ナトリウム水浴液でそ
れぞれ洗浄し、無水硫酸す) リウムで乾燥¥る。 クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製(溶
出液として0〜4%のメタノール含有クロロホルムを使
用)シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化
合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物〔■](n=12) 115mg
。 (3,45μmof) を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔■〕に、化合物〔0360mg (0,
04mmol )をトリエチルアミン−ピリジン−水(
1:3:1、V/V)溶液3ml で処理(脱シアノ
エチル化)した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち。 MSNT50mg (0、2mmol )およびビリジ
71 rnl ’a?加え□□□分間反応(縮合)させ
、反応終了後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥
して、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔■
〕ビ得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔0315mg Y o、!
5 Mテトラメチルグアニジン−ピリジン−2−カルゼ
アルドギシメイトのジオキサン−水(9:1゜CV/V
)溶液200μmを加え、遠沈管中、室温で胴時間反応
させる。反応後、濃アンモニア水(2,5m1)を加え
て密閉し、50℃で一枢反応させる。反応終了後、Pフ
のし、流液を濃縮後、水に居解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層を濃縮後。 セファデック、x、 G −50(φ] 、5 X 1
20 cm、 @出液は0.05Mの重炭俊トリエチル
アンモニウム緩衝液pH7,5)で脱塩精製しペンタデ
カアデニル酸誘縛体〔Q′3を得た。 また同様の方法で実験1−2.1−3および1−4のよ
うなオリゴヌクレオチド鋳心体を得た。 以上で合成した化合物f;r:第1表に示す。 第1表 ただし、この表でAはアデニン、Tはチミン、Gはグア
ニン、Cはシトシンを示す。 これら4種の化合物の高速液体クロマトグラフィーの結
果を第3図に示す。A〜Dは、それぞれ実験1.−1〜
1−4の化合物についての図である。 3)2.4−ジニトロフェニル−ペンタデカアデニル酸
〔0〕の製造
実験2−1
上記実験1−1で合成したペンタデカアデニル酸誘導体
〔■〕約1.OODを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶
液(pH8,3)10μlvc溶解し、l−フルオロ−
2,4−ジニトロベンゼンのエタノール浴液(50mg
/ml ) 5μl (大過剰)ヲ加えて37℃で2時
間反応させた後、水加μl を加えエーテル150μl
で4回抽出を行ない、2,4−ジニトロフェニル−ペ
ンタデカアデニル酸[Q]w得る。反応の確認は、高速
液体クロマトグラフィーにより行なった。 またその際、反応性の比較のため上記で合成しタオリゴ
ヌクレオチド[■〕な脱係1うoして得た5′−水酸基
をもつ化@物[IQ]も同様に1−フルオロ−2,4−
ジニトロベンゼンと反応サセル。 上記実B1−2.1−3および1−4で合成した化合物
し■〕についても実戯2−1と同様な操作を行なって各
々について化合物し0〕乞製造する。 また、反応の比較のため5′−水酸基をもつ化合物〔◎
〕をも製造し、化合物〔◎〕と1−フルオロ−2,4−
ジニトロ−ベンゼンとを谷々反比、させる。このときの
実験す谷々実1Q2−2.2−3および2−4とした。 実験2で製造した化合物f?r:第2表に示す。 ただし、この表でAl’lアデニン、Tはチミン%Gは
グアニン、Cはシトシンを示す。 以上の結果を第4図(高速液体クロマトグラフィーの結
果)に示す。 第4図は高速液体クロマトグラフィーの浴出・ξターン
を示すものである。図中、■は倒れも反応前の化合物そ
のもの、2は何れも化合物と1−フルオロ−2,4−ジ
ニトロベンゼンとを反応させたもの、のクロマトグラム
である。イは実験2−1で式〔◎〕である化合物、口は
実Jil−1で式[e)である化合物、ハは実験2−2
で式〔◎〕である化合物、二は実験1−2で式〔■〕で
ある化合物、ホは実験2−3で式〔◎〕である化合物、
へは実験1−3で式[e〕である化合物、トは実験2−
4で式〔◎〕である化合物、チは実験1−4で式〔[株
]〕である化合物について上記のような操作を行なった
際のクロマトグラムを示す。なおピーク上の数値は保持
時間を示す。 これらの結果からみれば、式◎で示される5′−水酸基
乞もつ化合物(第4図のイーエ、)1−11ホー1.お
よびトー1)は1−フルオロ−2,4−ジニトロベンゼ
ンと反応していないことがわかる(第4図イー2.)・
−2,ホー2、およびトー2)。 それに対してオリゴヌ、クレオチP誘樽体〔Q〕は1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼンと反応させると、
高速液体クロマトグラフィーの溶出・ξターンに変化が
生じ、て、原料のピーク(第4図ロー1、ニー1、へ−
1およびチー1)はなくなっており、1−フルオロ−2
,4−ジニトロベンゼンと反応して新しい化合物(第4
図ロー2、ニー2.へ−2およびチー2)ができて(・
ることかわかる。 すなわち、−級アミノ基を有する化合物〔■〕は1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンセ゛ント選択的に反応し
、5′−水酸基をもつ化合物[Q]とは全く反応しない
ことがわかる。 なお、第4図の保持時間5分程度で各々溶出されるピー
クは、2,4−ジ丁゛トロフェノールと考えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフィーは日本分光
HPLCSystem Tri−Roterlm ?:
用い、次の条件により測定を行なった。 カラム : tt −Bondapak 018 (W
aters )流速:2ml/分 耐出液 ニアセトニトリルを含む、20mM−TEAA
緩衝液(PH7,2) 濃度勾配ニアセトニ) IJルの饋度6〜14%/16
分(16分以後は14%を続ける)
〔■〕約1.OODを0.1M炭酸水素ナトリウム水溶
液(pH8,3)10μlvc溶解し、l−フルオロ−
2,4−ジニトロベンゼンのエタノール浴液(50mg
/ml ) 5μl (大過剰)ヲ加えて37℃で2時
間反応させた後、水加μl を加えエーテル150μl
で4回抽出を行ない、2,4−ジニトロフェニル−ペ
ンタデカアデニル酸[Q]w得る。反応の確認は、高速
液体クロマトグラフィーにより行なった。 またその際、反応性の比較のため上記で合成しタオリゴ
ヌクレオチド[■〕な脱係1うoして得た5′−水酸基
をもつ化@物[IQ]も同様に1−フルオロ−2,4−
ジニトロベンゼンと反応サセル。 上記実B1−2.1−3および1−4で合成した化合物
し■〕についても実戯2−1と同様な操作を行なって各
々について化合物し0〕乞製造する。 また、反応の比較のため5′−水酸基をもつ化合物〔◎
〕をも製造し、化合物〔◎〕と1−フルオロ−2,4−
ジニトロ−ベンゼンとを谷々反比、させる。このときの
実験す谷々実1Q2−2.2−3および2−4とした。 実験2で製造した化合物f?r:第2表に示す。 ただし、この表でAl’lアデニン、Tはチミン%Gは
グアニン、Cはシトシンを示す。 以上の結果を第4図(高速液体クロマトグラフィーの結
果)に示す。 第4図は高速液体クロマトグラフィーの浴出・ξターン
を示すものである。図中、■は倒れも反応前の化合物そ
のもの、2は何れも化合物と1−フルオロ−2,4−ジ
ニトロベンゼンとを反応させたもの、のクロマトグラム
である。イは実験2−1で式〔◎〕である化合物、口は
実Jil−1で式[e)である化合物、ハは実験2−2
で式〔◎〕である化合物、二は実験1−2で式〔■〕で
ある化合物、ホは実験2−3で式〔◎〕である化合物、
へは実験1−3で式[e〕である化合物、トは実験2−
4で式〔◎〕である化合物、チは実験1−4で式〔[株
]〕である化合物について上記のような操作を行なった
際のクロマトグラムを示す。なおピーク上の数値は保持
時間を示す。 これらの結果からみれば、式◎で示される5′−水酸基
乞もつ化合物(第4図のイーエ、)1−11ホー1.お
よびトー1)は1−フルオロ−2,4−ジニトロベンゼ
ンと反応していないことがわかる(第4図イー2.)・
−2,ホー2、およびトー2)。 それに対してオリゴヌ、クレオチP誘樽体〔Q〕は1−
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼンと反応させると、
高速液体クロマトグラフィーの溶出・ξターンに変化が
生じ、て、原料のピーク(第4図ロー1、ニー1、へ−
1およびチー1)はなくなっており、1−フルオロ−2
,4−ジニトロベンゼンと反応して新しい化合物(第4
図ロー2、ニー2.へ−2およびチー2)ができて(・
ることかわかる。 すなわち、−級アミノ基を有する化合物〔■〕は1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンセ゛ント選択的に反応し
、5′−水酸基をもつ化合物[Q]とは全く反応しない
ことがわかる。 なお、第4図の保持時間5分程度で各々溶出されるピー
クは、2,4−ジ丁゛トロフェノールと考えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフィーは日本分光
HPLCSystem Tri−Roterlm ?:
用い、次の条件により測定を行なった。 カラム : tt −Bondapak 018 (W
aters )流速:2ml/分 耐出液 ニアセトニトリルを含む、20mM−TEAA
緩衝液(PH7,2) 濃度勾配ニアセトニ) IJルの饋度6〜14%/16
分(16分以後は14%を続ける)
第1図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第2図は、実験例で示した本発明化合物の製造法のフロ
ーチャートである。 第3図A〜Dは、実験例で示した化合物[VI]の高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。 第4図は、高速液体クロマトグラフィーの溶出、Rター
ンを示す図である。 第1 図 第 2図
フローチャートである。 第2図は、実験例で示した本発明化合物の製造法のフロ
ーチャートである。 第3図A〜Dは、実験例で示した化合物[VI]の高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。 第4図は、高速液体クロマトグラフィーの溶出、Rター
ンを示す図である。 第1 図 第 2図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下式〔■〕で示される2、4−ジニトロフェニルー
オリビデオキシリゼヌクレオチドであることを特徴とす
る、2,4−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体。 〔■〕 〔ただし、mおよびnはそれぞれOまたは任意の自然数
であり、R1は2価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Bはヌクレオチドを構成する塩基である(Bが
複数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよ
い)。〕2、塩基Bがアデニン、チミン、シトシンおよ
びグアニンからなる群より選ばれた°ものである、特許
請求の範囲第1項記載の2,4−ジニトロフェニルヌク
レオチド誘導体。 3、R1が炭素数2〜20の直鎖または分岐鎖のアルキ
レン基である、特許請求の範囲第1項または第2項記載
の2,4−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体。 4mがOまたは6までの自然数、nがOまたは40まで
の自然数である、特許請求の範囲第1〜3項のいずれか
一項に記載の2.4−ジニトロフェニルヌクレオチド誘
導体。 5、下式(vi)で示されるオリザヌクレオチド誘導体
の末端アミノ基に2,4−ジニトロベンゼンを結合させ
て下式〔■〕で示される2、4−ジニトロフェニルーオ
リゴデオキシリゼヌクオチ1?を得ることを特徴とする
。2,4−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体の製造
法。 〔■〕 〔ただし、mおよびnはそれぞれOまたは任意の自然数
であり、Rは2価の@鎖または分岐鎖の炭化氷菓残基で
あり、BはヌクレオチPを措成する塩基である(Bが複
数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい
)。〕6、アミン基と2,4−ジニトロベンゼンとの結
合を、アミン基と1−ハロゲノ−2,4−ジニトロベン
ゼンとの脱ハロゲン化氷菓反応にヨッて行なわせる、特
許請求の範囲第5項記載の2.4−ジニトロフェニルヌ
クレオチYma体の製造法。 7、 1−ハロ)l/−2,4−ジニトロベンゼンが1
−フルオロ−2,4−ジニトロペンぜンテする、特許請
求の範囲第6項記載の2,4−ジニトロフェニルヌクレ
オチド誘導体の製造法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | 2,4―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
US06/578,678 US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-09 | Oligonucleotide derivatives |
EP84101392A EP0119448B1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
DE8484101392T DE3463384D1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
CA000447146A CA1212914A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
US06/855,710 US4849336A (en) | 1983-02-14 | 1986-04-25 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | 2,4―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59204200A true JPS59204200A (ja) | 1984-11-19 |
JPH0435480B2 JPH0435480B2 (ja) | 1992-06-11 |
Family
ID=13588975
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7587883A Granted JPS59204200A (ja) | 1983-02-14 | 1983-04-28 | 2,4―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59204200A (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03500773A (ja) * | 1987-10-28 | 1991-02-21 | ハワード・フローレイ・インスティテュト・オブ・イクスペリメンタル・フィジオロジー・アンド・メディシン | オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート |
WO2010061922A1 (ja) | 2008-11-27 | 2010-06-03 | 独立行政法人理化学研究所 | 新規MutSタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法 |
WO2010113452A1 (ja) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 凸版印刷株式会社 | 遺伝子型の識別方法 |
WO2011122501A1 (ja) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | 凸版印刷株式会社 | 標的塩基配列の識別方法 |
EP2415878A1 (en) | 2003-12-25 | 2012-02-08 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
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