JP2710159B2 - 複製型ｒｎａリポーター・システム - Google Patents
複製型ｒｎａリポーター・システムInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリ核酸及びポリペプチドを含む生体高分
子のアツセイに向けられたものであり、より詳細には、
RNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒される自己複製の
鋳型となるRNAに基くリポーター・システムを用いるア
ツセイに関する。 本発明の背景 非常に大量の非関連物質を背景に含むサンプル中にあ
る特定の小量の生体高分子を検索することが時々必要と
なる。いくつかの重要なケースとしては、感染した患者
の血液や他の体液中に微小量存在するウイルスや抗病原
菌抗体についてのイムノ・アツセイとか、細胞表面に散
在するレセプターについてのアツセイ、さらに、食品中
に微小量存在する病原菌、体液中に小量存在する病原性
原生寄生動物、バクテリア、ウイルス、或いは、ある種
の全遺伝子DNA中の遺伝子の異常を示す決められた配列
の短い断片についての核酸プローブ・ハイブリダイゼー
シヨン・アツセイなどがある。 そのようなアツセイの特異性は、サンプル中に試験さ
れている本体（例えばウイルスとか、他の微生物、特別
なレセプターをもつた細胞、異常遺伝子）が存在してい
る限りにおいて、サンプル中に存在する生体高分子検体
（即ち、特定の標的生体高分子、又は、特定の標的部
位、又は生体高分子の一部分）に特異的に結合する親和
性分子を用いることに依存している。親和性分子の例と
しては抗体を誘導するのに用いられる抗原となつている
タンパク質の標的に対する抗体、又は、標的DNA又はRNA
の標的部分と相補的な配列をもつオリゴ・ヌクレオチ
ド、又は、抗原により誘導される抗体となつている抗体
の標的に対する抗原、さらに、標的糖タンパク又は標的
ポリ多糖のある特定の炭化水素部分に特異的に結合する
レクチンなどがある。 アツセイしているサンプル中に存在する生体高分子検
体のいずれかと結合した親和性分子の検出は、典型的に
は、リポーター・システムの一部分として検出しうるシ
グナルを発生しうるリポーター・グループを親和性分子
と複合させるか、とりこませることによつてなされる。
アツセイの感染は、アツセイ系における親和性分子と生
体高分子検体の結合の特異性、と、アツセイ系における
親和性分子だけからシグナルを生じさせるリポーター・
システムの特異性、さらに、アツセイ系におけるリポー
ター・システムから生じたシグナルの強度に依存するこ
とになろう。 典型的なリポーター・システムでは、リポーター・グ
ループとして螢光有機分子や32Pでラベルしたリン酸基
を用いている。リポーター・グループから直接生じるシ
グナルが係わつてくる、このようなタイプのリポーター
・システムによつて達成されうる感度は、根本的には検
出しうるだけの強度のシグナルを生じさせるのに必要と
するリポーター・グループの数によつて制限を受ける。
従つて、これらのグループでは、約105個以下の標的分
子又は標的部分をアツセイして検出することはできな
い。生体高分子検体に対する非放射活性アツセイの感度
は、親和性分子を連結した酵素を用いることにより改善
されてきた。例えば、ビオチニル化（biotinylated）し
たオリゴヌクレオチド又はDNA親和性分子“プローブ（p
robe）”は、酵素に連結したアビジン（avidin）リポー
ター・グループをビオチニル・グループと複合体を形成
させ、次に、酵素によつて触媒される反応生成物を検出
することにより検出される。Langerら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.（U.S.A.）78巻、6633−6637ページ（1981）;Lea
ryら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）80巻、4045−404
9ページ（1983）。また、酵素に連結させたアビジンを
イムノ・アツセイにおけるリポーター・グループとした
ものに関しては、HeveyとMalmros,米国特許No.4,228,23
7を参照せよ。酵素を親和性分子と結合させ、さらにそ
の酵素により触媒される反応の基質を供することによ
り、それぞれの酵素−親和性分子−検体の複合体につい
て大量の数の生成分子を蓄積させ、それ故、原則的に
は、少数のリポーター分子を直接用いることによりより
もずつと大きな感度を得ることが可能となる。感度の高
い色素法によつて容易にアツセイできるペルオキシダー
ゼ（peroxidase）やホスフアターゼ（phosphatase）な
どの酵素は、酵素に結合したリポーター・グループとし
て広く利用されている。Learyら先に引用。 しかしながら、アビジンを連結したホスフアターゼが
係わつてくるような酵素付加リポーター・システムは、
根本的には、リポーター・グループの酵素によつて触媒
される反応がおこりうる速度によつて、感度において制
限を受けることになる。実際の問題として、酵素触媒反
応の生成物の検出しうる量とは、大体１時間から100時
間といつた適正な時間内のアツセイで生産されるもので
なければならない。実際には、酵素−付加リポーター・
システムは、32P崩壊に基く、リポーター・システムよ
り約10倍から100倍感度が劣る。 より感度に富み、標的生体高分子の単一分子、又は標
的生体高分子断片の単一断片の存在までが、原則とし
て、数時間たらずのアツセイで検出しうる程度のリポー
ター・システムが必要とされている。そのようなリポー
ター・システムでは、反応を通じて、検体分子又は断片
あたり比較的短い時間内に漠大な数の生成分子を生産す
るような被検体の存在が必要となつてくる。 酵素によつて触媒される核酸の重合反応は鋳型から、
相補配列をもつ鎖を生成し、この鎖はまた関連するポリ
メラーゼの基質になる。こうしてくり返し反応がおこる
ことにより、特定のヌクレオチド鎖の数が対数的に増大
するのである。従つて核酸の自己複製をリポーター・シ
ステムの感度の向上に用いるのは、有利である。 核酸の重合反応を、検出しうる微量の検体の検出に利
用した例が、R.K.Saikiら、Science,230巻、1350−1354
ページ（1985年）及びヨーロツパ特許出願広報No.01640
54に記載されている。Saikiら、上述、はE.coli DNAポ
リメラーゼＩとともに、dATP,dCTP,dGTP,dTTP,と、さら
に２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー即ち、１つ
は、センス鎖の３′末端の近くの部分に相補的な配列を
もつもの、そしてもう一方は検体DNA断片のアンチ・セ
ンス鎖の３′末端の近くの部分に相補的な配列をもつも
のを用いており、サンプル中の検体の量を標準的なDNA
プローブ・アツセイ技術で容易に検出できるレベルまで
増大させるのである。Saikiらの方法には、多数のサイ
クルからなるDNAポリメラーゼ−触媒複製、鎖の分離、
さらにプライマー・アニーリングが含まれる。検体の量
は、サイクル数に伴つて対数的に増加し、少なくとも複
製の開始断片の濃度が、ポリメラーゼ分子の濃度を上回
わるまでになる。Saikiらにより記述される方法では、
少なくとも３つの合成オリゴヌクレオチドが必要であ
り、２つはプライマーで、また少なくとも１つは検体を
検出するプローブである。Saikiらの方法における複製
の各サイクルは、３ステツプからなる。従つて、Saiki
らの方法ではDNAの自己複製を利用して検体の量を増大
させることにより、DNAプローブ・アツセイの感度を増
大させるのであるが、その一方で核酸の自己複製を通じ
て、生体高分子又はその特定の断片又はその部位に対す
るアツセイの感度を増大させるような、より簡便で、よ
り一般的に応用可能な方法が依然として必要とされてい
るのである。 酵素により触媒される、RNA配向性の、RNA重合は、相
補鎖を迅速に生産し、しかもプライマーを必要としない
のである。RNA鎖の数は、NRA配向性の、RNA重合の反応
サイクルのくり返えしにつれて対数的に増加していく。
イン・ビトロの他の重合反応と異なり、RNA配向性のRNA
重合は、サイクル間に鎖の分離とプライマー・アニーリ
ングを必要とすることなく、連続的に進行する。酵素に
よつて触媒される、RNA配向性のRNA重合は“自動触媒複
製”と呼ばれてきた。 HarunaとSpiegolman,Science,150巻、884−886ページ
（1965年）。本発明があるまでは自動触媒複製を生体高
分子検体の簡便で、広く応用可能で高感度のリポーター
・システムに利用することができることは考えられてい
なかつた。 Mieleら、J.Mol.Biol.,171巻、281−295ページ（1983
年）では、デカアデニル酸部分を、突然変異中間変種−
1 RNAの、バクテリオフアージＱβのRNA依存性RNAポリ
メラーゼ（“レプリカーゼ”）の機能には必須ではない
位置への挿入を記述しており、さらに、組み換え中間変
種−1 RNAが、レプリカーゼによる複製の鋳型として活
性でありつづけることを報告している。Kramerら、米国
特許出願No.614,350（1984年５月25日整理）も参照せ
よ、これはここで参考文献に含まれている。Kramerらの
出願は、中間変種及び同類のRNAに基く、Ｑβレプリカ
ーゼ活性による複製のための組み換えRNA鋳型と、さら
に、そのような鋳型の、核酸ハイブリダイゼーョ余ン・
プローブとしての利用について記述している。Mielらの
報文も、Kramerらの特許出願も、ともに、生体高分子検
体のアツセイのリポーター・システムの基礎としての複
製型RNA及びこれに関連したRNA依存性RNAポリメラーゼ
の利用について示唆していない。さらに、報文と特許出
願のどちらも、標的核酸断片のプローブとして用いられ
る組み換え複製型RNAが、標的とのハイブリダイゼーシ
ヨンにつづいて複製され、プローブを用いたアツセイの
感度を増大させることについては示唆していない。 本発明の要約 本発明は、ある種のRNAのイン・ビトロでの自動触媒
複製が、生体高分子検体のアツセイの高感度のリポータ
ー・システムとして利用可能である、という我々の発見
に基いている。 従つて、本発明は、特定の生体高分子検体を検出する
アツセイで、感度を高度に増強させたリポーター・シス
テムに関している。このリポーター・システムは、バク
テリオ・フアージＱβのRNAポリメラーゼによるイン・
ビトロでの複製が可能な、中間変種−1 RNA及びその突
然変異体を含む、RNA配向性のRNAポリメラーゼによるイ
ン・ビトロでの複製が可能なRNAの、迅速な、対数的
な、酵素触媒による複製に基いている。 本発明のリポーター・システムは、そのような複製型
RNAを親和性分子に加え、これがアツセイ中の生体高分
子検体と特異的に結合することに係わつている。もし検
体がポリヌクレオチドの断片である場合には、複製型RN
Aは、それによつて検体断片とハイブリダイゼーシヨン
がおこるような検体断片と相補的な配列をもつ、DNAま
たはRNAで、断片を含むポリヌクレオチドあるいは、オ
リゴヌクレオチド親和性分子と、連結させることができ
る。もし検体が、例えば、ウイルスの外被タンパクと
か、培養中の細胞の溶解に際して放出される興味あるタ
ンパクなどのタンパク質である場合には、RNAはアツセ
イ・システム中の検体タンパクと特異的に結合する抗体
親和性分子と連結させることができる。もし検体が、炭
化水素残基を含む糖タンパクとか、ポリ多糖のような分
子である場合、複製型RNAは、炭化水素残基と特異的に
結合するレクチン親和性分子と連結させることができ
る。 複製型RNAは、親和性分子がアツセイ・システム中に
存在するいずれかの生体高分子検体と複合体をつくる前
に、又はつくつた後でも、親和性分子と結合させること
ができる。 なぜならば、複製型RNAが親和性分子と結合した後
で、検体に結合した親和性分子を検出するためには、こ
のRNAの複製が必要となるからである。ここでａ）RNA
は、結合している間でも、RNA依存性RNAポリメラーゼに
より複製されることができるような様式で親和性分子と
結合しているか、あるいは、ｂ）RNAは、分離したRNAが
RNA依存性ポリメラーゼによつて複製されることができ
るような形で、親和性分子から分離できるような様式を
とつて親和性分子と結合しているのである。 親和性分子に結合した複製型RNAから複製されたRNA、
即ち、今度はアツセイ・システム中の検体に結合してい
るRANの検出は、数多くの既知の技術のいずれかを用い
て行うことができる。例えば、RNAの複製は、放射活性
で標識したリボヌクレオシド−５′−三リン酸を用いて
行なうことができ、次に複製の結果生じた放射活性をも
つRNAを検出するのである。別の方法として、ビオチニ
ル化したリボヌクレオシド−５′−三リン酸を複製過程
の基質として用いることができ、さらに、その結果生じ
たビオチニル化したRNAは、例えばLearyら（先に引用）
により開示されるように、酵素−アビジン付加物を利用
して検出することができる。また、複製されたRNAは紫
外線吸収や又は染色により、直接に検出することができ
る。 本発明の詳細な記述 一面からみて本発明はサンプル中の検体の存在を決定
する方法であり、これは、 ｉ）親和性分子と検体の間で結合がおこるような条件下
で、サンプルを上述の検体親和性分子にさらし、 ii）もし上述の親和性分子、それ自体が、複製型RNAで
はない場合、ステツプｉ）の前又は後で、複製型RNA
を、ステツプｉ）で用いた親和性分子に結合させ、 iii）RNA依存性RNAポリメラーゼを用いて、検体に結合
した親和性分子に結合している、又は、した複製型RNA
あるいは、検体に結合している親和性分子である複製型
RNAの複製を触媒させる、そして iv）ステツプiii）の反応で生成したRNAを検出する、以
上ステツプから構成される。 他の側面からみると、本発明は親和性分子−複製型RN
A混成分子、即ち、複製型RNAに結合した親和性分子を伴
つている。親和性分子は複製型RNAに、RNA依存性RNAポ
リメラーゼによる複製型RNAの複製をおこさせなくする
ことがないように、複製型RNAに共有結合した第１の連
結部分を介して、さらに、新和性分子とその検体との特
異的な結合を妨げないように複製型RNAに結合した第２
の連結部分を介して、結合させることができるのであ
る。また、ここで述べた第１と第２の連結部分は、お互
いに共有結合しており、特異的な結合対を形成している
かあるいは、通常の第３の連結部分とも特異的な結合対
を同時に形成しているのである。 本発明はまた、“スマートプローブ（smart prob
e）”を必然的に伴つており、即ち、これは、核酸であ
る親和性分子が複製型RNAに結合していて、さらに、親
和性分子が、その検体と結合していない場合には、複製
型RNAがRNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型と
して不活性であるように、複製型RNA部分と結合してい
る化合物である。 本発明はさらに、塩基対を介して、複製型RNAに非共
有的に結合している親和性分子を必然的に伴つている。 さらにまた一面からみると、本発明はRNA依存性のRNA
ポリメラーゼによる複製型RNAの複製を妨げることな
く、連結部分に結合した複製型RNAに係わつており、こ
こでいう連結部分とはこれにより、他の連結部分対に結
合した複製型RNAと親和性分子との間の連結が特異的な
結合対として、連結部分の共有的な結合により、あるい
は、連結部分の相互作用により生じる、１対の連結部分
のことである。 本発明に従う、一対の連結部分の１つに結合した、そ
のような複製型RNAは、検体との結合の特異性を失わな
いように他の連結部分対に結合したいかなる親和性分子
に対しても、普遍的なリポーター・グループである。 “検体”とは、サンプル中でのその存在や濃度量をア
ツセイで決定される物質のことを意味する。検体は時に
は、アツセイの標的物質、あるいは標的断片のことをさ
している。本発明に従うアツセイでは、検体とは通常、
生体高分子あるいは生体高分子の断片のことである。検
体には、例えば糖タンパク、リポタンパク、酵素、ホル
モン、レセプター、さらに抗原、抗体などのタンパク質
や、核酸（DNA,RNA）、核酸の断片、そしてポリ多糖な
どを含んでいる。 本発明のアツセイでは検体は、もしそれが存在してい
れば、あるいは存在していさえすれば、サンプル中に存
在する生物本体に関連していることもしばしばである。
そのような生物本体には、ウイロイド（検体は核酸又は
その断片である）；ウイルス（検体は例えばウイルス外
被タンパク、ウイルス・ゲノム、ウイルス・ゲノムの断
片、あるいはウイルスに対する抗体などである）；他の
微生物（検体は例えば、微生物のゲノムの断片又は、RN
A、微生物により生産される毒素、微生物に遺伝子工学
を施したときに生産される異種タンパクなどである）
（原生動物寄生虫に関しては、Lizadi Noguiera,ヨーロ
ッパ特許出願公報No.0135108を参照のこと）；がん細胞
のような異常細胞（検体は例えば異常細胞の細胞表面抗
原である）；あるいは、異常遺伝子（検体は例えば、遺
伝子異常をおこす変調塩基を含む遺伝子断片とか、異常
遺伝子から転写された結果生じる変調塩基を含むメツセ
ンジヤーRNA断片とか、又は、異常遺伝子が発現して生
じた異常タンパクである）、以上が含まれる。検体はま
た、例えば、ホルモンのような特定のタンパクでもあり
え、その血清中や体液中の存在や濃度をアツセイで決定
することになる。必然的に２つの抗体を使うことになる
イムノ・アツセイの場合、検体は、（サンドイツチアツ
セイの場合には）第一の抗体に結合した抗原であり、又
は、（イムノソルベントアツセイの場合には）抗原に結
合した第１の抗体になるであろう。多くの他のタイプの
検体が技術に精通した者にとつては明らかであろう。 検体の記述から、本発明はイムノ・アツセイや核酸プ
ローブ・ハイブリダイゼーシヨン・アツセイに用いる応
用も含んだ広い応用の可能性がある。こうして、他の応
用の中でも、本発明は植物や、人間を含む動物の病気の
診断に有用であり、さらに食物や血液、組織培養のよう
な試料の汚染の検査に有用である。 検体に対する“親和性分子”とは検対に親和性をもつ
物質（あるいは、異つた名前をつけると、特異的に結合
する物質）の分子のことである。特定の検体に特異的に
結合する物質や、それらの調製方法は、本技術分野にお
いてよく知られているところである。 抗原検体（それ自体抗体であるかもしれぬ）に対して
は、モノクローナル抗体を含む抗体が、特異的結合物質
として利用可能である。唯一つの抗体を含むサンプル中
のある種の抗体検体に対しては、ブドウ球菌プロテイン
Ａのような抗体結合タンパクを特異的結合物質として用
いることができる。 核酸（DNA又はRNA）あるいはその断片の検体について
は、検体の断片と相補的な配列の部分を含む、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチド（双方とも、DNA又はR
NA）を特異的結合物質として用いることができる。そう
した親和性分子は自動合成技術を含むイン・ビボ（in
vivo）又はイン・ビトロ（in vitro）の多くの既知の
方法のいずれかにより合成することができる。技術分野
において理解されているように、DNA又はRNA親和性分子
が、アツセイにおける前もつて決定された特異性を発揮
するために持たなければならない長さは、部分的には、
アツセイしているサンプル中の核酸の量や複雑さに依存
している。そのような親和性分子は通常、少なくとも10
ヌクレオチドを必要とする。１つの糖タンパク又は一連
の糖タンパク、あるいは、１つのポリ多糖又は一連のポ
リ多糖のような、レクチンに、特異的に結合する炭化水
素部分をもつことによりサンプル中の他の物質と区別さ
れる検体については、適当な特異的結合物質はレクチン
である。 ホルモンの検体については、ホルモンのレセプターを
特異的結合物質として用いることができる。逆に、ホル
モンのレセプターが検体のときは、ホルモンを特異的結
合物質として用いることができる。 酵素の検体については、酵素の阻害物質を特異的結合
物質として用いることができる。検体が酵素の阻害物質
のときは、酵素を特異的結合物質として用いることがで
きる。 通常、検体分子と検体分子に対する親和性分子は、特
異的結合対として、即ち、これらの相互作用は非共有結
合（例えば塩橋、水素結合、疎水的相互作用）のみを介
しているものとして関係している。 熟練者は、サンプル中の親和性分子と、存在するかも
しれぬ検体との間の結合がおこる条件を容易に決定する
ことができる。詳細には、熟練者は技術分野において
“特異的結合”と考えられている、親和性分子と検体と
の間の結合を生じさせることができる条件を容易に決定
することができる。技術分野において理解されているよ
うに、そのような特異性は通常親和性分子がサンプル中
の他の物質と構成物（例えば器壁や固体担体）よりも、
検体に対してより高い特異性を示すことによる。 本発明のアツセイ方法を実行するサンプルは、血清
や、他の体液、又は組織培養培地や食料品のような生体
物質の生のままの標本であることもありえる。より典型
的には、本方法は、生の標本を親和性分子の非特異的結
合を生じさせるなどして、検体の検出を妨げるような物
質を取り除く各種の処理を施すことにより得られた、加
工した標本のサンプルについて実施される。生の標本を
加工して、本発明のアツセイ方法により適したサンプル
を得るための方法は、技術分野においてよく知られてい
る。 こうして、本方法は、GrunsteinとHognes,Proc.Natl.
Acad.Sci.（U.S.A.）72巻、3961−3965ページ（1975
年）（例えばFalkowとMoseley,米国特許No.4,358,535;
及びShafritz,米国特許No.4,562,159なども参照せよ）
のコロニーハイブリダイゼーシヨン法や、あるいは、Be
ntonとDavis,Science,196巻、180−182ページ（1977
年）のプレーク・リフト法に従つて細胞から得た核酸に
ついて実行することができる。本方法は、また、ウイロ
イドやウイルス、あるいは標本の細胞から単離され、固
体担体上（計量棒（dipstick）上の固体担体や、ミクロ
稀釈プレート・ウエルの内壁なども含んでいる）に付着
させた（GillespieとSpiegelman,J.Mol.Biol.12巻、829
−842ページ（1965年））核酸についても行うことがで
きる。本方法はまた標本から単離され、“ドツト（do
t）”・ブロツテイング（Kafatosら、Nucl.Acid.Res.7
巻、1541−1552ページ（1979年）;WhiteとBancroft,J.B
iol.Chem.257巻、8569−8572ページ（1982年）；サザン
・ブロツテイング（Southern,J.Mol.Biol,98巻、503−5
17ページ（1975年））；“ノーザン”ブロツテイング
（Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）77巻、5201−
5205ページ（1980年））；さらに、エレクトロ・ブロツ
テイング（StellwagとDahlberg;Nucl.Acids.Res.8巻、2
99−317ページ（1980年））により固体担体上に固定さ
れた核酸についても行うことができる。 標本の核酸はまた、本発明を水層ハイブリダイゼーシ
ヨン（BrittenとKohre,Science 161巻、527−540ページ
（1968年））及び水／有機中間層ハイブリダイゼーシヨ
ン（Kohreら、Biochemistry 16巻、5329−5341ページ
（1977年）に応用した方法によりアツセイすることもで
きる。水／有機中間層ハイブリダイゼーシヨンは大変速
い速度で進行する利点があるが、ビオチンのような有機
層に可溶性の連結部分が核酸親和性分子に結合している
場合は適していない。 本発明のアツセイ方法はまた、標本から単離され、ド
ツト・ブロツテイングや“ウエスタン”ブロツテイング
（例えば、実施例XIIを参照せよ）、又は、ミクロ稀釈
プレート・ウエルや計量棒上の固体担体に吸着させるこ
により、固体担体上に固定されたタンパクやポリ多糖に
ついても行うことができる。 さらにまた、本発明の方法は、標本の細胞性タンパク
や全細胞表面のポリ多糖（例えば、実施例XIを参照のこ
と）、あるいは、レプリカ・プレートのバクテリアや酵
母のような、固体担体上に固定した微生物由来のタンパ
クやポリ多糖などの検出に応用できる。 親和性分子が、アツセイしているサンプル中に存在す
るかもしれない検体と結合する前か、又は後に、複製型
RNAは親和性分子に結合しなければならない。 “複製型RNA"とは、イン・ビトロで自動触媒的に複製
される、即ち、イン・ビトロでRNA依存性RNAポリメラー
ゼによつて触媒される反応により複製されうるいかなる
RNAでもよい。本発明の実践に適したRNAポリメラーゼ及
び複製型RNAは以下の実施例Ｉに記述されている。 これに関連して、ここで述べるバクテリオフアージＱ
βは、特定の変種や突然変異体やその個体群に限定され
ない。そのような言及は特に制限しないならば、バクテ
リオフアージＱβの感染が疑われるE.coliの感染に際し
て、RNA依存性のRNAポリメラーゼの生産を起こすいかな
る変種や突然変異体やその個体群に対してなされてい
る。 それによる感染が疑われるバクテリアの感染に際し
て、RNA依存性RNAポリメラーゼ及び、それに関連した本
発明に利用可能な、イン・ビトロで自動触媒的に複製さ
れることができる複製型RNAを生産する他のフアージに
ついては、例えばMiyakeら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.
S.A.）68巻、2022−2024ページ（1971年）を参照せよ。 複製型RNAは多くの異なる方法により親和性分子に結
合させることができるが、そのうちのいくつかについて
は実施例に記述されている。 もし、複製型RNAが、親和性分子が検体に結合する前
に、親和性分子に結合するのであれば、熟練者によく理
解されているように、親和性分子の検体に対する特異性
が失われていないことが必須であり、即ち複製型RNAに
結合した親和性分子は、アツセイにおいて試験されてい
る検体にいくらかの特異的をもつて結合する能力を維持
していなければならない。 もし複製型RNAが、親和性分子が検体に結合した後で
親和性分子に結合するのであれば、これも熟練した者に
はよく知られているように、複製型RNAの結合した親和
性分子を、親和性分子に結合していない複製型RNAから
分離できることが必須である。このことは重要な問題で
はない。通常の場合、検体に結合し、さらに固体担体に
結合した親和性分子について、そのような分離は単に洗
浄することにより容易に達成される。なぜならば、複製
型RNAが、結合した親和性分子に結合することは、親和
性分子と固体担体との関係を大きくこわしてしまうこと
がないからである。もし通常のケースが得られない場合
には、そのような分離は、よく知られたクロマトグラフ
イーや電気泳動の技術のいずれかにより容易に達成され
る。 最後に、複製型RNAの親和性分子への結合は、RNA依存
性のRNAポリメラーゼによるRNAの複製能を失わせないよ
うなものでなければならない。即ち、親和性分子に結合
している複製型RNAは、RNA依存性RNAポリメラーゼによ
る複製の鋳型であるか、あるいは、親和性分子から分離
されて、RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型の
形態をとつていることができるのである。 複製型RNAと親和性分子との間の関係の１つのタイプ
は、親和性分子自体が複製型RNAで、主に適当な配列を
もつた部分を含む組み換えRNAであるものである。その
ような親和性分子は、核酸やその断片である検体にむい
ているであろう。親和性分子は複製型RNAから、好まし
くは、Mieleら、先に引用、及びKramerら、米国特許出
願番号No.614,350の方法により、検体の部分配列と相補
的な配列を含むように調製された組み換えRNAであろ
う。この相補配列の部分は、特異性を与えるためには少
なくとも、長さは10リボヌクレオチドあり、複製能を失
わないためには長さは約4500ヌクレオチドまでのもので
ある。実施例IXに組み換えRNAを親和性分子として用い
る例が説明されている。 複製型RNAと親和性分子との間の結合は、非共有又は
共有的な結合でありうる。 親和性分子と複製型RNAの間の非共有的な結合は、親
和性分子に、複製型RNA断片の相補的な配列の核酸部分
が結合するかとりこまれるかして、さらに複製型RNAが
親和性分子に結合するかとりこまれた部分とハイブリダ
イズすることにより形成されることができる。そのよう
な核酸断片を、タンパクの親和性分子に結合させるもの
については、例えばDattaguptaら、ヨーロツパ特許出願
広報No.0154884を参照せよ。核酸の親和性分子について
は、そのような断片を結合させたり、とりこませたりす
る方法は、技術分野においてよく知られている。親和性
分子と複製型RNAとの間のそのような結合を用いて、複
製型RNAが複製されて検出が可能になるような複製型RNA
の検体に結合した親和性分子からの分離は、複製型RNA
部分と親和性分子に結合した、あるいは、とりこまれた
核酸部分との複合体の融解温度以上に加熱することによ
り達成される。 複製型RNAと親和性分子との間の非共有的な結合は、
また、複製型RNAに結合した１番目の連結部分と、親和
性分子に結合した２番目の連結部分の結合を通じて行わ
れ、ここでいう連結部分とは特異的な結合対をさしてい
る。 複製型RNAと親和性分子との間の共有的な結合は、唯
一つ共有的な両者の間の結合（複合体の２次又は３次構
造から生じた結合は除く）を通じて行われる。通常、共
有的な結合は複製型RNAに共有結合した１番目の連結部
分と、親和性分子に共有結合した２番目の連結部分と、
さらに１番目と２番目の連結部分との間の共有結合が係
わつている。 ここで述べた複製型RNA又は親和性分子に対する連結
部分の“共有的な結合”又は“共有的な連結”又は“共
有的な接合”とは、連結部分とそれぞれの複製型RNA又
は親和性分子との間の、２次又は３次構造から生じる結
合以外のすべての結合が、共有的なものであることを意
味している。ここで述べた、連結部分の複製型RNA又は
親和性分子への“結合（joining）”、“連結（linkag
e）”、あるいは“接合（connection）”とは、無条件
に、連結部分が“共有的に”又は“非共有的に”、それ
ぞれ複製型RNAや親和性分子と結合したり連結したりす
ることを意味している。“非共有的な”結合、又は連
結、接合とは、連結部分と複製型RNAや親和性分子との
間の、２次、３次構造による結合以外の、少なくともい
くつかの結合が非共有的なものであることを意味してい
る。 連結部分と複製型RNAとの間の共有的な結合で、それ
によつてRNAの複製能が失われないもののいくつかの例
として以下のものが含まれる。 （ａ）連結部分は、リン酸基であり、結合は、リン酸と
複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素との間の
直接的なもの。複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′
−炭素に結合したリン酸連結部分は、通常、核酸親和性
分子の３′−ヌクレオチドの３′−炭素へのあるいは、
核酸親和性分子の３′−末端に結合していると考えられ
ている連結部分で、さらに、その５′−ヌクレオチドの
５′−炭素におけるリン酸を介して親和性分子の３′−
ヌクレオチドの３′−炭素に共有結合している核酸断片
の３′−ヌクレオチドの３′−炭素への直接の共有結合
が、係わつている。複製型RNAの５′末端ヌクレオチド
は、技術分野において既知の方法により、５′炭素をT4
ポリヌクレオチド・キナーゼでリン参加することができ
る。実施例Ｉも参照せよ。親和性分子、あるいは親和性
分子の核酸連結部分は、次に、T4RNAリガーゼを用いる
既知の方法により、複製型RNAの５′−ヌクレオチドの
５′−リン酸に接続することができる。この後者の反応
は、もし、リボヌクレオチドが親和性分子（又は親和性
分子の連結部分）の３′−末端であればより効率的に進
行する；技術分野において知られているように、単一の
リボヌクレオチド末端デオキシヌクレオチド転移酵素を
用いて、DNAの３′−末端に付加させることができるの
である。 （ｂ）連結部分がビオチン又はイミノビオチン（imino
−biotinyl）で式−NH(CH2)aaNH(PO2)O−、式−NH(CH2)
bbSS(CH2)ccNH(PO2)O−、又は式−NH(CH2)bb(CO)(NH)(C
H2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループを介した複製
型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に連結したも
の、ここで、それぞれ、リン酸アミド基は５′−ヌクレ
オチドに、そして、アミノ基はビオチン又はイミノビオ
チンに結合しており、aaは２から20、bbとccは同じか又
は異つており、それぞれ２から20である。式−NH(CO2)
aaNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつた複製型RN
Aは、ChuとOrgel,DNA,4巻,327−331ページ（1985年）の
方法に従い合成することができる。式−NH(CH2)bbSS(CH
2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつた複製型
RNAは、実施例Ｉに説明されている。式−NH(CH2)bb(CO)
(NH)(CH2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつ
た複製型RNAは、複製型RNAを、５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合した式 −O(PO2)NH(CH2)ccNH2基と式NH2(CH2)bbCO2Hのアミノ・
カルボン酸の活性エステルと反応させることにより合成
される。１級アミノ基をもつたビオチン・アミド又はイ
ミノビオチンアミド結合を生成させるビオチン又はイミ
ノビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミノ・エステル
（Ｎ−hydroxysuccinimino）の反応は、技術分野におい
て知られており、実施例で説明されている。 （ｃ）式−(CH2)aa(NH)(PO2)O−又は−(CH2)bbSS(CH2)N
H(PO2)O−のスペーサー・グループを介して連結したア
ミノ基連結部分のものでここでリン酸アミド基は、複製
型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合してお
り、aa、bb、及びccは前述のように定義される。そのよ
うな複製型RNAの調製には、ChuとOrgel,DNA,4巻,327−3
31ページ、及び以下の実施例Ｉの方法が用いられる。 （ｄ）式−(CH2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループ
により結合したイオウ連結部分のもので、ここでリン酸
アミド基は複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭
素に結合しており、ccは前述のように定義される。実施
例ＩとＸでは、そのような連結部分とスペーサーグルー
プをもつた複製型RNAの合成について説明している。 アビジンやストレプトアビジンの連結部分と、複製型
RNAの間の“非共有”結合の例は、アビジン又は、スト
レプトアビジンがビオチン又はイミノビオチンと複合体
を（ここで述べる複合体には非共有的な相互作用のみが
係わつている）形成し、さらに、このビオチン又はイミ
ノビオチンが先に述べたスペーサー・グループの１つに
より複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結
合して複製型RNAにビオチン又はイミノビオチンを共有
的に結合させたものであろう。 核酸の親和性分子については、連結部分との共有結合
は、５′−ヌクレオチドの５′−炭素、３′−ヌクレオ
チドの３′−炭素、あるいはピリミジン又はプリン塩基
の各種原子を介して形成させることができる。連結部分
は、検体の断片の配列と相補的な配列をもつた親和性分
子の断片のそれぞれ３′−、５′−末端から伸長する核
酸断片の３′又は５′未満のヌクレオチドである。連結
部分は、例えば、上述のスペーサー・グループの１つを
介して、複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′炭素に
結合するように、親和性分子の５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合した、ビオチン又はイミノビオチン、
あるいは、硫黄原子であろう。ビオチン連結部分（複数
のこともある）は、それにより親和性分子が検体にハイ
ブリダイズする、検体の断片の配列と相補的な配列をも
つ断片以外の核酸親和性分子の部分において、各種のス
ペーサー・アームを介してウラシル（uracil）残基（複
数のこともある）の５−炭素あるいはアデニン（adenin
e）残基（複数のこともある）の８−炭素又は６−炭素
に結合していることもあろう。例えばRuth、特許協会条
約広報No.84/03285;BrakelとStarvianopoulous、ヨーロ
ツパ特許出願広報No.0122614を参照せよ。複製型RNAに
ついては、親和性分子に適当な特に親和性分子の検体に
対する親和性を失わせないような、多くの他の連結部分
やスペーサー・グループ、さらに、そのような連結部分
やスペーサー・グループをもつた親和性分子の調製方法
などが、技術分野において知られている。 抗体、抗原あるいは、レクチンの親和性分子について
は、多くの連結部分（例えば、ビオチン、複製型RNAの
ハイブリダイゼーシヨンに用いる核酸断片、硫黄原子な
ど）や、それらを、直接、又はスペーサー・グループを
介して親和性分子に共有結合させる適当な方法が技術分
野において知られている。例えば多くのビオチニル化さ
れた抗体やレクチンが購入可能である。 アビジン又はストレプトアビジンのような連結残基
と、抗体、抗原、又はレクチン親和性分子との間の“非
共有”結合の１つの例は、アビジン又はストレプトアビ
ジンがビオチンやイミノビオチンと複合体をつくつてお
り、これが、親和性分子に非共有的あるいは、共有的に
連結したものである。例えばビオチンは、技術分野にお
いて理解されているように、ビオチニル化した抗−抗
体、又は、ビオチニル化したブドウ球菌プロテインＡ
と、抗体親和性分子の複合体を形成させることにより、
非共有的に抗体親和性分子に結合させることができる。 技術における補促的な情報として、タンパクや核酸に
連結残基を結合させる方法に関しては、例えばDreyerと
Dervan,Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）82巻、968−972
ページ（1985年）;Forsterら、Nucl.Acids,Res.13巻、7
45−761ページ（1984年）;Wardら、ヨーロツパ特許出願
広報No.0063879;Englehardtら、ヨーロツパ特許出願広
報No.0097373;AlagonとKing,Biochemistry19巻、4341−
4345ページ（1980年）;Imamら、Cnacer Res.45巻、263
−271ページ（1985年）を参照せよ。 複製型RNAに結合した１番目の連結部分と親和性分子
に結合した２番目の連結部分は、（２つの硫黄原子連結
部分から形成されるジスルフイド残基や、複製型RNAの
５′−末端のリン酸に結合した核酸親和性分子の３′−
末端から伸長したヌクレオチドのように）相互に共有結
合したり、あるいは、（アビジン又は、ストレプトアビ
ジンに結合したビオチンやイミノビオチン、対応する抗
体に結合した抗原、又は、酵素に結合した酵素阻害剤の
ように）特異的な結合対として相互に非共有的に相互作
用することにより、複製型RNAと親和性分子との間の結
合を形成する。 先に示したように、親和性分子と複製型RNAとの間の
共有結合の１つの例は、親和性分子がイン・ビトロで合
成される間か、又は、末端デオキシヌクレオチド転移酵
素を用い、そして次に、T4RNAリガーゼを用いて、５′
末端を介して（１つ又はそれ以上の）プリンの伸長３′
−末端に複製型RNAを結合させる間に、DNA親和性分子の
３′−末端に付加された伸長プリン残基を介して形成さ
れる結合である。技術分野において理解されているよう
に、この連結部分の３′−末端におけるプリン・ヌクレ
オチドは、複製型RNAへの付加を効率よく進行させるた
めには、リボヌクレオチドであるべきである。そのよう
な親和性分子−複製型RNAハイブリツドが検体に結合し
た後で、もし、これがRNAレプリカーゼの鋳型として活
性できないときには、酸脱プリン反応、次にβ−脱離に
よりリン酸ジエステル結合を開裂させて、RNAをDNAから
解離させることができ、そこでレプリカーゼの鋳型とし
て用いることができる。 他の例には、T4RNAリガーゼを用いて、RNA親和性分子
を複製型RNAのどちらかの末端に結合させるものがあ
る。そのような分子は、複製型RNAと、検体とハイブリ
ダイズする親和性分子の断片との間に、多少のリボヌク
レオチドをもつように調製される。その結果得られたRN
Aは、もし親和性分子RNAが複製型RNAの５′−末端に付
加しているのであれば、それ自体RNAレプリカーゼの鋳
型となることができる。もし、その結果得られたRNA
が、レプリカーゼの鋳型とはならない場合、親和性分子
部分は、複製型RNA部分から解離させ複製型RNAを放出さ
せる。そのような解裂は、初めに、複製型分子と、検体
にハイブリダイズする親和性分子部分の間の断片と相補
的な配列をもつオリゴデオキシリボヌレオチドと、分子
をハイブリダイズさせ、（検体にハイブリダイズさせる
か、又は検体にハイブリダイズさせた後、加熱する（又
は融解する）ことにより遊離させ）、次に、RNAがDNAと
ハイブリダイズする位置で特異的にRNAを切断するリボ
ヌクレアーゼＨを用いて、開裂させるのである。Donis
−Keller,Nucl.Acids Res.7巻、179−192ページ（1979
年）を参照せよ。 本発明に従う、親和性分子−複製型RNAハイブリッド
化合物（即ち、親和性分子が複製型RNAに結合している
化合物）の中には、“スマート・プローブ”がある。
“スマート・プローブ”とは、親和性分子が核酸であ
り、２番目の連結部分が親和性分子に共有結合してお
り、１番目の連結部分が複製型RNAに共有結合してい
て、さらに１番目と２番目の連結部分が相互に共有結合
している親和性分子−複製型RNAハイブリッド分子のこ
とである（即ち、２次、３次構造による結合を除いて、
２つの連結部分の間のすべての結合は共有的である）。
さらにスマート・プローブでは、親和性分子と２つを結
合している１番目と２番目の連結部分、さらにこの２つ
の連結部分を結合しているいかなる部分も、理想的に
は、もし親和性分子部分が検体にハイブリダイズしてい
れば、あるいは、しているときだけハイブリツド分子の
複製型RNAが、RNA依存性のRNAポリメラーゼにより複製
されるようになつているのである。要するに、このプロ
ーブはそれ自体検体と結合して検出を可能にするから
“スマート”なのである。 本発明に従つたスマートプローブの１つの具体例は、
複製型RNA部分が親和性分子部分の３′−末端断片の配
列と相補的な配列をもつ、約10から30のリボヌクレオチ
ドの短い断片を含む組み換え複製型RNAのものである。
この組み換え複製型RNAは、例えば、Mielら、先に引
用、及び、クラマー（Kramer）ら、米国特許出願番号N
o.614,350先に引用、の方法に従つて合成する。親和性
分子部分は、典型的には約75から150ヌクレオチドの長
さで、これは、複製型RNA部分に組み換えられた部分の
配列と相補的な配列をもつ部分よりもいくぶん長く、さ
らにこれは、技術分野において既知の多くのイン・ビト
ロやイン・ビボの方法のいずれかにより合成される。組
み換え複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素と
親和性分子部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭素は、
実施例Ｉ及びＸの方法に従い、式−O(PO2)NH(CH2)aSS(C
H2)bNH(PO2)O−の部分によりスマート・プローブ中に結
合させる。ここでａとｂは同じか、または異なるもので
あり、それぞれ２から20である。そのようなスマート・
プローブでは、親和性分子部分が何か他のものとより安
定に結合していない場合（そのような結合は、実質的に
は、検体との特異的な結合か又は、非特異的な結合だけ
である）、親和性分子部分の３′−末端は、組み換えRN
A部分とハイブリダイズしたままになつている。プロー
ブの使用に際しては、初めにサンプルの核酸とのハイブ
リダイゼーシヨンを行い、次にリボヌクレアーゼＨの溶
液を加えると、親和性分子部分が複製型RNA部分から解
離していないスマート・プローブの、複製型RNA部分の
開裂と複製能の喪失がおこる（Doonis−Keller（1979
年）、先に引用、を参照せよ）；次に結合していないス
マート・プローブを除くために短い洗浄を行い、さらに
親和性分子部分が、複製型RNAがリボヌクレアーゼＨに
よる開裂を受けないように、複製型RNAから解離してし
まつている、少量の非特異的結合をおこしたスマート・
プローブの量を減ずる；そして最後に、ジチオスレイト
ール（dithiothreitol）でジスルフイド結合を開裂し
て、複製型RNAを親和性分子から解離させた後で、RNAを
複製し、複製したRNAを検出することにより検出を行う
のである。 本発明のスマート・プローブのもう１つの具体例で
は、標的とハイブリダイズしていないプローブの複製型
RNAを不活性化するのにリボヌクレアーゼＨによる開裂
を必要としていない。この具体例では、親和性分子部分
の５′−ヌクレオチドの５′−炭素は、他の具体例と同
様に、式−O(PO2)NH(CH2)aSS(CH2)bNH(PO2)O−の部分に
より、複製型RNA部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭
素に結合している。この具体例では、どんな複製型RNA
をも用いることができる。親和性分子部分に対応する組
み換え複製型RNAを調製する必要はない。しかしながら
この具体例では、親和性分子部分は、本質的に以下の３
つの部分から構成されている：即ち、親和性分子がハイ
ブリダイズする検体の部分配列を相補的な配列中の約50
から150ヌクレオチドからなる“検体−結合”部分；親
和性分子の５′−ヌクレオチドから、検体結合部分の
５′−ヌクレオチドへ伸長し、（しかしこの部分を含ん
ではいない）、複製型RNAの部分の配列と相補的な配列
中の約30から60ヌクレオチドからなる“５′−クランプ
（clamp）”部分；そして、検体−結合部分の３′−ヌ
クレオチド（しかし、この部分は含まない）から、親和
性分子の３′−ヌクレオチドへ伸長し、親和性分子の
５′−クランプ部分がハイブリダイズする部分よりも、
さらに、複製型RNAの５′−末端に近接する複製型RNAの
部分と相補的な配列中の、約30から60ヌクレオチドから
なる“３′−クランプ”部分である。 技術分野において知られている方法による、この具体
化では随意に、親和性分子の５′−クランプ部分及び
３′−クランプ部分とハイブリダイズする複製型RNA部
分の少なくともいくつかのグアノシン塩基はイノシンで
置換することができる。この効果は、（クランプしてい
ない）複製型RNAを複製の鋳型として活性なものとし、
さらに、これら複数型RNA部分で、DNA−RNA塩基対を安
定化し、逆にRNA−RNA塩基対を不安定なものにすること
である。この具体例の親和性分子は、他の場合と同様
に、既知のイン・ビトロ又はイン・ビボの方法により合
成される。複製型RNA部分の親和性分子部分への連結
は、実施例Ｉ及びＸに従つて行う。この具体例では、親
和性分子の３′−クランプ部分と５′−クランプ部分の
双方が、複製型RNAにハイブリダイズしている間、複製
型RNAは非複製型に“クランプ”されており、複製の鋳
型として不活性である。一度、スマート・プローブが、
１つ、又は、他のクランプ部分が複製型RNAから解離す
るようにして親和性分子部分が十分な安定性をもつて結
合するような何物かと、（それは本質的に検体だけであ
ろう）遭遇すれば、RNAはとたんに複製可能になり検出
可能な形をとる。本発明のスマート・プローブの具体例
の利用に際して、まず初めに、サンプルの核酸とのハイ
ブリダイゼーシヨンを行い、次に、短い洗浄を行なつて
結合していないスマート・プローブを除き、さらに、一
方又は両方のクランプ部分が複製型RNAから遊離してい
る。少量の非特異的な結合をしたスマート・プローブを
減少させ、最後に、ジチオスレイトールでジスルフイド
結合を開裂して複製型RNAを親和性分子から解離させた
後、随意に、RNAを複製させ、複製したRNAを検出するこ
とにより検出を行うのである。 検体を含まない部位に非特異的に結合した複製型RNA
から生じるシグナルは、本発明に従うスマートプローブ
を用いると減少してしまうので、比較的低いバツク・グ
ラウンドを得るためのハイブリダイゼーシヨンの後での
長時間の洗浄の必要性は、技術分野において現在行われ
ている典型的な核酸プローブ・ハイブリダイゼーシヨン
・アツセイに比べて、そのようなプローブを用いたアツ
セイでは小さなものとなる。 イムノアツセイや核酸プローブ・ハイブリダイゼーシ
ヨン・アツセイの技術に習熟した者には理解できること
だが、“バツク・グラウンド”を生じる、親和性分子や
複製型RNAの（そのRNA部分あるいは一番目の連結残基部
分を介しての）不可避的な“非特異的結合”を取り除
き、ただ検体に（親和性分子に結合したり又は結合しつ
づけて）連結した複製型RNAだけがアツセイ系に存在す
るように、必要な結合をおこさせ、洗浄のステツプを行
つた後で、系をRNA依存性のRNAポリメラーゼを用いる複
製からなるプロセスにより、複製型RNAが検出可能にな
る条件にかけるのである。 現在の発明に従つてアツセイを行う上で、アツセイ中
の検体に結合する又は結合している親和性分子に結合し
た複製型RNAは、親和性分子に結合している間か、ある
いは、それから分離された後のどちらかにRNA依存性RNA
ポリメラーゼにより複製されうることが必要である。複
製型RNAを親和性分子から分離させる各種の方法を先に
記述したがその中には、複製型RNAを親和性分子に結合
させている連結部分の中の、又は、間のジスルフイド結
合を還元的に切断する方法が含まれている。 複製型RNAをRNA依存性RNAポリメラーゼで複製する方
法は、技術分野において知られている。一般に、RNA
は、４つのリボヌクレオシド−５′−三リン酸、ATP、C
TP、GTP及びUTPを含む適当な水系緩衝液中、単に酵素と
混合し、適当な温度でインキユベートしなければならな
い。例では、好まれる酵素であるＱβレプリカーゼを用
いて複製を行う条件を説明している。Kramerら、M.Mol.
Biol.89巻、719−736ページ（1974年）;Kramerら米国特
許出願広報No.614,350;Mielら（1983年）先に引用、な
ども参照せよ。 別法として、親和性分子から解離した複製型RNAは、E
CTEOLAペーパーのような、正に荷電した担体に結合させ
ることができる（Sarisら、Nucl.Acids.Res.10巻、4831
−4843ページ（1982年））。複製型RNAの結合したその
ような担体は、適当な緩衝液を用いて４つのリボヌクレ
オシド−５′−三リン酸とともに適当な温度のもと、RN
Aレプリカーゼ（RNR依存性RNAポリメラーゼ）の溶液に
懸濁させると（即ち液相の複製に用いたのと本質的に同
じ条件である）、すると担体に結合したRNAの複製が起
きるのである。Sarisら（1982年）上述；及びBresser
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）80巻、6523−6527
ページ（1983年）を参照せよ。簡便なRNAの検出では、
複製型RNAは正に荷電した担体に結合したままである。 複製型RNAは多くの異なる方法により検出することが
できる。 検出は、例えば、接触光プリンテイング法（Kutatela
dzeら、Anal.Biochem.100巻、129−135ページ（1979
年））のように複製型RNAの紫外線吸収により行うこと
ができる。 複製されたRNAが放射活性をもつように、複製反応
中、放射活性で標識した（例えば、3Hラベルとか、α−
32PO4−ラベルなど）リボヌクレオシド−５′−三リン
酸を用いることにより、複製されたRNAをその放射活性
により多くの既知の方法のいずれかを用いて検出するこ
とができる。 ビオチン又はイミノビオチンは複製型RNAにとりこま
せることができる、これはさらに既知の技術を用いて、
RNAの結合したビオチンに結合し、簡単に検出すること
のできる色素の生成を触媒する、酵素−アビジン又は酵
素−ストレプトアビジン付加物として検出することがで
きる。Metthewsら（1985年）上述;Learyら（1983年）、
上述;Wardら、上述;Englehardtら、上述、を参照せよ。
ビオチン又はイミノビオチンの複製型RNAへのとりこみ
は、ウラシル残基の５位の炭素にスペーサーを介してビ
オチニル化されたUTPを、複製反応のレプリカーゼの基
質として用いることにより行うことができる。そのよう
なUTPは既知の化合物である。さらに、そのようなUTPは
Ｑβレプリカーゼの基質となり、さらに、５位の炭素に
結合したスペーサー・グループを介してビオチニル化さ
れたウラシルを含むRNAは、その合成にそのようなUTPを
用いたために、Ｑβレプリカーゼが触媒する複製の鋳型
となることが知られている。 複製の過程の結果生じたRNAもまた、Forsterら（1985
年）上述、の方法に従い、光ビオチン酢酸を用いてビオ
チニル化することができ、さらに次に、アビジン−酵素
付加物−色素原化合物の系を用いて、複製反応において
ビオチニル化したUTPを使つて合成した複製型RNAと同様
に検出することができる。 複製過程の結果生じたRNAは、T4RNAリガーゼの触媒す
る反応を用いて、複製型RNAの３′末端に螢光修飾した
核酸を付加することにより、螢光をもたせることができ
る。Cosstickら、Nucl.Acid.Res.12巻、1791−1810ペー
ジ（1984年）を参照せよ。その結果得られたRNAの螢光
は、いつかの標準的な技術のいずれかにより、RNAの検
出に用いることができる。 複製されたRNAの検出に用いることのできるさらに他
の方法の中には、核酸と特異的に結合する受容体物質
を、複製が行なわれる系か、あるいは、複製型RNAが単
離されているECTEOLAペーパーのような正に荷電した担
体などの媒体に添加して、受容体物質から生じるシグナ
ルを測定するものがある。そのような物質には以下のも
のが含まれる：“ステイン・オール（Stains all）”の
ような色素原染料（Dahlbergら、J.Mol.Biol.41巻、139
−147ページ（1969年）；メチレンブルー（DingmanとPe
acock,Biochemistry,7巻、659−668ページ（1968年）及
び銀染色（Sammonsら、Electrophoresis,2巻、135−141
ページ（1981年）、Igloi,Anal,Biochem.134巻、184−1
88ページ（1983年）；例えば臭化エチジウムなどのRNA
に結合する螢光原化合物（Sharpら、Biochemistry,12
巻、3055−3063ページ（1973年）;BaileyとDavidson,An
al.Biochem.70巻、75−85ページ（1976年）;Qβレプリ
カーゼによる複製の鋳型となるRNAに特異的に結合する
螢光原化合物……例えばＱβレプリカーゼの感染サブ・
ユニツトに共役するフイコビリ・プロテイン（phycobil
iprotein）（Oiら、J.Cell Biol,93巻、981−986ページ
（1982年）、Stryerら、米国特許No.4,520,110）などで
ある。 レプリカーゼの濃度が、鋳型RNAの濃度ふりも濃いま
まであり、さらにリボヌクレオシド−５′−三リン酸の
濃度の制限を受けないと仮定すると、鋳型RNAの濃度
は、レプリカーゼの触媒によるRNAの複製の間、時間と
ともに対数的に増大するであろう。鋳型RNAの濃度が、
レプリカーゼの濃度と等しくなるか、超えてしまつた後
では、リボヌクレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限
を受けないかぎり、鋳型RNAの濃度は、時間に直線的に
増加するであろう。例えばKramerら（1974年）上述、を
参照せよ。 実施例Ｉに特定されるレプリカーゼ触媒による複製の
条件下では、MDV−1 RNAは36秒毎にその濃度を倍化し、
ついには、鋳型の濃度が酵素の濃度を上回つてしまうこ
とが示されている。 レプリカーゼ触媒による複製反応系で、一定の反応時
間の後の鋳型RNAの濃度は、鋳型RNAの初期濃度に関係す
ることになる。もし、複製反応の間中、レプリカーゼの
濃度が鋳型の濃度よりも高いものと仮定すれば、（さら
にリボヌクレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限を受
けなければ）、反応終了時の鋳型RNAの濃度の対数は、
鋳型の初期濃度（反応開始時点の）対数に、直接比例す
るであろう。レプリカーゼの濃度が鋳型の濃度よりも低
くなつた後では、リボヌクレオシド−５′−三リン酸の
濃度の制限を受けないかぎり、反応終了時の鋳型の濃度
は、鋳型の初期濃度の対数に直接比例する。さらに、鋳
型の濃度がレプリカーゼの濃度に等しくなるまでに要す
る反応時間は、鋳型の初期濃度の負の対数に比例する。 複製反応をより長時間進行させることにより、さらに
大きな感度を得ることができる。 本発明に従うアツセイでは、検体を試験しているサン
プルとコントロールサンプルの双方のテストサンプルに
ついてできるだけ同じような条件下で同時にアツセイを
行うのである。技術分野において理解されているよう
に、コントロールサンプルは、検体を含まないか、ある
いは既知の量の検体を含む点以外はテスト・サンプルと
同様なものになるようにする。検体を含まないコントロ
ールは“バツク・グランド”であり、それ以下のとき
は、検体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別す
ることは不可能である。テスト・サンプルのアツセイで
複製された複製型RNAの量又は濃度を、同時にアツセイ
したコントロール・サンプルの量又は濃度と比較するこ
とにより、テストサンプル中の検体の存在をバツク・グ
ランド以上のレベルで決定することができるのである。
もし、既知の濃度範囲の検体を加えたコントロール・サ
ンプルを用いたときは、テスト・サンプル中の検体の濃
度を推測することができる。 ここで、本発明を実施例によりさらに詳細にわたつて
記述してみる。 実施例１ 本実施例はビオチン及びアビジン（次に）の中間変種
RNA（「MDV−１」RNAとする）への結合において、該RNA
がＱβRNAポリメラーゼに対する鋳型として活性を保持
し、ビオチンまたはビオチン＋アビジンから分離可能で
ある、同方法を示す。ビオチン−アビジン特異的結合ペ
アーを介してアビジンに特異的に結合する能力のため
に、ビオチンのみが付いたMDV−1 RNAはアビジン骨格が
結合されうる（例えば、該親和性分子に直接自身で結合
されるビオチンを介して）いずれの親和性分子に対して
も普遍的レポーターとなり、その際、親和性分子の標的
生物ポリマー検体に特異的に結合する能力は損わない。
ビオチンに特異的に結合する能力（ビオチンとアビジン
との間の特異的結合ペアーに由来する）のために、ビオ
チン及びアビジン（ビオチンに対して複合体形成したも
の）を結合したMDV−1 RNAが、ビオチン骨格が結合され
うるいずれの親和性分子に対しても普遍的レポーターと
して使用されうるが、その際該ビオチン骨格自身のアビ
ジンに特異的に結合する能力または該親和性分子の標的
生物ポリマー検体に特異的に結合する能力は損わない。
（アビジンは４つのビオチン−反応生部位を有してお
り、それ故ビオチン−アビジン−ビオチン結合という中
間組成物となりうる。） MDV−1 RNAはミール（Miele）ら、J.Mol.Biol.171
巻、281−295ページ（1983年）において示される、中間
変種RNA変異株と同じ配列を有しており、次の相違点が
ある。ミールらの配列の43位ＣがMDV−1 RNAにおいてＵ
に変えられる。ミールらの配列の61位ＡがMDV−1 RNAに
おいてＧに変えられる。ミールらの配列における105位
ＡがMDV−1 RNAにおいてＵに変えられる。ミールらの配
列の134位ＣがMDV−1 RNAにおいてＵに変えられる。最
後に、ミールらの配列における135位ＧがMDV−1 RNA配
列においてＡに変えられる。今述べられた配列をもつ特
定のRNA変異株は本明細書の本実施例及び他の実施例に
おいて使用されたが、本変異株は、単に供給面で簡便に
入手可能であるという理由から使用された。該Ｑβレプ
リカーゼによる試験管内での複製に対する鋳型となるい
くつかのRNA（「野生型」中間変種RNA、MDV−1 RNAとは
異なる中間変種RNAの変異株、ミニ変種RNA、ミクロ変種
RNA、ナノ変種RNAのひとつ、同定はされているが名前が
まだ決定されていない他の変種または上記いずれかの突
然変異株で試験管内で該Ｑβレプリカーゼによる複製を
うける能力を保持しているものを含む）もまた使用され
うる。 さらに、ＱβRNA−依存生RNAポリメラーゼは、その試
験管内における著しい安定性のために本発明に対する好
適なレプリカーゼであるが、使用されうる技術において
知られている他のRNA−依存性RNAポリメラーゼがあり、
これは同ポリメラーゼが複製に対する鋳型として認識す
る複製可能RNAとともに非常に数が多い。これら他の酵
素の中にはSPレプリカーゼ及びMS2レプリカーゼが含ま
れる。 Ｑβレプリカーゼを用いる酵素的合成により得られる
５′−pppMDV-1（＋）RNAは一連の工程； １）５′−末端３リン酸基は子ウシ腸アルカルフオスフ
アターゼとのインキユベーシヨンにより除去され、〔ガ
ンマ−32P〕ATP及びT4ポリヌクレオチド・キナーゼとの
インキユベーシヨンにより５′−末端１リン酸に換えら
れた； ２）５′−フオスフオロイミダゾール基がカツプリング
試薬、１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピ
ル〕カルボジイミドの存在下イミダゾールとの縮合によ
り合成された； ３）該イミダゾール基はシスタミン・ジヒドロクロリド
とのインキユベーシヨンによりシスタミン基に転換され
た； ４）ビオチンがビオチニル化試薬、Ｎ−ヒドロキシサク
シニミドビオチンとのインキユベーシヨンによりシスタ
ミンに結合された；そして ５）アビジンがアビジンとのインキユベーシヨンにより
５′−ビオチン基に結合された により５′−ビオチニル化MDV−１（＋）RNA−アビジン
付加物に転化された。また、６）該５′−ビオチニル化
MDV−1 RNA−アビジン付加物は部分反応した中間体から
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。次の反
応式の初めの４工程は上述の工程２）〜５）を要約す
る： 式に示される５番目の工程は以下で述べるようにビオ
チン−アビジンからRNAを分離するための、シスタミン
骨格のジスルフイドの還元的開裂を示す。 RNA−ビオチン−アビジン付加物（II）の電気泳動上
での移動度は、その大きさのため、５′−ビオチニル化
RNA前駆体（Ｉ）の移動度よりも低かつた。 形成したRNA−ビオチン−アビジン付加物の量（各ゲ
ルのバンド中の放射活性を測定することにより決定され
る）はアビジン濃度の関数として漸近的に増加し、形成
付加物25〜35％で最大値に対した。RNA−ビオチン−ア
ビジン付加物（II）の同定は３つの方法で確かめられ
た： １）該５′−シスタミンMDV−1 RNAがアビジンとインキ
ユベートされ、生成物の電気泳動上の移動度が、未反応
対照のそれと同定され、遅い移動バンド中の付加物は非
ビオチニル化前駆体でないことを示した； ２）同様に、該５′−リン酸化MDV−1 RNAがビオチニル
化試薬と反応、電気泳動による精製、アビジンとのイン
キユベートのそれぞれがなされ、その移動度が同一のま
まであつた；そして ３）遅い移動度のバンドから溶出される該付加物の80％
以上がビオチニル化アガロースに結合していたが、５′
−シスタミンを含む対照物の場合では10％以下であつ
た。 さらに詳細な記述として、ビオチン及びアビジンのMD
V−１（＋）RNAの５′−末端への結合及び該付加物の同
定が、材料を使い、次の方法に従つて行われた： 酵素及び化合物 次のものが購入された：子牛腸アルカリフオスフアタ
ーゼ（ボーリンガー・マンハイムバイオケミカルス、イ
ンデイアンポリス、インデイアナ州、米国）、バクテリ
オフアージT4ポリヌクレオチドキナーゼ（フアルマシア
Ｐ−Ｌバイオケミカルス、ピスキヤタウエイ、ニユージ
ヤージー州、米国）；リボヌクレアーゼT1及び高重合酵
母RNA（キヤルバイオケム−ベーリング、サンデイエ
ゴ、カリフオルニア州、米国）;N−ヒドロキシサクシニ
ミドビオチン（シグマケイカル社、セント・ルイス、ミ
ズーリ州、米国）;2,2′−ジチオビス（エチルアミン）
−ジヒドロクロライド（CTCオーガニツクス、アトラン
タ、ジヨージア州、米国）;1−エチル−３−〔３−ジメ
チルアミノプロピル〕カルボジイミド（アルドリツチ・
ケミカル社、ミルウオーキー、ウイスコンシン州、米
国）；ビオチン化アガロース（8mgアビジン/ml結合）及
びアビジンDN（ベクター、ラポラトリース、バーリンゲ
ーム、カリフオルニア州、米国）；及び〔ガンマー
32P〕ATP及び〔アルフア−32P〕GTP（アマーシヤム、ア
ーリントン・ハイツ・イリノイ州、米国）。ＱβRNAレ
プリカーゼは、ヨーヤング（Eoyang）及びホガスト（Au
gust）（文献、ヨーヤングら、（1971年）、Nucleic Ac
id Research,G.L.カントニ（Cantoni）及びD.R.デーヴ
イース（Davies）の編集による（ハーパー・アンド・ロ
ー、ニユーヨーク）、第２巻、829〜839ページ中の操
作）の操作により、バクテリオフアジＱβ感染大腸菌株
Q13から単離され、該ヒドロキシアパタイトの工程は省
かれた。 MDV−１（＋）RNAの調整 容易に同定及び単離が可能な（クラマー（Kramer）
ら、J.Mol.Biol.89巻、719−736ページ、974年参照）中
間変種RNAの変異株が実施例において使用され、ここで
は「MDV−1 RNA」として言及される。この配列は前述さ
れる。758μｇのMDV−1 RNAは、705ngのMDV−１（＋）R
NA変異株鋳型及び69μｇのＱβレプリカーゼを、210分
間、37℃で1mM ATP、1mM CTP、1mM GTP、1mM UTP、15mM
MgCl2、100mMトリス−HClを含有する1ml中、pH7.5でイ
ンキユベートすることにより合成された。該インキユベ
ーシヨン混合物は次にフエノールによる抽出（メソツズ
・イン・エンザイモロジー、L.グロスマン（Grossman）
及びK.モルデイブ（Moldave）による編集（アカデミツ
ク・プレス、ニユーヨーク）、12巻、パートＢ、87−10
0ページ、1968年におけるK.S.カービー（Kirby））によ
り脱タンパクされ、該RNAは、2M酢酸アンモニウム存在
下−20℃で２倍量のエタノールを用いる沈澱により単離
された。MDV−１（＋） RNAはMDV−１（−）RNAから、1
mM MgCl2存在下アクリルアミドゲル電気泳動により分離
された（D.R.ミルズ（mills）ら、セル、15巻、541−56
0ページ、1978年）。 化学修飾RNAの分析及び単離 RNA中間体は、100mM NaCl、1mM EDTA、10mMヘペス（p
H7.5）｛T.マニアテイス（maniatis）ら、Molecular Cl
oning:ラボラトリ・マニユアル、コールド・スプリング
・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニユーヨーク州、1982年｝で平衡化させたセフアデ
ツクスＧ−50（フアルマシア P−L バイオケミカルズ）
を通す、スピン・カラム・クロマトグラフイーによつて
反応混合物から単離された。RNAは100mM NaCl存在下、
−20℃で２倍量のエタノール添加により、溶液から沈澱
された。電気泳動は、90mMトリス−ホウ酸、pH8.3、1mM
EDTA中で添加・展開される、厚さ1mmの６％ポリアクリ
ルアミド・ゲル上で行われた。変性ゲルはまた、7Mの尿
素を含有した。変性ゲル上での電気泳動前に、RNAは7M
尿素中90℃で１分間加熱により融解され、ただちに冷却
された。ゲルのオートラジオグラフは、デユポン・クロ
ネツクス・ライトニング・プラス（Dupont Cronex Ligh
tnig Plus）強化スクリーン存在（あるいは非存在）
下、−80℃でコダツクＸ−オマツトARフイルムに露出す
ることにより得られた。RNAは500mM酢酸アンモニウム、
pH7.5、1mM EDTA（T.マニアテイスら、前述）により、
ゲルから溶出された。 ５′−pppMDV−１（＋）RNAの脱リン酸化 該５′−末端トリフオスフエートグループは２μｇの
MDV−１（＋）RNAから、0.7EU子牛腸アルカリフオスフ
アターゼと30分間、50℃で、50μｌの50mMトリス−HC
l、pH8、100μM EDTA中でインキユベートすることによ
り除去された。さらに0.7EU子牛腸アルカリフオスフア
ターゼが加えられ、該インキユベーシヨンはさらに30分
間継続された。該反応は、該インキユベーシヨン混合物
を100mM NaCl及び２％ドデシル硫酸ナトリウム中に空
け、これを15分間60℃で加熱することにより停止され
た。該溶液は次にフエノール：クロロホルム（1:1）で
２度、クロロホルムで２度（T.マニアテイスら、前述）
抽出することにより、脱タンパクされた。該脱リン酸化
MDV−1 RNAは次にエタノールによる沈澱により単離され
た。 MDV−1 RNAの５′−32Pリン酸化 ２μｇの脱リン酸化MDV−1 RNAは３分間、50℃で、10
mMトリス−HCl20μｌ（pH7.5）、1mMスペルミジン、100
μM EDTA中でインキユベートされ、次いで、迅速に冷却
された。該容量は次に12.2p molの〔ガンマ−32P〕ATP
（300Ci/mol）、30EU T4ポリヌクレオチド・キナーゼ及
び、最終濃度でMgCl210mM、ジチオトレイトール1mM、ト
リス−HCl 50mM（pH7.5）になる緩衝液を用いて40μｌ
とされた。この溶液は75分間37℃でインキユベートされ
該混合物を20mM EDTAに空けることにより停止された。
該キナーゼは同量のフエノール：クロロホルム（1:1）
で抽出され、該リン酸化MDV−1 RNAはエタノールを用い
る沈澱により単離された。該RNAは、セフアデツクスＧ
−50を通すスピン・カラム・クロマトグラフイー、それ
に続くエタノールによる再沈澱によつてさらに精製さ
れ、次いで1mM EDTA−NaOH（pH8）中に懸濁化された。 MDV−1 RNAの５′−シスタミン−MDV−1 RNAへの転化 ２μｇの〔５′−32P〕MDV−1 RNA及び16μｇの高重
合酵母RNA（180μｇの酵母RNAと50EUの子牛腸アルカリ
フオスフアターゼと１時間50℃でインキユベートするこ
とにより前もつて脱リン酸化されたもの）が３分間、50
℃で20μｌの1mM EDTA−NaOH（pH8）中でインキユベー
トされ、次いでただちに冷却された。25μｌの1Mイミダ
ゾール（pH6）及び2.5μｌの1.5M 1−エチル−３−〔３
−ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミドが次に加え
られ、該混合物は１時間23℃でインキユベートされた。
RNAはこの混合物から、セフアデツクスＧ−50を通すス
ピン・カラムクロマトグラフイーにより単離された。
〔５′−32P〕MDV−1 RNAの５′−イミダゾライド（非
転化〔５′−32P〕MDV−1 RNAを含む）は100mM NaCl、1
mM EDTA、10mMヘペス（pH7.5）100μｌ中で集められ
た。1M2,2′−ジチオビス（エチラミン）−ジヒドロク
ロライド（シスタミン・ジヒドロクロライド、pH7.7）
が次に加えられ、最終濃度25mMとされ、該溶液は１時間
50℃でインキユベートされた。該RNAは次にセフアデツ
クスＧ−50を通すスピン・カラムクロマトグラフィーに
より単離され、エタノールを用いて沈澱された。 ５′−シスタミン−MDV−1 RNAの５′−ビオチン化シス
タミン−MDV−1 RNAへの転化 該５′−シスタミン−〔32P〕MDV−1 RNA（非転化〔
32P〕MDV−1 RNAを含む）は200mMヘペス（pH7.7）、1mM
EDTA 40μｌに溶解され、40分間、23℃でインキユベー
トされた。過剰のＮ−ヒドロキシサクシニミドビオチン
は遠心分離により除去され、該RNAは次にエタノールを
用いて沈澱された。該５′−ビオチン化MDV−1 RNA
（Ｉ）（非ビオチン化RNAを含む）は変性ゲル上での電
気泳動により過剰のＮ−ヒドロキシサクシニミドビオチ
ンからさらに分離された。該32P−標識バンド中のRNAは
該ゲルから溶出されエタノールを用いる数回の沈澱によ
り精製された。 ５′−ビオチン化MDV−1 RNAの非ビオチン化MDV−1 RNA
からの分離 50から200μｇの部分５′−ビオチン化〔32P〕MDV−1
RNAは２から10μｇのアビジンDN（ベクター・ラボラト
リー、バーリンゲーム、カリフオルニア州、米国から購
入されたアビジンの高純度型）と45分間、23℃で10mMヘ
ペス（pH7.7）、1mM EDTA中でインキユベートされた。
該５′−ビオチン化〔32P〕MDV−1 RNA−アビジン付加
物（II）は、非ビオチン化〔32P〕RNA及び遊離アビジン
から、変性ゲル上の電気泳動により分離された。該５′
−ビオチン化MDV−1 RNA−アビジン付加物は次に該ゲル
から抽出され、エタノールを用いて沈澱された。 該RNA−ビオチン付加物（II）のビオチン化アガロース
との複合体形成による同定 ５′−ビオチニル化された〔32〕MDV−1 RNA−アビジ
ン付加物及び５′−シスタミン−〔32P〕MDV−1 RNAは
該ゲルから流出され、エタノールを用いて数回沈澱され
た。各付加物はビオチニル化アガロール50μｌと15分間
23℃、10mMヘペス;pH7、1mM EDTA中でインキユベートさ
れた。該アガロースは遠心分離により沈澱され、緩衝液
を用いて２度洗浄された。該ビオチン化アガロースによ
り沈澱された、各放射活性付加物のフラクシヨンはシン
チレーシヨン・カウンターで測定された。 ５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNA 該〔32P〕MDV−1 RNA−ビオチン−アビジン付加物は
ジチオトレイトールを用いる還元により、５′−チオ−
エチルアミノ−〔32P〕MDV−1 RNA及びビオチン−アビ
ジン副産物に転化された。５′−ビオチニル化〔32P〕M
DV−1 RNA−アビジン付加物は、１時間、23℃、100mMジ
チオトレイトール（DTT）30μｌ、1mM EDTA、10mMヘペ
ス（pH7.7）中でインキユベートされ、該スペーサー結
合アームのジスルフイド結合を切断する。次にビオチニ
ル化アガロール40μｌが該反応混合物に加えられ、１時
間23℃でインキユベートし、ビオチン−アビジン副産物
を結合する。該ビオチニル化アガロースは遠心分離によ
つて該溶液から除去された。 放射活性の95％は上清液から回収され、ジスルフイド
結合アームが切断されたことを確認する。非還元RNA−
ビオチン−アビジン付加物がビオチニル化アガロースと
インキユベートされる対照反応においては、10％に満た
ない放射活性が上清液中に見い出された。 切断されたRNAはエタノールを用いる沈澱により回収
され、100μＭジチオトレイトール（還元RNAの二量化を
防ぐ）の存在下、非変性ゲル上の電気泳動により分析さ
れた。該５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNAは、
５′−リン酸化MDV−１対照RNAと同じ速度でゲル上を移
動したが、非還元付加物はより遅い速度で移動した。該
５′−ビオチニル化MDV−1 RNA−アビジン付加物（II）
及び該５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNAはそれぞ
れ、ＱβレプリカーゼによるMDV−1 RNA合成に対する鋳
型として作用することが可能かどうかをみるために試験
された。 試験されるべき、該修飾〔32P〕MDV−1 RNA各５μｇ
は、37℃で、50μｇの400μM ATP、400μM CTP、400μ
Ｍ〔アルフアー32P〕GTP（500m Ci/m mol）、400μM UT
P 12mM MgCl2、84mMトリス−HCl（pH7.5）中でインキユ
ベートされた。２μｌの試料が、７分〜15分の間毎分と
られた。各試料はナンバード・セミサークル（孔径23m
m）の3MM過紙（ワツトワン）上に吸着され、氷冷300m
Mリン酸、20mMピロリン酸ナトリウム、1mM EDTAを含む
ビーカー中に空けられた。該紙は同液を用いて６回洗
浄され、フアイバー中にトラツプされた沈澱RNAから標
識前駆体を流出した。該紙は次にエタノールを用いて
１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性はシンチレ
ーシヨンカウンター中で測定された。結果は両５′−修
飾RNAがＱβRNAレプリカーゼに対する鋳型として作用す
ることを示した。各反応におけるRNA合成速度は、100ng
/ml非修飾MDV−1 RNAを用いて開始した対照反応におい
てみられる合成速度と同じであつた。 本実施例は、ビオチンのMDV−1 RNAへの結合に含まれ
る化学的操作もアビジンの５′末端ビオチン基への場合
も該RNA配列の酵素的複製に阻害を与えないことを示
す。該５′−末端ビオチン−アビジンが該RNAの酵素的
複製に阻害を与えない、という事は次図： に示される、ビオチンの結合位置及びスペーサー・アー
ムの長さに帰されうる。RNA合成は該鋳型の非修飾３′
末端（A.K.バナージー（Banerjie）ら、J.Mol.Biol.46
巻、445−455ページ、1969年）で開始し、該スペーサー
・アームは該鋳型の５′末端での複製停止のために適当
な長さ以上与えなければならない。 実施例II ヒト・ガンマ・グロブリン（IgG）は、Ａ）風疹に最
近感染した被験者及びＢ）風疹に感染してない被験者か
ら単離され、その抗血清が前もつて風疹抗原との反応に
陰性であることが試験された。各試料中のIgGをビオチ
ンに結合させるために、各試料はホウ酸緩衝生理食塩水
（pH8.5）中で4mg蛋白/mlに希釈される。ジメチルホル
ムアミド（10mg/ml）中に溶解した。ビオチニル−Ｎ−
ヒドロキシサクシニミドエステル50マイクロリツトルが
該希釈試料1mlごとに加えられる。該反応混合物は室温
で２時間攪拌され、次いで、1ml当たりリン酸緩衝生理
食塩水（PBS,pH7.4,4℃）１リツトルに対して一晩透析
される。結果としてできる溶液は、ビオチニル化IgGを
含有し、４℃でアジ化ナトリウム存在下保存される。 0.1M炭酸ナトリウム緩衝液中、pH9.8で風疹抗原で被
覆されたウエルを有する。ポリスチレン・マイクロタイ
タープレートが、３時間室温でウエル当たり、1:10、1:
30、1:100、1:300、1:1000、及び1:3000の希釈比で、上
述のように調製されたビオチニル化IgG含有溶液50μｌ
とともにインキユベートされる。風疹抗原で被覆されな
いウエルをもつプレートが対照として使用うされる。Ig
G試料の希釈はPBS中で５％ウマ血清が用いられた。ビオ
チニル化IgG試料の希釈液とのインキユベーシヨン後、
該プレートはNaCl−トウイーン20を用いて３回洗浄され
る。 マイクロタイタープレートの各ウエルに、次いで実施
例Ｉの場合のように調製されたMDV−１ビオチン−アビ
ジン付加物（II）のPBS溶液が、１〜10μg/mlの濃度で
加えられ、該ウエルは次に該溶液とともに２時間室温で
インキユベートされる。次に該プレートはNaCl−トウイ
ーン20を用いて３回洗浄される。 次にトリス緩衝液（pH7.5）中の0.1M DTTが全てのウ
エルに加えられ、結果としてできる混合物は室温で１時
間インキユベートされる。 各ウエルは次にＱβレプリカーゼ4.6μｇとともに、3
7℃、400μM ATP、400μM CTP、400μＭ〔アルフアー32
P〕GTP（500m Ci/m mol）、400μMUTP、12mM MgCl2、84
mMトリス−HCl（pH7.5）50μｌ中でインキユベートされ
る。２μｌの試料が１分から15分の間、毎分とられる。
各２μｌの試料はナンバード・セミサークル（孔径23m
m）の3MM過紙（ワツトマン）上に吸着され、氷冷300m
Mリン酸、20mMピロリン酸ナトリウム、1mM EDTAを含む
ビーカー中に空けられる。該紙は同液を用いて６回洗
浄され、フアイバー中にトラツプされた沈澱RNAから標
識前駆体を流出する。該紙は次にエタノールを用いて
１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性はシンチレ
ーシヨンカウンター中で測定される。バツクグラウンド
以上の放射活性は検定血清中の抗−風疹IgGの存在を示
唆するものである。 実施例III ５′−ビオチン−ヘクス−Ｐ−16−mer（５′−bio−
tin−hex−Ｐ−16−mer）は、ヘキサメチレンジアミン
リンカーを介し16・マー５′−CACAATTCCACACAAC−３′
に結合したビオチンから成り、M13mp 8DNA断片と相補的
配列をもつたもので、B.C.F.チユー（Chu）及びL.E.オ
ーゲル（Orgel）、DNA4、327−331ページ（1985年）に
従つて調製される。また、本参考文献に従つて、単一株
のM13mp8DNAを10ng、0.1ng、0.01ng及び0.001ng含有す
るニトロセルロース・プロツトが調製され、DNAを含有
しない対照ブロツトも同様に調製される。 該ブロツトは切断され、実施例Ｉの場合のように調製
されたMDV−１ビオチン−アビジン付加物大過剰と反応
する、マイクロタイターウエルに移される（ウエル当り
50μｌ、付加物濃度はPBS中約１〜約10μg/mlであ
る）。各該ブロツトは次にNaCl−トウイーン20で充分洗
浄され、新たなマイクロタイターウエルへ移行、初めに
トリス緩衝液（pH7.5）中0.1M DTTと１時間インキユベ
ート、次いで先の実施例IIにおいて記述されたＱβレプ
リカーゼ含有溶液50μｌ（ウエハ当たり）とインキユベ
ートされる。２μｌの試料が１分〜30分の間、90秒ごと
にとられ、シンチレーシヨンカウンター中での放射活性
測定のために実施例IIで記述されるように過紙上にブ
ロツトされる。バツクグラウンド以上の放射活性は該検
定ブロツト上のM13mpDNAを示唆するものである。 実施例IV 本実施例は、ブロツトがDTTとともにインキユベート
されないことを除いて、実施例IIIと同方法で行われ、
結果として、MDV−1 RNAをビオチン−アビジンに結合す
るジスルフイド結合は切断されず、該MDV−1 RNAは16−
merプローブ（及びM13mp8検体）への結合を残してい
る。しかしながら、該ブロツトはＱβレプリカーゼ溶液
とインキユベートされ、試料がとられ、実施例IIIで記
述されたように放射活性が測定される。 実施例Ｖ 本実施例は、DTTとのインキユベーシヨンの代わりに
トリス緩衝液（pH7.5が該ウエルに加えられ、該マイク
ロタイターが80℃10分間加熱され、ニトロセルロース・
ブロツトM13mp8検体からMDV−1 RNAレポーター基に結合
したプロツブを遊離させることを除いて実施例IIIと同
方法で行われる。室温に冷却後、該試料はＱβレプリカ
ーゼ溶液とインキユベートされ、そうでなければ実施例
IVの場合のように処理される。 実施例VI 実施例III〜Ｖで記述される16−merオリゴヌクレオチ
ドプローブは、フオースター（Forster）ら、Nucleic A
cids Res,3巻、745−761ページ（1985年）によつて記述
されるように酢酸フオトビオチンを用いる光化学反応に
おいてビオチニル化される。該ビオチニル化オリゴヌク
レオチドはRPC−５を用いる高性能液体クロマトグラフ
イーによつて出発物質から分離される。該ビオチニル化
16−merは次に実施例IIIの操作に従つてM13mp8.DNAの同
定に供される。 実施例VII M13mp8 DNAの300塩基断片がフアージから得られ、ビ
オチンを用いて化学的に標識されるが、これは上記フオ
ースターらの操作に従つて酢酸フオトビオチンを使用す
る。上記フオースターらによつて記述される。ドツト・
ブロツト交配の操作が流用される。次に該ブロツトは実
施例IIIにおいて記述されるようにビオチン−アビジン
レポーター付加物とインキユベートされ、実施例IIIの
操作の残りはM13mp8 DNAを同定するために流用される。 実施例VIII 炭素５位へのスペーサーアームを通してビオチニル化
された、ウリジン残基が上記ランガー（Langer）ら及び
上記ラリー（Leary）らによつて記述されるニツク−翻
訳の操作により、実施例IIIにおいて記述されるオリゴ
ヌクレオチド中に導入される。次に結果としてビオチニ
ル化される16−merについて、MDV−１ビオチン−アビジ
ンレポーター付加物を用いる実施例IIIの操作に従い、
ブロツトM13mp8DNAに対する検定が行われる。 実施例IX 本実施例は核酸検体に対する「セルフ・レポーテイン
グ（自己報告）」親和性分子、すなわち本発明に従う検
定系においてRNA自体の同定のための複製型RNAでもある
親和性分子としての組換えRNAの使用を示す。 本実施例はまた、同定性を供する複製レポーターグル
ープRNAのビオチニル化を示す。 ミール（Miele）ら（1983年、上記）及びクラマー（K
ramer）らの米国特許出願第614,350号（上記）の操作に
従い、30−merオリゴヌクレオチド５′−AGUCAGGCACCGU
GUAUGAAUCUAACAAU−３′のついたMDV−1 RNA（MDV−１
配列の63位Ｇと64位Ｕとの間に挿入されたもの）から成
る、組換えRNAが調製される。該30−merはプラスミツド
pBR322断片の配列と相補的なそれを有する（マニアテイ
スら、上記の付録Ｂにおいて提供されるpBR322配列中の
71〜100位をみよ。） マシユーズ（Matthews）らのAnal.Biochem.151巻、20
5〜209ページ（1985年）の操作に従い、ニトロセルロー
スの仲介により該組換えRNAはpBR322DNA2ng〜0.01pgを
含有するブロツトにハイブリツド形成される。組換えRN
A5ngが各ハイブリツド形成に使用される。該組換えRNA
は煮沸により変性させられ、つづいてハイブリツド形成
溶液（45％ホルムアミド、20mMリン酸ナトリウム、５×
SSC,0.1％フイコール400、0.1％ウシ血清アルブミン、
0.1％ポリビニル−ピロリドン、250mg/ml変性サケ精子D
NA、pH6.4）に加えられる。該ハイブリツド形成は次に1
2時間42℃で行われる。 該ハイブリツド形成及びハイブリツド形成後の洗浄に
続いて、該試料に対応する個々のサークルはブロツトか
ら切除、別個に処理され、トリス緩衝液（pH7.5）に空
けられる。そして該サークルは10分間、100℃に加熱さ
れ、ハイブリツド組換えRNAを溶液中に分離する。ウエ
ル中の溶液は室温まで冷却された後、放射活性標識GTP
が非放射活性GTPに換わり、非標識UTPがビオチニル化GT
P｛ビオチン−11−UTPがベセスダ（Bethesda）リサーチ
・ラボラトリー、ガイゼルスブルク、メリーランド州、
米国から購入される；本品は11−アトム・スペーサー・
アームを介してウラシル骨格の炭素５位にビオチンが結
合したUTPである、ランガーら、上記、をみよ；ワード
（Ward）ら、欧州公報第0063879号）に換わつている、
ことを除いて実施例IIにおいて記述されているものと同
じＱβレプリカーゼ溶液50μｌが各ウエルに加えられ、
該プレートは37℃でインキユベートされる。30分間90秒
ごとに、96−指アリコツターを使用し、各ウエルから溶
液２μｌがニトロセルロースフイルター上にブロツトさ
れ（フイルター上にマークされた、各ウエルに対応する
エリアをもつ）、各フイルターは、マシユーズらの操作
に従い化学螢光試薬（1.25mMルミノール、2.7mMH2O2、
0.1Mトリス緩衝液、pH8.6、増強剤として0.136M p−ヨ
ードフエノールまたは0.68μM p−ヒドロキシケイ皮酸
を共存）存在下ストレプタビジン−パーオキシダーゼ複
合体とともに展開される。スポツトからフイルターに発
せられる光は次に螢光マイクロタイター・プレート・リ
ーダーを使用して感知される。バツクグラウンド（すな
わちpBR322DNR以外の検体について行われた操作による
スポツト由来の放射）以上の放射は検定溶液中のpBR322
検体の存在を示す。 実施例Ｘ 実施例IIに記述される16−merの、−Ｏ−PO2−NH(C
H2)2−Ｓ−Ｓ−(CH2)2NH2グループと５′−ヌクレオチ
ドの炭素５′位で結合した付加物は、ヘキサメチレンジ
アミンの代わりにシスタミンが使用されることを除い
て、チユー（Chu）及びオーゲル（Orgel）、DNA4、327
〜331ページ、1985年の操作により調製される。本ジス
ルフイド付加物から、−Ｏ−PO2−NH(CH2)2SHと５′−
ヌクレオチドの炭素５′位で結合した（２−チオエチ
ル）アミノ付加物が0.1M DTTと１時間室温でインキユベ
ートすることにより調製される。該チオ付加物は次に、
1mM DTT存在下、RPC−５を使用する高性能液体クロマト
グラフイーにより非還元ジスルフイド付加物から単離さ
れる。 MDV−1 RNAの、−Ｏ−PO2−NH(CH2)2SS(CH2)NH2と
５′−ヌクレオチドの炭素５′位で結合した付加物は実
施例Ｉで記述されるように調製される。同操作由来の生
成物を含む、エタノール沈澱ジスルフイド付加物は次に
0.1M DTT中に溶解され、結果としてできる溶液は１時間
室温でインキユベートされ、対応するチオ付加物を与え
る。 MDV−1 RNAのチオ付加物約50ngを含有する、0.1M DTT
溶液50μｌが、16−merのチオ付加物10倍モル過剰量
（すなわち、HDLC精製に由来する溶液量で、該チオ付加
物を約30ng含有する。）と合わされる。結果としてでき
る溶液にO2気流が15分間通され、２つのチオ付加物で生
ずる反応は一晩室温で進行することが許容される。ゲル
電気泳動を使用し、ジスルフイド含有骨格を介して16−
merに結合したMDV−1 RNAは、他のMDV−1 RNA付加物及
び未反応16−mer付加物から分離される。 ジスルフイド含有骨格を介して16−merに結合したMDV
−1 RNA付加物は次に、MDV−1 RNAビオチン−アビジン
の代わりに、実施例IIIの操作に従いM13mp8DNAの同定に
供される。 実施例XI 本実施例は、本発明に基づくレポーター・システムを
使用する、細胞表面上の特異的抗原の同定を記述する。
ここで記述される操作は一部、ホラン−ハンド（Horan
−Hand）ら、Cancer Research 43巻、728〜735ページ
（1983年）の教示に基づく。 本操作は標準技術によつて調製された、検定される抗
原に対する、ネズミモノクローナルIgG抗体によつて例
示される。当業者は、該抗原検体に特異的な、他の型の
抗体もまた使用されうるということを把握するだろう。 （ａ）単一層培養細胞を使用する操作： 試験されるべき細胞は、平端な96穴フラツト・ボトム
組織培養プレート内に、適当な成長培地とともに植えら
れ、37℃で24時間インキユベートされる。成長培地は次
に10％（W/V）ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する成
長培地と交換される。60分間のインキユベーシヨン後、
10％BSA含有培地は除去され、ウエルは洗浄媒体（１％
（W/V）BSAを補つた。RPMI 1640溶媒）で洗浄される。
該洗浄溶媒は次に除去され、ウエル当たり、PBS中0.1mg
/mlで、該抗原検体に対するモノクローナル抗体50μｌ
と交換され、該混合物は４℃で２時間インキユベートさ
れる。インキユベーシヨン後、未結合抗体は抗体溶液の
アスピレーシヨンにより除去され、続いて洗浄溶媒を用
いて洗浄される。洗浄に続いて、各ウエルに洗浄溶媒を
用いて1:1000に希釈した、ビオチニル化ウサギ抗血清Ig
G（ベクター・ラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリ
フオルニア州、米国から購入したもの）が加えられ、同
溶液はウエル中、４℃で２時間インキユベートされる。
該抗−IgG抗体溶液は次にウエルからアスピレートさ
れ、ウエルは洗浄溶媒を用いて再度洗浄される。次に各
ウエルに実施例ＩのMDV−1 RNAビオチン−アビジン付加
物のPBS溶液50μｌが、１〜10μg/mlで加えられ、同溶
液はウエル中４℃で２時間インキユベートされる。本溶
液は次にウエルからアスピレートされ、ウエルは洗浄溶
媒で３回洗浄される。トリス−HCl緩衝液（pH7.5）中0.
1M DTT50μｌが次に各ウエルに加えられ、１時間室温で
インキユベーシヨンが行われる。次に、96指−アリコツ
ターを使用して各ウエルから上清が新しいマイクロタイ
ター・プレートに除去され、実施例IIの操作に従い、同
溶液はＱβレプリカーゼ溶液と合わさせれて組換えMDV
−1 RNAに対する検定が行われる。 （ｂ）懸濁液中の細胞を使用する操作： 懸濁液中の細胞は、単一層培養細胞に対して使用され
る操作による特異な抗原に対して、次の修飾をすること
によつて試験されうる： 細胞が単一細胞懸濁液（例えば、血清由来のリンホサ
イト）の形で得られない場合、適当に処理され、そのよ
うな懸濁液を調製する。例えば、組織培養由来の細胞は
標準技術によりトリプシン処理され、培養容器表面から
解離させることが可能で、結果としてできる溶液は次
に、培養容器から適当な溶媒中にピペツトで移すことが
可能である。 単一細胞懸濁液中の細胞は次にマイクロ・タイタープ
レートのウエルに分けられ、添加されたBSAを含まないR
PMI 1640溶媒を用いて２度洗浄される。懸濁液中の同細
胞は次に２時間４℃で、ウエル当たり、注目している抗
原に対する抗体のPBS中0.1ml/mlのもの50μｇとともに
インキユベートされる。 本操作の残りは単一層培養細胞に対する操作と同じで
ある。懸濁培養中の細胞の洗浄はペレツトを生ずる遠心
分離、培地のアスピレーシヨン、次いで、新たな溶媒
（洗浄溶媒）中でのペレツトの再懸濁化、再ペレツト化
及び溶媒のアスピレーシヨンのサイクルによつて行われ
る。 本実施例の操作に対して、抗原検体を含まないとして
知られる、細胞が対照として使用されうる。 本実施例で上述される操作は、抗原検体に結合する初
期抗体へのビオチニル化第２抗体の結合を含む。又は、
初期抗体自体は、ビオチニル化が、その抗原検体に特異
的に結合する能力をなくさないとすればビオチニル化が
可能であり、第２抗体結合工程が避けられる。抗体のビ
オチニル化は、イマム（Imam）ら、Cancer Research 45
巻、263−271ページ（1985年）の操作に従い、抗体のＮ
−ヒドロキシサクシニミドビオチンとの直接反応により
実行される。 実施例XII 本実施例は本発明に基づく、細胞溶解質、血清または
他の溶液から蛋白質を同定する検定の使用を記述する。
記述される操作は「ウエスターン・ブロツト（Western
blot）」法の一型式である。 細胞が関与する場合、細胞溶解質が、２％ドデシル硫
酸ナトリウム、２％２−メルカプトエタノール及び10％
グリセロールを含有するトリス−HCl緩衝液（pH6.8）溶
液（100℃）を用いて可溶化するような標準操作によつ
て調製される。 該溶解質（または血清または他の溶液）は次にデユプ
リケート中ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供される
が、隣接するレーンにマーカーとして同定されうる蛋白
質を移動させる。標準的なブロツテイング装置（例え
ば、トランス−ブロツト装置、バイオ・ラツト・ラボラ
トリース、リツチモンド、カリフオルニア州、米国）を
使用し、該蛋白質はゲルからニトロセルロース・シート
へ移される。実験ゲルレーンのひとつ及びマーカーゲル
・レーンはクーマーシー・ブルーを用いて染色される。
該蛋白質検体を含有する可能性のあるゾーンは、試料中
に存在するとすれば次に実験レーンから切断される。検
体を含有する可能性のあるゲルゾーンに対応するニトロ
セルロースペーパーのゾーンはペーパーから切断され、
蒸留水中３（W/V）BSAを用いて１時間37℃で浸され全て
の非特異的蛋白質結合部位を飽和させる。 親和性分子として該蛋白質に対するビオチニル化抗体
を使用して、該蛋白質検体がニトロセルロース片上にあ
るかを試験するために次の実施例の操作が行われる。 実施例XIII 本実施例は本発明に基づく検定を用いる、細胞表面糖
蛋白質の同体を例示する。本実施例の操作はゴードン
（Gordon）及びペナ（Pena）、Biochem.J.208巻、351〜
358ページ（1982年）のそれを変えたもので、彼らはイ
イラミニダーゼ処理、培養、正常及び異常それぞれのヒ
ト・皮膚繊維芽細胞上の特異的細胞表面糖蛋白質を同定
するためのピーナツツ凝集素及びヒマノ実凝集素を使用
した。 細胞は培養皿上に約２×104cells/cm2の密度で植えら
れる。24時間後、同細胞は洗浄され、２％（W/V）ドデ
シル硫酸ナトリウム、２％（W/V）２−メルカプトエタ
ノール、10％（V/V）グリセロール、0.01％ブロモフエ
ノール・ブルーの0.125Mトリス−HCl緩衝液（pH6.8）溶
液（100℃）を用いて可溶化される。該溶解質は次にSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、蛋白質は
トランス・ブロツト装置（バイオ・ラツドラボラトリー
ス）を使用してニトロセルロースシートへ移される。該
ニトロセルロースシートは約５cm2の大きさの切片に切
断される。結果としてできるニトロセルロース片は３％
（W/V）BSA水溶液に１時間37℃で浸され、全ての非特異
的蛋白質−結合部位を飽和する。該片は次にHBS溶液（1
37mM NaCl、2.7mM KCl、0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2、39
mMヘペス、pH7.4）を用いてすすがれ、ビオチニル化レ
クチン（該溶解質の糖蛋白質上の注目している炭化水素
骨格に適切なものである）とともに、３％BSAを含有す
るHBS溶液中10mg/mlにおいて、１時間室温でインキユベ
ートされる。ビオチニル化レクチンは市販品であり、例
えばベクター・ラボラトリース（ベーリンゲームカリフ
オルニア州）、から得られる。該片は次に、HBS溶液を
用いて30分間４回浸たすことにより充分洗浄され、実施
例ＩのMDV−1 RNAビオチン−アビジン付加物0.5mlと、P
BS中約５μg/mlで１時間、室温でインキユベートされ
る。アビジン−ビオチンMDV−1 RNA付加物とのインキユ
ベーシヨン後、過剰の付加物はHBSを用いて３回洗い流
される。該片は次にトリス−HCl（pH7.5）中0.1M DTT0.
5mlと１時間インキユベートされ、結果としてできる溶
液は、ＱβレプリカーゼにRNA複製を触媒させて、実施
例IIの操作によりMDV−1 RNAに対する検定が行われる。 実施例XIV 生物標本（例えば、細胞培養、組織、血液、他の体
液、食品材料など）由来の核酸は、本発明に基づく検
定、すなわち、第一に核酸をひき出す標準技術（例え
ば、標本約５μｌを45℃で20分間、30mMトリス−HCl、2
mM EDTA、３％トライトンX100、300μg/mlプロテアーゼ
Ｋ、pH7.5）約５μｌから約1mlとともにインキユベート
すること）により標本を破壊し、次に結果としてできる
溶液を固体担体（例えばニトロセルロース）上にブロツ
ト、そして実施例III〜Ｘに記述されるような操作を行
い該核酸検体を同定することによつて検体断片または検
体分子に対する検定が行われる。 このような検定における対照は、検定されている生物
標本と同じであるが検体を含まないことが知られている
ものでありうる。 標本中の検体量の定量的評価のために、既知量の検体
が加えられた対照が実験され、標本中の検体量が、試験
標本に由来する複製型RNAの複製率と対照に由来する複
製率とを比較することにより評価されうる。 実施例XV 実施例IXの操作が、非修飾リボヌクレオシド３リン酸
が複製反応において使用され、複製RNAが次のように同
定されることを除いて、流用される： 整数比希釈（等容量のもの）された複製反応溶液が96
−指アルコツターを用いてジエチルアミノエチルセルロ
ースペーパーのシートに移される。 該シートは次に室温で200mM NaCl、300mM酢酸アンモ
ニウム（pH6.0）溶液中洗浄され、RNA中にとり込まれな
かつたリボヌクレオシドを除去する。 該シートは次に0.3μg/ml臭化エチジウムを用いて染
色される。シヤープ（Sharp）ら、Biochemistry 12巻、
3055〜3063ページ（1973年）及びベイリー（Bailey）及
びデビツドソン（Davidson）、Anal.Biochem.70巻、75
〜85ページ（1976年）を見よ。 最後に個々のブロツトからの螢光がいくつかの既知技
術のいずれかひとつによつて測定される。対照ブロツト
由来の螢光強度以上の、染色ブロツト由来のそれは染色
ブロツトに対応する試料ブロツト中の検体（すなわちpB
R322）の存在を示す。 他の染色材料が臭化エチジウムの代わりに使用されう
る。これらの中にはメチレン・ブルー（デイングマン
（Dingman）及びピーコツク（Peacock）、1968年上
記）；銀染色｛サモンス（Sammons）、1981年、上記；
イグロイ（Igloi）、1983年、上記）；またはフイコビ
リ蛋白質−Ｑβレプリカーーゼ共役体（オオイ（Oi）
ら、1982年、上記；ストライヤー（Stryer）ら、上記）
が含まれる。 さらに、螢光測定よりもむしろ、RNAの染色に由来す
るブロツトの色が評価されうる。 実施例XVI 大腸菌Ｋ−12/600株の培養物がpBR322を用いて形質転
換され、テトラサイクリン存在下108cells/mlまで培養
される。0.1mlの培養液が30mMトリス−HCl、2mM EDTA、
３％トライトンＸ−100、300μg/mlプロテナーゼＫ（pH
7.5）溶液の0.1ml、1ml、10ml、100ml及び1000mlのそれ
ぞれに合わされ、結果としてできる溶液45℃で20分間加
熱される。 対照溶液がテトラサイクリン非存在下pBR322を用いて
形質転換されていない大腸菌Ｋ−12/600株を108cells/m
lまで培養し、次に同培養液0.1mlと上記で特定したプロ
テナーゼＫ溶液0.1mlとを合わせ、結果としてできる溶
液を20分間45℃で加熱することにより調製される。 次に各５試験溶液の各３試料及び対照溶液の３μｌ
が、ニトロセルロース担体上へドツト・ブロツトされる
（標準96−穴配列中、96スペースの18スペースに施され
る）。該担体は次に400mM NaOHを用いて飽和させたペー
パー・タオルの先端におかれ、DNAを変性、次に連続的
に（ａ）400mMトリス−HCl、pH7.0（ｂ）20×SSC及び
（ｃ）10×SSCで飽和させたペーパータオルと接触され
る、最後に該ニトロセルロースシートは80℃で90分間焼
かれる。 実施例IXの30−merが、実施例Ｉ及びＸの操作に従
い、式−O(PO2)NH(CH2)2SS(CH2)2NH(PO2)2O−という骨
格〔ここで、フオスフオラミデートグループは30−mer
親和性分子及び複製可能RNAの５′−ヌクレオチドの炭
素５′位に結合している〕によりMDV−１（＋）RNAに結
合している。 標準操作に従い、該シートは前ハイブリツド形成さ
れ、次に結果としてできる親和性分子MDV−1 RNAハイブ
リツド形成溶液中３μg/mlで、ハイブリツド形成され、
ハイブリツド形成後は洗浄され、ハイブリツド形成され
なかつた親和性分子−MDV−1 RNAハイブリツドを除去す
る。 次に該ニトロセルロースシートはエクテオラ（ECT−E
OLA）ペーパー（サリス（Sarris）ら、1982年、上記）
シートの先端（または乾燥ペーパー・タオルの先端）に
おかれる。0.05Mトリス−HCl（pH7.5）中0.1M DTTで飽
和した湿つたスポンジが該ニトロセルロース・シート先
端におかれる。DTT溶液のペーパータオルへの毛細管移
動に伴い、複製型RNAは、該ハイブリツドのジスルフイ
ドの還元により遊離され、エクテオラ・ペーパー（ここ
で、正電荷により付着される）へ移される複製となる。 該エクテオラペーパーは次に100μg/mlBSA溶液とイン
キユベートされ、蛋白質結合部位をブロツクする。 該ペーパーは次に実施例IIにおいて記述されるＱβレ
プリカーゼ溶液と15分間インキユベートされる。 15分間のインキユベーシヨンに従い、該ペーパーは20
0mM NaCl、5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）を用いて洗浄
され、とり込まれなかつたリボヌクレオチドを除去す
る。該エクテオラ・ペーパー上の各ブロツトの放射活性
は次に例えば、96−位β−放射スキヤナー／デイジタイ
ザー（ゴウリアノス（Goulianos）ら、Anal.Biochem.10
3巻、64−69ページ、1980年）を使用して決定される。 また、該複製は非放射活性リボヌクレオシド３リン酸
のみを用いて行われ、RNA量はその固有のUV吸収（例え
ば、クラテラゼ（Kulateladge）ら、1979年、上記らの
フオトプリンテイング法による）により決定されうる
し、あるいは該エクテオラ・ペーパー上で直接、実施例
XVで記述される染色技術のひとつによつても決定されう
る。 検定される溶液中のpBR322の存在は該エクテオラ・ペ
ーパー上の対応するRNA複製ブロツトに由来する、バツ
クグラウンド信号（対照溶液に由来する）以上の信号に
より示される。 実施例XVII 大腸菌Ｋ−12/C600株の培養液（pBR322を用いて形質
転換されたもの及びされていないもの）が実施例XVIの
場合のように調製される。 次に未希釈対照液、未希釈pBR322−形質転換培養液、
1:10希釈pBR322−形質転換培養液、1:100希釈pBR322−
形質転換培養液、1:1000希釈pBR322−形質転換培養液及
び1:10000希釈pBR322−形質転換培養液（全ての希釈は
細胞非存在培養培地を用いる）それぞれの各３試料がポ
リプロピレン・ミクロ遠心分離チユーブに加えられる。
各ウエルに30mMトリス−HCl、2mM EDTA、２％トライト
ンＸ−100、300μg/mlプロテナーゼＫ（pH7.5）溶液５
μｌが加えられる。該プレートは次に20分間45℃でイン
キユベートされる。20分の終わりに、温度が100℃に上
げられ、インキユベーシヨンをさらに５分間続ける。該
プレートを室温に冷却後、実施例XVIの親和性分子−MDV
−1 RNAハイブリツドの水性塩溶液／フエノール懸濁液
８μｌが５μg/mlで各ウエルに加えられ、ハイブリツド
形成がコーン（Kohne）ら、（1977年）、上記に従い５
分間行われる。 各ウエル由来の水−フエノール混合物は次にアガロー
スゲル電気泳動に付され、pBR322（親和性分子−MDV−1
RNAとハイブリツド形成したもの及びしないもの）をは
るかに小さい新和性分子−MDV−1 RNAから分離する。該
ゲルは0.1M、 DTT、0.05Mトリス−HCl（pH7.5）中に浸
され、親和性分子と該RNAとの間のジスルフイドの開裂
により複製型RNAを遊離する。 該複製型RNAは次に電気ブロツテイング（ステルワー
ク（Stellwg）及びダールベルク（Dahlberg）、Nucl.Ac
ids Res.8巻、299−317ページ（1980年））によりエク
テオラ・ぺーパーに移される。 最後に、複製RNAがエクテオラ・ペーパー中に複製−
ブロツトされる工程後、実施例XVIの操作が流用され、
複製可能RNAの複製、該複製RNAの同定、及び検定される
試料中にpBR322が存在するか否かの確認が行われる。 本発明は、RNA−依存性RNAポリメラーゼによるRNA複
製に基づくレポーターシステムの使用により達成されう
る感度のために、先行技術のシステムよりも有意に進歩
した生物検定システムを含む。これらのレポーターシス
テムを使用する検定の感度は、親和性分子及び複製可能
RNAの非特異的吸着に由来するバツクグラウンドのみに
よつて測定されるべきである。そうでなければ、このよ
うな検定の感度は、試料当たり１分子という理論的制限
にとどめられるべきである。 本発明はある程度の明細をもつて記述されてきたが、
等業者にとつては自明な修飾が本発明の方向から逸脱す
ることなくなされうる。 本発明の様々な特徴は次の特許請求の範囲において提
示される。
子のアツセイに向けられたものであり、より詳細には、
RNA依存性RNAポリメラーゼにより触媒される自己複製の
鋳型となるRNAに基くリポーター・システムを用いるア
ツセイに関する。 本発明の背景 非常に大量の非関連物質を背景に含むサンプル中にあ
る特定の小量の生体高分子を検索することが時々必要と
なる。いくつかの重要なケースとしては、感染した患者
の血液や他の体液中に微小量存在するウイルスや抗病原
菌抗体についてのイムノ・アツセイとか、細胞表面に散
在するレセプターについてのアツセイ、さらに、食品中
に微小量存在する病原菌、体液中に小量存在する病原性
原生寄生動物、バクテリア、ウイルス、或いは、ある種
の全遺伝子DNA中の遺伝子の異常を示す決められた配列
の短い断片についての核酸プローブ・ハイブリダイゼー
シヨン・アツセイなどがある。 そのようなアツセイの特異性は、サンプル中に試験さ
れている本体（例えばウイルスとか、他の微生物、特別
なレセプターをもつた細胞、異常遺伝子）が存在してい
る限りにおいて、サンプル中に存在する生体高分子検体
（即ち、特定の標的生体高分子、又は、特定の標的部
位、又は生体高分子の一部分）に特異的に結合する親和
性分子を用いることに依存している。親和性分子の例と
しては抗体を誘導するのに用いられる抗原となつている
タンパク質の標的に対する抗体、又は、標的DNA又はRNA
の標的部分と相補的な配列をもつオリゴ・ヌクレオチ
ド、又は、抗原により誘導される抗体となつている抗体
の標的に対する抗原、さらに、標的糖タンパク又は標的
ポリ多糖のある特定の炭化水素部分に特異的に結合する
レクチンなどがある。 アツセイしているサンプル中に存在する生体高分子検
体のいずれかと結合した親和性分子の検出は、典型的に
は、リポーター・システムの一部分として検出しうるシ
グナルを発生しうるリポーター・グループを親和性分子
と複合させるか、とりこませることによつてなされる。
アツセイの感染は、アツセイ系における親和性分子と生
体高分子検体の結合の特異性、と、アツセイ系における
親和性分子だけからシグナルを生じさせるリポーター・
システムの特異性、さらに、アツセイ系におけるリポー
ター・システムから生じたシグナルの強度に依存するこ
とになろう。 典型的なリポーター・システムでは、リポーター・グ
ループとして螢光有機分子や32Pでラベルしたリン酸基
を用いている。リポーター・グループから直接生じるシ
グナルが係わつてくる、このようなタイプのリポーター
・システムによつて達成されうる感度は、根本的には検
出しうるだけの強度のシグナルを生じさせるのに必要と
するリポーター・グループの数によつて制限を受ける。
従つて、これらのグループでは、約105個以下の標的分
子又は標的部分をアツセイして検出することはできな
い。生体高分子検体に対する非放射活性アツセイの感度
は、親和性分子を連結した酵素を用いることにより改善
されてきた。例えば、ビオチニル化（biotinylated）し
たオリゴヌクレオチド又はDNA親和性分子“プローブ（p
robe）”は、酵素に連結したアビジン（avidin）リポー
ター・グループをビオチニル・グループと複合体を形成
させ、次に、酵素によつて触媒される反応生成物を検出
することにより検出される。Langerら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.（U.S.A.）78巻、6633−6637ページ（1981）;Lea
ryら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）80巻、4045−404
9ページ（1983）。また、酵素に連結させたアビジンを
イムノ・アツセイにおけるリポーター・グループとした
ものに関しては、HeveyとMalmros,米国特許No.4,228,23
7を参照せよ。酵素を親和性分子と結合させ、さらにそ
の酵素により触媒される反応の基質を供することによ
り、それぞれの酵素−親和性分子−検体の複合体につい
て大量の数の生成分子を蓄積させ、それ故、原則的に
は、少数のリポーター分子を直接用いることによりより
もずつと大きな感度を得ることが可能となる。感度の高
い色素法によつて容易にアツセイできるペルオキシダー
ゼ（peroxidase）やホスフアターゼ（phosphatase）な
どの酵素は、酵素に結合したリポーター・グループとし
て広く利用されている。Learyら先に引用。 しかしながら、アビジンを連結したホスフアターゼが
係わつてくるような酵素付加リポーター・システムは、
根本的には、リポーター・グループの酵素によつて触媒
される反応がおこりうる速度によつて、感度において制
限を受けることになる。実際の問題として、酵素触媒反
応の生成物の検出しうる量とは、大体１時間から100時
間といつた適正な時間内のアツセイで生産されるもので
なければならない。実際には、酵素−付加リポーター・
システムは、32P崩壊に基く、リポーター・システムよ
り約10倍から100倍感度が劣る。 より感度に富み、標的生体高分子の単一分子、又は標
的生体高分子断片の単一断片の存在までが、原則とし
て、数時間たらずのアツセイで検出しうる程度のリポー
ター・システムが必要とされている。そのようなリポー
ター・システムでは、反応を通じて、検体分子又は断片
あたり比較的短い時間内に漠大な数の生成分子を生産す
るような被検体の存在が必要となつてくる。 酵素によつて触媒される核酸の重合反応は鋳型から、
相補配列をもつ鎖を生成し、この鎖はまた関連するポリ
メラーゼの基質になる。こうしてくり返し反応がおこる
ことにより、特定のヌクレオチド鎖の数が対数的に増大
するのである。従つて核酸の自己複製をリポーター・シ
ステムの感度の向上に用いるのは、有利である。 核酸の重合反応を、検出しうる微量の検体の検出に利
用した例が、R.K.Saikiら、Science,230巻、1350−1354
ページ（1985年）及びヨーロツパ特許出願広報No.01640
54に記載されている。Saikiら、上述、はE.coli DNAポ
リメラーゼＩとともに、dATP,dCTP,dGTP,dTTP,と、さら
に２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー即ち、１つ
は、センス鎖の３′末端の近くの部分に相補的な配列を
もつもの、そしてもう一方は検体DNA断片のアンチ・セ
ンス鎖の３′末端の近くの部分に相補的な配列をもつも
のを用いており、サンプル中の検体の量を標準的なDNA
プローブ・アツセイ技術で容易に検出できるレベルまで
増大させるのである。Saikiらの方法には、多数のサイ
クルからなるDNAポリメラーゼ−触媒複製、鎖の分離、
さらにプライマー・アニーリングが含まれる。検体の量
は、サイクル数に伴つて対数的に増加し、少なくとも複
製の開始断片の濃度が、ポリメラーゼ分子の濃度を上回
わるまでになる。Saikiらにより記述される方法では、
少なくとも３つの合成オリゴヌクレオチドが必要であ
り、２つはプライマーで、また少なくとも１つは検体を
検出するプローブである。Saikiらの方法における複製
の各サイクルは、３ステツプからなる。従つて、Saiki
らの方法ではDNAの自己複製を利用して検体の量を増大
させることにより、DNAプローブ・アツセイの感度を増
大させるのであるが、その一方で核酸の自己複製を通じ
て、生体高分子又はその特定の断片又はその部位に対す
るアツセイの感度を増大させるような、より簡便で、よ
り一般的に応用可能な方法が依然として必要とされてい
るのである。 酵素により触媒される、RNA配向性の、RNA重合は、相
補鎖を迅速に生産し、しかもプライマーを必要としない
のである。RNA鎖の数は、NRA配向性の、RNA重合の反応
サイクルのくり返えしにつれて対数的に増加していく。
イン・ビトロの他の重合反応と異なり、RNA配向性のRNA
重合は、サイクル間に鎖の分離とプライマー・アニーリ
ングを必要とすることなく、連続的に進行する。酵素に
よつて触媒される、RNA配向性のRNA重合は“自動触媒複
製”と呼ばれてきた。 HarunaとSpiegolman,Science,150巻、884−886ページ
（1965年）。本発明があるまでは自動触媒複製を生体高
分子検体の簡便で、広く応用可能で高感度のリポーター
・システムに利用することができることは考えられてい
なかつた。 Mieleら、J.Mol.Biol.,171巻、281−295ページ（1983
年）では、デカアデニル酸部分を、突然変異中間変種−
1 RNAの、バクテリオフアージＱβのRNA依存性RNAポリ
メラーゼ（“レプリカーゼ”）の機能には必須ではない
位置への挿入を記述しており、さらに、組み換え中間変
種−1 RNAが、レプリカーゼによる複製の鋳型として活
性でありつづけることを報告している。Kramerら、米国
特許出願No.614,350（1984年５月25日整理）も参照せ
よ、これはここで参考文献に含まれている。Kramerらの
出願は、中間変種及び同類のRNAに基く、Ｑβレプリカ
ーゼ活性による複製のための組み換えRNA鋳型と、さら
に、そのような鋳型の、核酸ハイブリダイゼーョ余ン・
プローブとしての利用について記述している。Mielらの
報文も、Kramerらの特許出願も、ともに、生体高分子検
体のアツセイのリポーター・システムの基礎としての複
製型RNA及びこれに関連したRNA依存性RNAポリメラーゼ
の利用について示唆していない。さらに、報文と特許出
願のどちらも、標的核酸断片のプローブとして用いられ
る組み換え複製型RNAが、標的とのハイブリダイゼーシ
ヨンにつづいて複製され、プローブを用いたアツセイの
感度を増大させることについては示唆していない。 本発明の要約 本発明は、ある種のRNAのイン・ビトロでの自動触媒
複製が、生体高分子検体のアツセイの高感度のリポータ
ー・システムとして利用可能である、という我々の発見
に基いている。 従つて、本発明は、特定の生体高分子検体を検出する
アツセイで、感度を高度に増強させたリポーター・シス
テムに関している。このリポーター・システムは、バク
テリオ・フアージＱβのRNAポリメラーゼによるイン・
ビトロでの複製が可能な、中間変種−1 RNA及びその突
然変異体を含む、RNA配向性のRNAポリメラーゼによるイ
ン・ビトロでの複製が可能なRNAの、迅速な、対数的
な、酵素触媒による複製に基いている。 本発明のリポーター・システムは、そのような複製型
RNAを親和性分子に加え、これがアツセイ中の生体高分
子検体と特異的に結合することに係わつている。もし検
体がポリヌクレオチドの断片である場合には、複製型RN
Aは、それによつて検体断片とハイブリダイゼーシヨン
がおこるような検体断片と相補的な配列をもつ、DNAま
たはRNAで、断片を含むポリヌクレオチドあるいは、オ
リゴヌクレオチド親和性分子と、連結させることができ
る。もし検体が、例えば、ウイルスの外被タンパクと
か、培養中の細胞の溶解に際して放出される興味あるタ
ンパクなどのタンパク質である場合には、RNAはアツセ
イ・システム中の検体タンパクと特異的に結合する抗体
親和性分子と連結させることができる。もし検体が、炭
化水素残基を含む糖タンパクとか、ポリ多糖のような分
子である場合、複製型RNAは、炭化水素残基と特異的に
結合するレクチン親和性分子と連結させることができ
る。 複製型RNAは、親和性分子がアツセイ・システム中に
存在するいずれかの生体高分子検体と複合体をつくる前
に、又はつくつた後でも、親和性分子と結合させること
ができる。 なぜならば、複製型RNAが親和性分子と結合した後
で、検体に結合した親和性分子を検出するためには、こ
のRNAの複製が必要となるからである。ここでａ）RNA
は、結合している間でも、RNA依存性RNAポリメラーゼに
より複製されることができるような様式で親和性分子と
結合しているか、あるいは、ｂ）RNAは、分離したRNAが
RNA依存性ポリメラーゼによつて複製されることができ
るような形で、親和性分子から分離できるような様式を
とつて親和性分子と結合しているのである。 親和性分子に結合した複製型RNAから複製されたRNA、
即ち、今度はアツセイ・システム中の検体に結合してい
るRANの検出は、数多くの既知の技術のいずれかを用い
て行うことができる。例えば、RNAの複製は、放射活性
で標識したリボヌクレオシド−５′−三リン酸を用いて
行なうことができ、次に複製の結果生じた放射活性をも
つRNAを検出するのである。別の方法として、ビオチニ
ル化したリボヌクレオシド−５′−三リン酸を複製過程
の基質として用いることができ、さらに、その結果生じ
たビオチニル化したRNAは、例えばLearyら（先に引用）
により開示されるように、酵素−アビジン付加物を利用
して検出することができる。また、複製されたRNAは紫
外線吸収や又は染色により、直接に検出することができ
る。 本発明の詳細な記述 一面からみて本発明はサンプル中の検体の存在を決定
する方法であり、これは、 ｉ）親和性分子と検体の間で結合がおこるような条件下
で、サンプルを上述の検体親和性分子にさらし、 ii）もし上述の親和性分子、それ自体が、複製型RNAで
はない場合、ステツプｉ）の前又は後で、複製型RNA
を、ステツプｉ）で用いた親和性分子に結合させ、 iii）RNA依存性RNAポリメラーゼを用いて、検体に結合
した親和性分子に結合している、又は、した複製型RNA
あるいは、検体に結合している親和性分子である複製型
RNAの複製を触媒させる、そして iv）ステツプiii）の反応で生成したRNAを検出する、以
上ステツプから構成される。 他の側面からみると、本発明は親和性分子−複製型RN
A混成分子、即ち、複製型RNAに結合した親和性分子を伴
つている。親和性分子は複製型RNAに、RNA依存性RNAポ
リメラーゼによる複製型RNAの複製をおこさせなくする
ことがないように、複製型RNAに共有結合した第１の連
結部分を介して、さらに、新和性分子とその検体との特
異的な結合を妨げないように複製型RNAに結合した第２
の連結部分を介して、結合させることができるのであ
る。また、ここで述べた第１と第２の連結部分は、お互
いに共有結合しており、特異的な結合対を形成している
かあるいは、通常の第３の連結部分とも特異的な結合対
を同時に形成しているのである。 本発明はまた、“スマートプローブ（smart prob
e）”を必然的に伴つており、即ち、これは、核酸であ
る親和性分子が複製型RNAに結合していて、さらに、親
和性分子が、その検体と結合していない場合には、複製
型RNAがRNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型と
して不活性であるように、複製型RNA部分と結合してい
る化合物である。 本発明はさらに、塩基対を介して、複製型RNAに非共
有的に結合している親和性分子を必然的に伴つている。 さらにまた一面からみると、本発明はRNA依存性のRNA
ポリメラーゼによる複製型RNAの複製を妨げることな
く、連結部分に結合した複製型RNAに係わつており、こ
こでいう連結部分とはこれにより、他の連結部分対に結
合した複製型RNAと親和性分子との間の連結が特異的な
結合対として、連結部分の共有的な結合により、あるい
は、連結部分の相互作用により生じる、１対の連結部分
のことである。 本発明に従う、一対の連結部分の１つに結合した、そ
のような複製型RNAは、検体との結合の特異性を失わな
いように他の連結部分対に結合したいかなる親和性分子
に対しても、普遍的なリポーター・グループである。 “検体”とは、サンプル中でのその存在や濃度量をア
ツセイで決定される物質のことを意味する。検体は時に
は、アツセイの標的物質、あるいは標的断片のことをさ
している。本発明に従うアツセイでは、検体とは通常、
生体高分子あるいは生体高分子の断片のことである。検
体には、例えば糖タンパク、リポタンパク、酵素、ホル
モン、レセプター、さらに抗原、抗体などのタンパク質
や、核酸（DNA,RNA）、核酸の断片、そしてポリ多糖な
どを含んでいる。 本発明のアツセイでは検体は、もしそれが存在してい
れば、あるいは存在していさえすれば、サンプル中に存
在する生物本体に関連していることもしばしばである。
そのような生物本体には、ウイロイド（検体は核酸又は
その断片である）；ウイルス（検体は例えばウイルス外
被タンパク、ウイルス・ゲノム、ウイルス・ゲノムの断
片、あるいはウイルスに対する抗体などである）；他の
微生物（検体は例えば、微生物のゲノムの断片又は、RN
A、微生物により生産される毒素、微生物に遺伝子工学
を施したときに生産される異種タンパクなどである）
（原生動物寄生虫に関しては、Lizadi Noguiera,ヨーロ
ッパ特許出願公報No.0135108を参照のこと）；がん細胞
のような異常細胞（検体は例えば異常細胞の細胞表面抗
原である）；あるいは、異常遺伝子（検体は例えば、遺
伝子異常をおこす変調塩基を含む遺伝子断片とか、異常
遺伝子から転写された結果生じる変調塩基を含むメツセ
ンジヤーRNA断片とか、又は、異常遺伝子が発現して生
じた異常タンパクである）、以上が含まれる。検体はま
た、例えば、ホルモンのような特定のタンパクでもあり
え、その血清中や体液中の存在や濃度をアツセイで決定
することになる。必然的に２つの抗体を使うことになる
イムノ・アツセイの場合、検体は、（サンドイツチアツ
セイの場合には）第一の抗体に結合した抗原であり、又
は、（イムノソルベントアツセイの場合には）抗原に結
合した第１の抗体になるであろう。多くの他のタイプの
検体が技術に精通した者にとつては明らかであろう。 検体の記述から、本発明はイムノ・アツセイや核酸プ
ローブ・ハイブリダイゼーシヨン・アツセイに用いる応
用も含んだ広い応用の可能性がある。こうして、他の応
用の中でも、本発明は植物や、人間を含む動物の病気の
診断に有用であり、さらに食物や血液、組織培養のよう
な試料の汚染の検査に有用である。 検体に対する“親和性分子”とは検対に親和性をもつ
物質（あるいは、異つた名前をつけると、特異的に結合
する物質）の分子のことである。特定の検体に特異的に
結合する物質や、それらの調製方法は、本技術分野にお
いてよく知られているところである。 抗原検体（それ自体抗体であるかもしれぬ）に対して
は、モノクローナル抗体を含む抗体が、特異的結合物質
として利用可能である。唯一つの抗体を含むサンプル中
のある種の抗体検体に対しては、ブドウ球菌プロテイン
Ａのような抗体結合タンパクを特異的結合物質として用
いることができる。 核酸（DNA又はRNA）あるいはその断片の検体について
は、検体の断片と相補的な配列の部分を含む、オリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチド（双方とも、DNA又はR
NA）を特異的結合物質として用いることができる。そう
した親和性分子は自動合成技術を含むイン・ビボ（in
vivo）又はイン・ビトロ（in vitro）の多くの既知の
方法のいずれかにより合成することができる。技術分野
において理解されているように、DNA又はRNA親和性分子
が、アツセイにおける前もつて決定された特異性を発揮
するために持たなければならない長さは、部分的には、
アツセイしているサンプル中の核酸の量や複雑さに依存
している。そのような親和性分子は通常、少なくとも10
ヌクレオチドを必要とする。１つの糖タンパク又は一連
の糖タンパク、あるいは、１つのポリ多糖又は一連のポ
リ多糖のような、レクチンに、特異的に結合する炭化水
素部分をもつことによりサンプル中の他の物質と区別さ
れる検体については、適当な特異的結合物質はレクチン
である。 ホルモンの検体については、ホルモンのレセプターを
特異的結合物質として用いることができる。逆に、ホル
モンのレセプターが検体のときは、ホルモンを特異的結
合物質として用いることができる。 酵素の検体については、酵素の阻害物質を特異的結合
物質として用いることができる。検体が酵素の阻害物質
のときは、酵素を特異的結合物質として用いることがで
きる。 通常、検体分子と検体分子に対する親和性分子は、特
異的結合対として、即ち、これらの相互作用は非共有結
合（例えば塩橋、水素結合、疎水的相互作用）のみを介
しているものとして関係している。 熟練者は、サンプル中の親和性分子と、存在するかも
しれぬ検体との間の結合がおこる条件を容易に決定する
ことができる。詳細には、熟練者は技術分野において
“特異的結合”と考えられている、親和性分子と検体と
の間の結合を生じさせることができる条件を容易に決定
することができる。技術分野において理解されているよ
うに、そのような特異性は通常親和性分子がサンプル中
の他の物質と構成物（例えば器壁や固体担体）よりも、
検体に対してより高い特異性を示すことによる。 本発明のアツセイ方法を実行するサンプルは、血清
や、他の体液、又は組織培養培地や食料品のような生体
物質の生のままの標本であることもありえる。より典型
的には、本方法は、生の標本を親和性分子の非特異的結
合を生じさせるなどして、検体の検出を妨げるような物
質を取り除く各種の処理を施すことにより得られた、加
工した標本のサンプルについて実施される。生の標本を
加工して、本発明のアツセイ方法により適したサンプル
を得るための方法は、技術分野においてよく知られてい
る。 こうして、本方法は、GrunsteinとHognes,Proc.Natl.
Acad.Sci.（U.S.A.）72巻、3961−3965ページ（1975
年）（例えばFalkowとMoseley,米国特許No.4,358,535;
及びShafritz,米国特許No.4,562,159なども参照せよ）
のコロニーハイブリダイゼーシヨン法や、あるいは、Be
ntonとDavis,Science,196巻、180−182ページ（1977
年）のプレーク・リフト法に従つて細胞から得た核酸に
ついて実行することができる。本方法は、また、ウイロ
イドやウイルス、あるいは標本の細胞から単離され、固
体担体上（計量棒（dipstick）上の固体担体や、ミクロ
稀釈プレート・ウエルの内壁なども含んでいる）に付着
させた（GillespieとSpiegelman,J.Mol.Biol.12巻、829
−842ページ（1965年））核酸についても行うことがで
きる。本方法はまた標本から単離され、“ドツト（do
t）”・ブロツテイング（Kafatosら、Nucl.Acid.Res.7
巻、1541−1552ページ（1979年）;WhiteとBancroft,J.B
iol.Chem.257巻、8569−8572ページ（1982年）；サザン
・ブロツテイング（Southern,J.Mol.Biol,98巻、503−5
17ページ（1975年））；“ノーザン”ブロツテイング
（Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）77巻、5201−
5205ページ（1980年））；さらに、エレクトロ・ブロツ
テイング（StellwagとDahlberg;Nucl.Acids.Res.8巻、2
99−317ページ（1980年））により固体担体上に固定さ
れた核酸についても行うことができる。 標本の核酸はまた、本発明を水層ハイブリダイゼーシ
ヨン（BrittenとKohre,Science 161巻、527−540ページ
（1968年））及び水／有機中間層ハイブリダイゼーシヨ
ン（Kohreら、Biochemistry 16巻、5329−5341ページ
（1977年）に応用した方法によりアツセイすることもで
きる。水／有機中間層ハイブリダイゼーシヨンは大変速
い速度で進行する利点があるが、ビオチンのような有機
層に可溶性の連結部分が核酸親和性分子に結合している
場合は適していない。 本発明のアツセイ方法はまた、標本から単離され、ド
ツト・ブロツテイングや“ウエスタン”ブロツテイング
（例えば、実施例XIIを参照せよ）、又は、ミクロ稀釈
プレート・ウエルや計量棒上の固体担体に吸着させるこ
により、固体担体上に固定されたタンパクやポリ多糖に
ついても行うことができる。 さらにまた、本発明の方法は、標本の細胞性タンパク
や全細胞表面のポリ多糖（例えば、実施例XIを参照のこ
と）、あるいは、レプリカ・プレートのバクテリアや酵
母のような、固体担体上に固定した微生物由来のタンパ
クやポリ多糖などの検出に応用できる。 親和性分子が、アツセイしているサンプル中に存在す
るかもしれない検体と結合する前か、又は後に、複製型
RNAは親和性分子に結合しなければならない。 “複製型RNA"とは、イン・ビトロで自動触媒的に複製
される、即ち、イン・ビトロでRNA依存性RNAポリメラー
ゼによつて触媒される反応により複製されうるいかなる
RNAでもよい。本発明の実践に適したRNAポリメラーゼ及
び複製型RNAは以下の実施例Ｉに記述されている。 これに関連して、ここで述べるバクテリオフアージＱ
βは、特定の変種や突然変異体やその個体群に限定され
ない。そのような言及は特に制限しないならば、バクテ
リオフアージＱβの感染が疑われるE.coliの感染に際し
て、RNA依存性のRNAポリメラーゼの生産を起こすいかな
る変種や突然変異体やその個体群に対してなされてい
る。 それによる感染が疑われるバクテリアの感染に際し
て、RNA依存性RNAポリメラーゼ及び、それに関連した本
発明に利用可能な、イン・ビトロで自動触媒的に複製さ
れることができる複製型RNAを生産する他のフアージに
ついては、例えばMiyakeら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.
S.A.）68巻、2022−2024ページ（1971年）を参照せよ。 複製型RNAは多くの異なる方法により親和性分子に結
合させることができるが、そのうちのいくつかについて
は実施例に記述されている。 もし、複製型RNAが、親和性分子が検体に結合する前
に、親和性分子に結合するのであれば、熟練者によく理
解されているように、親和性分子の検体に対する特異性
が失われていないことが必須であり、即ち複製型RNAに
結合した親和性分子は、アツセイにおいて試験されてい
る検体にいくらかの特異的をもつて結合する能力を維持
していなければならない。 もし複製型RNAが、親和性分子が検体に結合した後で
親和性分子に結合するのであれば、これも熟練した者に
はよく知られているように、複製型RNAの結合した親和
性分子を、親和性分子に結合していない複製型RNAから
分離できることが必須である。このことは重要な問題で
はない。通常の場合、検体に結合し、さらに固体担体に
結合した親和性分子について、そのような分離は単に洗
浄することにより容易に達成される。なぜならば、複製
型RNAが、結合した親和性分子に結合することは、親和
性分子と固体担体との関係を大きくこわしてしまうこと
がないからである。もし通常のケースが得られない場合
には、そのような分離は、よく知られたクロマトグラフ
イーや電気泳動の技術のいずれかにより容易に達成され
る。 最後に、複製型RNAの親和性分子への結合は、RNA依存
性のRNAポリメラーゼによるRNAの複製能を失わせないよ
うなものでなければならない。即ち、親和性分子に結合
している複製型RNAは、RNA依存性RNAポリメラーゼによ
る複製の鋳型であるか、あるいは、親和性分子から分離
されて、RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型の
形態をとつていることができるのである。 複製型RNAと親和性分子との間の関係の１つのタイプ
は、親和性分子自体が複製型RNAで、主に適当な配列を
もつた部分を含む組み換えRNAであるものである。その
ような親和性分子は、核酸やその断片である検体にむい
ているであろう。親和性分子は複製型RNAから、好まし
くは、Mieleら、先に引用、及びKramerら、米国特許出
願番号No.614,350の方法により、検体の部分配列と相補
的な配列を含むように調製された組み換えRNAであろ
う。この相補配列の部分は、特異性を与えるためには少
なくとも、長さは10リボヌクレオチドあり、複製能を失
わないためには長さは約4500ヌクレオチドまでのもので
ある。実施例IXに組み換えRNAを親和性分子として用い
る例が説明されている。 複製型RNAと親和性分子との間の結合は、非共有又は
共有的な結合でありうる。 親和性分子と複製型RNAの間の非共有的な結合は、親
和性分子に、複製型RNA断片の相補的な配列の核酸部分
が結合するかとりこまれるかして、さらに複製型RNAが
親和性分子に結合するかとりこまれた部分とハイブリダ
イズすることにより形成されることができる。そのよう
な核酸断片を、タンパクの親和性分子に結合させるもの
については、例えばDattaguptaら、ヨーロツパ特許出願
広報No.0154884を参照せよ。核酸の親和性分子について
は、そのような断片を結合させたり、とりこませたりす
る方法は、技術分野においてよく知られている。親和性
分子と複製型RNAとの間のそのような結合を用いて、複
製型RNAが複製されて検出が可能になるような複製型RNA
の検体に結合した親和性分子からの分離は、複製型RNA
部分と親和性分子に結合した、あるいは、とりこまれた
核酸部分との複合体の融解温度以上に加熱することによ
り達成される。 複製型RNAと親和性分子との間の非共有的な結合は、
また、複製型RNAに結合した１番目の連結部分と、親和
性分子に結合した２番目の連結部分の結合を通じて行わ
れ、ここでいう連結部分とは特異的な結合対をさしてい
る。 複製型RNAと親和性分子との間の共有的な結合は、唯
一つ共有的な両者の間の結合（複合体の２次又は３次構
造から生じた結合は除く）を通じて行われる。通常、共
有的な結合は複製型RNAに共有結合した１番目の連結部
分と、親和性分子に共有結合した２番目の連結部分と、
さらに１番目と２番目の連結部分との間の共有結合が係
わつている。 ここで述べた複製型RNA又は親和性分子に対する連結
部分の“共有的な結合”又は“共有的な連結”又は“共
有的な接合”とは、連結部分とそれぞれの複製型RNA又
は親和性分子との間の、２次又は３次構造から生じる結
合以外のすべての結合が、共有的なものであることを意
味している。ここで述べた、連結部分の複製型RNA又は
親和性分子への“結合（joining）”、“連結（linkag
e）”、あるいは“接合（connection）”とは、無条件
に、連結部分が“共有的に”又は“非共有的に”、それ
ぞれ複製型RNAや親和性分子と結合したり連結したりす
ることを意味している。“非共有的な”結合、又は連
結、接合とは、連結部分と複製型RNAや親和性分子との
間の、２次、３次構造による結合以外の、少なくともい
くつかの結合が非共有的なものであることを意味してい
る。 連結部分と複製型RNAとの間の共有的な結合で、それ
によつてRNAの複製能が失われないもののいくつかの例
として以下のものが含まれる。 （ａ）連結部分は、リン酸基であり、結合は、リン酸と
複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素との間の
直接的なもの。複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′
−炭素に結合したリン酸連結部分は、通常、核酸親和性
分子の３′−ヌクレオチドの３′−炭素へのあるいは、
核酸親和性分子の３′−末端に結合していると考えられ
ている連結部分で、さらに、その５′−ヌクレオチドの
５′−炭素におけるリン酸を介して親和性分子の３′−
ヌクレオチドの３′−炭素に共有結合している核酸断片
の３′−ヌクレオチドの３′−炭素への直接の共有結合
が、係わつている。複製型RNAの５′末端ヌクレオチド
は、技術分野において既知の方法により、５′炭素をT4
ポリヌクレオチド・キナーゼでリン参加することができ
る。実施例Ｉも参照せよ。親和性分子、あるいは親和性
分子の核酸連結部分は、次に、T4RNAリガーゼを用いる
既知の方法により、複製型RNAの５′−ヌクレオチドの
５′−リン酸に接続することができる。この後者の反応
は、もし、リボヌクレオチドが親和性分子（又は親和性
分子の連結部分）の３′−末端であればより効率的に進
行する；技術分野において知られているように、単一の
リボヌクレオチド末端デオキシヌクレオチド転移酵素を
用いて、DNAの３′−末端に付加させることができるの
である。 （ｂ）連結部分がビオチン又はイミノビオチン（imino
−biotinyl）で式−NH(CH2)aaNH(PO2)O−、式−NH(CH2)
bbSS(CH2)ccNH(PO2)O−、又は式−NH(CH2)bb(CO)(NH)(C
H2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループを介した複製
型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に連結したも
の、ここで、それぞれ、リン酸アミド基は５′−ヌクレ
オチドに、そして、アミノ基はビオチン又はイミノビオ
チンに結合しており、aaは２から20、bbとccは同じか又
は異つており、それぞれ２から20である。式−NH(CO2)
aaNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつた複製型RN
Aは、ChuとOrgel,DNA,4巻,327−331ページ（1985年）の
方法に従い合成することができる。式−NH(CH2)bbSS(CH
2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつた複製型
RNAは、実施例Ｉに説明されている。式−NH(CH2)bb(CO)
(NH)(CH2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループをもつ
た複製型RNAは、複製型RNAを、５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合した式 −O(PO2)NH(CH2)ccNH2基と式NH2(CH2)bbCO2Hのアミノ・
カルボン酸の活性エステルと反応させることにより合成
される。１級アミノ基をもつたビオチン・アミド又はイ
ミノビオチンアミド結合を生成させるビオチン又はイミ
ノビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミノ・エステル
（Ｎ−hydroxysuccinimino）の反応は、技術分野におい
て知られており、実施例で説明されている。 （ｃ）式−(CH2)aa(NH)(PO2)O−又は−(CH2)bbSS(CH2)N
H(PO2)O−のスペーサー・グループを介して連結したア
ミノ基連結部分のものでここでリン酸アミド基は、複製
型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合してお
り、aa、bb、及びccは前述のように定義される。そのよ
うな複製型RNAの調製には、ChuとOrgel,DNA,4巻,327−3
31ページ、及び以下の実施例Ｉの方法が用いられる。 （ｄ）式−(CH2)ccNH(PO2)O−のスペーサー・グループ
により結合したイオウ連結部分のもので、ここでリン酸
アミド基は複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭
素に結合しており、ccは前述のように定義される。実施
例ＩとＸでは、そのような連結部分とスペーサーグルー
プをもつた複製型RNAの合成について説明している。 アビジンやストレプトアビジンの連結部分と、複製型
RNAの間の“非共有”結合の例は、アビジン又は、スト
レプトアビジンがビオチン又はイミノビオチンと複合体
を（ここで述べる複合体には非共有的な相互作用のみが
係わつている）形成し、さらに、このビオチン又はイミ
ノビオチンが先に述べたスペーサー・グループの１つに
より複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結
合して複製型RNAにビオチン又はイミノビオチンを共有
的に結合させたものであろう。 核酸の親和性分子については、連結部分との共有結合
は、５′−ヌクレオチドの５′−炭素、３′−ヌクレオ
チドの３′−炭素、あるいはピリミジン又はプリン塩基
の各種原子を介して形成させることができる。連結部分
は、検体の断片の配列と相補的な配列をもつた親和性分
子の断片のそれぞれ３′−、５′−末端から伸長する核
酸断片の３′又は５′未満のヌクレオチドである。連結
部分は、例えば、上述のスペーサー・グループの１つを
介して、複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′炭素に
結合するように、親和性分子の５′−ヌクレオチドの
５′−炭素に結合した、ビオチン又はイミノビオチン、
あるいは、硫黄原子であろう。ビオチン連結部分（複数
のこともある）は、それにより親和性分子が検体にハイ
ブリダイズする、検体の断片の配列と相補的な配列をも
つ断片以外の核酸親和性分子の部分において、各種のス
ペーサー・アームを介してウラシル（uracil）残基（複
数のこともある）の５−炭素あるいはアデニン（adenin
e）残基（複数のこともある）の８−炭素又は６−炭素
に結合していることもあろう。例えばRuth、特許協会条
約広報No.84/03285;BrakelとStarvianopoulous、ヨーロ
ツパ特許出願広報No.0122614を参照せよ。複製型RNAに
ついては、親和性分子に適当な特に親和性分子の検体に
対する親和性を失わせないような、多くの他の連結部分
やスペーサー・グループ、さらに、そのような連結部分
やスペーサー・グループをもつた親和性分子の調製方法
などが、技術分野において知られている。 抗体、抗原あるいは、レクチンの親和性分子について
は、多くの連結部分（例えば、ビオチン、複製型RNAの
ハイブリダイゼーシヨンに用いる核酸断片、硫黄原子な
ど）や、それらを、直接、又はスペーサー・グループを
介して親和性分子に共有結合させる適当な方法が技術分
野において知られている。例えば多くのビオチニル化さ
れた抗体やレクチンが購入可能である。 アビジン又はストレプトアビジンのような連結残基
と、抗体、抗原、又はレクチン親和性分子との間の“非
共有”結合の１つの例は、アビジン又はストレプトアビ
ジンがビオチンやイミノビオチンと複合体をつくつてお
り、これが、親和性分子に非共有的あるいは、共有的に
連結したものである。例えばビオチンは、技術分野にお
いて理解されているように、ビオチニル化した抗−抗
体、又は、ビオチニル化したブドウ球菌プロテインＡ
と、抗体親和性分子の複合体を形成させることにより、
非共有的に抗体親和性分子に結合させることができる。 技術における補促的な情報として、タンパクや核酸に
連結残基を結合させる方法に関しては、例えばDreyerと
Dervan,Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）82巻、968−972
ページ（1985年）;Forsterら、Nucl.Acids,Res.13巻、7
45−761ページ（1984年）;Wardら、ヨーロツパ特許出願
広報No.0063879;Englehardtら、ヨーロツパ特許出願広
報No.0097373;AlagonとKing,Biochemistry19巻、4341−
4345ページ（1980年）;Imamら、Cnacer Res.45巻、263
−271ページ（1985年）を参照せよ。 複製型RNAに結合した１番目の連結部分と親和性分子
に結合した２番目の連結部分は、（２つの硫黄原子連結
部分から形成されるジスルフイド残基や、複製型RNAの
５′−末端のリン酸に結合した核酸親和性分子の３′−
末端から伸長したヌクレオチドのように）相互に共有結
合したり、あるいは、（アビジン又は、ストレプトアビ
ジンに結合したビオチンやイミノビオチン、対応する抗
体に結合した抗原、又は、酵素に結合した酵素阻害剤の
ように）特異的な結合対として相互に非共有的に相互作
用することにより、複製型RNAと親和性分子との間の結
合を形成する。 先に示したように、親和性分子と複製型RNAとの間の
共有結合の１つの例は、親和性分子がイン・ビトロで合
成される間か、又は、末端デオキシヌクレオチド転移酵
素を用い、そして次に、T4RNAリガーゼを用いて、５′
末端を介して（１つ又はそれ以上の）プリンの伸長３′
−末端に複製型RNAを結合させる間に、DNA親和性分子の
３′−末端に付加された伸長プリン残基を介して形成さ
れる結合である。技術分野において理解されているよう
に、この連結部分の３′−末端におけるプリン・ヌクレ
オチドは、複製型RNAへの付加を効率よく進行させるた
めには、リボヌクレオチドであるべきである。そのよう
な親和性分子−複製型RNAハイブリツドが検体に結合し
た後で、もし、これがRNAレプリカーゼの鋳型として活
性できないときには、酸脱プリン反応、次にβ−脱離に
よりリン酸ジエステル結合を開裂させて、RNAをDNAから
解離させることができ、そこでレプリカーゼの鋳型とし
て用いることができる。 他の例には、T4RNAリガーゼを用いて、RNA親和性分子
を複製型RNAのどちらかの末端に結合させるものがあ
る。そのような分子は、複製型RNAと、検体とハイブリ
ダイズする親和性分子の断片との間に、多少のリボヌク
レオチドをもつように調製される。その結果得られたRN
Aは、もし親和性分子RNAが複製型RNAの５′−末端に付
加しているのであれば、それ自体RNAレプリカーゼの鋳
型となることができる。もし、その結果得られたRNA
が、レプリカーゼの鋳型とはならない場合、親和性分子
部分は、複製型RNA部分から解離させ複製型RNAを放出さ
せる。そのような解裂は、初めに、複製型分子と、検体
にハイブリダイズする親和性分子部分の間の断片と相補
的な配列をもつオリゴデオキシリボヌレオチドと、分子
をハイブリダイズさせ、（検体にハイブリダイズさせる
か、又は検体にハイブリダイズさせた後、加熱する（又
は融解する）ことにより遊離させ）、次に、RNAがDNAと
ハイブリダイズする位置で特異的にRNAを切断するリボ
ヌクレアーゼＨを用いて、開裂させるのである。Donis
−Keller,Nucl.Acids Res.7巻、179−192ページ（1979
年）を参照せよ。 本発明に従う、親和性分子−複製型RNAハイブリッド
化合物（即ち、親和性分子が複製型RNAに結合している
化合物）の中には、“スマート・プローブ”がある。
“スマート・プローブ”とは、親和性分子が核酸であ
り、２番目の連結部分が親和性分子に共有結合してお
り、１番目の連結部分が複製型RNAに共有結合してい
て、さらに１番目と２番目の連結部分が相互に共有結合
している親和性分子−複製型RNAハイブリッド分子のこ
とである（即ち、２次、３次構造による結合を除いて、
２つの連結部分の間のすべての結合は共有的である）。
さらにスマート・プローブでは、親和性分子と２つを結
合している１番目と２番目の連結部分、さらにこの２つ
の連結部分を結合しているいかなる部分も、理想的に
は、もし親和性分子部分が検体にハイブリダイズしてい
れば、あるいは、しているときだけハイブリツド分子の
複製型RNAが、RNA依存性のRNAポリメラーゼにより複製
されるようになつているのである。要するに、このプロ
ーブはそれ自体検体と結合して検出を可能にするから
“スマート”なのである。 本発明に従つたスマートプローブの１つの具体例は、
複製型RNA部分が親和性分子部分の３′−末端断片の配
列と相補的な配列をもつ、約10から30のリボヌクレオチ
ドの短い断片を含む組み換え複製型RNAのものである。
この組み換え複製型RNAは、例えば、Mielら、先に引
用、及び、クラマー（Kramer）ら、米国特許出願番号N
o.614,350先に引用、の方法に従つて合成する。親和性
分子部分は、典型的には約75から150ヌクレオチドの長
さで、これは、複製型RNA部分に組み換えられた部分の
配列と相補的な配列をもつ部分よりもいくぶん長く、さ
らにこれは、技術分野において既知の多くのイン・ビト
ロやイン・ビボの方法のいずれかにより合成される。組
み換え複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素と
親和性分子部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭素は、
実施例Ｉ及びＸの方法に従い、式−O(PO2)NH(CH2)aSS(C
H2)bNH(PO2)O−の部分によりスマート・プローブ中に結
合させる。ここでａとｂは同じか、または異なるもので
あり、それぞれ２から20である。そのようなスマート・
プローブでは、親和性分子部分が何か他のものとより安
定に結合していない場合（そのような結合は、実質的に
は、検体との特異的な結合か又は、非特異的な結合だけ
である）、親和性分子部分の３′−末端は、組み換えRN
A部分とハイブリダイズしたままになつている。プロー
ブの使用に際しては、初めにサンプルの核酸とのハイブ
リダイゼーシヨンを行い、次にリボヌクレアーゼＨの溶
液を加えると、親和性分子部分が複製型RNA部分から解
離していないスマート・プローブの、複製型RNA部分の
開裂と複製能の喪失がおこる（Doonis−Keller（1979
年）、先に引用、を参照せよ）；次に結合していないス
マート・プローブを除くために短い洗浄を行い、さらに
親和性分子部分が、複製型RNAがリボヌクレアーゼＨに
よる開裂を受けないように、複製型RNAから解離してし
まつている、少量の非特異的結合をおこしたスマート・
プローブの量を減ずる；そして最後に、ジチオスレイト
ール（dithiothreitol）でジスルフイド結合を開裂し
て、複製型RNAを親和性分子から解離させた後で、RNAを
複製し、複製したRNAを検出することにより検出を行う
のである。 本発明のスマート・プローブのもう１つの具体例で
は、標的とハイブリダイズしていないプローブの複製型
RNAを不活性化するのにリボヌクレアーゼＨによる開裂
を必要としていない。この具体例では、親和性分子部分
の５′−ヌクレオチドの５′−炭素は、他の具体例と同
様に、式−O(PO2)NH(CH2)aSS(CH2)bNH(PO2)O−の部分に
より、複製型RNA部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭
素に結合している。この具体例では、どんな複製型RNA
をも用いることができる。親和性分子部分に対応する組
み換え複製型RNAを調製する必要はない。しかしながら
この具体例では、親和性分子部分は、本質的に以下の３
つの部分から構成されている：即ち、親和性分子がハイ
ブリダイズする検体の部分配列を相補的な配列中の約50
から150ヌクレオチドからなる“検体−結合”部分；親
和性分子の５′−ヌクレオチドから、検体結合部分の
５′−ヌクレオチドへ伸長し、（しかしこの部分を含ん
ではいない）、複製型RNAの部分の配列と相補的な配列
中の約30から60ヌクレオチドからなる“５′−クランプ
（clamp）”部分；そして、検体−結合部分の３′−ヌ
クレオチド（しかし、この部分は含まない）から、親和
性分子の３′−ヌクレオチドへ伸長し、親和性分子の
５′−クランプ部分がハイブリダイズする部分よりも、
さらに、複製型RNAの５′−末端に近接する複製型RNAの
部分と相補的な配列中の、約30から60ヌクレオチドから
なる“３′−クランプ”部分である。 技術分野において知られている方法による、この具体
化では随意に、親和性分子の５′−クランプ部分及び
３′−クランプ部分とハイブリダイズする複製型RNA部
分の少なくともいくつかのグアノシン塩基はイノシンで
置換することができる。この効果は、（クランプしてい
ない）複製型RNAを複製の鋳型として活性なものとし、
さらに、これら複数型RNA部分で、DNA−RNA塩基対を安
定化し、逆にRNA−RNA塩基対を不安定なものにすること
である。この具体例の親和性分子は、他の場合と同様
に、既知のイン・ビトロ又はイン・ビボの方法により合
成される。複製型RNA部分の親和性分子部分への連結
は、実施例Ｉ及びＸに従つて行う。この具体例では、親
和性分子の３′−クランプ部分と５′−クランプ部分の
双方が、複製型RNAにハイブリダイズしている間、複製
型RNAは非複製型に“クランプ”されており、複製の鋳
型として不活性である。一度、スマート・プローブが、
１つ、又は、他のクランプ部分が複製型RNAから解離す
るようにして親和性分子部分が十分な安定性をもつて結
合するような何物かと、（それは本質的に検体だけであ
ろう）遭遇すれば、RNAはとたんに複製可能になり検出
可能な形をとる。本発明のスマート・プローブの具体例
の利用に際して、まず初めに、サンプルの核酸とのハイ
ブリダイゼーシヨンを行い、次に、短い洗浄を行なつて
結合していないスマート・プローブを除き、さらに、一
方又は両方のクランプ部分が複製型RNAから遊離してい
る。少量の非特異的な結合をしたスマート・プローブを
減少させ、最後に、ジチオスレイトールでジスルフイド
結合を開裂して複製型RNAを親和性分子から解離させた
後、随意に、RNAを複製させ、複製したRNAを検出するこ
とにより検出を行うのである。 検体を含まない部位に非特異的に結合した複製型RNA
から生じるシグナルは、本発明に従うスマートプローブ
を用いると減少してしまうので、比較的低いバツク・グ
ラウンドを得るためのハイブリダイゼーシヨンの後での
長時間の洗浄の必要性は、技術分野において現在行われ
ている典型的な核酸プローブ・ハイブリダイゼーシヨン
・アツセイに比べて、そのようなプローブを用いたアツ
セイでは小さなものとなる。 イムノアツセイや核酸プローブ・ハイブリダイゼーシ
ヨン・アツセイの技術に習熟した者には理解できること
だが、“バツク・グラウンド”を生じる、親和性分子や
複製型RNAの（そのRNA部分あるいは一番目の連結残基部
分を介しての）不可避的な“非特異的結合”を取り除
き、ただ検体に（親和性分子に結合したり又は結合しつ
づけて）連結した複製型RNAだけがアツセイ系に存在す
るように、必要な結合をおこさせ、洗浄のステツプを行
つた後で、系をRNA依存性のRNAポリメラーゼを用いる複
製からなるプロセスにより、複製型RNAが検出可能にな
る条件にかけるのである。 現在の発明に従つてアツセイを行う上で、アツセイ中
の検体に結合する又は結合している親和性分子に結合し
た複製型RNAは、親和性分子に結合している間か、ある
いは、それから分離された後のどちらかにRNA依存性RNA
ポリメラーゼにより複製されうることが必要である。複
製型RNAを親和性分子から分離させる各種の方法を先に
記述したがその中には、複製型RNAを親和性分子に結合
させている連結部分の中の、又は、間のジスルフイド結
合を還元的に切断する方法が含まれている。 複製型RNAをRNA依存性RNAポリメラーゼで複製する方
法は、技術分野において知られている。一般に、RNA
は、４つのリボヌクレオシド−５′−三リン酸、ATP、C
TP、GTP及びUTPを含む適当な水系緩衝液中、単に酵素と
混合し、適当な温度でインキユベートしなければならな
い。例では、好まれる酵素であるＱβレプリカーゼを用
いて複製を行う条件を説明している。Kramerら、M.Mol.
Biol.89巻、719−736ページ（1974年）;Kramerら米国特
許出願広報No.614,350;Mielら（1983年）先に引用、な
ども参照せよ。 別法として、親和性分子から解離した複製型RNAは、E
CTEOLAペーパーのような、正に荷電した担体に結合させ
ることができる（Sarisら、Nucl.Acids.Res.10巻、4831
−4843ページ（1982年））。複製型RNAの結合したその
ような担体は、適当な緩衝液を用いて４つのリボヌクレ
オシド−５′−三リン酸とともに適当な温度のもと、RN
Aレプリカーゼ（RNR依存性RNAポリメラーゼ）の溶液に
懸濁させると（即ち液相の複製に用いたのと本質的に同
じ条件である）、すると担体に結合したRNAの複製が起
きるのである。Sarisら（1982年）上述；及びBresser
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）80巻、6523−6527
ページ（1983年）を参照せよ。簡便なRNAの検出では、
複製型RNAは正に荷電した担体に結合したままである。 複製型RNAは多くの異なる方法により検出することが
できる。 検出は、例えば、接触光プリンテイング法（Kutatela
dzeら、Anal.Biochem.100巻、129−135ページ（1979
年））のように複製型RNAの紫外線吸収により行うこと
ができる。 複製されたRNAが放射活性をもつように、複製反応
中、放射活性で標識した（例えば、3Hラベルとか、α−
32PO4−ラベルなど）リボヌクレオシド−５′−三リン
酸を用いることにより、複製されたRNAをその放射活性
により多くの既知の方法のいずれかを用いて検出するこ
とができる。 ビオチン又はイミノビオチンは複製型RNAにとりこま
せることができる、これはさらに既知の技術を用いて、
RNAの結合したビオチンに結合し、簡単に検出すること
のできる色素の生成を触媒する、酵素−アビジン又は酵
素−ストレプトアビジン付加物として検出することがで
きる。Metthewsら（1985年）上述;Learyら（1983年）、
上述;Wardら、上述;Englehardtら、上述、を参照せよ。
ビオチン又はイミノビオチンの複製型RNAへのとりこみ
は、ウラシル残基の５位の炭素にスペーサーを介してビ
オチニル化されたUTPを、複製反応のレプリカーゼの基
質として用いることにより行うことができる。そのよう
なUTPは既知の化合物である。さらに、そのようなUTPは
Ｑβレプリカーゼの基質となり、さらに、５位の炭素に
結合したスペーサー・グループを介してビオチニル化さ
れたウラシルを含むRNAは、その合成にそのようなUTPを
用いたために、Ｑβレプリカーゼが触媒する複製の鋳型
となることが知られている。 複製の過程の結果生じたRNAもまた、Forsterら（1985
年）上述、の方法に従い、光ビオチン酢酸を用いてビオ
チニル化することができ、さらに次に、アビジン−酵素
付加物−色素原化合物の系を用いて、複製反応において
ビオチニル化したUTPを使つて合成した複製型RNAと同様
に検出することができる。 複製過程の結果生じたRNAは、T4RNAリガーゼの触媒す
る反応を用いて、複製型RNAの３′末端に螢光修飾した
核酸を付加することにより、螢光をもたせることができ
る。Cosstickら、Nucl.Acid.Res.12巻、1791−1810ペー
ジ（1984年）を参照せよ。その結果得られたRNAの螢光
は、いつかの標準的な技術のいずれかにより、RNAの検
出に用いることができる。 複製されたRNAの検出に用いることのできるさらに他
の方法の中には、核酸と特異的に結合する受容体物質
を、複製が行なわれる系か、あるいは、複製型RNAが単
離されているECTEOLAペーパーのような正に荷電した担
体などの媒体に添加して、受容体物質から生じるシグナ
ルを測定するものがある。そのような物質には以下のも
のが含まれる：“ステイン・オール（Stains all）”の
ような色素原染料（Dahlbergら、J.Mol.Biol.41巻、139
−147ページ（1969年）；メチレンブルー（DingmanとPe
acock,Biochemistry,7巻、659−668ページ（1968年）及
び銀染色（Sammonsら、Electrophoresis,2巻、135−141
ページ（1981年）、Igloi,Anal,Biochem.134巻、184−1
88ページ（1983年）；例えば臭化エチジウムなどのRNA
に結合する螢光原化合物（Sharpら、Biochemistry,12
巻、3055−3063ページ（1973年）;BaileyとDavidson,An
al.Biochem.70巻、75−85ページ（1976年）;Qβレプリ
カーゼによる複製の鋳型となるRNAに特異的に結合する
螢光原化合物……例えばＱβレプリカーゼの感染サブ・
ユニツトに共役するフイコビリ・プロテイン（phycobil
iprotein）（Oiら、J.Cell Biol,93巻、981−986ページ
（1982年）、Stryerら、米国特許No.4,520,110）などで
ある。 レプリカーゼの濃度が、鋳型RNAの濃度ふりも濃いま
まであり、さらにリボヌクレオシド−５′−三リン酸の
濃度の制限を受けないと仮定すると、鋳型RNAの濃度
は、レプリカーゼの触媒によるRNAの複製の間、時間と
ともに対数的に増大するであろう。鋳型RNAの濃度が、
レプリカーゼの濃度と等しくなるか、超えてしまつた後
では、リボヌクレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限
を受けないかぎり、鋳型RNAの濃度は、時間に直線的に
増加するであろう。例えばKramerら（1974年）上述、を
参照せよ。 実施例Ｉに特定されるレプリカーゼ触媒による複製の
条件下では、MDV−1 RNAは36秒毎にその濃度を倍化し、
ついには、鋳型の濃度が酵素の濃度を上回つてしまうこ
とが示されている。 レプリカーゼ触媒による複製反応系で、一定の反応時
間の後の鋳型RNAの濃度は、鋳型RNAの初期濃度に関係す
ることになる。もし、複製反応の間中、レプリカーゼの
濃度が鋳型の濃度よりも高いものと仮定すれば、（さら
にリボヌクレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限を受
けなければ）、反応終了時の鋳型RNAの濃度の対数は、
鋳型の初期濃度（反応開始時点の）対数に、直接比例す
るであろう。レプリカーゼの濃度が鋳型の濃度よりも低
くなつた後では、リボヌクレオシド−５′−三リン酸の
濃度の制限を受けないかぎり、反応終了時の鋳型の濃度
は、鋳型の初期濃度の対数に直接比例する。さらに、鋳
型の濃度がレプリカーゼの濃度に等しくなるまでに要す
る反応時間は、鋳型の初期濃度の負の対数に比例する。 複製反応をより長時間進行させることにより、さらに
大きな感度を得ることができる。 本発明に従うアツセイでは、検体を試験しているサン
プルとコントロールサンプルの双方のテストサンプルに
ついてできるだけ同じような条件下で同時にアツセイを
行うのである。技術分野において理解されているよう
に、コントロールサンプルは、検体を含まないか、ある
いは既知の量の検体を含む点以外はテスト・サンプルと
同様なものになるようにする。検体を含まないコントロ
ールは“バツク・グランド”であり、それ以下のとき
は、検体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別す
ることは不可能である。テスト・サンプルのアツセイで
複製された複製型RNAの量又は濃度を、同時にアツセイ
したコントロール・サンプルの量又は濃度と比較するこ
とにより、テストサンプル中の検体の存在をバツク・グ
ランド以上のレベルで決定することができるのである。
もし、既知の濃度範囲の検体を加えたコントロール・サ
ンプルを用いたときは、テスト・サンプル中の検体の濃
度を推測することができる。 ここで、本発明を実施例によりさらに詳細にわたつて
記述してみる。 実施例１ 本実施例はビオチン及びアビジン（次に）の中間変種
RNA（「MDV−１」RNAとする）への結合において、該RNA
がＱβRNAポリメラーゼに対する鋳型として活性を保持
し、ビオチンまたはビオチン＋アビジンから分離可能で
ある、同方法を示す。ビオチン−アビジン特異的結合ペ
アーを介してアビジンに特異的に結合する能力のため
に、ビオチンのみが付いたMDV−1 RNAはアビジン骨格が
結合されうる（例えば、該親和性分子に直接自身で結合
されるビオチンを介して）いずれの親和性分子に対して
も普遍的レポーターとなり、その際、親和性分子の標的
生物ポリマー検体に特異的に結合する能力は損わない。
ビオチンに特異的に結合する能力（ビオチンとアビジン
との間の特異的結合ペアーに由来する）のために、ビオ
チン及びアビジン（ビオチンに対して複合体形成したも
の）を結合したMDV−1 RNAが、ビオチン骨格が結合され
うるいずれの親和性分子に対しても普遍的レポーターと
して使用されうるが、その際該ビオチン骨格自身のアビ
ジンに特異的に結合する能力または該親和性分子の標的
生物ポリマー検体に特異的に結合する能力は損わない。
（アビジンは４つのビオチン−反応生部位を有してお
り、それ故ビオチン−アビジン−ビオチン結合という中
間組成物となりうる。） MDV−1 RNAはミール（Miele）ら、J.Mol.Biol.171
巻、281−295ページ（1983年）において示される、中間
変種RNA変異株と同じ配列を有しており、次の相違点が
ある。ミールらの配列の43位ＣがMDV−1 RNAにおいてＵ
に変えられる。ミールらの配列の61位ＡがMDV−1 RNAに
おいてＧに変えられる。ミールらの配列における105位
ＡがMDV−1 RNAにおいてＵに変えられる。ミールらの配
列の134位ＣがMDV−1 RNAにおいてＵに変えられる。最
後に、ミールらの配列における135位ＧがMDV−1 RNA配
列においてＡに変えられる。今述べられた配列をもつ特
定のRNA変異株は本明細書の本実施例及び他の実施例に
おいて使用されたが、本変異株は、単に供給面で簡便に
入手可能であるという理由から使用された。該Ｑβレプ
リカーゼによる試験管内での複製に対する鋳型となるい
くつかのRNA（「野生型」中間変種RNA、MDV−1 RNAとは
異なる中間変種RNAの変異株、ミニ変種RNA、ミクロ変種
RNA、ナノ変種RNAのひとつ、同定はされているが名前が
まだ決定されていない他の変種または上記いずれかの突
然変異株で試験管内で該Ｑβレプリカーゼによる複製を
うける能力を保持しているものを含む）もまた使用され
うる。 さらに、ＱβRNA−依存生RNAポリメラーゼは、その試
験管内における著しい安定性のために本発明に対する好
適なレプリカーゼであるが、使用されうる技術において
知られている他のRNA−依存性RNAポリメラーゼがあり、
これは同ポリメラーゼが複製に対する鋳型として認識す
る複製可能RNAとともに非常に数が多い。これら他の酵
素の中にはSPレプリカーゼ及びMS2レプリカーゼが含ま
れる。 Ｑβレプリカーゼを用いる酵素的合成により得られる
５′−pppMDV-1（＋）RNAは一連の工程； １）５′−末端３リン酸基は子ウシ腸アルカルフオスフ
アターゼとのインキユベーシヨンにより除去され、〔ガ
ンマ−32P〕ATP及びT4ポリヌクレオチド・キナーゼとの
インキユベーシヨンにより５′−末端１リン酸に換えら
れた； ２）５′−フオスフオロイミダゾール基がカツプリング
試薬、１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピ
ル〕カルボジイミドの存在下イミダゾールとの縮合によ
り合成された； ３）該イミダゾール基はシスタミン・ジヒドロクロリド
とのインキユベーシヨンによりシスタミン基に転換され
た； ４）ビオチンがビオチニル化試薬、Ｎ−ヒドロキシサク
シニミドビオチンとのインキユベーシヨンによりシスタ
ミンに結合された；そして ５）アビジンがアビジンとのインキユベーシヨンにより
５′−ビオチン基に結合された により５′−ビオチニル化MDV−１（＋）RNA−アビジン
付加物に転化された。また、６）該５′−ビオチニル化
MDV−1 RNA−アビジン付加物は部分反応した中間体から
アクリルアミドゲル電気泳動により分離された。次の反
応式の初めの４工程は上述の工程２）〜５）を要約す
る： 式に示される５番目の工程は以下で述べるようにビオ
チン−アビジンからRNAを分離するための、シスタミン
骨格のジスルフイドの還元的開裂を示す。 RNA−ビオチン−アビジン付加物（II）の電気泳動上
での移動度は、その大きさのため、５′−ビオチニル化
RNA前駆体（Ｉ）の移動度よりも低かつた。 形成したRNA−ビオチン−アビジン付加物の量（各ゲ
ルのバンド中の放射活性を測定することにより決定され
る）はアビジン濃度の関数として漸近的に増加し、形成
付加物25〜35％で最大値に対した。RNA−ビオチン−ア
ビジン付加物（II）の同定は３つの方法で確かめられ
た： １）該５′−シスタミンMDV−1 RNAがアビジンとインキ
ユベートされ、生成物の電気泳動上の移動度が、未反応
対照のそれと同定され、遅い移動バンド中の付加物は非
ビオチニル化前駆体でないことを示した； ２）同様に、該５′−リン酸化MDV−1 RNAがビオチニル
化試薬と反応、電気泳動による精製、アビジンとのイン
キユベートのそれぞれがなされ、その移動度が同一のま
まであつた；そして ３）遅い移動度のバンドから溶出される該付加物の80％
以上がビオチニル化アガロースに結合していたが、５′
−シスタミンを含む対照物の場合では10％以下であつ
た。 さらに詳細な記述として、ビオチン及びアビジンのMD
V−１（＋）RNAの５′−末端への結合及び該付加物の同
定が、材料を使い、次の方法に従つて行われた： 酵素及び化合物 次のものが購入された：子牛腸アルカリフオスフアタ
ーゼ（ボーリンガー・マンハイムバイオケミカルス、イ
ンデイアンポリス、インデイアナ州、米国）、バクテリ
オフアージT4ポリヌクレオチドキナーゼ（フアルマシア
Ｐ−Ｌバイオケミカルス、ピスキヤタウエイ、ニユージ
ヤージー州、米国）；リボヌクレアーゼT1及び高重合酵
母RNA（キヤルバイオケム−ベーリング、サンデイエ
ゴ、カリフオルニア州、米国）;N−ヒドロキシサクシニ
ミドビオチン（シグマケイカル社、セント・ルイス、ミ
ズーリ州、米国）;2,2′−ジチオビス（エチルアミン）
−ジヒドロクロライド（CTCオーガニツクス、アトラン
タ、ジヨージア州、米国）;1−エチル−３−〔３−ジメ
チルアミノプロピル〕カルボジイミド（アルドリツチ・
ケミカル社、ミルウオーキー、ウイスコンシン州、米
国）；ビオチン化アガロース（8mgアビジン/ml結合）及
びアビジンDN（ベクター、ラポラトリース、バーリンゲ
ーム、カリフオルニア州、米国）；及び〔ガンマー
32P〕ATP及び〔アルフア−32P〕GTP（アマーシヤム、ア
ーリントン・ハイツ・イリノイ州、米国）。ＱβRNAレ
プリカーゼは、ヨーヤング（Eoyang）及びホガスト（Au
gust）（文献、ヨーヤングら、（1971年）、Nucleic Ac
id Research,G.L.カントニ（Cantoni）及びD.R.デーヴ
イース（Davies）の編集による（ハーパー・アンド・ロ
ー、ニユーヨーク）、第２巻、829〜839ページ中の操
作）の操作により、バクテリオフアジＱβ感染大腸菌株
Q13から単離され、該ヒドロキシアパタイトの工程は省
かれた。 MDV−１（＋）RNAの調整 容易に同定及び単離が可能な（クラマー（Kramer）
ら、J.Mol.Biol.89巻、719−736ページ、974年参照）中
間変種RNAの変異株が実施例において使用され、ここで
は「MDV−1 RNA」として言及される。この配列は前述さ
れる。758μｇのMDV−1 RNAは、705ngのMDV−１（＋）R
NA変異株鋳型及び69μｇのＱβレプリカーゼを、210分
間、37℃で1mM ATP、1mM CTP、1mM GTP、1mM UTP、15mM
MgCl2、100mMトリス−HClを含有する1ml中、pH7.5でイ
ンキユベートすることにより合成された。該インキユベ
ーシヨン混合物は次にフエノールによる抽出（メソツズ
・イン・エンザイモロジー、L.グロスマン（Grossman）
及びK.モルデイブ（Moldave）による編集（アカデミツ
ク・プレス、ニユーヨーク）、12巻、パートＢ、87−10
0ページ、1968年におけるK.S.カービー（Kirby））によ
り脱タンパクされ、該RNAは、2M酢酸アンモニウム存在
下−20℃で２倍量のエタノールを用いる沈澱により単離
された。MDV−１（＋） RNAはMDV−１（−）RNAから、1
mM MgCl2存在下アクリルアミドゲル電気泳動により分離
された（D.R.ミルズ（mills）ら、セル、15巻、541−56
0ページ、1978年）。 化学修飾RNAの分析及び単離 RNA中間体は、100mM NaCl、1mM EDTA、10mMヘペス（p
H7.5）｛T.マニアテイス（maniatis）ら、Molecular Cl
oning:ラボラトリ・マニユアル、コールド・スプリング
・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニユーヨーク州、1982年｝で平衡化させたセフアデ
ツクスＧ−50（フアルマシア P−L バイオケミカルズ）
を通す、スピン・カラム・クロマトグラフイーによつて
反応混合物から単離された。RNAは100mM NaCl存在下、
−20℃で２倍量のエタノール添加により、溶液から沈澱
された。電気泳動は、90mMトリス−ホウ酸、pH8.3、1mM
EDTA中で添加・展開される、厚さ1mmの６％ポリアクリ
ルアミド・ゲル上で行われた。変性ゲルはまた、7Mの尿
素を含有した。変性ゲル上での電気泳動前に、RNAは7M
尿素中90℃で１分間加熱により融解され、ただちに冷却
された。ゲルのオートラジオグラフは、デユポン・クロ
ネツクス・ライトニング・プラス（Dupont Cronex Ligh
tnig Plus）強化スクリーン存在（あるいは非存在）
下、−80℃でコダツクＸ−オマツトARフイルムに露出す
ることにより得られた。RNAは500mM酢酸アンモニウム、
pH7.5、1mM EDTA（T.マニアテイスら、前述）により、
ゲルから溶出された。 ５′−pppMDV−１（＋）RNAの脱リン酸化 該５′−末端トリフオスフエートグループは２μｇの
MDV−１（＋）RNAから、0.7EU子牛腸アルカリフオスフ
アターゼと30分間、50℃で、50μｌの50mMトリス−HC
l、pH8、100μM EDTA中でインキユベートすることによ
り除去された。さらに0.7EU子牛腸アルカリフオスフア
ターゼが加えられ、該インキユベーシヨンはさらに30分
間継続された。該反応は、該インキユベーシヨン混合物
を100mM NaCl及び２％ドデシル硫酸ナトリウム中に空
け、これを15分間60℃で加熱することにより停止され
た。該溶液は次にフエノール：クロロホルム（1:1）で
２度、クロロホルムで２度（T.マニアテイスら、前述）
抽出することにより、脱タンパクされた。該脱リン酸化
MDV−1 RNAは次にエタノールによる沈澱により単離され
た。 MDV−1 RNAの５′−32Pリン酸化 ２μｇの脱リン酸化MDV−1 RNAは３分間、50℃で、10
mMトリス−HCl20μｌ（pH7.5）、1mMスペルミジン、100
μM EDTA中でインキユベートされ、次いで、迅速に冷却
された。該容量は次に12.2p molの〔ガンマ−32P〕ATP
（300Ci/mol）、30EU T4ポリヌクレオチド・キナーゼ及
び、最終濃度でMgCl210mM、ジチオトレイトール1mM、ト
リス−HCl 50mM（pH7.5）になる緩衝液を用いて40μｌ
とされた。この溶液は75分間37℃でインキユベートされ
該混合物を20mM EDTAに空けることにより停止された。
該キナーゼは同量のフエノール：クロロホルム（1:1）
で抽出され、該リン酸化MDV−1 RNAはエタノールを用い
る沈澱により単離された。該RNAは、セフアデツクスＧ
−50を通すスピン・カラム・クロマトグラフイー、それ
に続くエタノールによる再沈澱によつてさらに精製さ
れ、次いで1mM EDTA−NaOH（pH8）中に懸濁化された。 MDV−1 RNAの５′−シスタミン−MDV−1 RNAへの転化 ２μｇの〔５′−32P〕MDV−1 RNA及び16μｇの高重
合酵母RNA（180μｇの酵母RNAと50EUの子牛腸アルカリ
フオスフアターゼと１時間50℃でインキユベートするこ
とにより前もつて脱リン酸化されたもの）が３分間、50
℃で20μｌの1mM EDTA−NaOH（pH8）中でインキユベー
トされ、次いでただちに冷却された。25μｌの1Mイミダ
ゾール（pH6）及び2.5μｌの1.5M 1−エチル−３−〔３
−ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミドが次に加え
られ、該混合物は１時間23℃でインキユベートされた。
RNAはこの混合物から、セフアデツクスＧ−50を通すス
ピン・カラムクロマトグラフイーにより単離された。
〔５′−32P〕MDV−1 RNAの５′−イミダゾライド（非
転化〔５′−32P〕MDV−1 RNAを含む）は100mM NaCl、1
mM EDTA、10mMヘペス（pH7.5）100μｌ中で集められ
た。1M2,2′−ジチオビス（エチラミン）−ジヒドロク
ロライド（シスタミン・ジヒドロクロライド、pH7.7）
が次に加えられ、最終濃度25mMとされ、該溶液は１時間
50℃でインキユベートされた。該RNAは次にセフアデツ
クスＧ−50を通すスピン・カラムクロマトグラフィーに
より単離され、エタノールを用いて沈澱された。 ５′−シスタミン−MDV−1 RNAの５′−ビオチン化シス
タミン−MDV−1 RNAへの転化 該５′−シスタミン−〔32P〕MDV−1 RNA（非転化〔
32P〕MDV−1 RNAを含む）は200mMヘペス（pH7.7）、1mM
EDTA 40μｌに溶解され、40分間、23℃でインキユベー
トされた。過剰のＮ−ヒドロキシサクシニミドビオチン
は遠心分離により除去され、該RNAは次にエタノールを
用いて沈澱された。該５′−ビオチン化MDV−1 RNA
（Ｉ）（非ビオチン化RNAを含む）は変性ゲル上での電
気泳動により過剰のＮ−ヒドロキシサクシニミドビオチ
ンからさらに分離された。該32P−標識バンド中のRNAは
該ゲルから溶出されエタノールを用いる数回の沈澱によ
り精製された。 ５′−ビオチン化MDV−1 RNAの非ビオチン化MDV−1 RNA
からの分離 50から200μｇの部分５′−ビオチン化〔32P〕MDV−1
RNAは２から10μｇのアビジンDN（ベクター・ラボラト
リー、バーリンゲーム、カリフオルニア州、米国から購
入されたアビジンの高純度型）と45分間、23℃で10mMヘ
ペス（pH7.7）、1mM EDTA中でインキユベートされた。
該５′−ビオチン化〔32P〕MDV−1 RNA−アビジン付加
物（II）は、非ビオチン化〔32P〕RNA及び遊離アビジン
から、変性ゲル上の電気泳動により分離された。該５′
−ビオチン化MDV−1 RNA−アビジン付加物は次に該ゲル
から抽出され、エタノールを用いて沈澱された。 該RNA−ビオチン付加物（II）のビオチン化アガロース
との複合体形成による同定 ５′−ビオチニル化された〔32〕MDV−1 RNA−アビジ
ン付加物及び５′−シスタミン−〔32P〕MDV−1 RNAは
該ゲルから流出され、エタノールを用いて数回沈澱され
た。各付加物はビオチニル化アガロール50μｌと15分間
23℃、10mMヘペス;pH7、1mM EDTA中でインキユベートさ
れた。該アガロースは遠心分離により沈澱され、緩衝液
を用いて２度洗浄された。該ビオチン化アガロースによ
り沈澱された、各放射活性付加物のフラクシヨンはシン
チレーシヨン・カウンターで測定された。 ５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNA 該〔32P〕MDV−1 RNA−ビオチン−アビジン付加物は
ジチオトレイトールを用いる還元により、５′−チオ−
エチルアミノ−〔32P〕MDV−1 RNA及びビオチン−アビ
ジン副産物に転化された。５′−ビオチニル化〔32P〕M
DV−1 RNA−アビジン付加物は、１時間、23℃、100mMジ
チオトレイトール（DTT）30μｌ、1mM EDTA、10mMヘペ
ス（pH7.7）中でインキユベートされ、該スペーサー結
合アームのジスルフイド結合を切断する。次にビオチニ
ル化アガロール40μｌが該反応混合物に加えられ、１時
間23℃でインキユベートし、ビオチン−アビジン副産物
を結合する。該ビオチニル化アガロースは遠心分離によ
つて該溶液から除去された。 放射活性の95％は上清液から回収され、ジスルフイド
結合アームが切断されたことを確認する。非還元RNA−
ビオチン−アビジン付加物がビオチニル化アガロースと
インキユベートされる対照反応においては、10％に満た
ない放射活性が上清液中に見い出された。 切断されたRNAはエタノールを用いる沈澱により回収
され、100μＭジチオトレイトール（還元RNAの二量化を
防ぐ）の存在下、非変性ゲル上の電気泳動により分析さ
れた。該５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNAは、
５′−リン酸化MDV−１対照RNAと同じ速度でゲル上を移
動したが、非還元付加物はより遅い速度で移動した。該
５′−ビオチニル化MDV−1 RNA−アビジン付加物（II）
及び該５′−チオ−エチルアミノ−MDV−1 RNAはそれぞ
れ、ＱβレプリカーゼによるMDV−1 RNA合成に対する鋳
型として作用することが可能かどうかをみるために試験
された。 試験されるべき、該修飾〔32P〕MDV−1 RNA各５μｇ
は、37℃で、50μｇの400μM ATP、400μM CTP、400μ
Ｍ〔アルフアー32P〕GTP（500m Ci/m mol）、400μM UT
P 12mM MgCl2、84mMトリス−HCl（pH7.5）中でインキユ
ベートされた。２μｌの試料が、７分〜15分の間毎分と
られた。各試料はナンバード・セミサークル（孔径23m
m）の3MM過紙（ワツトワン）上に吸着され、氷冷300m
Mリン酸、20mMピロリン酸ナトリウム、1mM EDTAを含む
ビーカー中に空けられた。該紙は同液を用いて６回洗
浄され、フアイバー中にトラツプされた沈澱RNAから標
識前駆体を流出した。該紙は次にエタノールを用いて
１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性はシンチレ
ーシヨンカウンター中で測定された。結果は両５′−修
飾RNAがＱβRNAレプリカーゼに対する鋳型として作用す
ることを示した。各反応におけるRNA合成速度は、100ng
/ml非修飾MDV−1 RNAを用いて開始した対照反応におい
てみられる合成速度と同じであつた。 本実施例は、ビオチンのMDV−1 RNAへの結合に含まれ
る化学的操作もアビジンの５′末端ビオチン基への場合
も該RNA配列の酵素的複製に阻害を与えないことを示
す。該５′−末端ビオチン−アビジンが該RNAの酵素的
複製に阻害を与えない、という事は次図： に示される、ビオチンの結合位置及びスペーサー・アー
ムの長さに帰されうる。RNA合成は該鋳型の非修飾３′
末端（A.K.バナージー（Banerjie）ら、J.Mol.Biol.46
巻、445−455ページ、1969年）で開始し、該スペーサー
・アームは該鋳型の５′末端での複製停止のために適当
な長さ以上与えなければならない。 実施例II ヒト・ガンマ・グロブリン（IgG）は、Ａ）風疹に最
近感染した被験者及びＢ）風疹に感染してない被験者か
ら単離され、その抗血清が前もつて風疹抗原との反応に
陰性であることが試験された。各試料中のIgGをビオチ
ンに結合させるために、各試料はホウ酸緩衝生理食塩水
（pH8.5）中で4mg蛋白/mlに希釈される。ジメチルホル
ムアミド（10mg/ml）中に溶解した。ビオチニル−Ｎ−
ヒドロキシサクシニミドエステル50マイクロリツトルが
該希釈試料1mlごとに加えられる。該反応混合物は室温
で２時間攪拌され、次いで、1ml当たりリン酸緩衝生理
食塩水（PBS,pH7.4,4℃）１リツトルに対して一晩透析
される。結果としてできる溶液は、ビオチニル化IgGを
含有し、４℃でアジ化ナトリウム存在下保存される。 0.1M炭酸ナトリウム緩衝液中、pH9.8で風疹抗原で被
覆されたウエルを有する。ポリスチレン・マイクロタイ
タープレートが、３時間室温でウエル当たり、1:10、1:
30、1:100、1:300、1:1000、及び1:3000の希釈比で、上
述のように調製されたビオチニル化IgG含有溶液50μｌ
とともにインキユベートされる。風疹抗原で被覆されな
いウエルをもつプレートが対照として使用うされる。Ig
G試料の希釈はPBS中で５％ウマ血清が用いられた。ビオ
チニル化IgG試料の希釈液とのインキユベーシヨン後、
該プレートはNaCl−トウイーン20を用いて３回洗浄され
る。 マイクロタイタープレートの各ウエルに、次いで実施
例Ｉの場合のように調製されたMDV−１ビオチン−アビ
ジン付加物（II）のPBS溶液が、１〜10μg/mlの濃度で
加えられ、該ウエルは次に該溶液とともに２時間室温で
インキユベートされる。次に該プレートはNaCl−トウイ
ーン20を用いて３回洗浄される。 次にトリス緩衝液（pH7.5）中の0.1M DTTが全てのウ
エルに加えられ、結果としてできる混合物は室温で１時
間インキユベートされる。 各ウエルは次にＱβレプリカーゼ4.6μｇとともに、3
7℃、400μM ATP、400μM CTP、400μＭ〔アルフアー32
P〕GTP（500m Ci/m mol）、400μMUTP、12mM MgCl2、84
mMトリス−HCl（pH7.5）50μｌ中でインキユベートされ
る。２μｌの試料が１分から15分の間、毎分とられる。
各２μｌの試料はナンバード・セミサークル（孔径23m
m）の3MM過紙（ワツトマン）上に吸着され、氷冷300m
Mリン酸、20mMピロリン酸ナトリウム、1mM EDTAを含む
ビーカー中に空けられる。該紙は同液を用いて６回洗
浄され、フアイバー中にトラツプされた沈澱RNAから標
識前駆体を流出する。該紙は次にエタノールを用いて
１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性はシンチレ
ーシヨンカウンター中で測定される。バツクグラウンド
以上の放射活性は検定血清中の抗−風疹IgGの存在を示
唆するものである。 実施例III ５′−ビオチン−ヘクス−Ｐ−16−mer（５′−bio−
tin−hex−Ｐ−16−mer）は、ヘキサメチレンジアミン
リンカーを介し16・マー５′−CACAATTCCACACAAC−３′
に結合したビオチンから成り、M13mp 8DNA断片と相補的
配列をもつたもので、B.C.F.チユー（Chu）及びL.E.オ
ーゲル（Orgel）、DNA4、327−331ページ（1985年）に
従つて調製される。また、本参考文献に従つて、単一株
のM13mp8DNAを10ng、0.1ng、0.01ng及び0.001ng含有す
るニトロセルロース・プロツトが調製され、DNAを含有
しない対照ブロツトも同様に調製される。 該ブロツトは切断され、実施例Ｉの場合のように調製
されたMDV−１ビオチン−アビジン付加物大過剰と反応
する、マイクロタイターウエルに移される（ウエル当り
50μｌ、付加物濃度はPBS中約１〜約10μg/mlであ
る）。各該ブロツトは次にNaCl−トウイーン20で充分洗
浄され、新たなマイクロタイターウエルへ移行、初めに
トリス緩衝液（pH7.5）中0.1M DTTと１時間インキユベ
ート、次いで先の実施例IIにおいて記述されたＱβレプ
リカーゼ含有溶液50μｌ（ウエハ当たり）とインキユベ
ートされる。２μｌの試料が１分〜30分の間、90秒ごと
にとられ、シンチレーシヨンカウンター中での放射活性
測定のために実施例IIで記述されるように過紙上にブ
ロツトされる。バツクグラウンド以上の放射活性は該検
定ブロツト上のM13mpDNAを示唆するものである。 実施例IV 本実施例は、ブロツトがDTTとともにインキユベート
されないことを除いて、実施例IIIと同方法で行われ、
結果として、MDV−1 RNAをビオチン−アビジンに結合す
るジスルフイド結合は切断されず、該MDV−1 RNAは16−
merプローブ（及びM13mp8検体）への結合を残してい
る。しかしながら、該ブロツトはＱβレプリカーゼ溶液
とインキユベートされ、試料がとられ、実施例IIIで記
述されたように放射活性が測定される。 実施例Ｖ 本実施例は、DTTとのインキユベーシヨンの代わりに
トリス緩衝液（pH7.5が該ウエルに加えられ、該マイク
ロタイターが80℃10分間加熱され、ニトロセルロース・
ブロツトM13mp8検体からMDV−1 RNAレポーター基に結合
したプロツブを遊離させることを除いて実施例IIIと同
方法で行われる。室温に冷却後、該試料はＱβレプリカ
ーゼ溶液とインキユベートされ、そうでなければ実施例
IVの場合のように処理される。 実施例VI 実施例III〜Ｖで記述される16−merオリゴヌクレオチ
ドプローブは、フオースター（Forster）ら、Nucleic A
cids Res,3巻、745−761ページ（1985年）によつて記述
されるように酢酸フオトビオチンを用いる光化学反応に
おいてビオチニル化される。該ビオチニル化オリゴヌク
レオチドはRPC−５を用いる高性能液体クロマトグラフ
イーによつて出発物質から分離される。該ビオチニル化
16−merは次に実施例IIIの操作に従つてM13mp8.DNAの同
定に供される。 実施例VII M13mp8 DNAの300塩基断片がフアージから得られ、ビ
オチンを用いて化学的に標識されるが、これは上記フオ
ースターらの操作に従つて酢酸フオトビオチンを使用す
る。上記フオースターらによつて記述される。ドツト・
ブロツト交配の操作が流用される。次に該ブロツトは実
施例IIIにおいて記述されるようにビオチン−アビジン
レポーター付加物とインキユベートされ、実施例IIIの
操作の残りはM13mp8 DNAを同定するために流用される。 実施例VIII 炭素５位へのスペーサーアームを通してビオチニル化
された、ウリジン残基が上記ランガー（Langer）ら及び
上記ラリー（Leary）らによつて記述されるニツク−翻
訳の操作により、実施例IIIにおいて記述されるオリゴ
ヌクレオチド中に導入される。次に結果としてビオチニ
ル化される16−merについて、MDV−１ビオチン−アビジ
ンレポーター付加物を用いる実施例IIIの操作に従い、
ブロツトM13mp8DNAに対する検定が行われる。 実施例IX 本実施例は核酸検体に対する「セルフ・レポーテイン
グ（自己報告）」親和性分子、すなわち本発明に従う検
定系においてRNA自体の同定のための複製型RNAでもある
親和性分子としての組換えRNAの使用を示す。 本実施例はまた、同定性を供する複製レポーターグル
ープRNAのビオチニル化を示す。 ミール（Miele）ら（1983年、上記）及びクラマー（K
ramer）らの米国特許出願第614,350号（上記）の操作に
従い、30−merオリゴヌクレオチド５′−AGUCAGGCACCGU
GUAUGAAUCUAACAAU−３′のついたMDV−1 RNA（MDV−１
配列の63位Ｇと64位Ｕとの間に挿入されたもの）から成
る、組換えRNAが調製される。該30−merはプラスミツド
pBR322断片の配列と相補的なそれを有する（マニアテイ
スら、上記の付録Ｂにおいて提供されるpBR322配列中の
71〜100位をみよ。） マシユーズ（Matthews）らのAnal.Biochem.151巻、20
5〜209ページ（1985年）の操作に従い、ニトロセルロー
スの仲介により該組換えRNAはpBR322DNA2ng〜0.01pgを
含有するブロツトにハイブリツド形成される。組換えRN
A5ngが各ハイブリツド形成に使用される。該組換えRNA
は煮沸により変性させられ、つづいてハイブリツド形成
溶液（45％ホルムアミド、20mMリン酸ナトリウム、５×
SSC,0.1％フイコール400、0.1％ウシ血清アルブミン、
0.1％ポリビニル−ピロリドン、250mg/ml変性サケ精子D
NA、pH6.4）に加えられる。該ハイブリツド形成は次に1
2時間42℃で行われる。 該ハイブリツド形成及びハイブリツド形成後の洗浄に
続いて、該試料に対応する個々のサークルはブロツトか
ら切除、別個に処理され、トリス緩衝液（pH7.5）に空
けられる。そして該サークルは10分間、100℃に加熱さ
れ、ハイブリツド組換えRNAを溶液中に分離する。ウエ
ル中の溶液は室温まで冷却された後、放射活性標識GTP
が非放射活性GTPに換わり、非標識UTPがビオチニル化GT
P｛ビオチン−11−UTPがベセスダ（Bethesda）リサーチ
・ラボラトリー、ガイゼルスブルク、メリーランド州、
米国から購入される；本品は11−アトム・スペーサー・
アームを介してウラシル骨格の炭素５位にビオチンが結
合したUTPである、ランガーら、上記、をみよ；ワード
（Ward）ら、欧州公報第0063879号）に換わつている、
ことを除いて実施例IIにおいて記述されているものと同
じＱβレプリカーゼ溶液50μｌが各ウエルに加えられ、
該プレートは37℃でインキユベートされる。30分間90秒
ごとに、96−指アリコツターを使用し、各ウエルから溶
液２μｌがニトロセルロースフイルター上にブロツトさ
れ（フイルター上にマークされた、各ウエルに対応する
エリアをもつ）、各フイルターは、マシユーズらの操作
に従い化学螢光試薬（1.25mMルミノール、2.7mMH2O2、
0.1Mトリス緩衝液、pH8.6、増強剤として0.136M p−ヨ
ードフエノールまたは0.68μM p−ヒドロキシケイ皮酸
を共存）存在下ストレプタビジン−パーオキシダーゼ複
合体とともに展開される。スポツトからフイルターに発
せられる光は次に螢光マイクロタイター・プレート・リ
ーダーを使用して感知される。バツクグラウンド（すな
わちpBR322DNR以外の検体について行われた操作による
スポツト由来の放射）以上の放射は検定溶液中のpBR322
検体の存在を示す。 実施例Ｘ 実施例IIに記述される16−merの、−Ｏ−PO2−NH(C
H2)2−Ｓ−Ｓ−(CH2)2NH2グループと５′−ヌクレオチ
ドの炭素５′位で結合した付加物は、ヘキサメチレンジ
アミンの代わりにシスタミンが使用されることを除い
て、チユー（Chu）及びオーゲル（Orgel）、DNA4、327
〜331ページ、1985年の操作により調製される。本ジス
ルフイド付加物から、−Ｏ−PO2−NH(CH2)2SHと５′−
ヌクレオチドの炭素５′位で結合した（２−チオエチ
ル）アミノ付加物が0.1M DTTと１時間室温でインキユベ
ートすることにより調製される。該チオ付加物は次に、
1mM DTT存在下、RPC−５を使用する高性能液体クロマト
グラフイーにより非還元ジスルフイド付加物から単離さ
れる。 MDV−1 RNAの、−Ｏ−PO2−NH(CH2)2SS(CH2)NH2と
５′−ヌクレオチドの炭素５′位で結合した付加物は実
施例Ｉで記述されるように調製される。同操作由来の生
成物を含む、エタノール沈澱ジスルフイド付加物は次に
0.1M DTT中に溶解され、結果としてできる溶液は１時間
室温でインキユベートされ、対応するチオ付加物を与え
る。 MDV−1 RNAのチオ付加物約50ngを含有する、0.1M DTT
溶液50μｌが、16−merのチオ付加物10倍モル過剰量
（すなわち、HDLC精製に由来する溶液量で、該チオ付加
物を約30ng含有する。）と合わされる。結果としてでき
る溶液にO2気流が15分間通され、２つのチオ付加物で生
ずる反応は一晩室温で進行することが許容される。ゲル
電気泳動を使用し、ジスルフイド含有骨格を介して16−
merに結合したMDV−1 RNAは、他のMDV−1 RNA付加物及
び未反応16−mer付加物から分離される。 ジスルフイド含有骨格を介して16−merに結合したMDV
−1 RNA付加物は次に、MDV−1 RNAビオチン−アビジン
の代わりに、実施例IIIの操作に従いM13mp8DNAの同定に
供される。 実施例XI 本実施例は、本発明に基づくレポーター・システムを
使用する、細胞表面上の特異的抗原の同定を記述する。
ここで記述される操作は一部、ホラン−ハンド（Horan
−Hand）ら、Cancer Research 43巻、728〜735ページ
（1983年）の教示に基づく。 本操作は標準技術によつて調製された、検定される抗
原に対する、ネズミモノクローナルIgG抗体によつて例
示される。当業者は、該抗原検体に特異的な、他の型の
抗体もまた使用されうるということを把握するだろう。 （ａ）単一層培養細胞を使用する操作： 試験されるべき細胞は、平端な96穴フラツト・ボトム
組織培養プレート内に、適当な成長培地とともに植えら
れ、37℃で24時間インキユベートされる。成長培地は次
に10％（W/V）ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する成
長培地と交換される。60分間のインキユベーシヨン後、
10％BSA含有培地は除去され、ウエルは洗浄媒体（１％
（W/V）BSAを補つた。RPMI 1640溶媒）で洗浄される。
該洗浄溶媒は次に除去され、ウエル当たり、PBS中0.1mg
/mlで、該抗原検体に対するモノクローナル抗体50μｌ
と交換され、該混合物は４℃で２時間インキユベートさ
れる。インキユベーシヨン後、未結合抗体は抗体溶液の
アスピレーシヨンにより除去され、続いて洗浄溶媒を用
いて洗浄される。洗浄に続いて、各ウエルに洗浄溶媒を
用いて1:1000に希釈した、ビオチニル化ウサギ抗血清Ig
G（ベクター・ラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリ
フオルニア州、米国から購入したもの）が加えられ、同
溶液はウエル中、４℃で２時間インキユベートされる。
該抗−IgG抗体溶液は次にウエルからアスピレートさ
れ、ウエルは洗浄溶媒を用いて再度洗浄される。次に各
ウエルに実施例ＩのMDV−1 RNAビオチン−アビジン付加
物のPBS溶液50μｌが、１〜10μg/mlで加えられ、同溶
液はウエル中４℃で２時間インキユベートされる。本溶
液は次にウエルからアスピレートされ、ウエルは洗浄溶
媒で３回洗浄される。トリス−HCl緩衝液（pH7.5）中0.
1M DTT50μｌが次に各ウエルに加えられ、１時間室温で
インキユベーシヨンが行われる。次に、96指−アリコツ
ターを使用して各ウエルから上清が新しいマイクロタイ
ター・プレートに除去され、実施例IIの操作に従い、同
溶液はＱβレプリカーゼ溶液と合わさせれて組換えMDV
−1 RNAに対する検定が行われる。 （ｂ）懸濁液中の細胞を使用する操作： 懸濁液中の細胞は、単一層培養細胞に対して使用され
る操作による特異な抗原に対して、次の修飾をすること
によつて試験されうる： 細胞が単一細胞懸濁液（例えば、血清由来のリンホサ
イト）の形で得られない場合、適当に処理され、そのよ
うな懸濁液を調製する。例えば、組織培養由来の細胞は
標準技術によりトリプシン処理され、培養容器表面から
解離させることが可能で、結果としてできる溶液は次
に、培養容器から適当な溶媒中にピペツトで移すことが
可能である。 単一細胞懸濁液中の細胞は次にマイクロ・タイタープ
レートのウエルに分けられ、添加されたBSAを含まないR
PMI 1640溶媒を用いて２度洗浄される。懸濁液中の同細
胞は次に２時間４℃で、ウエル当たり、注目している抗
原に対する抗体のPBS中0.1ml/mlのもの50μｇとともに
インキユベートされる。 本操作の残りは単一層培養細胞に対する操作と同じで
ある。懸濁培養中の細胞の洗浄はペレツトを生ずる遠心
分離、培地のアスピレーシヨン、次いで、新たな溶媒
（洗浄溶媒）中でのペレツトの再懸濁化、再ペレツト化
及び溶媒のアスピレーシヨンのサイクルによつて行われ
る。 本実施例の操作に対して、抗原検体を含まないとして
知られる、細胞が対照として使用されうる。 本実施例で上述される操作は、抗原検体に結合する初
期抗体へのビオチニル化第２抗体の結合を含む。又は、
初期抗体自体は、ビオチニル化が、その抗原検体に特異
的に結合する能力をなくさないとすればビオチニル化が
可能であり、第２抗体結合工程が避けられる。抗体のビ
オチニル化は、イマム（Imam）ら、Cancer Research 45
巻、263−271ページ（1985年）の操作に従い、抗体のＮ
−ヒドロキシサクシニミドビオチンとの直接反応により
実行される。 実施例XII 本実施例は本発明に基づく、細胞溶解質、血清または
他の溶液から蛋白質を同定する検定の使用を記述する。
記述される操作は「ウエスターン・ブロツト（Western
blot）」法の一型式である。 細胞が関与する場合、細胞溶解質が、２％ドデシル硫
酸ナトリウム、２％２−メルカプトエタノール及び10％
グリセロールを含有するトリス−HCl緩衝液（pH6.8）溶
液（100℃）を用いて可溶化するような標準操作によつ
て調製される。 該溶解質（または血清または他の溶液）は次にデユプ
リケート中ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供される
が、隣接するレーンにマーカーとして同定されうる蛋白
質を移動させる。標準的なブロツテイング装置（例え
ば、トランス−ブロツト装置、バイオ・ラツト・ラボラ
トリース、リツチモンド、カリフオルニア州、米国）を
使用し、該蛋白質はゲルからニトロセルロース・シート
へ移される。実験ゲルレーンのひとつ及びマーカーゲル
・レーンはクーマーシー・ブルーを用いて染色される。
該蛋白質検体を含有する可能性のあるゾーンは、試料中
に存在するとすれば次に実験レーンから切断される。検
体を含有する可能性のあるゲルゾーンに対応するニトロ
セルロースペーパーのゾーンはペーパーから切断され、
蒸留水中３（W/V）BSAを用いて１時間37℃で浸され全て
の非特異的蛋白質結合部位を飽和させる。 親和性分子として該蛋白質に対するビオチニル化抗体
を使用して、該蛋白質検体がニトロセルロース片上にあ
るかを試験するために次の実施例の操作が行われる。 実施例XIII 本実施例は本発明に基づく検定を用いる、細胞表面糖
蛋白質の同体を例示する。本実施例の操作はゴードン
（Gordon）及びペナ（Pena）、Biochem.J.208巻、351〜
358ページ（1982年）のそれを変えたもので、彼らはイ
イラミニダーゼ処理、培養、正常及び異常それぞれのヒ
ト・皮膚繊維芽細胞上の特異的細胞表面糖蛋白質を同定
するためのピーナツツ凝集素及びヒマノ実凝集素を使用
した。 細胞は培養皿上に約２×104cells/cm2の密度で植えら
れる。24時間後、同細胞は洗浄され、２％（W/V）ドデ
シル硫酸ナトリウム、２％（W/V）２−メルカプトエタ
ノール、10％（V/V）グリセロール、0.01％ブロモフエ
ノール・ブルーの0.125Mトリス−HCl緩衝液（pH6.8）溶
液（100℃）を用いて可溶化される。該溶解質は次にSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、蛋白質は
トランス・ブロツト装置（バイオ・ラツドラボラトリー
ス）を使用してニトロセルロースシートへ移される。該
ニトロセルロースシートは約５cm2の大きさの切片に切
断される。結果としてできるニトロセルロース片は３％
（W/V）BSA水溶液に１時間37℃で浸され、全ての非特異
的蛋白質−結合部位を飽和する。該片は次にHBS溶液（1
37mM NaCl、2.7mM KCl、0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2、39
mMヘペス、pH7.4）を用いてすすがれ、ビオチニル化レ
クチン（該溶解質の糖蛋白質上の注目している炭化水素
骨格に適切なものである）とともに、３％BSAを含有す
るHBS溶液中10mg/mlにおいて、１時間室温でインキユベ
ートされる。ビオチニル化レクチンは市販品であり、例
えばベクター・ラボラトリース（ベーリンゲームカリフ
オルニア州）、から得られる。該片は次に、HBS溶液を
用いて30分間４回浸たすことにより充分洗浄され、実施
例ＩのMDV−1 RNAビオチン−アビジン付加物0.5mlと、P
BS中約５μg/mlで１時間、室温でインキユベートされ
る。アビジン−ビオチンMDV−1 RNA付加物とのインキユ
ベーシヨン後、過剰の付加物はHBSを用いて３回洗い流
される。該片は次にトリス−HCl（pH7.5）中0.1M DTT0.
5mlと１時間インキユベートされ、結果としてできる溶
液は、ＱβレプリカーゼにRNA複製を触媒させて、実施
例IIの操作によりMDV−1 RNAに対する検定が行われる。 実施例XIV 生物標本（例えば、細胞培養、組織、血液、他の体
液、食品材料など）由来の核酸は、本発明に基づく検
定、すなわち、第一に核酸をひき出す標準技術（例え
ば、標本約５μｌを45℃で20分間、30mMトリス−HCl、2
mM EDTA、３％トライトンX100、300μg/mlプロテアーゼ
Ｋ、pH7.5）約５μｌから約1mlとともにインキユベート
すること）により標本を破壊し、次に結果としてできる
溶液を固体担体（例えばニトロセルロース）上にブロツ
ト、そして実施例III〜Ｘに記述されるような操作を行
い該核酸検体を同定することによつて検体断片または検
体分子に対する検定が行われる。 このような検定における対照は、検定されている生物
標本と同じであるが検体を含まないことが知られている
ものでありうる。 標本中の検体量の定量的評価のために、既知量の検体
が加えられた対照が実験され、標本中の検体量が、試験
標本に由来する複製型RNAの複製率と対照に由来する複
製率とを比較することにより評価されうる。 実施例XV 実施例IXの操作が、非修飾リボヌクレオシド３リン酸
が複製反応において使用され、複製RNAが次のように同
定されることを除いて、流用される： 整数比希釈（等容量のもの）された複製反応溶液が96
−指アルコツターを用いてジエチルアミノエチルセルロ
ースペーパーのシートに移される。 該シートは次に室温で200mM NaCl、300mM酢酸アンモ
ニウム（pH6.0）溶液中洗浄され、RNA中にとり込まれな
かつたリボヌクレオシドを除去する。 該シートは次に0.3μg/ml臭化エチジウムを用いて染
色される。シヤープ（Sharp）ら、Biochemistry 12巻、
3055〜3063ページ（1973年）及びベイリー（Bailey）及
びデビツドソン（Davidson）、Anal.Biochem.70巻、75
〜85ページ（1976年）を見よ。 最後に個々のブロツトからの螢光がいくつかの既知技
術のいずれかひとつによつて測定される。対照ブロツト
由来の螢光強度以上の、染色ブロツト由来のそれは染色
ブロツトに対応する試料ブロツト中の検体（すなわちpB
R322）の存在を示す。 他の染色材料が臭化エチジウムの代わりに使用されう
る。これらの中にはメチレン・ブルー（デイングマン
（Dingman）及びピーコツク（Peacock）、1968年上
記）；銀染色｛サモンス（Sammons）、1981年、上記；
イグロイ（Igloi）、1983年、上記）；またはフイコビ
リ蛋白質−Ｑβレプリカーーゼ共役体（オオイ（Oi）
ら、1982年、上記；ストライヤー（Stryer）ら、上記）
が含まれる。 さらに、螢光測定よりもむしろ、RNAの染色に由来す
るブロツトの色が評価されうる。 実施例XVI 大腸菌Ｋ−12/600株の培養物がpBR322を用いて形質転
換され、テトラサイクリン存在下108cells/mlまで培養
される。0.1mlの培養液が30mMトリス−HCl、2mM EDTA、
３％トライトンＸ−100、300μg/mlプロテナーゼＫ（pH
7.5）溶液の0.1ml、1ml、10ml、100ml及び1000mlのそれ
ぞれに合わされ、結果としてできる溶液45℃で20分間加
熱される。 対照溶液がテトラサイクリン非存在下pBR322を用いて
形質転換されていない大腸菌Ｋ−12/600株を108cells/m
lまで培養し、次に同培養液0.1mlと上記で特定したプロ
テナーゼＫ溶液0.1mlとを合わせ、結果としてできる溶
液を20分間45℃で加熱することにより調製される。 次に各５試験溶液の各３試料及び対照溶液の３μｌ
が、ニトロセルロース担体上へドツト・ブロツトされる
（標準96−穴配列中、96スペースの18スペースに施され
る）。該担体は次に400mM NaOHを用いて飽和させたペー
パー・タオルの先端におかれ、DNAを変性、次に連続的
に（ａ）400mMトリス−HCl、pH7.0（ｂ）20×SSC及び
（ｃ）10×SSCで飽和させたペーパータオルと接触され
る、最後に該ニトロセルロースシートは80℃で90分間焼
かれる。 実施例IXの30−merが、実施例Ｉ及びＸの操作に従
い、式−O(PO2)NH(CH2)2SS(CH2)2NH(PO2)2O−という骨
格〔ここで、フオスフオラミデートグループは30−mer
親和性分子及び複製可能RNAの５′−ヌクレオチドの炭
素５′位に結合している〕によりMDV−１（＋）RNAに結
合している。 標準操作に従い、該シートは前ハイブリツド形成さ
れ、次に結果としてできる親和性分子MDV−1 RNAハイブ
リツド形成溶液中３μg/mlで、ハイブリツド形成され、
ハイブリツド形成後は洗浄され、ハイブリツド形成され
なかつた親和性分子−MDV−1 RNAハイブリツドを除去す
る。 次に該ニトロセルロースシートはエクテオラ（ECT−E
OLA）ペーパー（サリス（Sarris）ら、1982年、上記）
シートの先端（または乾燥ペーパー・タオルの先端）に
おかれる。0.05Mトリス−HCl（pH7.5）中0.1M DTTで飽
和した湿つたスポンジが該ニトロセルロース・シート先
端におかれる。DTT溶液のペーパータオルへの毛細管移
動に伴い、複製型RNAは、該ハイブリツドのジスルフイ
ドの還元により遊離され、エクテオラ・ペーパー（ここ
で、正電荷により付着される）へ移される複製となる。 該エクテオラペーパーは次に100μg/mlBSA溶液とイン
キユベートされ、蛋白質結合部位をブロツクする。 該ペーパーは次に実施例IIにおいて記述されるＱβレ
プリカーゼ溶液と15分間インキユベートされる。 15分間のインキユベーシヨンに従い、該ペーパーは20
0mM NaCl、5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）を用いて洗浄
され、とり込まれなかつたリボヌクレオチドを除去す
る。該エクテオラ・ペーパー上の各ブロツトの放射活性
は次に例えば、96−位β−放射スキヤナー／デイジタイ
ザー（ゴウリアノス（Goulianos）ら、Anal.Biochem.10
3巻、64−69ページ、1980年）を使用して決定される。 また、該複製は非放射活性リボヌクレオシド３リン酸
のみを用いて行われ、RNA量はその固有のUV吸収（例え
ば、クラテラゼ（Kulateladge）ら、1979年、上記らの
フオトプリンテイング法による）により決定されうる
し、あるいは該エクテオラ・ペーパー上で直接、実施例
XVで記述される染色技術のひとつによつても決定されう
る。 検定される溶液中のpBR322の存在は該エクテオラ・ペ
ーパー上の対応するRNA複製ブロツトに由来する、バツ
クグラウンド信号（対照溶液に由来する）以上の信号に
より示される。 実施例XVII 大腸菌Ｋ−12/C600株の培養液（pBR322を用いて形質
転換されたもの及びされていないもの）が実施例XVIの
場合のように調製される。 次に未希釈対照液、未希釈pBR322−形質転換培養液、
1:10希釈pBR322−形質転換培養液、1:100希釈pBR322−
形質転換培養液、1:1000希釈pBR322−形質転換培養液及
び1:10000希釈pBR322−形質転換培養液（全ての希釈は
細胞非存在培養培地を用いる）それぞれの各３試料がポ
リプロピレン・ミクロ遠心分離チユーブに加えられる。
各ウエルに30mMトリス−HCl、2mM EDTA、２％トライト
ンＸ−100、300μg/mlプロテナーゼＫ（pH7.5）溶液５
μｌが加えられる。該プレートは次に20分間45℃でイン
キユベートされる。20分の終わりに、温度が100℃に上
げられ、インキユベーシヨンをさらに５分間続ける。該
プレートを室温に冷却後、実施例XVIの親和性分子−MDV
−1 RNAハイブリツドの水性塩溶液／フエノール懸濁液
８μｌが５μg/mlで各ウエルに加えられ、ハイブリツド
形成がコーン（Kohne）ら、（1977年）、上記に従い５
分間行われる。 各ウエル由来の水−フエノール混合物は次にアガロー
スゲル電気泳動に付され、pBR322（親和性分子−MDV−1
RNAとハイブリツド形成したもの及びしないもの）をは
るかに小さい新和性分子−MDV−1 RNAから分離する。該
ゲルは0.1M、 DTT、0.05Mトリス−HCl（pH7.5）中に浸
され、親和性分子と該RNAとの間のジスルフイドの開裂
により複製型RNAを遊離する。 該複製型RNAは次に電気ブロツテイング（ステルワー
ク（Stellwg）及びダールベルク（Dahlberg）、Nucl.Ac
ids Res.8巻、299−317ページ（1980年））によりエク
テオラ・ぺーパーに移される。 最後に、複製RNAがエクテオラ・ペーパー中に複製−
ブロツトされる工程後、実施例XVIの操作が流用され、
複製可能RNAの複製、該複製RNAの同定、及び検定される
試料中にpBR322が存在するか否かの確認が行われる。 本発明は、RNA−依存性RNAポリメラーゼによるRNA複
製に基づくレポーターシステムの使用により達成されう
る感度のために、先行技術のシステムよりも有意に進歩
した生物検定システムを含む。これらのレポーターシス
テムを使用する検定の感度は、親和性分子及び複製可能
RNAの非特異的吸着に由来するバツクグラウンドのみに
よつて測定されるべきである。そうでなければ、このよ
うな検定の感度は、試料当たり１分子という理論的制限
にとどめられるべきである。 本発明はある程度の明細をもつて記述されてきたが、
等業者にとつては自明な修飾が本発明の方向から逸脱す
ることなくなされうる。 本発明の様々な特徴は次の特許請求の範囲において提
示される。
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フロントページの続き
(73)特許権者 999999999
ザ・トラスティース・オブ・コロンビ
ア・ユニバーシティ・イン・ザ・シテ
ィ・オブ・ニューヨーク
アメリカ合衆国ニューヨーク州10027,
ニューヨーク，ブロードウェイ・アッ
ト・ウェスト・ワンハンドレッドアンド
シックスティーンス・ストリート（番地
なし)
(72)発明者 チュー，バーバラ
アメリカ合衆国カリフォルニア州92014,
デル・マー，リュート・レ・パルク
13716，アパートメント シー
(72)発明者 クレイマー，フレッド・アール
アメリカ合衆国ニューヨーク州10463,
ニューヨーク，ウエスト・トゥーハンド
レッドアンドサーティファースト・スト
リート 561
(72)発明者 リザルディ，ポール
メキシコ合衆国モレロス，クエルナバ
サ，アベニュー・ディアズ・オルダズ・
エスクワイア・アトラコムルコ501，ハ
ウス・ナンバー ９
(72)発明者 オージェル，レスリー・イー
アメリカ合衆国カリフォルニア州92037,
ラ・ホーラ，テリーヒル・ドライブ
6102
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．試料中の生体高分子検体の存在を測定する方法であ
って、 （ｉ）該試料を該検体にとっての親和性分子に、該親和
性分子と該検体との間に結合が生じるような条件下にさ
らし； （ii）該親和性分子が複製型RNAではない場合、段階
（ｉ）の前か後のいずれかで、複製型RNAを段階（ｉ）
で使用された親和性分子に結合させ； （iii）RNA依存RNAポリメラーゼを使用して、検体に結
合される親和性分子に結合されるかまたは結合されてい
た、あるいは検体に結合されていた親和性分子である、
複製型RNAの複製に触媒作用を及ぼし；そして （iv）段階（iii）の反応によってつくられたRNAを検出
することからなる方法。 ２．検体が核酸であり、親和性分子が該検体の断片の配
列に対して相補性である約20ないし約4000塩基の配列を
有する断片を含む複製型RNAであり、該複製型RNAの複製
は検体からの該RNAの解離後である請求の範囲第１項の
方法。 ３．複製型RNAの親和性分子への結合は、RNA依存RNAポ
リメラーゼによる複製可能性を失うことなく複製型RNA
に結合された第１連結部分および親和性分子と検体との
間の結合の特異性を失うことなく親和性分子に結合され
た第２連結部分によって行なわれ、該第１および第２連
結部分は互いに共有的に結合されているか特異的結合対
であるかのいずれかである請求の範囲第１項の方法。 ４．親和性分子への複製型RNAの結合が、複製型RNAと、
親和性分子に結合されるかそれに含まれている少くとも
長さ10塩基の核酸の断片とのハイブリダイゼーションに
よって行なわれる請求の範囲第１項の方法。 ５．RNA依存RNAポリメラーゼがＱβレプリカーゼであ
り、組換え複製型RNAが該レプリカーゼによるインビト
ロでの複製のための鋳型である請求の範囲第２項の方
法。 ６．複製型RNAの複製が放射能標識リボヌクレオシド−
５′−トリホスフェートによって行なわれ、得られた複
製されたRNAが放射能標識されている請求の範囲第５項
の方法。 ７．RNA−依存RNAポリメラーゼがＱβレプリカーゼであ
り、複製型RNAがインビトロでの該レプリカーゼによる
複製のための鋳型である請求の範囲第３項の方法。 ８．複製型RNAの複製は放射能標識リボヌクレオシド−
５′−トリホスフェートによって行なわれ、得られた複
製されたRNAが放射能標識されている請求の範囲第７項
の方法。 ９．親和性分子を試料にさらす前に、第１連結部分およ
び第２連結部分がジスルフイド部分によって互いに共有
的に結合されている請求の範囲第８項の方法。 １０．第１連結部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)n−Ｓ−
（式中ホスホラミデート部分が複数型RNAの５′−ヌク
レオチドの５′−炭素に結合され、ｎが２〜８である）
で表わされ、第２連結部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)m
−Ｓ−（式中ホスホラミデート部分が核酸親和性分子の
５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｍはｎと
同じでも異なっていてもよく、２〜８である）で表わさ
れる請求の範囲第９項の方法。 １１．親和性分子が少くとも１つのプリン残基の断片を
有する核酸であり、該断片は親和性分子の３′−末端に
あって、親和性分子の検体結合断片の外側にあり、該親
和性分子の３′−末端はホスホジエステルによって複製
型RNAの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合される
請求の範囲第８項の方法。 １２．親和性分子及び複製型RNAがスマートプローブに
おいて組合せられる請求の範囲第９項の方法。 １３．第１連結部分と第２連結部分とが特異的結合対で
ある請求の範囲第８項の方法。 １４．第１及び第２連結部分の一方がビオチニルであ
り、他方が、ビオチニルと複合体を形成することによっ
て親和性分子または複製型RNAに結合されたアビジンで
ある請求の範囲第13項の方法。 １５．ビオチニル部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)p−(S
S)q (CH2)rNH−（式中上記ホスホラミデート部分は
５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｐおよび
ｒは同じか異なっており、各々２〜８であり、ｑは０ま
たは１である。）のスペーサーアームによって複製型RN
Aの５′−ヌクレオチドに結合されている請求の範囲第1
4項の方法。 １６．親和性分子がビオチニル化された抗体であり、ア
ビジンが複製型RNAに結合された該ビオチニルと複合体
を形成する請求の範囲第15項の方法。 １７．親和性分子がビオチニル化したレクチンであっ
て、アジビンが複製型RNAに結合された該ビオチニルと
複合体を形成する請求の範囲第15項の方法。 １８．親和性分子が、光化学的にフォトビチオンで、あ
るいは酵素的に、ウラシル部分のＣ−５によってビオチ
ニルと結合されているdUTPまたはUTPあるいはアデニン
部分のＣ−６またはＣ−８によってビオチニルに結合さ
れているdATPで、あるいは化学的に５′−ヌクレオチド
の５′−炭素において式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)s (SS)t
(CH2)uNH−（式中ホスホラミデート部分は５′−ヌク
レオチドの５′−炭素に結合され、ｓおよびｕは同じか
異なっており、各々２〜８であり、ｔは０〜１である）
のスペーサーアームでビオチニル化された核酸であり、
アビジンが複製型RNAに結合されたビオチニルと複合体
形成している請求の範囲第15項の方法。 １９．親和性分子が５′−ヌクレオチドの５′−炭素で
ビオチニル化されている請求の範囲第18項の方法。 ２０．複製型DNAに結合された親和性分子を検体に結合
後で複製型RNAの複製前に、第１及び第２連結部分を共
有的に結合しているジスルフイドを還元することによっ
て親和性分子から複製型RNAが分離される請求の範囲第
９項の方法。 ２１．複製型RNAに結合した親和性分子を検体に結合後
で複製型RNAの複製前に、第１および第２連結部分を共
有的に結合しているジスルフイドの還元によって親和性
分子から複製型RNAが分離される請求の範囲第10項の方
法。 ２２．複製型DNAに結合された親和性分子を検体に結合
後で複製型RNAの複製前に、酸による脱プリン化とそれ
につづくβ−脱離によってホスホジエステル結合を切断
することにより親和性分子から複製型RNAを分離する請
求の範囲第11項の方法。 ２３．複製型DNAに結合した親和性分子を検体に結合後
で複製型RNAの複製前に、第１と第２連結部分を共有的
に結合しているジスルフイドの還元によって親和性分子
から複製型RNAを分離する請求の範囲第12項の方法。 ２４．スペーサー基のｑが１であり、複製型RNAに結合
された親和性分子を検体に結合後で複製型RNAの複製前
に、複製型RNAをビオチニルに結合しているスペーサー
アームのジスルフイドの還元によって親和性分子から複
製型RNAが分離される請求の範囲第15項の方法。 ２５．スペーサー基のｑが１であり、複製型RNAに結合
された親和性分子の検体への結合後で複製型RNAの複製
前に、複製型RNAをビオチニルに結合するスペーサーア
ームのジスルフイドの還元によって親和性分子から複製
型RNAを分離する請求の範囲第16項の方法。 ２６．スペーサー基のｑが１であって；複製型RNAに結
合された親和性分子の検体への結合後で複製型RNAの複
製前に、複製型RNAをビオチニルに結合するスペーサー
アームのジスルフイドの還元によって親和性分子から複
製型RNAを分離する請求の範囲第17項の方法。 ２７．スペーサー基のｑが１であり；複製型RNAに結合
された親和性分子の検体への結合後で複製型RNAの複製
前に、複製型RNAをビオチニルに結合するスペーサーア
ームのジスルフイドの還元によって親和性分子から複製
型RNAを分離する請求の範囲第19項の方法。 ２８．RNA−依存RNAポリメラーゼがＱβレプリカーゼで
あって、組換え複製型RNAがインビトロでの該レプリカ
ーゼによる複製のための鋳型である請求の範囲第４項の
方法。 ２９．親和性分子が核酸である請求の範囲第28項の方
法。 ３０．RNA依存性RNAポリメラーゼにより複製されうる複
製型RNAに結合された目的の分子と特異的に結合しうる
親和性分子。 ３１．複製型RNAの親和性分子への結合は、RNA依存RNA
ポリメラーゼによる複製可能性を失うことなく複製型RN
Aに結合された第１連結部分および親和性分子と検体と
の間の結合の特異性を失うことなく親和性分子に結合さ
れた第２連結部分によって行なわれ、該第１および第２
連結部分は互いに共有結合されているか特異的結合対で
あるかのいずれかである請求の範囲第30項の親和性分子
−複製型RNAハイブリッド。 ３２．複製型RNAがＱβレプリカーゼによるインビトロ
での複製のための鋳型である請求の範囲第31項の親和性
分子−複製型RNAハイブリッド。 ３３．第２連結部分と第１連結部分が親和性分子および
複製型RNAに各々共有的に結合し、ジスルフイド部分に
よって互いに共有的に結合されている請求の範囲第32項
の親和性分子−複製型RNAハイブリッド。 ３４．第１連結部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)n−Ｓ−
（式中ホスホラミデート部分が複数型RNAの５′−ヌク
レオチドの５′−炭素に結合され、ｎが２〜８である）
で表わされ、第２連結部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)m
−Ｓ−（式中ホスホラミデート部分が核酸親和性分子の
５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｍはｎと
同じでも異なっていてもよく、２〜８である）で表わさ
れる請求の範囲第33項の親和性分子−複製型RNAハイブ
リッド。 ３５．親和性分子が少くとも１つのプリン残基の断片を
有する核酸であり、該断片は親和性分子の３′−末端に
あって、検体の標的断片の配列に対して相補性である配
列を有する親和性分子の断片の外側にあり、該親和性分
子の３′−末端はホスホジエステルによって複製型RNA
の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合されている請
求の範囲第32項の親和性分子−複製型RNAハイブリッ
ド。 ３６．第１連結部分を第２連結部分が特異的結合対であ
る請求の範囲第32項の親和性分子−複製型RNAハイブリ
ッド。 ３７．第１及び第２連結部分の一方がビオチニルであ
り、他方が、ビオチニルと複合体を形成することによっ
て親和性分子または複製型RNAに結合されたアビジンで
ある請求の範囲第36項の親和性分子−複製型RNAハイブ
リッド。 ３８．ビオチニル部分が式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)p (S
S)q (CH2)rNH−（式中上記ホスホラミデート部分は
５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｐおよび
ｒは同じか異なっており、各々２〜８であり、ｑは０ま
たは１である。）のスペーサーアームによって複製型RN
Aの５′−ヌクレオチドに結合されている請求の範囲第3
7項の親和性分子−複製型RNAハイブリッド。 ３９．親和性分子はビオチニル化抗体でである請求の範
囲第38項の親和性分子−複製型RNAハイブリッド。 ４０．親和性分子がビオチニル化レクチンである請求の
範囲第38項の親和性分子−複製型RNAハイブリッド。 ４１．親和性分子が、光化学的にフォトビオチンで、あ
るいは酵素的に、ウラシル部分のＣ−５によってビオチ
ニルと結合されているdUTPまたはUTPあるいはアデニン
部分のＣ−６またはＣ−８によってビオチニルに結合さ
れているdATPで、あるいは化学的に５′−ヌクレオチド
の５′−炭素において式Ｏ−PO2−NH−(CH2)s (SS)t
(CH2)uNH−（式中ホスホラミデート部分は５′−ヌクレ
オチドの５′−炭素に結合され、ｓおよびｕは同じか異
なっており、各々２〜８であり、ｔは０〜１である）の
スペーサーアームでビオチニル化された核酸であり、ア
ビジンが複製型RNAに結合されたビオチニルと複合体形
成している請求の範囲第38項の親和性分子−複製型RNA
ハイブリッド。 ４２．親和性分子が５′−ヌクレオチドの５′−炭素で
ビオチニル化されている請求の範囲第41項の親和性分子
−複製型ハイブリッド。 ４３．複製型RNAの親和性分子が、RNA依存RNAポリメラ
ーゼによる複製可能性を失うことなく複製型RNAに結合
された連結部分を介して結合しており、かつ前記連結部
分は複製型RNAと親和性分子との間の結合を共有結合に
よってなしうるものである請求の範囲第30項の親和性分
子−複製型RNAハイブリッド。 ４４．RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製型RNAのイ
ンビトロでの複製可能性を失うことなしに、連結部分に
結合された複製型RNAであって；該連結部分は、複製型R
NAと親和性分子との間の結合を親和性分子と結合してい
る連結部分への共有的結合によって結合を行うことがで
きるRNA依存性RNAポリメラーゼにより複製されうるRN
A。 ４５．インビトロでのＱβレプリカーゼによる複製のた
めの鋳型である請求の範囲第44項の複製型RNA。 ４６．複製型RNAが結合されている連結部分が硫黄、ビ
オチニル、または複合体形成によってビオチニルに結合
されたアビジン（一方このビオチニルは複製型RNAに結
合されている）である請求の範囲第45項の複製型RNA。 ４７．連結部分がビオチニルまたはアビジンであり、ど
ちらの場合でも、ビオチニルが式−Ｏ−PO2−NH−(CH2)
p (SS)q CH2)rNH−（式中上記ホスホラミデート部分
は５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｐおよ
びｒは同じか異なっており、各々２〜８であり、ｑは０
または１である。）のスペーサーアームによって複製型
RNAの５′−ヌクレオチドに結合されている請求の範囲
第46項の複製型RNA。 ４８．連結部分が硫黄であって式−O(PO2)NH(CH2)p−
（式中ホスホラミデート基は５′−ヌクレオチドの５′
−炭素に結合され、ｐは２〜８である）のスペーサー基
によって複製型RNAの５′−ヌクレオチドに結合される
請求の範囲第46項の複製型RNA。 ４９．核酸親和性分子に共有的に結合されたRNA依存性R
NAポリメラーゼにより複製されうる複製型RNAからなる
スマートプローブ。 ５０．複製型RNAがＱβレプリカーゼによる複製のため
の鋳型であり、複製型RNAの５′−ヌクレオチドの５′
−炭素および親和性分子の５′−ヌクレオチドの５′−
炭素は式−O(PO2)NH(CH2)ySS(CH2)zNH(PO2)O−（式中ｙ
とｚは同じか異なっており各々２〜８である）の部分に
よって結合されている請求の範囲第49項のスマートプロ
ーブ。 ５１．親和性分子が５′−クランプ断片および３′−ク
ランプ断片の両方を有する請求の範囲第50項のスマート
プローブ。 ５２．複製型RNAが親和性分子の３′−末端における断
片の配列と相補性の配列をもつ断片を有する複製型組換
えRNAである請求の範囲第50項のスマートプローブ。 ５３．親和性分子が、該親和性分子に結合された、ある
いはそれに含まれた少くとも10塩基の長さの核酸の断片
と複製型RNAとのハイブリダイゼーションによって複製
型RNAに結合されている請求の範囲第30項の親和性分子
−複製型RNAハイブリッド。 ５４．複製型RNAがインビトロでのＱβレプリカーゼに
よる複製のための鋳型である請求の範囲第53項の親和性
分子−複製型RNAハイブリッド。 ５５．親和性分子が蛋白質である請求の範囲第54項の親
和性分子−複製型RNAハイブリッド。 ５６．親和性分子が核酸である請求の範囲第54項の親和
性分子−複製型RNAハイブリッド。
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