WO2013035875A1 - プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 - Google Patents

プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 Download PDF

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WO2013035875A1
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nucleic acid
primer
sequence
stranded
reaction
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PCT/JP2012/072997
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林崎　良英
恭将 木村
健悟 臼井
有希 田中
雄輝 川井
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
株式会社ダナフォーム
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a primer set, a target nucleic acid sequence amplification method using the primer set, and a mutant nucleic acid detection method.
  • Amplification of the target gene is mainly performed by an enzymatic method using a DNA polymerase.
  • enzymatic methods include polymerase chain reaction (PCR method; US Pat. No. 4,683,195 (Patent Document 1), US Pat. No. 4,683,202 (Patent Document 2) and US Pat. Patent No. 4800159 (Patent Document 3)), reverse transcription PCR method combining RT and reverse transcriptase reaction (RT-PCR method; Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992 (non-patented) There is literature 1)).
  • These methods consist of three steps: dissociation (denaturation) of a double-stranded nucleic acid serving as a template into a single-stranded nucleic acid, annealing of a primer into a single-stranded nucleic acid, and synthesis of a complementary strand from the primer (extension).
  • dissociation denaturation
  • primer primer into a single-stranded nucleic acid
  • synthesis of a complementary strand from the primer extension
  • the target gene can be amplified from DNA or RNA.
  • Patent Document 4 discloses a ligase chain reaction method (LCR method), in which two-step temperature cycling is performed using a heat-resistant DNA ligase.
  • LCR method ligase chain reaction method
  • a known gene sequence is amplified by performing a reaction (repeated reaction of heating and cooling).
  • it is necessary to use an expensive thermal cycler capable of performing strict temperature control over time in a wide temperature range.
  • thermal cycler capable of performing strict temperature control over time in a wide temperature range.
  • these reactions are performed under two to three temperature conditions, it takes time to adjust to each reaction temperature, and as the number of cycles increases, the time required for the reaction increases.
  • a nucleic acid amplification method that can be carried out in an isothermal state.
  • examples of such a method include a strand displacement amplification (SDA) method described in Japanese Patent Publication No. 7-114718 (Patent Document 5), a self-sustained sequence replication (3SR) method, Nucleic acid sequence amplification (NASBA) method described in Japanese Patent No. 2650159 (Patent Document 6), TMA (transcription-mediated amplification) method, Japanese Patent No. 2710159 (Patent Document 7) Qbeta replicase method described in US Pat. No.
  • SDA strand displacement amplification
  • 3SR self-sustained sequence replication
  • NASBA Nucleic acid sequence amplification
  • TMA transcription-mediated amplification
  • Patent Document 7 Qbeta replicase method described in US Pat. No.
  • Patent Document 8 5,824,517
  • Patent Document 9 WO99 / 09211
  • Patent Document 10 WO95 / 25180
  • WO00 / 28082 LAMP method (Loop-Mediated Isothermal Amplification) described
  • ICAN method Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • Patent Document 12 Japanese Patent No. 3897805 Examples thereof include the SmartAmp2 method described in (Patent Document 13). All of the reactions involved in these isothermal nucleic acid amplification methods proceed simultaneously in a reaction mixture maintained at a constant temperature.
  • the LAMP method is an isothermal amplification method that requires two turnback primers (TP) and two outer primers (OP). For this reason, four types of primers are required, and the total number of genome recognition sites is six.
  • FIG. 11 shows an example of the LAMP method. In the figure, two OPs are omitted and only two TPs are shown. As shown in the figure, TP has a sequence hybridizing to the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side and a sequence complementary to the primer extension strand on the 5 ′ side.
  • one TP has a sequence (A ′) complementary to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side, and primer extension on the 5 ′ side. It has a sequence (M) complementary to the strand sequence (M ′).
  • a ′ complementary to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side
  • M complementary to the strand sequence (M ′).
  • FIG. 12 shows an example of the SmartAmp2 method. As shown in the figure, in the SmartAmp2 method, TP is used as one primer and FP is used as the other primer.
  • the FP has a sequence (B ′) complementary to the sequence (B) of the target nucleic acid sequence on the 3 ′ side, and the sequences FF complementary to each other on the 5 ′ side. It has a folded sequence containing 'on a single strand. Since the SmartAmp2 method uses TP and FP, there are three genome recognition sites, and FP does not turn back. For this reason, in addition to the advantage that the amplification speed is high and the specificity is high, the primer design is easy and the amplification region can be shortened.
  • the SmartAmp2 method has various advantages and is a practical method.
  • the SmartAmp2 method uses TP, there are limitations in further reducing the number of genome recognition sites and shortening the amplification distance.
  • the present invention provides a primer set used in an isothermal amplification method that has few genome recognition sites and can shorten the amplification distance, an isothermal amplification method using the primer set, and a method for detecting a nucleic acid sequence mutation. Objective.
  • the primer set of the present invention is a primer set used in a method for isothermal amplification of a target nucleic acid sequence, wherein the primer set includes a first primer and a second primer, 3 'side contains a sequence (A') capable of hybridizing to the 3 'side sequence (A) of the target nucleic acid sequence, and the second primer is 3' side and the extended strand of the first primer Or a sequence (B ′) that can hybridize to the sequence (B) on the 3 ′ side of the complementary strand of the target nucleic acid sequence, and the first primer and the second primer are It is characterized by containing substantially the same sequence (C).
  • the isothermal amplification method of the present invention is an isothermal amplification method in which a target nucleic acid sequence is isothermally amplified using a primer set, wherein the primer set of the present invention is used as the primer set.
  • the method for detecting a mutation in a nucleic acid sequence of the present invention is a method for detecting a mutation in a nucleic acid sequence in a nucleic acid sample by an isothermal amplification method using a primer set, wherein the primer set of the present invention is used as the primer set.
  • the primer set uses a nucleic acid sequence having the mutation or a nucleic acid sequence not having the mutation as a target nucleic acid sequence, and the nucleotide residue related to the mutation is a complementary sequence (A) of the first primer or a second primer A primer set designed to be included in the complementary sequence (B), wherein an isothermal amplification reaction is performed with the primer set in the presence of the nucleic acid sample.
  • the primer set of the present invention there are two genome recognition sites, and since TP is not used, primer design is easy and the amplification region sequence can be shortened. For this reason, by using the primer set of the present invention, it is possible to amplify even a short sequence such as microRNA which could not be amplified by the conventional method.
  • the present invention provides a primer set and an isothermal amplification method that are completely different from SmartAmp2 developed by the present inventors.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing another example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing still another example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the amplification reaction of the primer set of the present invention.
  • FIG. 5A is a schematic diagram showing an example of a reaction mechanism in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • FIG. 5B is a schematic diagram illustrating an example of a reaction mechanism in the reaction step subsequent to FIG. 5A.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a reaction mechanism of an extended strand exchange reaction based on nick-passing extension.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing another example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing still another example of the primer set of the present invention.
  • FIG. 7A is a schematic diagram showing another example of the reaction mechanism in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • FIG. 7B is a schematic diagram illustrating an example of a reaction mechanism in the reaction step subsequent to FIG. 7A.
  • FIG. 8A is a schematic diagram showing still another example of the reaction mechanism in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • FIG. 8B is a schematic diagram illustrating an example of a reaction mechanism in the reaction step subsequent to FIG. 8A.
  • FIG. 9A is a schematic diagram showing still another example of the reaction mechanism in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • FIG. 9B is a schematic diagram illustrating an example of a reaction mechanism in the reaction step subsequent to FIG. 9A.
  • FIG. 9C is a schematic diagram illustrating another example of the reaction mechanism in the reaction step subsequent to FIG. 9A.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of the first primer in the primer set of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the LAMP method.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of the SmartAmp2 method.
  • FIG. 13 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 1 (Forward primer 1 and Reverse primer 1) is used.
  • FIG. 14 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in the fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of the first primer in the primer set of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating an example of the LAMP method.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of the SmartAmp2 method.
  • FIG. 13 is a graph showing a fluorescence a
  • FIG. 15 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 1 (Forward primer 2 and Reverse primer 2) is used.
  • FIG. 16 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in the fluorescence signal was recognized in FIG.
  • FIG. 17 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 2 (Forward primer 3 and Reverse primer 3) is used.
  • FIG. 18 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 19 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 3 (Forward primer 4 and Reverse primer 4) is used.
  • FIG. 20 is a graph showing a fluorescence amplification curve when only the Boost primer 1 of Example 3 is used.
  • FIG. 21 is a graph showing a fluorescence amplification curve when only the Boost primer 2 of Example 3 is used.
  • FIG. 22 is a graph showing a fluorescence amplification curve when Boost primers 1 and 2 of Example 3 are used.
  • FIG. 23 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in the fluorescence signal was observed in FIGS.
  • FIG. 24 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 4 (Forward primer 5 and Reverse primer 5) is used.
  • FIG. 25 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 26 is a schematic diagram showing the amplification reaction of the primer set of Example 4.
  • FIG. 27 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 5 (Forward primer 6 and Reverse primer 6) was used.
  • FIG. 28 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 29 is a schematic diagram showing the amplification reaction of the primer set of Example 5.
  • FIG. 30 is a graph showing a fluorescence amplification curve when the primer set of Example 6 (Forward primer 7 and Reverse primer 7) was used.
  • FIG. 31 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 32 is a graph showing fluorescence amplification curves when the primer set of Example 7 (Forward primer 8 and Reverse primer 6) was used.
  • FIG. 33 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 34 is a graph showing fluorescence amplification curves when the primer set of Example 8 (Forward primer 5 and Reverse primer 8) was used.
  • FIG. 35 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG.
  • FIG. 36 is a schematic diagram showing the amplification reaction of the primer set of Example 8.
  • the first primer and the second primer each contain substantially the same sequence (C) on the 5 ′ side as described above.
  • the phrase “substantially identical” between the two sequences (C) means that the two sequences (C) can each hybridize to the complementary sequence of the other primer.
  • the two sequences (C) may be completely identical to each other (full match), or may be sequences (mismatches) in which some bases are different.
  • one of the two sequences (C) may be a sequence generated by at least one of base substitution, insertion and deletion with respect to the other sequence (C).
  • the number of bases in which substitution, insertion or deletion has occurred is preferably 2/10 or less of the total number of bases in the two sequences (C), It is more preferable that it is 1/10 or less. Further, it is particularly preferable that the two sequences (C) are completely identical (that is, the number of bases causing substitution, insertion or deletion is zero).
  • a folded sequence comprising two sequences hybridizing to each other on the same strand ( DD ') may be included.
  • the primer set of the present invention includes a folded sequence (DD ′) containing two sequences hybridizing to each other on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (C) in the first primer.
  • the second primer further comprises a folded sequence (EE ′) containing two sequences hybridizing to each other on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • D ′) and the array (EE ′) may be different from each other.
  • the primer set of the present invention further includes a third primer, and the third primer is the target nucleic acid sequence, a complementary sequence of the target nucleic acid sequence, or an extended strand of the first primer or an extension of the second primer. It may be an embodiment that hybridizes to a strand and the hybridization of the third primer does not compete with the first primer and the second primer.
  • Another aspect of the present invention is a first method of isothermally synthesizing a double-stranded nucleic acid composed of a single-stranded nucleic acid in which the order of at least two different sequences is repeated at least twice and a nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid.
  • the method for synthesizing a nucleic acid according to the above may be the first nucleic acid synthesis method characterized by including the following steps (A1) to (A6).
  • (A3) A step of continuously continuing the extension reaction of the primer that has progressed to the 5 ′ end of the 5 ′ side stem sequence from the 5 ′ end of the 5 ′ side stem sequence to the 3 ′ end of the folded sequence.
  • (A4) The extension reaction of the primer that has proceeded to the 3 ′ end of the folded sequence of (A3) is continuously continued again toward the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence.
  • (A5) A step of stopping the primer extension reaction of (A4) at the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence.
  • (A6) A step of extending the 3 ′ end of the folded sequence of the single-stranded template nucleic acid using the primer extended strand that has become a single strand in (A4) as a template.
  • step (A3) and step (A4) may be repeated at least twice.
  • the single-stranded template nucleic acid provided in the step (A1) is the primer set of the present invention, and only the first primer has the sequence (C).
  • a single-stranded template nucleic acid formed by an isothermal amplification reaction using a primer set containing the folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the primer, and hybridizing to the loop in the step (A2) May be the first primer including the folded sequence (DD ′).
  • the single-stranded template nucleic acid provided in the step (A1) further hybridizes to the 5 ′ end of the 5 ′ stem loop sequence 2
  • a single-stranded template nucleic acid in which folded sequences containing two sequences on the same strand are linked may include the following step (A3-2) instead of the step (A3).
  • A3-2) The extension reaction of the primer that has progressed to the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence is directly performed without using the folded sequence linked to the 5′-end of the 5′-side stem sequence. The process of continuing continuously from the 5 'end of the' side stem sequence to the 3 'end of the folded sequence.
  • the steps (A3-2) and (A4) may be repeated at least twice.
  • the first nucleic acid synthesis method of the present invention includes the step (A3-2) instead of the step (A3), the single-stranded template nucleic acid provided in the step (A1) One formed by an isothermal amplification method using the primer set of the present invention comprising the first primer containing the folded sequence (DD ′) and the second primer containing the folded sequence (EE ′).
  • the primer that is a double-stranded template nucleic acid and hybridizes to the loop in the step (A2) may be the first primer or the second primer of the primer set of the present invention.
  • Still another aspect of the present invention is a method for amplifying a nucleic acid, comprising a single-stranded nucleic acid in which the order of at least two different sequences is repeated at least twice and a nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid.
  • a nucleic acid synthesis method comprising synthesizing a double-stranded nucleic acid isothermally, wherein the nucleic acid synthesis step is performed by the first nucleic acid synthesis method of the present invention. There may be.
  • Still another aspect of the present invention provides isothermal synthesis of a single-stranded nucleic acid in which the sequence of at least two different sequences is repeated at least twice and a nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid.
  • a second nucleic acid synthesis method comprising: a first reaction step including the following steps (B1) to (B3); and a second reaction including the following steps (C1) to (C3): It may be a second nucleic acid synthesis method characterized by including at least one of the steps.
  • (B1) consisting of a single-stranded nucleic acid containing a folded sequence containing two sequences that hybridize to each other on the same strand in a region containing the 3 ′ end, and a single-stranded nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid Providing two duplexes in a state in which the orientations of the sequences are opposite to each other.
  • (B2) From the 3 ′ end of the double-stranded sequence of the single-stranded nucleic acid of one of the two double-stranded strands of (B1), use the complementary single-stranded nucleic acid of the other double-stranded as a template A partial displacement in which a strand displacement extension reaction occurs, and a complementary single-stranded nucleic acid of the other double strand is hybridized to a part of the extended strand of the single-stranded nucleic acid of the one double strand Forming.
  • a complete duplex is formed from the 3 ′ end of the complementary single-stranded nucleic acid by an extension reaction using the single-stranded nucleic acid as a template.
  • Process. (C1) It consists of a single-stranded nucleic acid containing a folded sequence containing two sequences that hybridize to each other on the same strand in a region containing the 3 ′ end, and a single-stranded nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid. Providing a single duplex.
  • the double strands of the step (B1) and the step (C1) are further connected to the 5 ′ side of the sequence (C) in at least one of the first primer and the second primer of the primer set of the present invention. It may be a duplex formed by an isothermal amplification reaction using a primer set containing a folded sequence (DD ′) containing two sequences that hybridize to each other on the same strand.
  • DD ′ folded sequence
  • the duplexes of the steps (B1) and (C1) are further hybridized to each other on the 5 ′ side of the sequence (C) in the first primer of the primer set of the present invention 2
  • a folded sequence (DD ′) containing two sequences on the same strand, and in the second primer, two sequences hybridizing to each other are further arranged on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • the sequence (DD ′) and the sequence (EE ′) are formed by isothermal amplification reaction using primer sets having different sequences. It may be a heavy chain.
  • Yet another aspect of the present invention is a method for amplifying a nucleic acid, comprising a single-stranded nucleic acid in which the order of at least two different sequences is repeated at least twice, and a nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid.
  • a nucleic acid synthesis method comprising synthesizing a double-stranded nucleic acid isothermally, wherein the nucleic acid synthesis step is carried out by the second nucleic acid synthesis method of the present invention. There may be.
  • target nucleic acid or “target nucleic acid sequence” means not only the nucleic acid to be amplified or the sequence itself, but also a complementary sequence or a nucleic acid having the sequence.
  • hybridize means that a part of the primer according to the present invention hybridizes to a target nucleic acid under stringent conditions and does not hybridize to a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid.
  • Stringent conditions can be determined, for example, depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex of the primer according to the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc. You can refer to Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), etc.
  • the primer can be specifically hybridized to the target nucleic acid.
  • a primer that hybridizes to a target nucleic acid comprises a sequence of all or part of a nucleic acid molecule complementary to the target nucleic acid.
  • FIG. 1 shows an example of the primer set of the present invention.
  • the primer set of this example is a primer set used for the isothermal amplification method of the target nucleic acid sequence 4, and the primer set includes a first primer 1F and a second primer 1R
  • Primer 1F includes a sequence (A ′) capable of hybridizing to the 3 ′ side sequence (A) on the 3 ′ side
  • the second primer 1R is arranged on the 3 ′ side to A sequence (B ′) capable of hybridizing to an extended strand of a primer or a sequence (B ′) on the 3 ′ side of a complementary strand of the target nucleic acid sequence 4
  • the first primer 1F and the second primer 1R are each The same sequence (C) is included on the 5 ′ side of each other.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of an example of the amplification reaction of the primer set of this example.
  • the same parts as those in FIG. 4 are identical to FIG. 4 in this figure.
  • the first primer 1F and the second primer 1R are hybridized to the target nucleic acid sequence 4 to cause an extension reaction.
  • the first primer hybridizes to the extended strand of the first primer by hybridization with the second primer, or the first primer hybridizes to the extended strand of the second primer.
  • Extension to form a double-stranded intermediate As shown in (c) and (c ′) in the figure, the double-stranded intermediate has a stem-loop structure by intramolecular hybridization when it becomes a single strand by a dynamic equilibrium reaction.
  • the first primer or the second primer hybridizes to the loop of the single-stranded intermediate of the stem-loop structure to form an extended strand, whereby two strands shown in (d) and (d ′) of FIG. Chain intermediates are formed.
  • the double-stranded intermediates in FIGS. 4 (d) and (d ′) are the same as the double-stranded intermediate in FIG. 2 (b). It becomes an intermediate of this chain.
  • the number of bases of the sequences (A ′) and (B ′) that hybridize with the target nucleic acid sequence is not particularly limited, for example, 3 to 100 bases, preferably Is 10 to 60 bases, more preferably 15 to 50 bases. Further, the number of bases of the same sequence (C) of the first primer and the second primer of the primer set of the present invention is not particularly limited, for example, 3 to 100 bases, preferably 10 to 60 bases, more preferably 15-50 bases.
  • DD folded sequence
  • the total length of the folded sequence (DD ′) is not particularly limited, and is, for example, 3 to 100 bases, preferably 4 to 60 bases, more preferably 5 to 50 bases.
  • the number of bases of any one of the sequences complementary to each other of the folded sequence (DD ′) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 50 bases, preferably 1 to 30 bases, more preferably 1 to 20 bases.
  • An intervening sequence may exist between the complementary sequences of the folded sequence (DD ′).
  • the number of bases in the intervening sequence is, for example, 1 to 50 bases, preferably 1 to 20, and more preferably 1 to 10.
  • a part of the folded sequence may form a part of the same sequence (C) of the first primer and the second primer.
  • the first primer 3F includes a folded sequence (DD ′) that includes two sequences that hybridize to each other on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • the second primer 3R further includes a folded sequence (EE ′) containing two sequences hybridizing to each other on the same strand on the 5 ′ side of the sequence (C). ′) And the sequence (EE ′) are different from each other.
  • a single-stranded nucleic acid in which the order of at least two different sequences is repeated at least twice and a nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid is used.
  • Single-stranded nucleic acid is synthesized isothermally.
  • Examples of the reaction mechanism of the nucleic acid synthesis method of the present invention include a first synthesis reaction shown in FIGS. 5A to 7B described later and a second synthesis reaction shown in FIGS. 8A to 9C described later. .
  • the first synthesis reaction includes the steps (A1) to (A6), or, as described above, may include the step (A3-2) instead of the step (A3).
  • the second synthesis reaction includes at least one of a first reaction step including the steps (B1) to (B3) and a second reaction step including the steps (C1) to (C3).
  • the amplification reaction using the primer set of the present invention may include a synthesis reaction other than the first synthesis reaction and the second synthesis reaction.
  • the amplification reaction using the primer set of the present invention preferably includes at least one of the first synthesis reaction and the second synthesis reaction, but includes the first synthesis reaction and the second synthesis reaction. You don't have to leave.
  • the first synthesis reaction is an extended strand exchange reaction based on nick-passing extension.
  • an example of the first synthesis reaction will be described with reference to FIGS. 5A to 7B.
  • FIGS. 5A and 5B show an example of the first synthesis reaction.
  • This reaction is a reaction using the same primer set as in FIG. 2 in which only one primer contains a folded sequence. That is, the primer set includes a first primer 2F including a folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the sequence (C), and a second primer 2R not including the folded sequence.
  • DD ′ folded sequence
  • C 5 ′ side of the sequence
  • second primer 2R not including the folded sequence.
  • 5A and 5B the same components as those in FIG. 2 are denoted by the same reference numerals.
  • an ⁇ intermediate is provided (step (A1)).
  • this ⁇ intermediate is composed of a 3 ′ stem sequence (C ′) including a 3 ′ end and a 5 ′ stem sequence (C) including a 5 ′ end.
  • the step (A1) (FIGS. 5A (a) to (g)) will be specifically described. That is, first, as shown in FIG. 5A (a), the first primer 2F hybridizes to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence. Furthermore, as shown in FIG. 5B, the first strand 2F is extended, whereby the first strand is extended. Next, as shown in FIG. 5C, the extended strand of the first primer 2F has the same sequence (A ′) as the first primer 2F, and the sequence (A ′) is released from the sequence (A) of the target nucleic acid sequence due to fluctuation. A primer having a sequence undergoes strand displacement hybridization (SDH) to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence and further undergoes an extension reaction, whereby the extended strand (first strand) of the first primer 2F is released.
  • SDH strand displacement hybridization
  • the second primer 2R is hybridized and extended to the released first strand, whereby the extended strand of the second primer 2R (first 2 strands) are formed.
  • the second strand includes a sequence (DD′-C′-A) complementary to the sequence (A′-CDD ′) of the first primer, as shown in FIG. .
  • the extended strand of the second primer 2R has the same sequence (B ′) as the second primer 2R, because the sequence (B ′) is released from the sequence (B) of the target nucleic acid sequence due to fluctuation.
  • a primer having a sequence undergoes strand displacement hybridization (SDH) to the sequence (B) of the first strand, and further undergoes an extension reaction, whereby the second strand is released. Then, as shown in FIG. 5G, the released second strand sequences (C) and (C ′) self-hybridize to form a single-stranded template nucleic acid having an ⁇ -like structure. This is the aforementioned ⁇ intermediate.
  • the sequence (A) in the loop of the ⁇ intermediate has the same sequence as the first primer 2F.
  • the primer is hybridized, and the primer is extended toward the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C) of the ⁇ intermediate (step (A2)).
  • this extension reaction reaches the 5′-side stem sequence (C)
  • the extension reaction using the 5′-side stem sequence (C) as a template is accompanied by a strand displacement reaction.
  • the nick formed from the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C) (Tail sequence) and the 3 ′ end of the hook sequence (DD ′) is used for extension.
  • a haploid amplicon the single-stranded template nucleic acid
  • the extension reaction of the primer proceeding to the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C) is performed on the 5′-side stem sequence (C).
  • the process continues continuously from the 5 ′ end to the 3 ′ end of the folded sequence (DD ′) (step (A3)).
  • the extension reaction of the primer proceeding to the 3 ′ end of the folded sequence (DD ′) in the same figure (i) step (A3)). Is continued continuously toward the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C), and the primer extension reaction continues, so that FIGS.
  • the primer extension strand hybridized with the single-stranded template nucleic acid ( ⁇ intermediate) formed in (A2) step) is made into a single strand by a strand displacement reaction ((A4) step). Then, the primer extension reaction in the step (A4) is stopped at the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C) shown in FIG. 5B (l) (step (A5)).
  • the primer extension strand becomes a diploid la in which two amplicon sequences (the single-stranded template nucleic acid sequences) are linked in the forward direction (tandem). Furthermore, as shown in FIG.
  • the single-stranded template nucleic acid ( ⁇ intermediate) of the single-stranded template nucleic acid ( ⁇ intermediate) is formed using the primer extension strand (tandem diploid la) that has become single-stranded in the step (A4).
  • the 3 ′ end of the folded sequence (DD ′) is extended (step (A6)).
  • a strand complementary to the primer extension strand (tandem diploid la) is formed, and a complete double strand ma composed of the primer extension strand and a strand complementary thereto is formed.
  • 5A and 5B show an example in which a tandem diploid is formed by performing the steps (A3) and (A4) only once.
  • steps (A3) and (A4) by repeating the steps (A3) and (A4) at least twice, a tandem chain of triploid or higher can be formed. That is, after the step (A4), the process returns to the step (A3).
  • steps (A3) and (A4) are repeated at least twice, the process proceeds to the steps (A5) and (A6). You may form a tandem chain more than a diploid.
  • Fig. 6 shows the case where the nick transfer reaction occurs and does not occur.
  • (a) of the figure in the ⁇ intermediate, when the 5 ′ end of the 5 ′ stem and the 3 ′ end of the folded sequence are close to each other to form a nick, overcome the nick. Primer extension reaction occurs.
  • FIG. 4B in the ⁇ intermediate, when the 5 ′ end of the 5 ′ stem is separated from the 3 ′ end of the folded sequence and a nick is not formed, the primer is extended. The reaction stops at the 5 'end of the 5' stem.
  • FIGS. 7A and 7B show another example of the first synthesis reaction.
  • This reaction is a reaction using a primer set similar to that shown in FIG. 3 in which both primers contain folded sequences. That is, the primer set includes a first primer 3F including a folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the sequence (C), and a folded sequence (EE ′) on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • a second primer 3R. 7A and 7B, the same components as those in FIG. 3 are denoted by the same reference numerals.
  • an ⁇ intermediate is provided (step (A1)).
  • this ⁇ intermediate has a loop sequence consisting of a 3 ′ stem sequence (C ′) containing a 3 ′ end and a 5 ′ stem sequence (C) containing a 5 ′ end.
  • Two sequences (D) and (D) that hybridize with each other at the 3 ′ end of the 3 ′ stem (C ′) of the single-stranded template nucleic acid of the stem-loop structure linked via (AB ′) A single-stranded template nucleic acid in which folded sequences (DD ') containing') in the same strand are linked.
  • 5A (g) is different from the ⁇ intermediate shown in FIG. 5A in that the folded arrays (EE ′) included in the shape are connected. Except for including the folded array (EE ′), it is the same as the ⁇ intermediate of FIG. 5A (g).
  • FIGS. 7A (a) to (g) In the step (A1) (FIGS. 7A (a) to (g)), FIGS. 7A (a) to (c) (hybridization of the first primer to the template nucleic acid, extension reaction, and extension of the first primer)
  • the release of the chain (first chain) is the same as in FIGS. 5A (a) to (c).
  • the sequence of the first primer 3F in FIG. 7A is the same as the first primer 2F in FIG. 5A.
  • the second primer 3R including the folded sequence (EE ′) is used instead of the second primer 2R not including the folded sequence.
  • a single-stranded template nucleic acid ( ⁇ intermediate) shown in FIG. 7A (g) is formed in the same manner as 5A (d) to (g).
  • the sequence (A) in the loop of the ⁇ intermediate has the same sequence as the first primer 3F.
  • the primer is hybridized, and the primer is extended toward the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C) of the ⁇ intermediate (step (A2)).
  • this extension reaction reaches the 5′-side stem sequence (C)
  • the extension reaction using the 5′-side stem sequence (C) as a template is accompanied by a strand displacement reaction.
  • the primer extension reaction may proceed from the middle of the 5′-side stem sequence to the 3 ′ end of the folded sequence, or may be linked to the 5 ′ end of the 5′-side stem.
  • the primer extension reaction may proceed in the middle of the folded sequence or from the 5 ′ end of the folded sequence to the 3 ′ end of the folded sequence linked to the 3 ′ stem sequence.
  • the extension reaction is continuously continued again toward the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C), and the primer extension reaction of the primer continues, FIG.
  • Step (A4) The primer extension reaction in the step (A4) is stopped at the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C) shown in FIG. 7B (l) (step (A5)).
  • the reaction for converting the primer extension strand into a single strand by a strand displacement reaction is stopped at the 5 ′ end of the 5′-side stem sequence (C), but the extension reaction itself is performed in the 5′-side stem sequence (C ) To the 5 ′ end of the folded sequence (EE ′) of the ⁇ intermediate.
  • the primer extension strand becomes a (tandem) diploid in which two amplicon sequences are linked in the forward direction (the upper strand in FIG. 7B (m) or (n)).
  • FIGS. 7B (m) and (n) the folded sequence of the single-stranded template nucleic acid ( ⁇ intermediate) (see FIG.
  • DD ′ is extended at the 3 ′ end (step (A6)).
  • a strand complementary to the primer extension strand (the lower strand in the figure) is formed, and the primer extension strand and the strand complementary thereto are completely formed. Double strands are formed.
  • the continuous primer extension reaction from the 5 ′ end of the 5 ′ side stem to the 3 ′ end of the folded sequence (DD ′) occurs by the same mechanism as the nick transfer reaction described above.
  • FIG. 7A and 7B show an example in which a tandem diploid is formed by performing the steps (A3-2) and (A4) only once.
  • steps (A3-2) and (A4) by repeating the steps (A3-2) and (A4) at least twice, a tandem chain of triploid or higher can be formed. That is, after the step (A4), the process returns to the step (A3-2), and when the step (A3-2) and the step (A4) are repeated at least twice, the step (A5) and the step (A6) Proceeding to tandem chains more than triploid may be formed.
  • 8A and 8B show an example of the second synthesis reaction.
  • This reaction is a reaction using the same primer set as in FIG. 2 in which only one primer contains a folded sequence. That is, the primer set includes a first primer 2F including a folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the sequence (C), and a second primer 2R not including the folded sequence.
  • DD ′ folded sequence
  • B primer 2R not including the folded sequence.
  • one of the complementary double strands (haploid amplicons) formed according to FIGS. 8A (a) to (i) is provided as shown in FIG. 8B (j) (step (C1)), Alternatively, as shown in FIG. 8B (j ′), two are provided in a state where the orientations of the arrays are opposite to each other (step (B1)).
  • 8A (a) to (g) (formation of ⁇ intermediate) is exactly the same as FIG. 5A (a) to (g) (the first synthesis reaction).
  • a primer having the same sequence as the first primer 2F is hybridized to the sequence (A) in the loop of the ⁇ intermediate (single-stranded template nucleic acid), The primer is extended toward the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C) of the ⁇ intermediate. This extension reaction was stopped at the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C), and as shown in FIG. 5 (i), two complementary strands consisting of the ⁇ intermediate and the extended strand of the primer. A chain (haploid amplicon) is formed. As shown, this amplicon includes a folded sequence (DD ′) containing two sequences (D) and (D ′) that hybridize to each other in the region containing the 3 ′ end on the same strand.
  • FIG. 8B From the amplicon of FIG. 8A (i) (identical to FIG. 8B (i)), as shown in FIG. 8B, the ⁇ intermediate or its complementary strand was linked in the forward direction in two reaction paths ( A tandem amplification product is formed.
  • One reaction pathway is a pathway in which strand displacement hybridization occurs in the molecule of the double-stranded amplicon (FIG. 8B (i)), as shown in FIGS. 8B (j) to (l).
  • the other reaction pathway is a pathway in which strand displacement hybridization occurs between two molecules of the double-stranded amplicon, as shown in FIGS. 8B (j ′) to (l ′). That is, first, one amplicon is provided as shown in FIG.
  • step (C1) the double-stranded amplicon is either in the molecule of the amplicon as shown in (j) to (k) of the figure, or as shown in (j ′) to (k ′) of the figure.
  • the 5 ′ end sequence (C) hybridizes to the sequence (C ′) of the other strand (Tail substitution).
  • this Tail substitution occurs, folding of the folded sequence (DD ′) at each end occurs as shown in FIGS.
  • the strand displacement extension reaction takes place from the 3 ′ end to the 5 ′ end of the complementary single-stranded nucleic acid using the complementary single-stranded nucleic acid as a template, and a part of the extended strand of the single-stranded nucleic acid This corresponds to the step ((C2) step) of forming a partial double strand ((m) in the figure) in which the complementary single-stranded nucleic acids are hybridized.
  • the reaction from FIG. 8B (l ′) to FIG. 8 (m) shows the folded sequence of the single-stranded nucleic acid of one double strand of the two double strands (B1) (FIG. 8B (j ′)).
  • a strand displacement extension reaction occurs using the complementary single-stranded nucleic acid of the other double strand as a template, and the single-stranded nucleic acid of one double strand is extended.
  • step (B2) of forming a partial duplex (FIG. (M)) in which a complementary single-stranded nucleic acid of the other duplex is hybridized to a part of the strand.
  • FOG. (M) partial duplex
  • an extension reaction using the opposite strand as a template occurs from the 3 ′ end portion of the complementary strand of the newly synthesized extension strand.
  • a double strand in which the amplicons are linked in the forward direction (tandem) is formed ((o) in the figure).
  • the reaction from FIG. 8B (n) to (o) is carried out by using the complementary single-stranded nucleic acid (FIG. 8) in the partial double strand (FIG. 8 (m)) of the step (B2) or (C2).
  • a step of forming a complete duplex (FIG. (O)) from the 3 ′ end of (m) upper strand) by an extension reaction using the single-stranded nucleic acid as a template (FIG. (N)) (B3) Step or (C3) Step).
  • FIGS. 9A to 9C show another example of the second synthesis reaction.
  • This reaction is a reaction using a primer set similar to that shown in FIG. 3 in which both primers contain folded sequences. That is, the primer set includes a first primer 3F including a folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the sequence (C), and a folded sequence (EE ′) on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • the primer set includes a first primer 3F including a folded sequence (DD ′) on the 5 ′ side of the sequence (C), and a folded sequence (EE ′) on the 5 ′ side of the sequence (C).
  • DD ′ folded sequence
  • EE ′ folded sequence
  • FIGS. 9A (a) to (i) are provided as shown in FIG. 9C (j) (step (C1)), Alternatively, as shown in FIG. 9C (j ′), two are provided in a state where the orientations of the arrays are opposite to each other (step (B1)).
  • 9A (a) to (g) formation of ⁇ intermediate
  • FIG. 7A (a) to (g) first synthesis reaction).
  • a primer having the same sequence as the first primer 3F is hybridized to the sequence (A) in the loop of the ⁇ intermediate (single-stranded template nucleic acid), The primer is extended toward the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C) of the ⁇ intermediate. This extension reaction was stopped at the 5 ′ end of the folding sequence (EE ′) linked to the 5 ′ end of the 5 ′ stem sequence (C), and as shown in FIG. 9A (i), the ⁇ A complementary double strand (haploid amplicon) consisting of the intermediate and the extended strand of the primer is formed.
  • this amplicon includes a folded sequence (DD ′) containing two sequences (D) and (D ′) that hybridize to each other in the region containing the 3 ′ end on the same strand. It is a double strand consisting of a single-stranded nucleic acid (lower strand in FIG. 9A (i)) and a single-stranded nucleic acid complementary to the single-stranded nucleic acid (upper strand in FIG. 9). Even when the second primer 3R becomes a reaction starting point, an amplicon is formed in the same reaction process.
  • FIG. 9B two reaction routes shown in either FIG. 9B or 9C can be considered.
  • one reaction route is a route using a turn having a similar palindromic sequence.
  • this is a route when the double-stranded amplicon folding sequences (DD ′) and (EE ′) of FIG. 9A (i) are similar palindromic sequences.
  • FIG. 9B (p) hetero-folds (DD ′) and (EE ′) having the similar palindromic sequence between the double-stranded amplicons of two molecules are obtained. , Hybridize to each other.
  • the other reaction pathway is a pathway in which recombination hybridization occurs between the double-stranded amplicon sequence (C) and its complementary sequence (C ′) (Tail sequence), as shown in FIG. 9C.
  • This reaction path is further divided into two reaction paths as shown in FIG. That is, as shown in FIGS. 9C (j) to (l), one reaction pathway is an intramolecular structure of the double-stranded amplicon (same as FIG. 9A (i)) represented by FIG. 9C (i). This is the pathway through which strand displacement hybridization occurs.
  • the other reaction pathway is a pathway in which strand displacement hybridization occurs between two molecules of the double-stranded amplicon, as shown in FIGS. 9C (j ′) to (l ′).
  • one amplicon is provided as shown in FIG. 9C (j) (step (C1)), or the arrangement directions are opposite to each other as shown in FIG. 9C (j ′). Two are provided in the state (step (B1)).
  • the double-stranded amplicon is either in the molecule of the amplicon as shown in (j) to (k) of the figure, or as shown in (j ′) to (k ′) of the figure.
  • the sequence (C) hybridizes to the sequence (C ′) of the other strand (Tail substitution).
  • this Tail substitution occurs, folding of each terminal folding sequence (DD ′) or (EE ′) occurs, as shown in FIGS.
  • the strand displacement extension reaction takes place from the 3 ′ end to the 5 ′ end of the complementary single-stranded nucleic acid using the complementary single-stranded nucleic acid as a template, and a part of the extended strand of the single-stranded nucleic acid This corresponds to the step ((C2) step) of forming a partial double strand ((m) in the figure) in which the complementary single-stranded nucleic acids are hybridized.
  • the reaction from FIG. 9C (l ′) to FIG. 9 (m) shows the folded sequence of the single-stranded nucleic acid of one double strand of the two double strands (B1) (FIG. 9C (j ′)).
  • a strand displacement extension reaction occurs using the complementary single-stranded nucleic acid of the other double strand as a template, and the single-stranded nucleic acid of one double strand is extended.
  • step (B2) of forming a partial duplex (FIG. (M)) in which a complementary single-stranded nucleic acid of the other duplex is hybridized to a part of the strand.
  • step (B2) of forming a partial duplex (FIG. (M)) in which a complementary single-stranded nucleic acid of the other duplex is hybridized to a part of the strand.
  • these extension reactions are not switchback extension using the 3 ′ end folding sequence (DD ′) or (EE ′) as its template.
  • a recombinant extension reaction occurs using the opposite strand as a template from the 3 ′ folding site of the released folding sequence (EE ′).
  • an amplification product is formed in which the heterofolds at the junction of the amplicons form a hammerhead structure ((o) in the figure).
  • the reaction from FIG. 9B (n) to (o) is carried out by using the complementary single-stranded nucleic acid (FIG. 9B) in the partial duplex (FIG. 9 (m)) of the step (B2) or (C2).
  • a step of forming a complete duplex (FIG. (O)) from the 3 ′ end of (m) upper strand) by an extension reaction using the single-stranded nucleic acid as a template (FIG. (N)) (B3) Step or (C3) Step).
  • the first and second synthesis reactions in the nucleic acid synthesis method of the present invention have been described above.
  • the isothermal amplification method using the primer set of the present invention may or may not include these synthesis reactions of the present invention.
  • the first primer may have an intervening sequence (G) between the sequence (A ′) and the sequence (C).
  • the length of the intervening sequence (G) is, for example, 1 to 30 bases, preferably 1 to 20 bases, more preferably 1 to 10 bases.
  • the first primer may have an intervening sequence (H) between the sequence (C) and the folded sequence (DD ′).
  • the length of the intervening sequence (H) is, for example, 1 to 30 bases, preferably 1 to 20 bases, more preferably 1 to 10 bases.
  • the primer set according to the present invention may include a third primer in addition to the first primer and the second primer.
  • the third primer hybridizes to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence, and does not compete with other primers for hybridization to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence.
  • not competing means that the primer does not interfere with the provision of a complementary strand synthesis starting point by hybridizing to the target nucleic acid.
  • the third primer is a single primer when the amplification product by amplification of the target nucleic acid is partially in a single-stranded state. It can be annealed to a target sequence present in the chain portion. As a result, a new complementary strand synthesis starting point is provided in the target nucleic acid sequence in the amplification product, and an extension reaction takes place therefrom, so that the nucleic acid amplification reaction is performed more rapidly.
  • the third primer is not necessarily limited to one type, and two or more types of third primers may be used simultaneously in order to improve the speed and specificity of the nucleic acid amplification reaction. These third primers typically have a different sequence from the first primer and the second primer, but may hybridize to partially overlapping regions as long as they do not compete with these primers.
  • the chain length of the third primer is preferably 2 to 100 bases, more preferably 5 to 50 bases, and even more preferably 7 to 30 bases.
  • the third primer is mainly intended to assist the nucleic acid amplification reaction by the first primer and the second primer more rapidly. Therefore, the third primer preferably has a Tm lower than the Tm of each 3 'end of the first primer and the second primer. Further, the addition amount of the third primer to the amplification reaction solution is preferably smaller than the addition amounts of the first primer and the second primer.
  • the third primer examples include a primer having a structure capable of forming a loop as described in WO 02/24902 and giving a starting point for complementary strand synthesis to the loop portion.
  • the present invention is not limited to this. That is, as long as it is within the target nucleic acid sequence, it may provide a complementary strand synthesis origin at any site.
  • Primers included in the primer set according to the present invention are composed of deoxynucleotides and / or ribonucleotides.
  • ribonucleotide (sometimes simply referred to as “N”) refers to ribonucleotide triphosphate such as ATP, UTP, CTP, GTP, and the like.
  • ribonucleotides include these derivatives, such as ribonucleotides ( ⁇ -thio-ribonucleotides) in which the oxygen atom of the phosphate group at the ⁇ -position is replaced with a sulfur atom.
  • the primer includes an oligonucleotide primer composed of unmodified deoxynucleotides and / or modified deoxynucleotides, and an oligonucleotide primer composed of unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides, unmodified deoxynucleotides and / or Alternatively, chimeric oligonucleotide primers containing modified deoxynucleotides and unmodified ribonucleotides and / or modified ribonucleotides are also included.
  • the primers contained in the primer set according to the present invention can be synthesized by any method that can be used for the synthesis of oligonucleotides, such as the phosphate triester method, the H-phosphonate method, the thiophosphonate method, and the like.
  • the primer can be easily obtained by, for example, synthesizing by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 manufactured by ABI (Applied Biosystem Inc.).
  • the template nucleic acid or nucleic acid sample containing the target nucleic acid sequence used in the nucleic acid amplification reaction may be either DNA or RNA, and may be double-stranded or single-stranded.
  • DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • RNA includes all RNA, mRNA, rRNA, siRNA, hnRNA, microRNA, and synthetic RNA.
  • These nucleic acids are prepared from, for example, blood, tissues, cells, biological samples such as animals and plants, or microorganism-derived samples or virus-derived samples separated from biological samples, food, soil, waste water, etc. be able to.
  • the isolation of the template nucleic acid or nucleic acid sample can be carried out by any method, and examples thereof include a method using dissolution treatment with a surfactant, sonication, shaking and stirring using glass beads, and a French press.
  • a surfactant for example, phenol extraction, chromatography, ion exchange, gel electrophoresis, density-dependent centrifugation, and the like.
  • the template nucleic acid or the nucleic acid sample is a double-stranded nucleic acid such as genomic DNA or PCR fragment isolated by the above method, or a cDNA prepared by reverse transcription from total RNA or mRNA. Any single stranded nucleic acid can be used. In the case of the above double-stranded nucleic acid, it can be used more optimally by carrying out a denaturing step to make it a single strand.
  • the enzyme used in the reverse transcription reaction is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template.
  • avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase AMV RTase
  • rous-related virus 2 Reverse transcriptases RAV-2 RTase
  • Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase MMLV RTase
  • other reverse transcriptases avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity can also be used.
  • an enzyme having reverse transcription activity at a high temperature is optimal.
  • a DNA polymerase derived from Thermus bacterium (Tth DNA polymerase, etc.), a DNA polymerase derived from Bacillus bacterium, or the like can be used.
  • a particularly preferable enzyme for example, as a DNA polymerase derived from a thermophilic Bacillus bacterium, B. st-derived DNA polymerase (Bst DNA polymerase); Examples include ca-derived DNA polymerase (Bca DNA polymerase), such as BcaBEST DNA polymerase and Bca (exo-) DNA polymerase.
  • Bca DNA polymerase does not require manganese ions for the reaction, and can synthesize cDNA while suppressing secondary structure formation of template RNA under high temperature conditions.
  • the primer nucleic acid can be denatured into a single strand to obtain a primer for the template nucleic acid. Annealing can also be performed efficiently. Increasing the temperature to about 95 ° C is a preferred nucleic acid denaturation method. As another method, it is possible to denature by raising the pH, but in this case, it is necessary to lower the pH in order to hybridize the primer to the target nucleic acid.
  • the polymerase used in the nucleic acid amplification reaction only needs to have a strand displacement activity (strand displacement ability), and any of normal temperature, intermediate temperature, and heat resistance can be suitably used. Further, this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutation. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Furthermore, it is preferable that the DNA polymerase has substantially no 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity. Examples of such DNA polymerase include Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B.st”), Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B.ca”), and the like.
  • B.st Bacillus stearothermophilus
  • B.ca Bacillus caldotenax
  • thermophilic Bacillus genus DNA polymerase Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, and the like.
  • DNA polymerases used in the nucleic acid amplification reaction Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase, ⁇ 29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z -Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, Thermonarter DNA polymerase, etc.
  • a DNA polymerase having reverse transcription activity for example, BcaBEST DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, etc.
  • reverse transcription reaction from total RNA or mRNA and cDNA as a template.
  • the DNA polymerase reaction can be carried out with one kind of polymerase.
  • reagents used in the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, etc. Can be used. Furthermore, additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, cation complexes, and the like may be used.
  • catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate
  • substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, etc.
  • additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, cation complexes,
  • a melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in order to increase the nucleic acid amplification efficiency.
  • the melting temperature (Tm) of a nucleic acid is generally determined by the specific nucleotide sequence of the double stranded portion in the nucleic acid. By adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution, this melting temperature can be changed. Therefore, under a certain temperature, the intensity of double strand formation in the nucleic acid can be adjusted.
  • a general melting temperature adjusting agent has an effect of lowering the melting temperature.
  • a melting temperature adjusting agent By adding such a melting temperature adjusting agent, it is possible to lower the melting temperature of the double-stranded forming part between two nucleic acids, in other words, to reduce the strength of the double-stranded formation. It becomes. Therefore, when such a melting temperature adjusting agent is added to the reaction solution in the nucleic acid amplification reaction, it is efficiently used in a GC-rich nucleic acid region that forms a strong double strand or a region that forms a complex secondary structure. The double-stranded portion can be made into a single strand, and this makes it easy for the next primer to hybridize to the target region after the extension reaction with the primer is completed, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased.
  • the melting temperature adjusting agent used in the present invention and its concentration in the reaction solution are appropriately selected by those skilled in the art in consideration of other reaction conditions that affect the hybridization conditions, such as salt concentration, reaction temperature, etc.
  • the melting temperature adjusting agent is not particularly limited, but is preferably dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide or glycerol, or any combination thereof, more preferably dimethyl sulfoxide (DMSO). .
  • an enzyme stabilizer can be added to the reaction solution in the nucleic acid amplification reaction. Thereby, since the enzyme in the reaction solution is stabilized, the amplification efficiency of the nucleic acid can be increased.
  • the enzyme stabilizer used in the present invention may be any known in the art, such as glycerol, bovine serum albumin, saccharides, etc., and is not particularly limited.
  • a reagent for enhancing the heat resistance of an enzyme such as DNA polymerase or reverse transcriptase can be added to the reaction solution as an enzyme stabilizer.
  • an enzyme stabilizer As a result, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid synthesis efficiency and amplification efficiency can be increased.
  • a reagent may be any known in the art and is not particularly limited, but is preferably a saccharide, more preferably a mono- or oligosaccharide, more preferably trehalose, sorbitol or mannitol, or these It is set as the mixture of 2 or more types.
  • the nucleic acid amplification reaction using the primer set according to the present invention can be performed isothermally.
  • “isothermal” refers to maintaining an approximately constant temperature condition such that the enzyme and the primer can substantially function.
  • the “substantially constant temperature condition” means that not only the set temperature is accurately maintained but also a temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is allowed. To do.
  • the nucleic acid amplification reaction under a constant temperature condition can be carried out by keeping the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained.
  • the reaction temperature is preferably set to a temperature near or below the melting temperature (Tm) of the primer.
  • Tm melting temperature
  • the level of stringency is preferably set in consideration of the melting temperature (Tm) of the primer. Therefore, this temperature is preferably about 20 ° C. to about 75 ° C., more preferably about 35 ° C. to about 65 ° C.
  • the amplification reaction is repeated until either the enzyme is inactivated or one of the reagents including the primer is used up.
  • nucleic acid containing a non-natural nucleotide can be used as a template nucleic acid (target nucleic acid sequence).
  • non-natural nucleotide means a nucleotide that contains a base other than the base (adenine, guanine, cytosine, and thymine or uracil) contained in a natural nucleotide, and that can be incorporated into a nucleic acid sequence. Examples thereof include xanthosines, diaminopyrimidines, isoG, isoC (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333, 1995).
  • a nucleic acid amplification enzyme having no heat resistance is used for amplification of a target nucleic acid containing a non-natural nucleotide.
  • the nucleic acid amplification reaction can be performed at, for example, an isothermal temperature of about 50 ° C., the possibility that the nucleic acid amplification enzyme (DNA polymerase or the like) is inactivated is low as compared with the conventional PCR method. Therefore, the nucleic acid amplification reaction using the primer set according to the present invention is also effective for amplification of a target nucleic acid containing a non-natural nucleotide in which a nucleic acid amplification enzyme having no heat resistance is used.
  • the enzyme used to amplify a nucleic acid containing a non-natural nucleotide is not particularly limited as long as it can amplify such a target nucleic acid, but particularly from the viewpoint of uptake efficiency, Y188L / E478Q mutant HIV I reverse transcription Enzymes, AMV reverse transcriptase, Klenow fragment of DNA polymerase, 9 ° N DNA polymerase, HotTub DNA polymerase, etc. are suitable (Michael Sismour 1 et al., Biochemistry 42, No. 28, 8598, 2003 / US Pat. No. 6,617,106) Statement, Michael J. Lutz et al., Bioorganic & Medical Chemistry letters 8, 1149-1152, 1998, etc.). Furthermore, a substance that improves the heat resistance of the nucleic acid amplification enzyme, such as trehalose, can also be added to the reaction solution, whereby the target nucleic acid containing unnatural nucleotides can be more efficiently amplified.
  • the presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method according to the present invention can be detected by many various methods.
  • One method is the detection of amplification products of a specific size by general gel electrophoresis. In this method, for example, it can be detected by a fluorescent substance such as ethidium bromide or cyber green.
  • a labeled probe having a label such as biotin and hybridizing it to the amplification product.
  • Biotin can be detected by binding to fluorescently labeled avidin, avidin bound to an enzyme such as peroxidase, and the like.
  • a method of visually observing the white turbidity of the reaction solution by utilizing the fact that pyrophosphoric acid is bonded to magnesium in the reaction solution to cause white precipitation of magnesium pyrophosphate.
  • a metal indicator whose color tone changes depending on the magnesium ion concentration (for example, Eriochrome Black T, Hydroxy Naphthol Blue, etc.) is added to the reaction solution, and the color change of the reaction solution is visually observed. This makes it possible to detect the presence or absence of amplification.
  • Calcein or the like it is possible to visually observe the increase in fluorescence accompanying the amplification reaction, so that the amplification product can be detected in real time.
  • the presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method according to the present invention can also be detected by observing the aggregation of the solid phase carrier resulting from the generation of the amplification product.
  • at least one primer contained in the primer set according to the present invention comprises a solid phase carrier or a site capable of binding to the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier or the site capable of binding to the solid phase carrier may be introduced into any part such as the 3 ′ end portion, 5 ′ end portion, central region of the primer, but preferably the 5 ′ end portion. It is assumed that it was introduced.
  • the substrate used in the nucleic acid amplification reaction may comprise a solid phase carrier or a site capable of binding to the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier used in the present invention is a carrier that is insoluble in the reaction solution used for the nucleic acid amplification reaction, or a property from the liquid phase to the solid phase (gel phase) or from the solid phase (gel phase) to the liquid phase before and after amplification.
  • Any phase transition carrier that changes can be used.
  • Preferred solid phase carriers include water-insoluble organic polymer carriers, water-insoluble inorganic polymer carriers, synthetic polymer carriers, phase transition carriers, metal colloids, magnetic particles, and the like, and further solvent-insoluble organic polymer carriers. , Solvent-insoluble inorganic polymer carriers, solvent-soluble polymer carriers, gel polymer carriers and the like.
  • examples of the water-insoluble organic polymer include silicon-containing materials such as porous silica, porous glass, diatomaceous earth, and celite, and cross-linked polysaccharides such as nitrocellulose, hydroxyapatite, agarose, dextran, cellulose, and carboxymethylcellulose. , Cross-linked protein such as methylated albumin, gelatin, collagen, casein, gel particles, dye sol and the like.
  • examples of the water-insoluble inorganic polymer include aluminum oxide, titanium oxide, and ceramic particles.
  • Examples of the synthetic polymer include polystyrene, poly (meth) acrylate, polyvinyl alcohol, polyacrylonitrile or a copolymer thereof, styrene-styrene sulfonic acid copolymer, vinyl acetate-acrylic acid ester copolymer, and the like.
  • Examples of the metal colloid include gold colloid.
  • Examples of magnetic particles include magnetic iron oxide beads, monodispersed magnetic iron oxide finely pulverized particles, superparamagnetic particles (Japanese Patent Publication No. 4-501959), and superparamagnetic oxidation covered with a polymerizable silane coating. Examples thereof include magnetically responsive particles having iron (Japanese Patent Publication No.
  • the magnetized solid phase carrier can be easily separated from solid and liquid using magnetic force.
  • the shape of the solid support include particles, membranes, fibers, and filters. Particles are particularly preferred as the shape of the solid support, and the surface thereof may be either porous or non-porous.
  • Particularly preferred solid phase carriers include latex in which a synthetic polymer carrier is uniformly dispersed in water, metal colloid particles such as gold colloid, magnetic particles such as magnet beads, and the like.
  • the immobilization of a primer or a substrate to a solid phase carrier can be performed by a method known to those skilled in the art, and may be a method using either physical bonding or chemical bonding. Immobilization of a primer or a substrate to a solid phase carrier is generally performed by, for example, combining a substance capable of labeling an oligonucleotide such as a primer or a probe with a solid phase carrier to which a substance capable of binding to the substance is bound. be able to.
  • a combination of substances used for such purpose those well known in the art can be used, for example, a combination of biotin and avidin or streptavidin, a combination of an antigen and an antibody capable of binding thereto, a ligand, And a combination of two nucleic acids which hybridize with each other.
  • a primer or a substrate labeled with biotin is bound to a solid phase carrier whose surface is coated with avidin or streptavidin, whereby the primer or the substrate can be immobilized on the solid phase carrier.
  • the antigen include haptens such as FITC, DIG, and DNP.
  • antibodies that can bind to these include antibodies such as anti-FITC antibody, anti-DIG antibody, and anti-DNP antibody.
  • these antibodies may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • the combination of biotin and streptavidin has high specificity and good binding efficiency, so that these combinations are particularly preferable. Labeling substances such as biotin, hapten, and ligand may be used alone or in a plurality of combinations if necessary, using known means (Japanese Patent Laid-Open Nos. 59-93099, 59-148798, and No. 59-204200), the primer can be introduced at the 5 ′ end of the primer.
  • the site (or group) capable of binding to the solid phase carrier used in the present invention can be selected according to the above-described method used for immobilization of the primer or the substrate to the solid phase carrier, and thus the solid phase carrier. Any of those that allow physical binding to or chemical binding to each other may be used, but specific binding is preferable.
  • the site capable of binding to such a solid phase carrier include biotin, avidin, streptavidin, antigen, antibody, ligand, receptor, nucleic acid, protein and the like, and preferably biotin or streptavidin. More preferably, it is biotin.
  • the solid phase carrier used in this case may include a binding partner of the site contained in the primer or the substrate, if necessary.
  • a binding partner is present in a form capable of binding to the site contained in the primer or the substrate, preferably present on the surface of the solid support, more preferably the solid support. It was assumed that it was applied on the surface of
  • a primer set according to the present invention is prepared for each of a plurality of target nucleic acids, the plurality of primer sets are immobilized on a solid phase carrier in a form that can be distinguished from each other, and these immobilizations are performed. Nucleic acid amplification reaction is performed using the optimized primer set. This makes it possible to simultaneously amplify a plurality of target nucleic acids and detect the amplification products for each of them in a distinguishable form. Detection of the amplification product can be performed using an intercalator or the like.
  • solid phase carriers that can be used for such purposes include not only the above-mentioned planar solid phase carriers but also bead surfaces that can be distinguished from each other (US Pat. No. 6,046,807 and US Pat. No. 6,057,107). ), A quasi-flat plate carrier (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-245460) produced by bundling a fibrous carrier in which each primer set is solid-phased and then cutting into thin pieces. Things can be used.
  • the amplified fragment obtained by the nucleic acid amplification method according to the present invention is composed of ordinary bases, it can be subcloned into an appropriate vector using the restriction enzyme site inside the amplified fragment after amplification. Furthermore, the amplified fragment can be treated with a restriction enzyme like RFLP, and can be widely used in the field of genetic testing. Further, the amplified fragment can be generated as containing an RNA polymerase promoter sequence, which makes it possible to synthesize RNA directly from the amplified fragment. The RNA synthesized in this way can also be used as an RNA probe, siRNA or the like.
  • a base labeled with biotin or a fluorescent substance can be used as a substrate in place of ordinary dNTP, whereby a DNA probe labeled with biotin or a fluorescent substance can be used. It is also possible to prepare. Furthermore, the presence or absence of an amplification product can be confirmed through some structure such as biotin or a labeling substance.
  • the primer included in the primer set according to the present invention can include a restriction enzyme recognition site, thereby improving the efficiency of nucleic acid amplification. That is, since a nick is generated in the amplification product by the restriction enzyme corresponding to the restriction enzyme recognition site in the primer, it is possible to cause a strand displacement type complementary strand synthesis reaction using this nick as a starting point for synthesis.
  • This method is basically based on the principle of the SDA method described as the prior art.
  • the primer included in the primer set according to the present invention may include an RNA polymerase promoter sequence, thereby improving the efficiency of nucleic acid amplification.
  • This method is basically based on the principle of the NASBA method described as the prior art.
  • the primer set according to the present invention can include an “outer primer” used in the LAMP method or the SDA method, thereby improving the efficiency of nucleic acid amplification.
  • an “outer primer” used in the LAMP method or the SDA method, thereby improving the efficiency of nucleic acid amplification.
  • the outer primer a primer capable of providing a complementary strand synthesis origin at a portion located outside the target nucleic acid sequence on the template nucleic acid can be used.
  • nucleic acid amplification method By the nucleic acid amplification method according to the present invention, a single-stranded nucleic acid to be immobilized on a DNA chip, a single-stranded DNA probe for determining a base sequence, a megaprimer for a long-chain PCR method, etc. can be easily and rapidly prepared. Can do. Further, according to the nucleic acid amplification method of the present invention, it is possible to selectively amplify only the sense sequence or the antisense sequence of the target nucleic acid depending on the purpose.
  • the single-stranded nucleic acid prepared by the nucleic acid amplification method according to the present invention can be used as a DNA fragment for immobilization on a DNA chip. That is, the nucleic acid amplification method according to the present invention can be applied to a method for preparing a DNA chain for immobilization in DNA chip production. It is also possible to prepare a DNA chip by preliminarily fixing the 5 'end of the primer on the DNA chip and performing nucleic acid amplification on the chip. In addition, by adding a fluorescently labeled probe that hybridizes to the amplification product in advance to the reaction solution before performing the nucleic acid amplification, the amplification product can be detected in real time while performing nucleic acid amplification on the DNA chip. It becomes possible.
  • the primer set can be designed so that the mutation site is included in the sequence (A) or the sequence (B), thereby confirming the presence or absence of the amplification product. It is possible to detect (determine) the presence or absence.
  • the presence of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction indicates the presence of the mutation. Absence or reduction of indicates an absence of mutation.
  • the presence of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction indicates the absence of the mutation, A decrease indicates the presence of the mutation.
  • “decrease in amplification product” means that the amount of amplification product obtained is reduced compared to the amount of amplification product obtained when the target nucleic acid sequence is present in the nucleic acid sample. To do.
  • mutation means that there is a base (base pair in the case of double-stranded nucleic acid) different from the control nucleic acid sequence in the nucleic acid sequence.
  • mutation includes base deletion, insertion, addition and substitution.
  • control nucleic acid refers to a standard base sequence, for example, a standard genotype, with respect to a specific base sequence, both a wild type and a normal type.
  • test nucleic acid means a nucleic acid to be examined whether or not it has a base (mutation) different from the reference nucleic acid in the mutation detection method according to the present invention, in other words, in a nucleic acid sample.
  • a nucleic acid sample Means a nucleic acid having the same sequence as that of the control nucleic acid except for the base related to the mutation.
  • mutant base or “mutation nucleotide residue” means a base or nucleotide residue present at the mutation site in the nucleic acid, and therefore included in the mutation site of the control nucleic acid.
  • the gene of the patient suspected of having the mutation is a test nucleic acid
  • the gene of a healthy person corresponding to this gene is a control nucleic acid.
  • test nucleic acid and control nucleic acid may be a natural product-derived nucleic acid or an artificially synthesized nucleic acid.
  • nucleic acid as used in the present invention means a polynucleotide comprising any unmodified nucleotide and / or modified nucleotide.
  • the test nucleic acid and the control nucleic acid are typically DNA such as cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA, or RNA such as mRNA, total RNA, hnRNA, siRNA, and synthetic RNA.
  • polynucleotide used in the present invention includes, for convenience, polynucleotides and oligonucleotides, and artificially synthesized nucleic acids such as peptide nucleic acids, morpholino nucleic acids, methylphosphonate nucleic acids, S-oligonucleic acids, and the like. Shall be.
  • the test nucleic acid can be freely selected by the tester. Furthermore, when performing detection, these nucleic acids may be mixed.
  • a nucleic acid sample containing a test nucleic acid can be obtained from a test subject, for example, a human or non-human animal.
  • the nucleic acid can be extracted from a sample such as a desired tissue, organ and cell from the subject by a method known in the art, and if necessary, the size of the nucleic acid fragment can be extracted after the extraction.
  • conditions such as purification purity can be adjusted to an appropriate state.
  • the test nucleic acid in the nucleic acid sample may be further amplified by performing an amplification reaction by a general polymerase chain reaction (PCR) or the like.
  • PCR general polymerase chain reaction
  • the test nucleic acid and the control nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • double-stranded nucleic acid used in the present invention means any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, and DNA / RNA.
  • the double-stranded nucleic acid may be used as it is as a nucleic acid sample, or may be amplified with a vector such as a phage or a plasmid.
  • Example 1 when the folding sequence (DD ′) is added to one of the first primer and the second primer, and the folding sequence (DD ′) is added to the first primer, When the folded sequence (EE ′) was added to the second primer, the target nucleic acid sequence was isothermally amplified using two types of primer sets.
  • a forward primer (Forward primer 1: SEQ ID NO: 1 or Forward primer 2: SEQ ID NO: 2) and a reverse primer ( A reaction solution was prepared by adding Reverse primer 1: SEQ ID NO: 3 or Reverse primer 2: SEQ ID NO: 4) at a concentration of 2 ⁇ M each.
  • Reverse primer 1 SEQ ID NO: 3 or Reverse primer 2: SEQ ID NO: 4
  • the underlined portion indicates the folded sequence
  • the enclosed portion indicates the common sequence of the Forward and Reverse primers.
  • plasmid DNA As a template DNA, 2 ⁇ 10 4 copies of plasmid DNA having the partial sequence of the cDNA of the RNA genome N2 segment of influenza A (H3N2) (SEQ ID NO: 5) was added to the reaction solution, and the real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent) was added. The reaction was carried out at a constant temperature of 60 ° C. for 60 minutes, and the nucleic acid amplification activity was examined by obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • FIG. 13 shows the fluorescence amplification curves ( ⁇ ) for the case where Forward Primer 1 (SEQ ID NO: 1) and Reverse Primer 1 (SEQ ID NO: 3) are used, with and without template DNA ( ⁇ ). The meanings of and ⁇ are the same in the following examples).
  • the increase in the fluorescence signal was remarkably observed in the template DNA added.
  • FIG. 14 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in the fluorescence signal was recognized in FIG. As shown in FIG. 14, a periodic band pattern extending from a short chain to a long chain was observed, which revealed that isothermal nucleic acid amplification occurred.
  • FIG. 15 shows a fluorescence amplification curve when Forward primer 2 (SEQ ID NO: 2) and Reverse primer 2 (SEQ ID NO: 4) are used.
  • FIG. 16 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in the fluorescence signal was recognized in FIG.
  • a periodic band pattern extending from a short chain to a long chain was observed.
  • the pattern of the band period is different, and it was revealed that isothermal nucleic acid amplification having an amplification pattern different from that in the above result 1 occurred.
  • Example 2 In this example, an intervening sequence (H) was inserted between the folded sequence (DD ′) or (EE ′) and the common sequence (C) in both the first primer and the second primer. In some cases, the target nucleic acid sequence was amplified isothermally. Further, the intervening sequence (H) was made different between the first primer and the second primer.
  • the reaction composition liquid other than the primer was the same as in Example 1 described above. That is, in a liquid having a volume of 25 ⁇ L, final concentrations of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 30 mM potassium acetate, 10 mM sodium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% Tween 20, 1 / 100,000 diluted SYBR Green I (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 12 unit Aac DNA polymerase solution, the primers are Forward primer (Forward primer 3: SEQ ID NO: 6) of the sequence shown below, and Reverse primer (Reverse primer 3: A reaction solution was prepared by adding SEQ ID NO: 7) at a concentration of 2 ⁇ M each.
  • the underlined (single underlined) part is a folded sequence
  • the enclosed part is a common sequence of Forward and Reverse primers
  • the double underlined part is
  • Example 2 Similarly to Example 1 described above, 2 ⁇ 10 4 copies of plasmid DNA having the partial sequence of the cDNA of the RNA genome N2 segment of influenza A (H3N2) (SEQ ID NO: 5) as template DNA were added to the reaction solution.
  • the nucleic acid amplification activity was examined by performing a reaction at a constant temperature of 60 ° C. for 90 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent) and obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • FIG. 17 shows a fluorescence amplification curve when Forward primer 3 (SEQ ID NO: 6) and Reverse primer 3 (SEQ ID NO: 7) are used. As shown in FIG. 17, the increase in the fluorescence signal was remarkably observed in the case where the template DNA was added.
  • FIG. 18 is a photograph showing an agarose gel electrophoresis result of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIG. As shown in FIG. 18, two periodic band patterns ranging from a short chain to a long chain were observed, and it was revealed that isothermal nucleic acid amplification occurred in the reaction solution.
  • Example 3 Effect of third primer
  • the effect of the third primer designed complementarily between the annealing regions of the first primer and the second primer in the target nucleic acid to improve the isothermal amplification reaction in the present invention is shown.
  • both of the first primer and the second primer used in this example are the intervening sequence (H) between the folded sequence (DD ′) or (EE ′) and the common sequence (C). What inserted was used.
  • the reaction composition solution other than the primer was the same as in Example 1 described above. That is, in a liquid having a volume of 25 ⁇ L, final concentrations of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 30 mM potassium acetate, 10 mM sodium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% Tween 20, 1 / 100,000 diluted SYBR Green I (Takara Shuzo) and 12 unit Aac DNA polymerase.
  • Primers were added at a concentration of 2 ⁇ M each using a forward primer (Forward primer 4: SEQ ID NO: 8) having the sequence shown below as a first primer and a reverse primer (Reverse primer 4: SEQ ID NO: 9) as a second primer.
  • the following Boost primer (Boost Primer 1 or 2: SEQ ID NO: 10 or 11) was added as a triple primer at a concentration of 0.66 ⁇ M as a reaction solution.
  • the underlined (single underlined) part is the folded sequence
  • the enclosed part is the common sequence of the Forward and Reverse primers
  • the double underlined part is the intervening sequence.
  • human genomic DNA Human Genomic DNA, Male; Cat # G1471 manufactured by Promega
  • a partial sequence SEQ ID NO: 12
  • Nucleic acid amplification activity is obtained by adding 10 ng of the human genomic DNA to the reaction solution, performing a reaction at a constant temperature of 60 ° C. for 100 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent), and obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • FIG. 19 shows a fluorescence amplification curve when Forward primer 4 (SEQ ID NO: 8) and Reverse primer 4 (SEQ ID NO: 9) were used as the first and second primers.
  • 20 to 22 show the results of fluorescence amplification curves when a third primer is further added to the first and second primers. Only Boost primer 1 is used in the reaction shown in FIG. 20, and only Boost primer 2 is used in the reaction shown in FIG.
  • FIG. 22 shows the result of adding both Boost primers 1 and 2 in the reaction of FIG.
  • FIG. 19 shows the results of agarose gel electrophoresis of the reaction solution in which an increase in fluorescence signal was observed in FIGS.
  • Example 4 the isothermal nucleic acid amplification method was carried out in a final concentration of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 8 mM magnesium sulfate in 25 ⁇ L of liquid.
  • plasmid DNA having the cDNA partial sequence (SEQ ID NO: 15) of the influenza B RNA genome MP segment was added as a template DNA so as to be 6 ⁇ 10 3 copies in the reaction solution. Also, for amplification from short template DNA, it corresponds to the annealing sequence of Forward primer 5 and Reverse primer 5 and the cDNA partial sequence of influenza B RNA genome MP segment sandwiched between them (SEQ ID NO: 15, underlined)
  • the 52-mer oligo DNA was used as a template DNA, and the template DNA was added to the reaction solution so as to be 6 ⁇ 10 3 copies.
  • the isothermal nucleic acid amplification reaction was performed by incubation at a constant temperature of 60 ° C. for 90 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent), and the presence or absence of nucleic acid amplification was examined by obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter. .
  • FIG. 24 shows a fluorescence amplification curve in the case of using Forward primer 5 (SEQ ID NO: 13) and Reverse primer 5 (SEQ ID NO: 14).
  • FIG. 25 shows the result of subjecting the reaction solution in the amplification reaction in FIG. 24 to agarose gel electrophoresis.
  • a periodic band pattern extending from the short chain to the long chain was observed in the reaction sample containing the template DNA, which revealed that isothermal nucleic acid amplification occurred.
  • FIG. 26 shows the result of determining the base sequence of each DNA for the bands indicated by arrows 1 and 2 in FIG. 25A.
  • a base sequence of 105 bp was obtained from the DNA corresponding to arrow 1 and a base sequence of 202 bp was obtained from the DNA corresponding to arrow 2, which almost coincided with the DNA fragment length observed by agarose electrophoresis.
  • the DNA corresponding to the arrow 1 in FIG. 25A had an amplicon sequence sandwiched between the forward and reverse primers from the template DNA (FIG. 26A).
  • the DNA corresponding to the arrow 2 has a sequence in which two amplicon sequences are ligated in the forward direction (tandem), and the amplicon ligation site contains only one primer folding sequence. (FIG. 26B).
  • Example 5 the specificity of the primer to the target sequence in the isothermal nucleic acid amplification method of the present invention was examined.
  • final concentrations of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% Tween 20, 1 / Forward primer 6 (SEQ ID NO: 16) and Reverse primer 6 (SEQ ID NO: 17) shown below were added to a solution containing 100,000 diluted SYBR Green I (Takara Shuzo) and 6 unit Aac DNA polymerase (Danaform), respectively. Added at a concentration of 2.5 ⁇ M.
  • the underlined portion indicates the folded sequence, and the enclosed portion indicates the common sequence of the Forward and Reverse primers.
  • plasmid DNA having the cDNA partial sequence (SEQ ID NO: 15) of the influenza B RNA genome MP segment was added as a template DNA so as to be 6 ⁇ 10 3 copies in the reaction solution. Further, with the template DNA, was prepared per reaction 20ng of human genomic DNA (Human Genomic DNA, Male, from Promega, 10 3 copies equivalent) and the reaction solution was added.
  • FIG. 27 shows fluorescence amplification when Forward Primer 6 (SEQ ID NO: 16) and Reverse Primer 6 (SEQ ID NO: 17) are used as primers, FluB cDNA plasmid containing the target sequence is added as template DNA, and human genomic DNA is added. A curve is shown. As a result, in both the case where the template DNA was added (white circle) and the case where the human genomic DNA was further added (gray square), the fluorescence signal was compared with the case where the template DNA was not added as a control experiment (gray diamond). The increase was noticeable.
  • FIG. 28A shows the result of subjecting the reaction solution in the amplification reaction in FIG. 27 to agarose gel electrophoresis. As can be seen from the figure, a periodic band pattern from short to long is observed in the reaction sample containing the template DNA of the FluB cDNA plasmid, and the reaction solution contains no template DNA or only human genomic DNA. In, no significant amplification pattern was observed. Therefore, it was revealed that the primers used in this example performed isothermal nucleic acid amplification and specifically recognized the FluB cDNA plasmid as a template DNA.
  • FIG. 29 shows the result of determining the base sequence of each DNA with respect to the band indicated by the arrow in FIG. 28B.
  • a base sequence of 105 bp was obtained from the DNA corresponding to the arrow, which almost coincided with the DNA fragment length observed by agarose electrophoresis.
  • the DNA indicated by the arrow in FIG. 28B has an amplicon sequence sandwiched between the template DNA and the Forward and Reverse primers, and the sequence corresponding to the 3 ′ end of both primers. In the sandwiched section, it was confirmed that the FluB continuous from the annealing region contains a specific sequence. Therefore, the specificity of the target sequence recognition of the primer used in this example was proved also from the primary sequence structure analysis of the amplification product.
  • Example 6 it was examined whether the isothermal nucleic acid amplification method according to the present invention can be used for direct isothermal nucleic acid amplification from a reverse transcription reaction solution using RNA as a template. From the plasmid DNA containing the partial sequence of the FluB cDNA used in Example 4, FluB cDNA linear primers with the T7 promoter sequence added using the following FluB cDNA amplification primers (SEQ ID NOs: 18 and 19) DNA was prepared by PCR.
  • RNA obtained by acidic phenol extraction from the reaction solution was used as a template RNA for the reverse transcription reaction in this example.
  • Reverse transcription reaction solution 25 ⁇ L (50 mM Tris-HCl [pH 8.3], 75 mM potassium chloride, 3 mM magnesium chloride, 10 mM DTT, 200 unit M-MLV Reverse transcriptase [deletion mutant, RNaseH] (-, Manufactured by Promega Corporation), a primer for reverse transcription [SEQ ID NO: 20]), and reacted at 42 ° C. for 1 hour. Then, in order to inactivate M-MLV Reverse transcriptase, it hold
  • Reverse transcription primer (SEQ ID NO: 20) 18-mer 5'-TGGACGTCTTCTCCTTTT-3 '
  • FIG. 30 shows a reaction in which a 1/4000 dilution of the reverse transcription reaction solution prepared in this example was added in an isothermal amplification reaction using Forward primer 5 (SEQ ID NO: 13) and Reverse primer 6 (SEQ ID NO: 14). It is the result compared with the case (Gray square) which added FluB cDNA plasmid as template DNA like a sample (white circle) and Example 4. As a result, although there was a delay in the rise time of the fluorescence signal compared to the plasmid template, the reaction sample with the reverse transcription reaction solution added no template DNA as a control experiment (black triangle).
  • FIG. 31 shows the result of subjecting the reaction solution in the amplification reaction in FIG. 30 to agarose gel electrophoresis. As a result, even in the reaction sample to which the reverse transcription reaction solution was added, a periodic band pattern extending from the short chain to the long chain was observed in the same pattern as when using template DNA, and the same isothermal nucleic acid amplification occurred. It became clear that
  • Example 7 the behavior of the primer structure used in the isothermal nucleic acid amplification method of the present invention was examined when only one primer was removed from the folded sequence located at the 5 ′ end.
  • a solution containing diluted SYBR Green I (Takara Shuzo) and 6 unit Aac DNA polymerase (Danaform) Forward primer 8 (SEQ ID NO: 21) shown below and Reverse primer 6 (sequence) used in Example 5 were used.
  • Forward primer 8 is a sequence obtained by removing the folded sequence (16 base) at the 5 ′ end of Forward primer 6 (SEQ ID NO: 16). Similar sequence.
  • plasmid DNA having the cDNA partial sequence (SEQ ID NO: 15) of the influenza B RNA genome MP segment was added as a template DNA so as to be 6 ⁇ 10 3 copies in the reaction solution. Further, with the template DNA, was prepared per reaction 20ng of human genomic DNA (Human Genomic DNA, Male, from Promega, 10 3 copies equivalent) and the reaction solution was added.
  • FIG. 32 shows FluB cDNA containing the target sequence using Forward primer 8 (SEQ ID NO: 21) containing no folding sequence at the 5 ′ end and Reverse primer 6 (SEQ ID NO: 17) containing the folding sequence at the 5 ′ end as primers.
  • a fluorescence amplification curve was shown when the plasmid was added as template DNA and human genomic DNA was added.
  • the fluorescence signal was compared with the case where the template DNA was not added as a control experiment (gray diamond). The increase was noticeable.
  • FIG. 33 shows the result of subjecting the reaction solution in the amplification reaction in FIG. 32 to agarose gel electrophoresis. As a result, a band pattern extending from short chain to long chain was observed in the reaction sample containing the template DNA of FluB cDNA plasmid, and a remarkable amplification pattern was observed in the reaction solution containing no template DNA or only human genomic DNA. There wasn't. Therefore, it was revealed that isothermal nucleic acid amplification with respect to the target template DNA was achieved even when one of the primers did not contain the 5 ′ end.
  • Example 8 the isothermal nucleic acid amplification method was carried out in a final concentration of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 8 mM magnesium sulfate in 25 ⁇ L of liquid.
  • Forward primer 5 (SEQ ID NO: 13) used in Example 4 was added to a solution containing 0.1% Tween 20, 1/10000 diluted SYBR Green I (Takara Shuzo), and 6 unit Aac DNA polymerase (Danaform).
  • a reaction solution was prepared by adding Reverse Primer 8 (SEQ ID NO: 22) at a concentration of 2.5 ⁇ M.
  • the box indicates the common sequence of the Forward and Reverse primers, and the Reverse primer 8 is the same as the sequence obtained by removing the 5 'terminal folding sequence (13base) of the Reverse primer 5 (SEQ ID NO: 14). Is an array of
  • plasmid DNA having the cDNA partial sequence (SEQ ID NO: 15) of the influenza B RNA genome MP segment was added as a template DNA so as to be 6 ⁇ 10 3 copies in the reaction solution.
  • the isothermal nucleic acid amplification reaction using the above reaction solution, electrophoresis of amplification reaction products, and sequence analysis of amplification products were performed in the same manner as in Example 4.
  • FIG. 34 shows FluB cDNA containing the target sequence using Forward primer 5 (SEQ ID NO: 13) containing a folded sequence at the 5 ′ end and Reverse primer 8 (SEQ ID NO: 22) containing no folded sequence at the 5 ′ end as primers.
  • the fluorescence amplification curve when a plasmid was added as a template DNA is shown.
  • a plasmid containing FluB cDNA was used as the template DNA (white circle), an increase in the fluorescence signal was significantly observed as compared with the case where no template DNA was added as a control experiment (black triangle).
  • FIG. 35 shows the result of subjecting the reaction solution in the amplification reaction in FIG. 34 to agarose gel electrophoresis. As a result, a periodic band pattern extending from the short chain to the long chain was observed in the reaction sample containing the template DNA, and it was revealed that isothermal nucleic acid amplification occurred.
  • FIG. 36 shows the result of determining the base sequence of each DNA with respect to the bands indicated by arrows 1 and 2 in FIG.
  • a base sequence of 92 bp was obtained from the DNA corresponding to arrow 1 and a base sequence of 186 bp was obtained from the DNA corresponding to arrow 2, which almost coincided with the DNA fragment length observed by agarose electrophoresis.
  • the DNA corresponding to arrow 1 in FIG. 35 has a sequence in which the amplicon sequence sandwiched between the forward and reverse primers was copied from the template DNA. (FIG. 36A).
  • the DNA corresponding to the arrow 2 has a sequence in which two amplicon sequences are linked in the forward direction (tandem) via two bases of GT (guanine, thymine) (FIG. 36B). .

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Abstract

　プライマー設計が容易であり、かつ、増幅距離を短くすることが可能なプライマーセットを提供する。　標的核酸配列４の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒを含み、前記第一プライマー１Ｆが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマー１Ｒが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列４の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とする。

Description

プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法
　本発明は、プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法に関する。
　遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
　目的遺伝子の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われる。このような酵素的方法の主要なものとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法；米国特許第４６８３１９５号明細書（特許文献１）、米国特許第４６８３２０２号明細書（特許文献２）および米国特許第４８００１５９号明細書（特許文献３））、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法；Trends　in　Biotechnology　10,　pp146-152,　1992（非特許文献１））がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。
　さらに、欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書（特許文献４）には、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が開示されており、前記方法では、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて２工程の温度サイクリング反応（加熱と冷却の繰り返し反応）を行うことにより既知の遺伝子配列が増幅される。しかし、以上に記載した方法においては、広い温度範囲で、かつ、厳密な温度制御を経時的に行うことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、これらの反応は、２種類～３種類の温度条件で行うために、各反応温度に調整するための時間が必要であり、サイクル数が増えれば増えるほど、それに要する時間は増大する。
　前記の問題点を解決すべく、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７－１１４７１８号公報（特許文献５）に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；strand　displacement　amplification）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustained　sequence　replication）法、日本国特許第２６５０１５９号公報（特許文献６）に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic　acid　sequence　based　amplification）法、ＴＭＡ(transcription-mediated　amplification)法、日本国特許第２７１０１５９号公報（特許文献７）に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書（特許文献８）、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット（特許文献９）または国際公開第９５／２５１８０号パンフレット（特許文献１０）に記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレット（特許文献１１）に記載のＬＡＭＰ法（Loop-Mediated　Isothermal　Amplification）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレット（特許文献１２）に記載のＩＣＡＮ法（Isothermal　and　Chimeric　primer-initiated　Amplification　of　Nucleic　acids）、日本国特許第３８９７８０５号公報（特許文献１３）に記載のSmartAmp2法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
　前記の等温増幅方法の中で、ＬＡＭＰ法及びSmartAmp2法は、実用性が高い方法である。まず、ＬＡＭＰ法は、二つのターンバックプライマー（ＴＰ）と二つのアウタープライマー（ＯＰ）を必須とする等温増幅方法である。このため、４種類のプライマーを必要とし、ゲノムの認識サイトも合計で６個となる。図１１に、ＬＡＭＰ法の例を示す。同図では、二つのＯＰを省略し、二つのＴＰのみを示している。同図に示すように、ＴＰは、標的核酸配列にハイブリダイズする配列を３´側に持ち、かつ、５´側に、プライマー伸長鎖に相補的な配列を持つ。例えば、同図において、一方のＴＰ（同図において左側）は、３´側に、標的核酸配列の配列（Ａ）と相補的な配列（Ａ´）を有し、５´側に、プライマー伸長鎖の配列（Ｍ´）に相補的な配列（Ｍ）を持つ。他方のＴＰ（同図において右側）も同様である。このような構成になっているため、ＴＰが、鋳型配列にハイブリダイズして伸長鎖が生成すると、前記ＴＰの５´側がターンバックして前記伸長鎖とハイブリダイズし、その結果、プライマー伸長鎖の５´側にステムループ構造が形成される。ＬＡＭＰ法では、二つのＴＰを使用するため、標的核酸配列の増幅領域配列を短くすることが困難であるという問題がある。また、前述のように、ＬＡＭＰ法では、４種類のプライマーを必要とし、かつ、ゲノム認識サイトが合計で６個もあるため、プライマー設計が難しいという問題もある。一方、SmartAmp2法は、ＴＰとフォールディングプライマー（ＦＰ）を使用する方法であるため、ＬＡＭＰ法のような前述の問題がない。図１２に、SmartAmp2法の例を示す。同図に示すように、SmartAmp2法では、一方のプライマーとしてＴＰを使用し、他方のプライマーとしてＦＰを使用する。同図に示すように、ＦＰは、標的核酸配列の配列（Ｂ）に相補的な配列（Ｂ´）を３´側に有し、５´側には、相互に相補的な配列Ｆ－Ｆ´を一本鎖上に含む折返し配列を有する。SmartAmp2法では、ＴＰとＦＰを使用するため、ゲノム認識サイトが三か所であり、かつ、ＦＰは、ターンバックしない。このため、増幅速度が速く、特異性が高いという利点に加え、さらに、プライマー設計が容易で、増幅領域を短くすることができるという利点も持つ。
米国特許第４６８３１９５号明細書 米国特許第４６８３２０２号明細書 米国特許第４８００１５９号明細書 欧州特許出願公開第０３２０３０８号明細書 特公平７－１１４７１８号公報 日本国特許第２６５０１５９号公報 日本国特許第２７１０１５９号公報 米国特許第５８２４５１７号明細書 国際公開第９９／０９２１１号パンフレット 国際公開第９５／２５１８０号パンフレット 国際公開第００／２８０８２号パンフレット 国際公開第０２／１６６３９号パンフレット 日本国特許第３８９７８０５号公報
Trends　in　Biotechnology　10,　pp146-152,　1992
　前述のように、SmartAmp2法は、種々の利点があり、実用性に優れた方法である。しかし、SmartAmp2法は、ＴＰを使用するため、ゲノム認識サイトのさらなる少数化、及び、増幅距離の短縮化においては、限界がある。
　そこで、本発明は、ゲノム認識サイトが少なく、かつ、増幅距離を短くすることが可能な等温増幅方法に使用するプライマーセット及びそれを用いた等温増幅方法並びに核酸配列の変異の検出方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、標的核酸配列の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー及び第二プライマーを含み、前記第一プライマーが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマーが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー及び第二プライマーが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とする。
　本発明の等温増幅方法は、プライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記プライマーセットとして、前記本発明のプライマーセットを用いることを特徴とする。
　本発明の核酸配列の変異の検出方法は、プライマーセットを用いた等温増幅方法により核酸試料中の核酸配列における変異を検出する方法であって、前記プライマーセットとして、前記本発明のプライマーセットを用い、前記プライマーセットが、前記変異を有する核酸配列又は前記変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、前記変異に係るヌクレオチド残基が、第一プライマーの相補配列（Ａ）又は第二プライマーの相補配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットであり、前記核酸試料の存在下、前記プライマーセットによる等温増幅反応を行うことを特徴とする。
　本発明のプライマーセットでは、ゲノムの認識サイトは二つであり、しかも、ＴＰを用いないため、プライマー設計が容易であり、かつ、増幅領域配列を短くすることができる。このため、本発明のプライマーセットを用いれば、従来の方法では増幅できなかったマイクロＲＮＡ等のような短い配列であっても増幅可能となる。このように、本発明は、本発明者等が開発したSmartAmp2とは全く異なるプライマーセットおよび等温増幅方法を提供する。
図１は、本発明のプライマーセットの一例を示す図である。 図２は、本発明のプライマーセットのその他の例を示す図である。 図３は、本発明のプライマーセットのさらにその他の例を示す図である。 図４は、本発明のプライマーセットの増幅反応の一例を示す模式図である。 図５Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構の一例を示す模式図である。 図５Ｂは、図５Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。 図６は、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応の反応機構の一例を示す模式図である。 図７Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のその他の例を示す模式図である。 図７Ｂは、図７Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。 図８Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のさらにその他の例を示す模式図である。 図８Ｂは、図８Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。 図９Ａは、本発明の核酸の合成方法における反応機構のさらにその他の例を示す模式図である。 図９Ｂは、図９Ａに続く反応工程における反応機構の一例を示す模式図である。 図９Ｃは、図９Ａに続く反応工程における反応機構のその他の例を示す模式図である。 図１０は、本発明のプライマーセットにおける、第一プライマーの一例を示す図である。 図１１は、ＬＡＭＰ法の例を示す図である。 図１２は、SmartAmp2法の例を示す図である。 図１３は、実施例１のプライマーセット（Forwardプライマー１およびReverseプライマー１）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図１４は、図１３で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図１５は、実施例１のプライマーセット（Forwardプライマー２およびReverseプライマー２）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図１６は、図１５で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図１７は、実施例２のプライマーセット（Forwardプライマー３およびReverseプライマー３）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図１８は、図１７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図１９は、実施例３のプライマーセット（Forwardプライマー４およびReverseプライマー４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２０は、実施例３のBoostプライマー1のみを用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２１は、実施例３のBoostプライマー２のみを用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２２は、実施例３のBoostプライマー１および２を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２３は、図１９～２２で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図２４は、実施例４のプライマーセット（Forwardプライマー５およびReverseプライマー５）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２５は、図２４で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図２６は、実施例４のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。 図２７は、実施例５のプライマーセット（Forwardプライマー６およびReverseプライマー６）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図２８は、図２７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図２９は、実施例５のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。 図３０は、実施例６のプライマーセット（Forwardプライマー７およびReverseプライマー７）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図３１は、図３０で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図３２は、実施例７のプライマーセット（Forwardプライマー８およびReverseプライマー６）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図３３は、図３２で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図３４は、実施例８のプライマーセット（Forwardプライマー５およびReverseプライマー８）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示すグラフである。 図３５は、図３４で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。 図３６は、実施例８のプライマーセットの増幅反応を示す模式図である。
　前記第一プライマー及び第二プライマーは、前述のとおり、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含む。前記２つの配列（Ｃ）が「実質的に同一」とは、前記２つの配列（Ｃ）が、それぞれ、他方のプライマーの相補的配列にハイブリダイズすることが可能であることをいう。具体的には、例えば、前記２つの配列（Ｃ）は、互いに完全に同一の配列（フルマッチ）でも良いし、一部の塩基が異なっている配列（ミスマッチ）であっても良い。前記ミスマッチにおいては、例えば、２つの配列（Ｃ）のうち一方が、他方の配列（Ｃ）に対する塩基の置換、挿入及び欠失の少なくとも一つにより生じる配列であっても良い。前記２つの配列（Ｃ）において、置換、挿入又は欠失が生じている塩基の数は、前記２つの配列（Ｃ）の塩基数の合計に対し、１０分の２以下であることが好ましく、１０分の１以下であることがより好ましい。また、前記２つの配列（Ｃ）が、完全に同一である（すなわち、置換、挿入又は欠失が生じている塩基の数がゼロである）ことが特に好ましい。
　本発明のプライマーセットは、前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含むという態様であってもよい。
　本発明のプライマーセットは、前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含み、前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含み、前記配列（Ｄ－Ｄ´）及び前記配列（Ｅ－Ｅ´）が、互いに異なる配列であるという態様であってもよい。
　本発明のプライマーセットにおいて、さらに、第三プライマーを含み、前記第三プライマーは、前記標的核酸配列、前記標的核酸配列の相補配列、又は、前記第一プライマーの伸長鎖若しくは前記第二プライマーの伸長鎖にハイブリダイズし、かつ、前記第三プライマーのハイブリダイゼーションが、前記第一プライマー及び第二プライマーと競合しないという態様であってもよい。
　本発明の別の側面は、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する第一の核酸の合成方法であって、下記の（Ａ１）～（Ａ６）の各工程を含むことを特徴とする第一の核酸の合成方法であってもよい。
 
（Ａ１）　３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
 
（Ａ２）　前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
 
（Ａ３）　前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
 
（Ａ４）　前記（Ａ３）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
 
（Ａ５）　前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
 
（Ａ６）　前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
　本発明の第一の核酸の合成方法において、（Ａ３）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返してもよい。
　本発明の第一の核酸の合成方法において、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、本発明のプライマーセットであって、前記第一プライマーにのみ、前記配列（Ｃ）の５´側に前記折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む前記第一プライマーであってもよい。
　本発明の第一の核酸の合成方法は、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、さらに、前記５´側ステムループ配列の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ３）工程に代えて、下記（Ａ３－２）工程を含んでいてもよい。
 
（Ａ３－２）　前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端に連結した前記折り返し配列を介することなく、直接、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
　本発明の第一の核酸の合成方法において、（Ａ３－２）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返してもよい。
　本発明の第一の核酸の合成方法が、前記（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ３－２）工程を含む場合、前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む前記第一プライマーと、前記折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含む前記第二プライマーとを含む本発明のプライマーセットを用いた等温増幅法で形成された一本鎖鋳型核酸であり、前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記本発明のプライマーセットの第一プライマー又は第二プライマーであってもよい。
　また、本発明のさらに別の側面は、核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、本発明の第一の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする第一の核酸の増幅方法であってもよい。
　また、本発明のさらに別の側面は、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する第二の核酸の合成方法であって、下記の（Ｂ１）～（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び下記の（Ｃ１）～（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含むことを特徴とする第二の核酸の合成方法であってもよい。
 
（Ｂ１）　３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する工程。
 
（Ｂ２）　前記（Ｂ１）の二つの二重鎖の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
 
（Ｂ３）　前記工程（Ｂ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
 
（Ｃ１）　３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を一つ提供する工程。
 
（Ｃ２）　前記（Ｃ１）の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
 
（Ｃ３）　前記工程（Ｃ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
　前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖は、本発明のプライマーセットの前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であってもよい。または、前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖は、本発明のプライマーセットの前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含み、前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含み、前記配列（Ｄ－Ｄ´）及び前記配列（Ｅ－Ｅ´）が、互いに異なる配列であるプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であってもよい。
　また、本発明のさらに別の側面は、核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、本発明の第二の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする第二の核酸の増幅方法であってもよい。
　次に、本発明について、例を挙げて詳細に説明する。
　本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または前記配列を有する核酸をも意味する。
　本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、例えば、本発明によるプライマーとその相補鎖との二本鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J.　Sambrook,　E.　F.　Frisch,　T.　Maniatis;　Molecular　Cloning　2nd　edition,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory　(1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行うと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead　Institute　for　Biomedical　Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
　図１に、本発明のプライマーセットの一例を示す。同図に示すように、本例のプライマーセットは、標的核酸配列４の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、前記プライマーセットが、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒを含み、前記第一プライマー１Ｆが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、前記第二プライマー１Ｒが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列４の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、さらに、前記第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒが、それぞれの５´側に、互いに同一の配列（Ｃ）を含む。
　本例のプライマーセットの増幅反応の一例の模式図を図４に示す。同図において、図１と同一部分には同一符号を付している。
　図４（ａ）に示すように、第一プライマー１Ｆ及び第二プライマー１Ｒは、標的核酸配列４にハイブリダイズして伸長反応が生じる。すると、同図（ｂ）に示すように、第一プライマーの伸長鎖に、第二プライマーがハイブリダイズして伸長することにより、又は、第二プライマーの伸長鎖に、第一プライマーがハイブリダイズして伸長することにより、二本鎖の中間体が形成される。同図（ｃ）及び（ｃ´）に示すように、二本鎖の中間体は、動的平衡反応により一本鎖になった際に、分子内のハイブリダイズにより、ステムループ構造をとる。そして、ステムループ構造の一本鎖の中間体のループに、第一プライマー又は第二プライマーがハイブリダイズして伸長鎖を形成することにより、同図（ｄ）及び（ｄ´）で示す二本鎖の中間体が形成される。同図（ｄ）及び（ｄ´）の二本鎖中間体は、同図（ｂ）の二本鎖の中間体と同じものであるため、再度、動的平衡反応により、ステムループ構造の一本鎖の中間体となる。これらの一連のサイクルにより、標的核酸配列が増幅される。
　本発明のプライマーセットの第一プライマー及び第二プライマーにおいて、標的核酸配列とハイブリダイズする配列（Ａ´）及び（Ｂ´）の塩基数は、特に制限されず、例えば、３～１００塩基、好ましくは、１０～６０塩基、より好ましくは、１５～５０塩基である。また、本発明のプライマーセットの第一プライマー及び第二プライマーの同一配列（Ｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、３～１００塩基、好ましくは、１０～６０塩基、より好ましくは、１５～５０塩基である。
　図２に、本発明のプライマーセットにおける前記第一プライマー２Ｆにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む例を示す。
　本発明において、折返し配列（Ｄ－Ｄ´）の全長は特に制限されず、例えば、３～１００塩基であり、好ましくは、４～６０塩基であり、より好ましくは５～５０塩基である。折返し配列（Ｄ－Ｄ´）の互いに相補的な配列のいずれか一つの塩基数は、特に制限されず、例えば、１～５０塩基であり、好ましくは１～３０塩基であり、より好ましくは、１～２０塩基である。折返し配列（Ｄ－Ｄ´）の互いに相補的な配列の間には、介在配列が存在してもよい。前記介在配列の塩基数は、例えば、１～５０塩基であり、好ましくは、１～２０であり、より好ましくは１～１０である。また、本発明において、折返し配列の一部は、第一プライマー及び第二プライマーの同一配列（Ｃ）の一部を形成していてもよい。これらの折返し配列（Ｄ－Ｄ´）の条件は、折返し配列（Ｄ－Ｄ´）と異なる折返し配列（Ｅ－Ｅ´）にも適用できる。
　図３に、前記第一プライマー３Ｆにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含み、前記第二プライマー３Ｒにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含み、記配列（Ｄ－Ｄ´）及び前記配列（Ｅ－Ｅ´）が、互いに異なる配列であるという態様を示す。
　次に、本発明の核酸の合成方法について、例を挙げて詳細に説明する。
　後述の実施例で示すように、本発明の核酸の合成方法では、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する。この、本発明の核酸の合成方法の反応機構としては、例えば、後述の図５Ａ～図７Ｂで示す第一の合成反応と、後述の図８Ａ～図９Ｃで示す第二の合成反応とがある。前記第一の合成反応は、前記工程（Ａ１）～（Ａ６）を含み、又は、前述のとおり、前記（Ａ３）工程に代えて、前記（Ａ３－２）工程を含んでいてもよい。前記第二の合成反応は、前記（Ｂ１）～（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び前記（Ｃ１）～（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含む。ただし、本発明のプライマーセットを用いた増幅反応は、これら第一の合成反応及び第二の合成反応以外の合成反応を含んでいても良い。また、本発明のプライマーセットを用いた増幅反応は、前記第一の合成反応及び第二の合成反応の少なくとも一方を含むことが好ましいが、前記第一の合成反応及び第二の合成反応を含んでいなくても良い。
　まず、前記第一の合成反応は、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応である。以下、図５Ａ～図７Ｂを用いて、前記第一の合成反応の例について説明する。
　図５Ａ及び５Ｂに、前記第一の合成反応の一例を示す。この反応は、片方のプライマーのみが折り返し配列を含む、図２と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む第一プライマー２Ｆと、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒとを含む。なお、図５Ａ及び５Ｂにおいて、図２と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
　まず、図５Ａ（ａ）～（ｇ）に示すように、Ω中間体を提供する（（Ａ１）工程）。このΩ中間体は、図５Ａ（ｇ）に示すように、３´末端を含む３´側ステム配列（Ｃ´）と、５´末端を含む５´側ステム配列（Ｃ）とが、ループ配列（Ａ－Ｂ´）を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸の前記３´側ステム（Ｃ´）の３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ´）及び（Ｄ）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）が連結した一本鎖鋳型核酸である。
　前記（Ａ１）工程（図５Ａ（ａ）～（ｇ））について、具体的に説明する。すなわち、まず、図５Ａ（ａ）に示すように、第一プライマー２Ｆが標的核酸配列の配列（Ａ）にハイブリダイズする。さらに、同図（ｂ）に示すように、第一プライマー２Ｆが伸長することにより、第１鎖の伸長が起こる。次に、同図（ｃ）に示すように、第一プライマー２Ｆの伸長鎖は、その配列（Ａ´）が、ゆらぎによって標的核酸配列の配列（Ａ）から遊離し、第一プライマー２Ｆと同一配列を有するプライマーが、前記標的核酸配列の配列（Ａ）に鎖置換ハイブリダイゼーション（SDH）し、さらに伸長反応することで、前記第一プライマー２Ｆの伸長鎖（第１鎖）が遊離する。
　次に、同図（ｄ）及び（ｅ）に示すように、遊離した前記第１鎖への、第二プライマー２Ｒのハイブリダイズ及び伸長反応が起こることにより、第二プライマー２Ｒの伸長鎖（第２鎖）が形成される。前記第２鎖は、同図（ｅ）に示すように、第一プライマーの配列（Ａ´－Ｃ－Ｄ－Ｄ´）に相補的な配列（Ｄ－Ｄ´－Ｃ´－Ａ）を含む。さらに、同図（ｆ）に示すように、第二プライマー２Ｒの伸長鎖は、その配列（Ｂ´）が、ゆらぎによって標的核酸配列の配列（Ｂ）から遊離し、第二プライマー２Ｒと同一の配列を有するプライマーが、前記第１鎖の配列（Ｂ）に鎖置換ハイブリダイゼーション（SDH）し、さらに伸長反応することで、前記第２鎖が遊離する。そして、同図（ｇ）に示すように、遊離した前記第２鎖の配列（Ｃ）及び（Ｃ´）が自己ハイブリダイズし、Ω状構造の一本鎖鋳型核酸が形成される。これが、前述のΩ中間体である。なお、図５Ａ（ｃ）及び（ｆ）のプライマー伸長鎖の遊離は、アウタープライマー（ＯＰ）を用いて実施してもよい。
　次に、図５Ａ（ｈ）～図５Ｂ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー２Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる（（Ａ２）工程）。この伸長反応が、前記５´側ステム配列（Ｃ）まで達すると、図５Ｂ（ｉ）に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）を鋳型とした伸長反応が、鎖置換反応を伴って起こる。なお、ここで、前記５´側ステム配列（Ｃ）（Tail配列）の５´末端部分と、前記折り返し（hook）配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端とから形成されるニックで伸長が停止する場合は、１倍体のアンプリコン（前記一本鎖鋳型核酸）が形成される。以下、前記ニックで伸長が停止せずに、ニック乗り越え型伸長に基づく伸長鎖交換反応が起こる場合について説明する。
　すなわち、まず、図５Ｂ（ｉ）の点線矢印に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端から前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端にかけて連続して続行する（（Ａ３）工程）。そして、同図（ｊ）～（ｌ）に示すように、同図（ｉ）（前記（Ａ３）工程）の前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、図５Ａ（ｈ）～図５Ｂ（ｉ）（前記（Ａ２）工程）で形成された一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする（（Ａ４）工程）。そして、前記（Ａ４）工程のプライマー伸長反応を、図５Ｂ（ｌ）に示す前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止する（（Ａ５）工程）。これにより、前記プライマー伸長鎖は、アンプリコン配列（前記一本鎖鋳型核酸配列）が二つ順方向に連結された（タンデムな）２倍体ｌａとなる。さらに、図５Ｂ（ｍ）に示すように、前記（Ａ４）工程で一本鎖になったプライマー伸長鎖（タンデムな２倍体ｌａ）を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）の前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端を伸長させる（（Ａ６）工程）。この伸長反応により、前記プライマー伸長鎖（タンデムな２倍体ｌａ）に相補的な鎖が形成され、前記プライマー伸長鎖及びそれに相補的な鎖からなる完全な二本鎖ｍａが形成される。
　なお、図５Ａ及び５Ｂでは、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を１回のみ行うことで、タンデムな２倍体を形成する例を示した。これに対し、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返す以外は同様にすることで、３倍体以上のタンデムな鎖を形成することもできる。すなわち、前記（Ａ４）工程後、前記（Ａ３）工程に戻り、前記（Ａ３）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返したところで前記（Ａ５）工程及び前記（Ａ６）工程に進み、３倍体以上のタンデムな鎖を形成しても良い。
　図６に、ニック乗り換え反応が起こる場合と起こらない場合を示す。まず、同図（ａ）に示すように、Ω中間体において、５´側ステムの５´末端と、折り返し配列の３´末端が接近してニックを形成している場合は、ニックを乗り越えてプライマー伸長反応がおこる。これに対し、同図（ｂ）に示すように、Ω中間体において、５´側ステムの５´末端と、折り返し配列の３´末端が離れてニックを形成していない場合は、プライマーの伸長反応は、５´側ステムの５´末端で停止する。
　次に、図７Ａ及び７Ｂに、前記第一の合成反応の別の例を示す。この反応は、両方のプライマーが折り返し配列を含む、図３と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む第一プライマー３Ｆと、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含む第二プライマー３Ｒとを含む。なお、図７Ａ及び７Ｂにおいて、図３と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
　まず、図７Ａ（ａ）～（ｇ）に示すように、Ω中間体を提供する（（Ａ１）工程）。このΩ中間体は、図７Ａ（ｇ）に示すように、３´末端を含む３´側ステム配列（Ｃ´）と、５´末端を含む５´側ステム配列（Ｃ）とが、ループ配列（Ａ－Ｂ´）を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸の前記３´側ステム（Ｃ´）の３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）が連結した一本鎖鋳型核酸である。ただし、図７Ａ（ｇ）に示すΩ中間体は、さらに、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｅ）及び（Ｅ´）を同一鎖状に含む折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）が連結している点が、図５Ａ（ｇ）のΩ中間体と異なる。前記折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含むこと以外は、図５Ａ（ｇ）のΩ中間体と同様である。
　前記（Ａ１）工程（図７Ａ（ａ）～（ｇ））において、図７Ａ（ａ）～（ｃ）（第一プライマーの鋳型核酸へのハイブリダイズ、伸長反応、及び、前記第一プライマーの伸長鎖（第１鎖）の遊離）は、図５Ａ（ａ）～（ｃ）と同じである。図７Ａの第一プライマー３Ｆの配列は、図５Ａの第一プライマー２Ｆと同一である。
　次に、図７Ａ（ｄ）～（ｇ）に示すように、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒに代えて折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含む第二プライマー３Ｒを用いること以外は、図５Ａ（ｄ）～（ｇ）と同様にして、図７Ａ（ｇ）に示す一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）を形成する。
　次に、図７Ａ（ｈ）～図７Ｂ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー３Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる（（Ａ２）工程）。この伸長反応が、前記５´側ステム配列（Ｃ）まで達すると、図７Ｂ（ｉ）に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）を鋳型とした伸長反応が、鎖置換反応を伴って起こる。この後、同図（ｊ´）に示すように、前記Ω中間体の折り返し配列（Ｅ´－Ｅ）の５´末端までそのまま伸長反応が進む場合は、完全相補なアンプリコン２本鎖DNAが生成される（同図（ｋ´））。
　一方、タンデムなアンプリコン配列を形成する場合は、図７Ｂ（ｉ）の点線矢印に示すように、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に連結した前記折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を介することなく、直接、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端から前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端にかけて連続して続行する（（Ａ３－２）工程、Ｎｉｃｋ乗り換え工程）。なお、前記Ｎｉｃｋ乗り換え工程においては、例えば、前記５´側ステム配列の途中から折り返し配列の３´末端にかけてプライマー伸長反応が進んでもよいし、その他、５´側ステムの５´末端に連結している折り返し配列の途中又は前記折り返し配列の５´末端から前記３´側ステム配列に連結している折り返し配列の３´末端にかけてプライマー伸長反応が進んでもよい。そして、同図（ｊ）～（ｌ）に示すように、同図（ｉ）（前記（Ａ３－２）工程）の前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、図７Ａ（ｈ）～図７Ｂ（ｉ）（前記（Ａ２）工程）で形成された一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする（（Ａ４）工程）。そして、前記（Ａ４）工程のプライマー伸長反応を、図７Ｂ（ｌ）に示す前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止する（（Ａ５）工程）。ただし、前記プライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止するが、伸長反応自体は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端を超えて前記Ω中間体の折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）の５´末端まで進むことになる。これにより、前記プライマー伸長鎖は、アンプリコン配列が二つ順方向に連結された（タンデムな）２倍体となる（図７Ｂ（ｍ）又は（ｎ）の上側の鎖）。さらに、図７Ｂ（ｍ）及び（ｎ）に示すように、前記（Ａ４）工程で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸（Ω中間体）の前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端を伸長させる（（Ａ６）工程）。この伸長反応により、図７Ｂ（ｎ）に示すように、前記プライマー伸長鎖に相補的な鎖（同図の下側の鎖）が形成され、前記プライマー伸長鎖及びそれに相補的な鎖からなる完全な二本鎖が形成される。なお、５´側ステムの５´末端から折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端への連続したプライマー伸長反応は、前述のニック乗り換え反応と同様のメカニズムで起きる。
　なお、図７Ａ及び７Ｂでは、前記（Ａ３－２）工程及び前記（Ａ４）工程を１回のみ行うことで、タンデムな２倍体を形成する例を示した。これに対し、前記（Ａ３－２）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返す以外は同様にすることで、３倍体以上のタンデムな鎖を形成することもできる。すなわち、前記（Ａ４）工程後、前記（Ａ３－２）工程に戻り、前記（Ａ３－２）工程及び前記（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返したところで前記（Ａ５）工程及び前記（Ａ６）工程に進み、３倍体以上のタンデムな鎖を形成しても良い。
　次に、図８Ａ～９Ｃを用いて、前記第二の合成反応について説明する。
　図８Ａ及び８Ｂに、前記第二の合成反応の一例を示す。この反応は、片方のプライマーのみが折り返し配列を含む、図２と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む第一プライマー２Ｆと、折り返し配列を含まない第二プライマー２Ｒとを含む。なお、図８Ａ及び８Ｂにおいて、図２と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
　まず、図８Ａ（ａ）～（ｉ）により形成した相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）を、図８Ｂ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図８Ｂ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。図８Ａ（ａ）～（ｇ）（Ω中間体の形成）までは、図５Ａ（ａ）～（ｇ）（前記第一の合成反応）と全く同じである。次に、図８Ａ（ｈ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー２Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる。この伸長反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端で停止し、同図（ｉ）に示すように、前記Ω中間体と前記プライマーの伸長鎖とからなる相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）が形成される。このアンプリコンは、図示のとおり、３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む一本鎖核酸（図８Ａ（ｉ）の下側の鎖）と、前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸（同図の上側の鎖）とからなる二重鎖である。なお、第二のプライマー２Ｒが反応起点となった場合にも、同様の反応過程でアンプリコンが形成される。
　図８Ａ（ｉ）のアンプリコン（図８Ｂ（ｉ）と同一）からは、図８Ｂに示すように、二通りの反応経路で、前記Ω中間体又はその相補鎖が順方向に連結された（タンデムな）増幅産物が形成される。一方の反応経路は、図８Ｂ（ｊ）～（ｌ）に示したように、前記二本鎖アンプリコン（図８Ｂ（ｉ））の分子内で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。もう一方の反応経路は、図８Ｂ（ｊ´）～（ｌ´）に示したように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。すなわち、まず、前記アンプリコンを、図８Ｂ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図８Ｂ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。つぎに、前記二本鎖アンプリコンが、同図（ｊ）～（ｋ）に示すように、前記アンプリコンの分子内で、又は、同図（ｊ´）～（ｋ´）に示すように、２分子間の前記アンプリコンの間で、５´末端配列（Ｃ）が他の鎖の配列（Ｃ´）にハイブリダイズする（Tail置換）。このTail置換が起きた際、同図（ｌ）および（ｌ´）に示すように、それぞれの末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の折りたたみが起きる。これにより、３´末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）における配列Ｄの３´末端から、逆側の鎖を鋳型とする組み換え型伸長が起きる。この伸長反応により、新しく合成された伸長鎖が生成する（同図（ｍ））。図８Ｂ（ｌ）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｃ１）の二重鎖（図８Ｂ（ｊ））の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｃ２）工程）に該当する。図８Ｂ（ｌ´）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｂ１）の二つの二重鎖（図８Ｂ（ｊ´））の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｂ２）工程）に該当する。なお、これらの伸長反応は、前記３´末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）から自身の配列を鋳型にするスイッチバック伸長ではない。
　さらに、同図（ｎ）に示すように、新しく合成された伸長鎖の相補鎖の３´末端部位から、逆側の鎖を鋳型とする伸長反応が起きる。その結果、前記アンプリコンが順方向に連結した（タンデムな）二本鎖が形成される（同図（ｏ））。この図８Ｂ（ｎ）から（ｏ）にかけての反応は、前記工程（Ｂ２）又は（Ｃ２）の部分的二重鎖（同図（ｍ））において、前記相補的な一本鎖核酸（同図（ｍ）の上側の鎖）の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応（同図（ｎ））により、完全二重鎖（同図（ｏ））を形成する工程（（Ｂ３）工程又は（Ｃ３）工程）に該当する。
　次に、図９Ａ～９Ｃに、前記第二の合成反応の別の例を示す。この反応は、両方のプライマーが折り返し配列を含む、図３と同様のプライマーセットを用いた反応である。すなわち、前記プライマーセットは、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む第一プライマー３Ｆと、配列（Ｃ）の５´側に折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含む。なお、図９Ａ～９Ｃにおいて、図３と同様の構成要素は、同一の符号で示している。
　まず、図９Ａ（ａ）～（ｉ）により形成した相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）を、図９Ｃ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図９Ｃ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。図９Ａ（ａ）～（ｇ）（Ω中間体の形成）までは、図７Ａ（ａ）～（ｇ）（前記第一の合成反応）と全く同じである。次に、同図（ｈ）に示すように、前記Ω中間体（一本鎖鋳型核酸）の前記ループにおける配列（Ａ）に、第一プライマー３Ｆと同一の配列を有するプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを、前記Ω中間体の５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に向かって伸長させる。この伸長反応は、前記５´側ステム配列（Ｃ）の５´末端に連結された折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）の５´末端で停止し、図９Ａ（ｉ）に示すように、前記Ω中間体と前記プライマーの伸長鎖とからなる相補的な二本鎖（１倍体のアンプリコン）が形成される。このアンプリコンは、図示のとおり、３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列（Ｄ）及び（Ｄ´）を同一鎖上に含む折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む一本鎖核酸（図９Ａ（ｉ）の下側の鎖）と、前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸（同図の上側の鎖）とからなる二重鎖である。なお、第二のプライマー３Ｒが反応起点となった場合にも、同様の反応過程でアンプリコンが形成される。
　図９Ａ（ｉ）以降は、図９Ｂ又は９Ｃのいずれかで示される二通りの反応経路が考えられる。一方の反応経路は、図９Ｂに示すように、類似したパリンドローム配列を有する折り返しを用いた経路である。具体的には、図９Ａ（ｉ）の二本鎖アンプリコンの折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）及び（Ｅ－Ｅ´）が、類似したパリンドローム配列である場合の経路である。まず、追加図９Ｂ（ｐ）に示すように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で、前記類似したパリンドローム配列を有するヘテロな折り返し（Ｄ－Ｄ´）及び（Ｅ－Ｅ´）が、互いにハイブリダイズする。このようにして３´末端を有する折り返し同士が互いにハイブリダイズした場合のみ、次の段階（同図（ｑ））に進む。次に、同図（ｑ）～（ｒ）に示すように、互いにハイブリダイズした折り返し配列の３´末端を起点に鎖置換伸長反応が起きる。これにより、同図（ｒ）に示すように、鎖置換伸長反応により順方向に前記アンプリコンが連結された（タンデムな）二本鎖核酸が生じる。このときに、前記鎖置換伸長反応により遊離した一本鎖ＤＮＡはΩ中間体となる。
　他方の反応経路は、図９Ｃに示すように、前記二本鎖アンプリコンの配列（Ｃ）及びそれに相補的な配列（Ｃ´）（Tail配列）間で組み換えハイブリダイゼーションが生じる経路である。この反応経路は、同図に示すように、さらに二通りの反応経路に分かれる。すなわち、一方の反応経路は、図９Ｃ（ｊ）～（ｌ）に示したように、図９Ｃ（ｉ）で表される前記二本鎖アンプリコン（図９Ａ（ｉ）と同一）の分子内で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。もう一方の反応経路は、図９Ｃ（ｊ´）～（ｌ´）に示したように、二分子の前記二本鎖アンプリコン間で鎖置換ハイブリダイゼーションが起こる経路である。すなわち、まず、前記アンプリコンを、図９Ｃ（ｊ）のように一つ提供するか（（Ｃ１）工程）、または、図９Ｃ（ｊ´）のように、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する（（Ｂ１）工程）。つぎに、前記二本鎖アンプリコンが、同図（ｊ）～（ｋ）に示すように、前記アンプリコンの分子内で、又は、同図（ｊ´）～（ｋ´）に示すように、２分子間の前記アンプリコンの間で、配列（Ｃ）が他の鎖の配列（Ｃ´）にハイブリダイズする（Tail置換）。このTail置換が起きた際、同図（ｌ）および（ｌ´）に示すように、それぞれの末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）又は（Ｅ－Ｅ´）の折りたたみが起きる。これにより、３´末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）における配列Ｄ又は（Ｅ－Ｅ´）における配列Ｅの３´末端から、逆側の鎖を鋳型とする組み換え型伸長が起きる。この伸長反応により、新しく合成された伸長鎖が生成する（同図（ｍ））。図９Ｃ（ｌ）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｃ１）の二重鎖（図９Ｃ（ｊ））の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｃ２）工程）に該当する。図９Ｃ（ｌ´）から同図（ｍ）にかけての反応は、前記（Ｂ１）の二つの二重鎖（図９Ｃ（ｊ´））の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖（同図（ｍ））を形成する工程（（Ｂ２）工程）に該当する。なお、これらの伸長反応は、前記３´末端の折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）又は（Ｅ－Ｅ´）から自身の配列を鋳型にするスイッチバック伸長ではない。
　さらに、同図（ｎ）に示すように、遊離した折り返し配列（Ｅ－Ｅ´）の３´折り返し部位から、逆側の鎖を鋳型とする組換え型伸長反応が起きる。その結果、前記アンプリコンの連結部分でヘテロな折り返し同士がハンマーヘッド構造を成した増幅産物が形成される（同図（ｏ））。この図９Ｂ（ｎ）から（ｏ）にかけての反応は、前記工程（Ｂ２）又は（Ｃ２）の部分的二重鎖（同図（ｍ））において、前記相補的な一本鎖核酸（同図（ｍ）の上側の鎖）の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応（同図（ｎ））により、完全二重鎖（同図（ｏ））を形成する工程（（Ｂ３）工程又は（Ｃ３）工程）に該当する。
　以上、本発明の核酸の合成方法における第一及び第二の合成反応について説明した。ただし、本発明のプライマーセットを用いた等温増幅方法は、これらの本発明の合成反応を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
　本発明のプライマーセットにおいて、図１０に示すように、第一プライマーは、配列（Ａ´）と配列（Ｃ）との間に介在配列（Ｇ）を持っていてもよい。介在配列（Ｇ）の長さは、例えば、１～３０塩基、好ましくは、１～２０塩基、より好ましくは、１～１０塩基である。また、本発明のプライマーセットにおいて、図１０に示すように、第一プライマーは、配列（Ｃ）と折返し配列（Ｄ－Ｄ´）との間に介在配列（Ｈ）を持っていてもよい。介在配列（Ｈ）の長さは、例えば、１～３０塩基、好ましくは、１～２０塩基、より好ましくは、１～１０塩基である。
　本発明によるプライマーセットは、第一プライマーおよび第二プライマー以外に、第三プライマーを含むものとすることができる。第三プライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
　本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
　第一プライマーおよび第二プライマーにより標的核酸が増幅された場合には、例えば、第三プライマーは、前記標的核酸の増幅による増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ－リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
　第三プライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三プライマーを同時に用いてもよい。これら第三プライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三プライマーの鎖長は、好ましくは２～１００塩基、より好ましくは５～５０塩基、さらに好ましくは７～３０塩基である。
　第三プライマーは、第一プライマーおよび第二プライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三プライマーは、第一プライマーおよび第二プライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三プライマーの増幅反応液への添加量は、第一プライマーおよび第二プライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
　第三プライマーとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
　本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α－チオ－リボヌクレオチド）等がある。
　また、前記プライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
　本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ－ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied　Biosystem　Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
　核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよく、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料もしくはウイルス由来試料から調製することができる。
　鋳型核酸または核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
　より具体的には、前記鋳型核酸または前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（denaturing）を行って一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
　前記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ　ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ－２　ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ　ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
　核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行うこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
　核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand　displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus　stearothermophilus、本明細書において「Ｂ.ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus　caldotenax、本明細書において「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent　DNAポリメラーゼ、Vent　(Exo-)　DNAポリメラーゼ、DeepVent　DNAポリメラーゼ、DeepVent　(Exo-)　DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ－２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq　DNAポリメラーゼ、Pfu　DNAポリメラーゼ、Pfu　turbo　DNAポリメラーゼ、KOD　DNAポリメラーゼ、9°Nm　DNAポリメラーゼ、Therminater　DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
　さらに、前記核酸増幅反応においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行うことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
　核酸増幅反応において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl　sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
　核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、二本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
　さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
　さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
　本発明によるプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、等温で実施可能である。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
　一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃～約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃～約６５℃とする。
　前記の核酸増幅反応においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
　前記の核酸増幅反応においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸（標的核酸配列）とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、isoG，isoC（Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　92,　6329-6333,　1995）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、前記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Y188L/E478Q変異型ＨＩＶ　Ｉ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°N　DNAポリメラーゼ、HotTub　DNAポリメラーゼ等が好適である（Michael　Sismour　1　et　al.,　Biochemistry　42,　No.28,　8598,　2003／米国特許第６６１７１０６号明細書、Michael　J.　Lutz　et　al.,　Bioorganic　&　Medical　Chemistry　letters　8,　1149-1152,　1998等）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロースなど、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
　本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明による核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome　Black　T、Hydroxy　Naphthol　Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
　本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、増幅産物の生成に起因する固相担体の凝集を観察することによって検出することもできる。このような検出を行う場合には、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとされる。固相担体または固相担体と結合可能な部位は、プライマーの３’末端部、５’末端部、中央領域など、いかなる部分に導入されたものであってもよいが、好ましくは５’末端部に導入されたものとされる。あるいは、核酸増幅反応において用いられる基質を、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとしてもよい。
　本発明に用いられる固相担体としては、核酸増幅反応に用いられる反応溶液に不溶性の担体、または増幅の前後において液相から固相（ゲル相）もしくは固相（ゲル相）から液相に性状が変化する相転移性担体であれば、いずれも使用することが可能である。好ましい固相担体としては、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイド、磁性粒子等が挙げられ、さらには、溶媒不溶性有機高分子担体、溶媒不溶性無機高分子担体、溶媒可溶性高分子担体、ゲル高分子担体等が挙げられる。さらに、水不溶性有機高分子としては、例えば、多孔質シリカ、多孔質ガラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体、メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体、ゲル状粒子、染料ゾル等が挙げられる。水不溶性無機高分子としては、例えば、酸化アルミニウム、酸化チタン、セラミック粒子等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。金属コロイドとしては、金コロイド等が挙げられる。磁性粒子としては、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子（特表平４－５０１９５９号公報）、重合性シラン被膜によって覆われた超常磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子（特公平７－６９８６号公報）、有機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子等が挙げられる。磁性化された固相担体は、固体と液体との分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。固相担体の形状としては、粒子、膜、繊維状、フィルター等が挙げられる。固相担体の形状としては粒子が特に好ましく、その表面は多孔質または非多孔質のいずれであってもよい。特に好ましい固相担体としては、合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス、金コロイドなどの金属コロイド粒子、マグネットビーズなどの磁性粒子等が挙げられる。
　プライマーまたは基質の固相担体への固定化は当業者に公知の方法によって行うことができ、物理的な結合または化学的な結合のいずれによる方法であってもよい。プライマーまたは基質の固相担体への固定化は、例えば、一般的にプライマーやプローブなどのオリゴヌクレオチドを標識化しうる物質と、これに結合可能な物質を結合させた固相担体とを組み合わせて行うことができる。このような目的で用いられる物質の組み合わせは、当技術分野において周知のものを用いることができ、例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの組み合わせ、抗原とこれに結合しうる抗体との組み合わせ、リガンドとこれに結合しうるレセプターとの組み合わせ、相互にハイブリダイズする２つの核酸の組み合わせ等が挙げられる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したプライマーまたは基質を、アビジンもしくはストレプトアビジンで表面をコートした固相担体に結合させることにより、プライマーまたは基質を固相担体に固定化することができる。前記抗原としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＤＮＰ等のハプテンが挙げられ、これらと結合しうる抗体としては、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＤＮＰ抗体等の抗体が挙げられる。また、これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。特に、ビオチンとストレプトアビジンとの結合は特異性が高く、結合効率も良好であるため、これらの組み合わせは特に好ましい。ビオチン、ハプテン、リガンド等の標識物質は、いずれも単独で、あるいは必要であれば複数の組み合わせで、公知の手段（特開昭５９－９３０９９号公報、特開昭５９－１４８７９８号公報、および特開昭５９－２０４２００号公報を参照のこと）により、プライマーの５’末端部に導入することができる。
　本発明に用いられる固相担体と結合可能な部位（または基）は、プライマーまたは基質の固相担体への固定化のために用いられる上述の方法に従って選択することができ、従って、固相担体との物理的な結合を可能とするものまたは化学的な結合を可能とするもののいずれであってもよいが、好ましくは特異的結合を可能とするものとされる。このような固相担体と結合可能な部位としては、上述のような、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸、タンパク質などが挙げられ、好ましくはビオチンまたはストレプトアビジンとされ、より好ましくはビオチンとされる。このような部位を含むプライマーまたは基質を用いることにより、核酸増幅反応を行った後に、増幅産物に上記固相担体を結合させることが可能となる。この場合において用いられる固相担体は、必要に応じて、プライマーまたは基質に含まれる前記部位の結合相手を含むものとすることができる。このような結合相手は、プライマーまたは基質に含まれる前記部位との結合が可能な形で存在するものであり、好ましくは固相担体の表面上に存在するものとされ、より好ましくは固相担体の表面上に塗布されたものとされる。
　本発明の一つの実施態様によれば、複数の標的核酸のそれぞれについて本発明によるプライマーセットを用意し、これら複数のプライマーセットを相互に識別可能な形で固相担体に固定化し、これらの固定化プライマーセットを用いて核酸増幅反応が行われる。これにより、複数の標的核酸を同時に増幅し、それぞれについての増幅産物を識別可能な形で検出することが可能となる。増幅産物の検出は、インターカレーターなどを用いて行うことができる。例えば、平面状の固相担体上において、複数のプライマーをそれぞれ特定の位置に固定化しておくことにより、核酸増幅反応および増幅産物の検出の後に、増幅産物が検出された位置によって、増幅された標的核酸を特定することができる。また、このような目的に使用可能な固相担体は、上記の平面状の固相担体のみならず、相互に識別可能なビーズ表面（米国特許第６０４６８０７号明細書および米国特許第６０５７１０７号明細書）、繊維状の担体にそれぞれのプライマーセットを固相化したものを束ねた後に薄片に切断して作製される準平板担体（特開２０００－２４５４６０号公報）等の、当技術分野において公知のものを使用することができる。
　本発明による核酸増幅法によって得られた増幅断片は通常の塩基により構成されるため、増幅後、増幅断片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることも可能である。さらに、前記増幅断片は、ＲＦＬＰのように、制限酵素処理することも可能であり、遺伝子検査の分野においても広く利用することができる。また、前記増幅断片は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むものとして生成させることができ、これにより、増幅断片から直接ＲＮＡを合成することが可能となる。このようにして合成されたＲＮＡは、ＲＮＡプローブ、ｓｉＲＮＡ等として使用することもできる。
　さらに、本発明による核酸増幅法においては、通常のｄＮＴＰの代わりに、ビオチンや蛍光物質で標識された塩基を基質として使用することができ、これにより、ビオチンや蛍光物質で標識されたＤＮＡプローブを調製することも可能である。さらには、それらビオチンや標識物質などの何らかの構造を介して増幅産物の有無を確認することも可能である。
　本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、制限酵素認識部位を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。すなわち、プライマー内の制限酵素認識部位に対応する制限酵素により増幅産物中にニックが生じるため、このニックを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成反応を生じさせることが可能になる。この方法は、基本的には先行技術として記載したＳＤＡ法の原理に基づく。
　また、本発明によるプライマーセットに含まれるプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。この方法は、基本的には先行技術として記載したＮＡＳＢＡ法の原理に基づく。
　さらに、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法またはＳＤＡ法において利用される「アウタープライマー」を含むものとすることができ、これにより、核酸増幅の効率を向上させることが可能となる。アウタープライマーとしては、鋳型核酸上において標的核酸配列の外側に位置する部分に相補鎖合成起点を提供しうるプライマーを用いることができる。
　本発明による核酸増幅法により、ＤＮＡチップに固定するための一本鎖核酸、塩基配列決定のための一本鎖ＤＮＡプローブ、長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマー等を簡便かつ迅速に作製することができる。また、本発明による核酸増幅法により、目的に応じて、標的核酸のセンス配列のみまたはアンチセンス配列のみを選択的に増幅することも可能である。
　本発明による核酸増幅法により調製された一本鎖核酸は、ＤＮＡチップ上に固定するためのＤＮＡ断片として使用することができる。すなわち、本発明による核酸増幅法は、ＤＮＡチップ作製において固定化するためのＤＮＡ鎖を調製する方法にも応用が可能である。また、プライマーの５’末端をあらかじめＤＮＡチップ上に固定しておき、そのチップ上で核酸増幅を行い、ＤＮＡチップを作製することも可能である。また、その核酸増幅を行う前に、あらかじめ増幅産物にハイブリダイズする蛍光標識プローブを反応液に添加しておくことにより、ＤＮＡチップ上で核酸増幅を行いながら、リアルタイムに増幅産物を検出することが可能となる。
　本発明によるプライマーセットを用いた核酸増幅反応を利用して、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を検出（判定）することが可能である。この目的のためには、変異部位が、前記配列（Ａ）または前記配列（Ｂ）に含まれるようにプライマーセットを設計することができ、これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を検出（判定）することが可能となる。
　本発明による変異検出法では、目的とする変異を有する核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が変異の存在を示し、増幅産物の不在または減少が変異の不在を示す。一方で、目的とする変異を有さない核酸配列を標的核酸配列として設計されたプライマーセットを用いる場合には、核酸増幅反応後における増幅産物の存在が変異の不在を示し、増幅産物の不在または減少が変異の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、得られた増幅産物の量が、核酸試料中に標的核酸配列が存在する場合に得られる増幅産物の量に比較して減少していることを意味する。
　本発明において「変異」とは、核酸配列中に対照核酸配列とは異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対）が存在することを意味する。本発明において、「変異」は、塩基の欠失、挿入、付加、置換を含む。また、本発明において「対照核酸」とは、ある特定の塩基配列に関して、標準的な塩基配列、例えば標準的な遺伝子型、であるとされる野生型（wild　type、正常型(normal　type)とも称される。）の配列を有する核酸をいう。これに対し、「被検核酸」とは、本発明による変異検出法において、対照核酸と異なる塩基（変異）を有するか否かを調べる対象となる核酸を意味し、換言すれば、核酸試料中に存在する核酸であって、変異に係る塩基を除いて対照核酸と同一の配列を有するものを意味する。さらに、本発明において「変異に係る塩基」または「変異に係るヌクレオチド残基」とは、核酸中における変異の部位に存在する塩基またはヌクレオチド残基を意味し、従って、対照核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基および変異型の核酸の変異部位に含まれる塩基またはヌクレオチド残基のどちらをも意味する。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において、変異を有することが疑われる患者の遺伝子は被検核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。
　上記の被検核酸および対照核酸は、天然物由来の核酸であっても、人工的に合成された核酸であってもよい。本発明において用いられる「核酸」という用語は、任意の未修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。被検核酸および対照核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡ、またはｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、合成ＲＮＡなどのＲＮＡである。また、本発明において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、便宜的に、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。被検核酸および対照核酸は、試験実施者が自由に選択することができる。さらに、検出を行う際には、これらの核酸が混在していてもよい。
　被検核酸を含む核酸試料は、被検体、例えばヒトまたは非ヒト動物から取得することができる。その場合には、該被検体からの所望の組織、臓器および細胞などのサンプルから当技術分野において公知の方法により核酸を抽出することができ、必要に応じて、抽出の後に核酸断片の大きさおよび精製純度などの条件を適度な状態に調整することもできる。その後、さらに、一般的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅反応を行うことにより、核酸試料中の被検核酸を増幅してもよい。
　被検核酸および対照核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明において用いられる「二本鎖核酸」という用語は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡのいずれをも意味する。二本鎖核酸は、そのまま核酸試料として用いてもよいし、ファージまたはプラスミドなどのベクターで増幅されたものを用いてもよい。
　次に、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、下記の実施例により制限及び限定されない。
（実施例１）
　本実施例では、第一プライマー及び第二プライマーのいずれか一方に折返し配列（Ｄ－Ｄ´）が付加されている場合、及び、第一プライマーに折返し配列（Ｄ－Ｄ´）が付加され、第二プライマーに折返し配列（Ｅ－Ｅ´）が付加されている場合の、二種類のプライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅した。
　容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液に、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー１：配列番号1、又はForwardプライマー２：配列番号２）、およびReverseプライマー（Reverseプライマー１：配列番号３、又はReverseプライマー２：配列番号４）を各2μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　鋳型DNAとして、インフルエンザA(H3N2)のRNAゲノムN2分節のcDNAの部分配列（配列番号５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に２×１０４コピー加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、60分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)　NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。
Influenza　A(H3N2)　N2　segment,　partial　cDNA（配列番号５）
 
401　bp
 
5’-CCAGGAGTCAGAATGCGTTTGTATCAATGGAACTTGTACAGTAGTAATGACTGATGGGAGTGCTTCAGGAAAAGCTGATACTAAAATACTATTCATTGAGGAGGGGAAAATCGTTCATACTAGCACATTGTCAGGAAGTGCTCAGCATGTCGAGGAGTGCTCCTGCTATCCTCGATATCCTGGTGTCAGATGTGTCTGCAGAGACAACTGGAAAGGCTCCAATAGGCCCATCGTAGATATAAACATAAAGGATCATAGCATTGTTTCCAGTTATGTGTGTTCAGGACTTGTTGGAGACACACCCAGAAAAAACGACAGCTCCAGCAGTAGCCATTGTTTGGATCCTAACAATGAAGAAGGTGGTCATGGAGTGAAAGGCTGGGCCTTTGATGATGGAAATG-3’
（結果１：Forwardプライマーのみに折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温反応結果）
　図１３は、Forwardプライマー１（配列番号１）およびReverseプライマー１（配列番号３）を用いた場合の、鋳型DNAを加えたもの（○）と加えないもの（●）それぞれの蛍光増幅曲線（○と●の意味は以下の実施例において同じ）を示す。図示のように、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、図１４は、図１３で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１４に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。
（結果２：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温反応結果）
　図１５は、Forwardプライマー２（配列番号２）およびReverseプライマー２（配列番号４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示す。図１５に示すように、前記結果１と同様に、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、図１６は、図１５で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１６に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが観察された。ただし、図１４におけるバンドパターンと比較すると、バンド周期のパターンが異なっており、前記結果１の場合と異なる増幅パターンを有する等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。
（実施例２）
　本実施例では、第一プライマー及び第二プライマーの双方において、折返し配列（Ｄ－Ｄ´）又は（Ｅ－Ｅ´）と共通配列（Ｃ）との間に、介在配列（Ｈ）を挿入した場合で、標的核酸配列を等温で増幅反応した。また、第一プライマー及び第二プライマーにおいて、介在配列（Ｈ）は異なるようにした。
　プライマー以外の反応組成液は、前述の実施例１と同様にした。すなわち、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液とし、プライマーは、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー３：配列番号６）、およびReverseプライマー（Reverseプライマー３：配列番号７）を各2μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマーにおいて、下線（一重下線）部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列、更に二重下線部は介在配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　また、前述の実施例１と同様に、鋳型DNAとしてインフルエンザA(H3N2)のRNAゲノムN2分節のcDNAの部分配列（配列番号５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に２×１０４コピー加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)　NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。
（結果３：介在配列（Ｈ）を持つプライマーを用いた場合の等温反応結果）
　図１７は、Forwardプライマー３（配列番号６）、およびReverseプライマー３（配列番号７）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示す。図１７に示すように、鋳型DNAを加えたものにおいて、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図１８は、図１７で蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果を示す写真である。図１８に示すように、短鎖から長鎖に渡る周期的な２本ずつのバンドパターンが観察され、等温核酸増幅が反応溶液中で起きていることが明らかとなった。
（実施例３：第三プライマーの効果）
　本実施例では、標的核酸において第一プライマー及び第二プライマーのアニーリング領域間に相補的に設計した第三プライマーが、本発明における等温増幅反応を向上させる効果について示す。
　まず、本実施例で用いた第一プライマー及び第二プライマーの双方は、折返し配列（Ｄ－Ｄ´）又は（Ｅ－Ｅ´）と共通配列（Ｃ）との間に、介在配列（Ｈ）を挿入したものを使用した。プライマー以外の反応組成液は、前述の実施例１と同様にした。すなわち、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液とした。プライマーは、以下に示す配列のForwardプライマー（Forwardプライマー４：配列番号８）を第一プライマー、およびReverseプライマー（Reverseプライマー４：配列番号９）を第二プライマーとして各2μMの濃度で加え、更に第三プライマーとして下記Boostプライマー（Boostプライマー１又は２：配列番号１０又は１１）を０．６６μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。なお、下記各プライマー配列において、下線（一重下線）部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列、更に二重下線部は介在配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　本実施例では、k-ras遺伝子を含む部分配列（配列番号１２）を標的配列とするため、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA(Promega社製　Human　Genomic　DNA,　Male;　Cat　#　G1471)を用いた。反応溶液中に前記ヒトゲノムDNAを10ng加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００p（アジレント製）にて６０℃、１００分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを3%(w/v)　NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。
Human　genome,　partial　DNA（配列番号１２）
 
401　bp
 
5’-TTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAA-3’
（結果４：第三プライマーを用いた場合の等温反応結果）
　図１９は、第一および第二プライマーとしてForwardプライマー４（配列番号８）およびReverseプライマー４（配列番号９）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示した。図２０～２２は、第一および第二プライマーに更に第三プライマーを加えた場合の蛍光増幅曲線の結果であり、図２０の反応ではBoostプライマー1のみを、図２１の反応ではBoostプライマー２のみを、図２２の反応では、Boostプライマー1および２の両方を添加した結果である。
　まず図１９の結果では、鋳型DNAを加えた場合、蛍光シグナルの増加が８０分以降に認められた。次にBoostプライマー１を加えた図２０の結果では、図１９の蛍光増幅曲線との違いが認められなかったものの、Boostプライマー２を加えた図２１の結果においては、鋳型DNAを加えた場合の蛍光シグナルの増加が50分以降に認められた。更に、Boostプライマー１および２を両方加えた図２２では、図２１の結果と同様の時間でシグナルが上昇する蛍光増幅曲線が認められた。なお、図２３は、図１９～２２において蛍光シグナルの増加が認められた反応溶液のアガロースゲル電気泳動結果である。この結果より、蛍光シグナルが認められた鋳型DNAを加えた場合の反応溶液においては、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが増幅産物として観察され、等温核酸増幅が反応溶液中で起きていることが明らかとなった。また、Boostプライマー２、又はBoostプライマー１および２を両方加えた場合は、より長鎖の核酸増幅産物が増大している事が明らかとなった。この電気泳動結果と図１９～２２の結果より、本実施例においては、第一および第二プライマーによって生じる等温核酸増幅は、Boostプライマー２が第三プライマーとして作用する事によって、その核酸増幅効率が著しく上昇する事が明らかとなった。
（実施例４）
　本実施例における等温核酸増幅法は、２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示す配列のForwardプライマー５（配列番号１３）、およびReverseプライマー５（配列番号１４）を各２．５μＭの濃度で加えたものを反応溶液とした。尚、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、短鎖鋳型DNAからの増幅には、Forwardプライマー５とReverseプライマー５のアニーリング配列とそれらに挟まれたB型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５、下線部）に相当する52-merのオリゴDNAを鋳型DNAとし、反応液中に前記鋳型DNAを６×１０３コピーとなる様に加えた。
Influenza　B　MP　segment,　partial　cDNA（配列番号１５）
 
740　bp
 
5’-AGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAGATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTACACTGTTGGTTTGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATCAGGAATGGGAACAACAGCAACAAAAAAGAAAGGCCTGATTCTGGCTGAGAGAAAAATGAGAAGATGTGTGAGCTTTCATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGCCATGAAAGCTCAGCGCTACTATACTGTCTCATGGTCATGTACCTGAATCCTGGAAATTATTCAATGCAAGTAAAACTAGGAACGCTCTGTGCTTTATGCGAGAAACAAGCATCACATTCACACAGGGCTCATAGCAGAGCAGCGAGATCTTCAGTGCCTGGAGTGAGACGAGAAATGCAGATGGTCTCAGCTATGAACACAGCAAAAACAATGAATGGAATGGGAAAAGGAGAAGACGTCCAAAAGCTGGCAGAAGAGCTGCAAAGCAACATTGGAGTGCTGAGATCTCTTGGGGCAAGTCAAAAGAATGGGGAAGGGATTGCAAAGGATGTAATGGAAGTGCTAAAGCAGAGCTCCATGGG-3’
　等温核酸増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度でのインキュベーションによって実施し、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅の有無を調べた。
　増幅反応終了後、核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを4.5％(W/V)　NuSieveアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。また、FluB cDNAプラスミドを鋳型とした増幅産物に関し、アガロース電気泳動で認められたDNAバンドを切り出し、Wizard　SV　Gel　and　PCR　Clean-Up　System（プロメガ社製）を用いてDNAを抽出した。その精製DNA断片の3’末端に、TAKARA　ExTaq　DNA　ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた60℃、10分間のインキュベーションによってA付加を行い、その３’A付加DNA断片をTOPO　TA　Cloning　Kit（ライフテクノロジーズ社製）を用いてTAクローニングした。得られたクローニング産物のインサート配列をBigDye　Terminator　Cycle　sequencing　kit　ver.1.1　およびABI3100-Avant(ライフテクノロジーズ社製)によって決定し、配列情報から増幅産物の一次構造を解析した。
（結果：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた場合の等温増幅反応結果）
　図２４では、Forwardプライマー５（配列番号１３）およびReverseプライマー５（配列番号１４）を用いた場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAとしてFluB　cDNAを含むプラスミドを用いた場合（白丸）、および両プライマーのアニーリング配列とそれらに挟まれたFluBのターゲット領域のみで構成される52-merの一本鎖オリゴDNAを用いた場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図２５は、図２４での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。同図からわかるように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが鋳型DNAを含む反応標品で観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。また、鋳型DNAが長鎖二本鎖となるプラスミドを供した場合と短鎖一本鎖オリゴDNAを供した場合ではバンドパターンの違いは認められず、同一の増幅反応が起きている事が明らかとなった。
　図２５Ａにおいて矢印１および２で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図２６に示した。図２５Ａにおいて矢印1に相当するDNAからは105　bpの塩基配列、矢印2に相当するDNAからは202　bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。各DNA断片の一次構造を解析した結果、図２５Ａにおいて矢印1に相当するDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列が得られていることが判明した(図２６Ａ)。さらに、図２５Ａにおいて矢印2に相当するDNAは、アンプリコン配列が2つ順方向(タンデム)に連結された配列が認められ、そのアンプリコンの連結部位では片方のプライマー折り返し配列のみが含まれる形状を成すことが判明した(図２６Ｂ)。
（実施例５）
　本実施例では、本発明の等温核酸増幅法におけるプライマーの標的配列への特異性について検討した。２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０　ｍＭ硫酸アンモニウム、８　ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示すForwardプライマー６（配列番号１６）、およびReverseプライマー６（配列番号１７）を各2.5μMの濃度で加えた。尚、下記各プライマーにおいて、下線部は折り返し配列、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、上記鋳型DNAと共に、１反応液あたり20ngのヒトゲノムDNA（Human　Genomic　DNA,　Male、プロメガ社製、１０３コピー相当）を添加した反応溶液を調製した。
　上記反応用液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の確認は、実施例４と同様の方法によって実施した。
（結果：Forwardプライマー及びReverseプライマーの両方に異なる折り返し配列を有するプライマーを用いた等温核酸増幅における鋳型DNA上の標的部位への特異性）
　図２７は、Forwardプライマー６（配列番号１６）およびReverseプライマー６（配列番号１７）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB　cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えると共に、ヒトゲノムDNAを添加した場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAを加えたもの（白丸）、およびヒトゲノムDNAを更に添加した場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（灰色菱形）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、ヒトゲノムDNAのみを鋳型として加えた場合(黒三角)では蛍光シグナルの増加は認められなかった。また図２８Ａは、図２７での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。同図からわかるように、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが、FluB　cDNAプラスミドの鋳型DNAを含む反応標品で観察され、鋳型DNAを含まないもしくはヒトゲノムDNAのみを含んだ反応溶液では、顕著な増幅パターンは認められなかった。よって、本実施例において使用したプライマーは等温核酸増幅を果たし、FluB　cDNAプラスミドを鋳型DNAとして特異的に認識していることが明らかとなった。
　また、図２８Ｂにおいて矢印で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図２９に示した。図２８Ｂにおいて矢印に相当するDNAからは105　bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。その一次配列構造を解析した結果、図２８Ｂにおいて矢印で示したDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列を有しており、両プライマーの3’末端に相当する配列に挟まれた区間では、アニーリング領域から連続したFluBに特異的な配列が含まれている事が認められた。よって増幅産物の一次配列構造解析からも、本実施例で用いたプライマーの標的配列認識の特異性が証明された。
（実施例６）
　本実施例では、本発明における等温核酸増幅法により、RNAを鋳型とした逆転写反応溶液からの直接的な等温核酸増幅が実施可能かについて検討した。実施例４で使用したFluB cDNAの部分配列を含むプラスミドDNAから、以下に示すFluB　cDNA増幅用プライマー（配列番号１８および１９）を用い、T7プロモータ配列を付加したFluB　cDNAの直鎖状二本鎖DNAをPCR法により作成した。このPCR産物とCUGA　T7　RNAポリメラーゼ（ニッポンジーンテク社製）を用いてin　vitro転写反応を行ない、反応溶液から酸性フェノール抽出法によって得られたRNAを本実施例における逆転写反応の鋳型RNAとした。
T7／FluB　cDNA増幅用Forwardプライマー７（配列番号１８）
39-mer
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGAAGCACGCACTTTC-3’
 
T7／FluB　cDNA増幅用Reverseプライマー７（配列番号１９）
20-mer
5’-CCCATGGAGCTCTGCTTTAG-3’
　上記で調製したRNA　200　ngを逆転写反応液25μL（50　mM　Tris-HCl　[pH　8.3]、75　mM塩化カリウム、3　mM塩化マグネシウム、10　mM　DTT、200　unit　M-MLV　Reverse　transcriptase　[deletion　mutant,　RNaseH(-)、プロメガ社製]、逆転写用プライマー[配列番号２０]）中で４２℃、１時間反応させた。その後、M-MLV　Reverse　transcriptaseを失活させるため、９５℃で５分間保持した。
逆転写用プライマー（配列番号２０）
18-mer
5’-TGGACGTCTTCTCCTTTT-3’
　上記逆転写反応液を1/4000希釈した溶液を、等温増幅反応溶液(試薬組成およびプライマーは実施例1に記載と同様)に1μL加え、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅の有無を調べた。また核酸増幅産物を調べるため、反応後の溶液5μLを4.5%　(W/V)　NuSieve　GTGアガロースを用いたアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によりバンドパターンを観察した。
（結果：RNAを鋳型とした逆転写反応溶液からの直接的な等温核酸増幅）
　図３０は、Forwardプライマー５（配列番号１３）およびReverseプライマー６（配列番号１４）を用いた等温増幅反応において、本実施例にて作成した逆転写反応液の1/4000希釈液を添加した反応標品（白丸）、および実施例４と同様、FluB　cDNAプラスミドを鋳型DNAとして添加した場合（灰色四角）とを比較した結果である。結果、プラスミドを鋳型としたものに比べ、蛍光シグナルの立ち上がり時間に遅延はあるものの、逆転写反応液を添加した反応標品においても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図３１は、図３０での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが逆転写反応液を添加した反応標品においても、鋳型DNAを用いた場合と同様のパターンが観察され、同一の等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。
（実施例７）
　本実施例では、本発明における等温核酸増幅法に供するプライマーの構造において、5’末端に位置する折り返し配列を、片方のプライマーのみ除去した場合の挙動について検討した。容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、１０ｍＭ　塩化カリウム、１０ｍＭ　硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、以下に示すForwardプライマー８（配列番号２１）、および実施例５で使用したReverseプライマー６（配列番号１７）を各2.5μMの濃度で加えた。尚、下記プライマーにおいて、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示しており、Forwardプライマー８は、Forwardプライマー６（配列番号１６）の5’末端の折り返し配列（16　base）を除去した配列と同様の配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。また、上記鋳型DNAと共に、１反応液あたり20ngのヒトゲノムDNA（Human　Genomic　DNA,　Male、プロメガ社製、１０３コピー相当）を添加した反応溶液を調製した。
　上記反応用液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の確認は、実施例４と同様の方法によって実施した。
（結果：片方のプライマーにおける5’末端折り返し配列を除去した場合の等温核酸増幅反応）
　図３２は、5’末端に折り返し配列を含まないForwardプライマー８（配列番号２１）および5’末端に折り返し配列を含むReverseプライマー６（配列番号１７）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB　cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えると共に、ヒトゲノムDNAを添加した場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAを加えたもの（白丸）、およびヒトゲノムDNAを更に添加した場合(灰色四角)のどちらにおいても、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（灰色菱形）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また、ヒトゲノムDNAのみを鋳型DNAのみに加えた場合(黒三角)では蛍光シグナルの増加は認められなかった。また図３３は、図３２での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡るバンドパターンが、FluB　cDNAプラスミドの鋳型DNA含む反応標品で観察され、鋳型DNAを含まないもしくはヒトゲノムDNAのみを含んだ反応溶液では、顕著な増幅パターンは認められなかった。よって、プライマーの片方が5’末端を含まない場合においても、標的の鋳型DNAに対する等温核酸増幅を果たしていることが明らかとなった。但し、増幅産物として得られたバンドパターンを実施例５の結果（図２８）と比較すると、異なるバンドパターンが得られており、片側のプライマー5’末端折り返し配列を除去する事により、異なる増幅産物が得られる事が明らかとなった。
（実施例８）
　本実施例における等温核酸増幅法は、２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、８ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１／１０００００希釈SYBR　Green　I（宝酒造社製）、および６ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ（ダナフォーム社製）を含む溶液に、実施例４で使用したForwardプライマー５（配列番号１３）、およびReverseプライマー８（配列番号２２）を各2.5μMの濃度で加えたものを反応溶液とした。尚、下記プライマーにおいて、囲部はForward及びReverseプライマーの共通配列を示しており、Reverseプライマー８は、Reverseプライマー５（配列番号１４）の5’末端の折り返し配列（13base）を除去した配列と同様の配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　さらに鋳型DNAとして、B型インフルエンザのRNAゲノムMP分節のcDNA部分配列（配列番号１５）を有するプラスミドDNAを、反応溶液中に６×１０３コピーとなる様に加えた。
　上記反応溶液を用いた等温核酸増幅反応、増幅反応産物の電気泳動、および増幅産物のシーケンス解析は、実施例４と同様の方法によって実施した。
（結果：片方のプライマーにおける5’末端折り返し配列を除去した場合の等温核酸増幅反応と増幅産物のシーケンス解析）
　図３４は、5’末端に折り返し配列を含むForwardプライマー５（配列番号１３）および5’末端に折り返し配列を含まないReverseプライマー８（配列番号２２）をプライマーとして用い、その標的配列を含むFluB　cDNAプラスミドを鋳型DNAとして加えた場合の蛍光増幅曲線を示した。この結果、鋳型DNAとしてFluB　cDNAを含むプラスミドを用いた場合（白丸）において、対照実験として鋳型DNAを加えなかった場合（黒三角）と比べ、蛍光シグナルの増加が顕著に認められた。また図３５は、図３４での増幅反応における反応溶液をアガロースゲル電気泳動に供した結果である。結果、短鎖から長鎖に渡る周期的なバンドパターンが鋳型DNA含む反応標品で観察され、等温核酸増幅が起きていることが明らかとなった。
　図３５において矢印１および２で示したバンドに関し、各DNAの塩基配列を決定した結果を図３６に示した。図３５において矢印1に相当するDNAからは92bpの塩基配列、矢印２に相当するDNAからは186bpの塩基配列が得られ、アガロース電気泳動で認められたDNA断片長とほぼ一致した。各DNA断片の一次構造を解析した結果、図３５において矢印1に相当するDNAは、鋳型DNAからForwardおよびReverseプライマーに挟まれたアンプリコン配列がコピーされた配列を有していることが判明した(図３６Ａ)。さらに、図３５において矢印２に相当するDNAは、アンプリコン配列が2つ順方向(タンデム)に、GT（グアニン、チミン）の2塩基を介して連結された配列が認められた（図３６Ｂ）。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。また、本願明細書中で文献名を示している全ての文献の記載内容は、それらの文献を参照することにより、本願明細書に組み込まれる。

Claims (16)

  1. 　標的核酸配列の等温増幅方法に用いるプライマーセットであって、
    前記プライマーセットが、第一プライマー及び第二プライマーを含み、
    前記第一プライマーが、３´側に、前記標的核酸配列の３´側の配列（Ａ）にハイブリダイズ可能な配列（Ａ´）を含み、
    前記第二プライマーが、３´側に、前記第一プライマーの伸長鎖又は前記標的核酸配列の相補鎖の３´側の配列（Ｂ）にハイブリダイズ可能な配列（Ｂ´）を含み、
    さらに、前記第一プライマー及び第二プライマーが、それぞれの５´側に、互いに実質的に同一の配列（Ｃ）を含むことを特徴とするプライマーセット。
  2. 　前記第一プライマー及び第二プライマーの少なくとも一方において、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含むことを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
  3. 　前記第一プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含み、
    前記第二プライマーにおいて、前記配列（Ｃ）の５´側に、さらに、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｅ－Ｅ´）を含み、
    前記配列（Ｄ－Ｄ´）及び前記配列（Ｅ－Ｅ´）が、互いに異なる配列であることを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
  4. 　さらに、第三プライマーを含み、前記第三プライマーは、前記標的核酸配列、前記標的核酸配列の相補配列、又は、前記第一プライマーの伸長鎖若しくは前記第二プライマーの伸長鎖にハイブリダイズし、かつ、前記第三プライマーのハイブリダイゼーションが、前記第一プライマー及び第二プライマーと競合しないことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
  5. 　プライマーセットを用いて標的核酸配列を等温で増幅する等温増幅方法であって、前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
  6. 　プライマーセットを用いた等温増幅方法により核酸試料中の核酸配列における変異を検出する方法であって、
    前記プライマーセットとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用い、
    前記プライマーセットが、前記変異を有する核酸配列又は前記変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、前記変異に係るヌクレオチド残基が、第一プライマーの相補配列（Ａ）又は第二プライマーの相補配列（Ｂ）に含まれるように設計されたプライマーセットであり、
    前記核酸試料の存在下、前記プライマーセットによる等温増幅反応を行うことを特徴とする方法。
  7. 　少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、
    下記の（Ａ１）～（Ａ６）の各工程を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
     
    （Ａ１）　３´末端を含む３´側ステム配列と、５´末端を含む５´側ステム配列とが、ループ配列を介して連結したステムループ構造の一本鎖鋳型核酸であって、前記３´側ステムの３´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸を提供する工程。
     
    （Ａ２）　前記一本鎖鋳型核酸の前記ループにプライマーをハイブリダイズさせ、前記プライマーを前記５´側ステム配列の５´末端に向かって伸長させる工程。
     
    （Ａ３）　前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
     
    （Ａ４）　前記（Ａ３）の前記折り返し配列の３´末端に進んだ前記プライマーの伸長反応を、再び、前記５´側ステム配列の５´末端に向かって連続して続行させ、かつ、続行する前記プライマーの伸長反応により、前記（Ａ２）で形成された一本鎖鋳型核酸にハイブリダイズしているプライマー伸長鎖を鎖置換反応により一本鎖にする工程。
     
    （Ａ５）　前記（Ａ４）のプライマー伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端で停止する工程。
     
    （Ａ６）　前記（Ａ４）で一本鎖になったプライマー伸長鎖を鋳型として前記一本鎖鋳型核酸の前記折り返し配列の３´末端を伸長させる工程。
  8. （Ａ３）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項７記載の核酸の合成方法。
  9. 前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、請求項２記載のプライマーセットであって、第一プライマーにのみ前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含むプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された一本鎖鋳型核酸であり、
    前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、前記折り返し配列（Ｄ－Ｄ´）を含む第一プライマーである
    ことを特徴とする請求項７または８に記載の核酸の合成方法。
  10. 前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、さらに、前記５´側ステムループ配列の５´末端に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列が連結した一本鎖鋳型核酸であり、
    前記（Ａ３）工程に代えて、下記（Ａ３－２）工程を含むことを特徴とする請求項７記載の核酸の合成方法。
     
    （Ａ３－２）　前記５´側ステム配列の５´末端まで進んだ前記プライマーの伸長反応を、前記５´側ステム配列の５´末端に連結した前記折り返し配列を介することなく、直接、前記５´側ステム配列の５´末端から前記折り返し配列の３´末端にかけて連続して続行する工程。
  11. （Ａ３－２）工程及び（Ａ４）工程を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする請求項１０記載の核酸の合成方法。
  12. 前記（Ａ１）工程で提供される前記一本鎖鋳型核酸が、請求項３のプライマーセットを用いた等温増幅法で形成された一本鎖鋳型核酸であり、
    前記（Ａ２）工程で前記ループにハイブリダイズする前記プライマーが、請求項３のプライマーセットの第一プライマー又は第二プライマーである
    ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の核酸の合成方法。
  13. 核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、請求項７から１２のいずれか一項に記載の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする核酸の増幅方法。
  14. 　少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成方法であって、下記の（Ｂ１）～（Ｂ３）の各工程を含む第１の反応工程及び下記の（Ｃ１）～（Ｃ３）の各工程を含む第２の反応工程の少なくとも一方を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
     
    （Ｂ１）　３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を、配列の向きが互いに逆方向になる状態で、二つ提供する工程。
     
    （Ｂ２）　前記（Ｂ１）の二つの二重鎖の一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、他方の二重鎖の前記相補的な一本鎖核酸を鋳型として鎖置換伸長反応が起こり、前記一方の二重鎖の前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記他方の二重鎖の相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
     
    （Ｂ３）　前記工程（Ｂ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
     
    （Ｃ１）　３´末端を含む領域に、相互にハイブリダイズする２つの配列を同一鎖上に含む折り返し配列を含む一本鎖核酸と前記一本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸とからなる二重鎖を一つ提供する工程。
     
    （Ｃ２）　前記（Ｃ１）の二重鎖の前記一本鎖核酸の折り返し配列の３´末端から、前記相補的な一本鎖核酸を鋳型とし、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から５´末端にかけて鎖置換伸長反応が起こり、前記一本鎖核酸の伸長鎖の一部に前記相補的な一本鎖核酸がハイブリダイズした部分的二重鎖を形成する工程。
     
    （Ｃ３）　前記工程（Ｃ２）の部分的二重鎖において、前記相補的な一本鎖核酸の３´末端から、前記一本鎖核酸を鋳型とした伸長反応により、完全二重鎖を形成する工程。
  15. 前記（Ｂ１）工程及び前記（Ｃ１）工程の二重鎖が、請求項２または３に記載のプライマーセットを用いた等温増幅反応により形成された二重鎖であることを特徴とする請求項１４記載の核酸の合成方法。
  16. 核酸の増幅方法であって、少なくとも二つの異なる配列の順序が少なくとも二回繰り返す一本鎖核酸及び前記一本鎖核酸と相補的な核酸から構成される二本鎖核酸を等温で合成する核酸の合成工程を含み、前記核酸の合成工程が、請求項１４または１５に記載の核酸の合成方法により実施されることを特徴とする核酸の増幅方法。
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